Summary
Lasermikrodissektion (LMD) ist eine empfindliche und hochreproduzierbare Technik, die verwendet werden kann, um Wege aufzudecken, die Gliomheterogenität und Invasion vermitteln. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Isolierung diskreter Bereiche aus Gliomgewebe mittels Laser LMD, gefolgt von transkriptomischer Analyse.
Abstract
Gliome sind primäre Hirntumoren, die sich durch ihre Invasivität und Heterogenität auszeichnen. Spezifische histologische Muster wie Pseudopalisaden, mikrovaskuläre Proliferation, mesenchymale Transformation und Nekrose charakterisieren die histologische Heterogenität hochwertiger Gliome. Unser Labor hat gezeigt, dass das Vorhandensein von hohen Dichten von mesenchymalen Zellen, die Oncostreams genannt werden, mit Tumormalignität korreliert. Wir haben einen einzigartigen Ansatz entwickelt, um die Mechanismen zu verstehen, die dem Wachstum und der Invasion von Glioma zugrunde liegen. Hier beschreiben wir ein umfassendes Protokoll, das Lasercapture Microdissection (LMD) und RNA-Sequenzierung nutzt, um die differenzielle mRNA-Expression intratumoraler heterogener multizellulärer Strukturen (d. h. mesenchymale Bereiche oder Bereiche der Tumorinvasion) zu analysieren. Diese Methode bewahrt eine gute Gewebehistologie und RNA-Integrität. Perfusion, Einfrieren, Einbetten, Schnitt und Färbung wurden optimiert, um die Morphologie zu erhalten und hochwertige Lasermikrodissektionsproben zu erhalten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Perfusion von Gliom-tragenden Mäusen mit 30% Saccharose eine gute Morphologie und RNA-Qualität bietet. Darüber hinaus führt die Färbung von Tumorabschnitten mit 4% Cresylviolett und 0,5% Eosin zu einer guten kern- und zellulären Färbung unter Beibehaltung der RNA-Integrität. Die beschriebene Methode ist empfindlich und hochreproduzierbar und kann verwendet werden, um Tumormorphologie in verschiedenen Tumormodellen zu studieren. Zusammenfassend beschreiben wir eine vollständige Methode zur Durchführung von LMD, die Morphologie und RNA-Qualität für die Sequenzierung bewahrt, um die molekularen Merkmale heterogener multizellulärer Strukturen innerhalb solider Tumoren zu untersuchen.
Introduction
Gliome sind die aggressivsten Primärtumoren des zentralen Nervensystems. Sie sind hochinvasiv und heterogen1. Die Analyse zellulärer und molekularer Komponenten des Tumors wird neue therapeutische Ziele aufzeigen.
Unter verschiedenen derzeit verfügbaren Methoden ist die Lasercapture-Mikrodissektion (LMD) von gefrorenem Hirntumorgewebe eine kostengünstige, zuverlässige Technik, die die Isolierung diskreter anatomischer Bereiche oder spezifischer Zellpopulationen aus Tumorgeweben ermöglicht, um ihr molekulares Profil zu untersuchen2,3. LMD ermöglicht die Analyse von mRNA-Genexpressionsprofilen ausgewählter Einzelzellen oder multizellulärer Strukturen4,5. LMD kann genutzt werden, um tiefgehendes mechanistisches Wissen über die molekularen Ereignisse zu gewinnen, die während der Tumorprogression stattfinden. Eine Verbesserung der Verarbeitung von Tumorgeweben ist notwendig, um eine optimale optische Auflösung der Gewebemorphologie und der RNA-Qualität6zu erhalten. Obwohl paraformaleDehyd-Fixierung die beste Option für die morphologische Analyse ist, wird die RNA-Qualität unter diesen Bedingungen beeinflusst und herabgestuft, was zu einer schlechten RNA-Qualität für die RNA-Seq-Analyse führt. Die Verwendung von gefrorenen Gewebeabschnitten vermeidet die Bildung von Eiskristallen, die Zellmembranen brechen und Löcher in Zellen produzieren könnten, und bleibt die beste Option für die RNA-Seq-Analyse7.
Hier beschreiben wir eine optimierte Abschnittsfixierungs- und Färbemethode zur Verarbeitung von gefrorenem Hirntumorgewebe der Maus für LMD. Um zu verhindern, dass sich Eiskristalle im Gewebe bilden, haben wir Mäuse mit einer Lösung von 30% Saccharose durchdrungen. Diese Lösung stört Wechselwirkungen zwischen polaren Wassermolekülen und verhindert die Bildung von Eiskristallen, wodurch die Gewebemorphologie erhalten bleibt. Gewebefärbung ist notwendig, um zu differenzieren und spezifische Population von Zellen oder anatomisch unterschiedliche Bereiche innerhalb des Tumors zu erhalten. Es ist wichtig, das Gewebe mit harmlosen Farbstoffen zu fixieren und zu färben, um die RNA-Integrität zu erhalten. Es wurde bereits gezeigt, dass Färbegewebe mit Hämatoxylin/Eosin (H&E) die RNA-Integrität verschlechtert8. Wir fixierten und färbten das Gewebe von Interesse mit Ethanol, Cresyl violett 4% und Eosin Y 0,5% Lösungen. Cresylviolett ist ein acidophiler Farbstoff, der den Zellkern mit einer dunkelblauen Farbe färbt. Eosin Y ist ein basophiler Farbstoff, der grundlegende Bestandteile der Zellen färbt und eine Unterscheidung zwischen Zytoplasma und anderen zellulären Strukturen bietet8. Beide Farbstoffe sind in Ethanol löslich und verschlechtern die RNA-Qualität nicht. Um Gewebeschäden zu vermeiden und eine hohe optische Auflösung der zellulären Strukturen zu erhalten, haben wir die Gewebeabschnitte vor LMD9montiert.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden, die Versuchstiere verwenden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Michigan zugelassen.
HINWEIS: Gliom-Neurosphären, die aus einem GEMM oder stabilen Linien erzeugt werden, können zur intrakraniellen Tumorengraftierung bei Mäusen10 verwendet und für die LMD- und RNA-Sequenzierung verarbeitet werden. Diese Zellen exprimieren konstitutiv Grüfly-Luziferase und GFP-Proteine, die weiter für die Tumorwachstumsanalyse und Lokalisierung genutzt werden.
1. Generierung eines intrakraniellen Mausgliommodells aus Neurosphären aus gentechnisch veränderten Gliommodellen
- Um eine Primärkultur von Neurosphärenzellen aus einem gentechnisch veränderten Mausmodell (GEMM) zu erzeugen, verwenden Sie das zuvor beschriebene Protokoll10,11.
- Vorbereiten von Neurosphärenkulturmedium wie beschrieben: 500 ml von Dulbecco s Modified Eagle Medium F-12 (DMEM/F12) ergänzt mit 10 ml 50x B-27 und 5 ml 100x N-2 neuronale KulturErgänzungen, 5 ml 100x Antibiotikum und 1 ml Normocin. Vor der Beschichtung der Neurosphären, fügen Sie 20 ng/mL menschlichen rekombinanten EGF und FGF auf das Kulturmedium.
- Kulturgliom-Neurosphären in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 für 2-3 Tage vor intrakranieller Tumortransplantation.
- Sammeln Sie am Tag der Operation die Gliom-Neurosphären und drehen Sie sie bei 550 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Zellpellet zu stören.
- Um die Neurosphären zu dissoziieren, setzen Sie das Zellpellet in 1 ml Zellablösung wieder auf und brüten bei 37 °C und 5%CO2 für 2-4 min. Nach der Inkubationszeit pipette die Neurosphären mit einer 1 ml Mikropipette auf und ab, um eine einzellige Suspension zu gewährleisten.
- Inaktivieren Sie die Zellablösung, indem Sie die Neurosphärensuspension mit 10 ml unergänzten DMEM/F12-Medien verdünnen. Drehen Sie die Neurosphären bei 550 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Setzen Sie das Zellpellet in 100 l DMEM/F12-Medien ohne Ergänzungen wieder auf. Machen Sie eine Verdünnung der Zellsuspension 1:50, und fügen Sie dann 50 l Trypan Blue hinzu, um lebensfähige Zellen zu zählen. Verwenden Sie die folgende Formel, um die Konzentration von Zellen zu bestimmen:
Zellen/ml = [((-Zellen gezählt pro Quadrat) / Anzahl der gezählten Quadrate) x 50 x 10.000 Zellen/ml] - Nach Bestimmung der Zellzahl, um eine Zielkonzentration von 30.000 Zellen /l in 100 L Volumen zu erreichen, drehen Sie die Neurosphären nach unten und setzen Sie sie in dem entsprechenden Volumen von DMEM/F12 ohne Ergänzungen wieder aus.
- Neurosphären in einem vorbeschrifteten 0,6 ml-Rohr auf Eis legen.
- Vorbereiten von Arbeitslösungen der Anästhesie, Analgetika und Anästhesieumumumvorkehr vor der Implantation: Für Ketamin/Dexmedetomidin-Anästhesie 0,6 ml von 100 mg/ml Ketaminhydrochlorid und 0,8 ml 0,5 mg/ml Dexmedetomidinhydrochlorid zu sterilen 8,6 ml 0,9% NCla enthalten. Für Buprenorphin-Analgetika 1 ml 0,3 mg/ml Buprenorphin zu 9 ml 0,9% NaCl enthaltende Durchstechflasche hinzufügen. Für Atipamezole Anästhesie umkehren, fügen Sie 1 ml von 5 mg/ml Atipamezol zu 9 ml von 0,9% NaCl enthaltenf.
- Verwenden Sie 6-8 Wochen alte C57BL/6J weibliche Mäuse zur intrakraniellen Tumortransplantation.
- In einem Raum, der für die Nagetier-Überlebenschirurgie zugelassen ist, stellen Sie sterile Vorräte für die intrakranielle Tumorenpfroptment auf. Führen Sie Operationen an einem stereotaxic-Rahmen durch, der mit einer sterilisierten 10-L-Hamilton-Spritze mit einer abnehmbaren 33G-Nadel ausgestattet ist. Verwenden Sie einen Perlensterilisator, um Werkzeuge zwischen Operationen zu sterilisieren.
- Anästhetisieren Sie Mäuse mit einer einzigen intraperitonealen (i.p.) Injektion der in Schritt 1.11 hergestellten Anästhetikumlösung (Ketamin:75,0 mg/kg und Dexmedetomidin:0,5 mg/kg). Ungefähr wird eine 250-L-Lautstärke der Anästhesielösung an eine Maus mit einem Gewicht von 20 g geliefert. Stellen Sie sicher, dass die Maus vor dem Fortfahren nicht auf Pedalreflexreagiert reagiert.
- Sobald sich die Maus in einem tief anästhesierten Zustand befindet, tragen Sie steriles Petrolatum-Ophthalmschmierstoff auf die Augen auf, um ein Trocknen zu verhindern. Rasieren Sie das Fell auf der Maus Schädel. 10% Povidon-Jod-Toplösung auf den rasierten Bereich auftragen, um zu desinfizieren.
- Sichern Sie den Schädel der Maus in einem stereotaktischen Rahmen. Zuerst öffnen Sie vorsichtig den Mund mit Zangen und ziehen Sie die Zunge vorsichtig und bewegen Sie sie auf eine Seite des Mundes, um ersticken zu verhindern. Halten Sie den Mund mit den Zangen offen und legen Sie die oberen Schneidezähne in das Schlüsselloch der Zahnstange auf dem stereotaktischen Rahmen.
- Halten Sie den Mauskopf an den Ohren, legen Sie die Ohrstangen gegen die postorbitalen Knochen und sichern Sie sie. Stellen Sie sicher, dass der Schädel der Maus mit der chirurgischen Tischplatte gleich ist. Sichern Sie die Ohrstangen vorsichtig nicht Druck auf den Schädel. Als nächstes, sichern Sie vorsichtig die Nasenstange.
- Mit einer Skalpellklinge der Größe 15, machen Sie einen Schnitt entlang des Mauskopfes, das Cranium freisetzen. Ziehen Sie die Haut an der Einschnittstelle mit Colibri-Retraktoren zurück. Verwenden Sie einen sterilen Applikator, um alle perikraniellen Gewebe zu entfernen.
- Identifizieren Sie das Bregma und senken Sie die Nadel der Hamilton-Spritze direkt darüber. Positionieren Sie die Nadel mit dem Rahmen 1 mm vordem und 1,5 mm seitlich. Markieren Sie diesen Punkt mit einer 26G-Nadel, indem Sie den Schädel markieren.
- Verwenden Sie einen Akku-Leistungsbohrer, der mit einem 0,45 mm Bohrer ausgestattet ist, um ein Gratloch am Zielstandort zu erstellen. Bohren Sie, bis sie die darunter liegende Dura mater erreichen. Den restlichen Knochen im Gratloch vorsichtig mit einer 26G Nadel extrahieren.
- Mit einer Pipette die Zellen gründlich homogenisieren und 7 l der Neurosphärensuspension in die Spritze einarbeiten. Um sicherzustellen, dass die Spritze ordnungsgemäß funktioniert, geben Sie 1 l der Suspension auf ein 70% alkoholgetränktes Pad aus.
- Senken Sie die Nadel auf die Oberfläche der Dura mater. Senken Sie die Spritze 3,5 mm ventral und ziehen Sie 0,5 mm zurück. Dadurch entsteht ein Raum von 0,5 mm im Gehirn, in dem sich die Neurosphären bei injektionen ablagern können.
- Lassen Sie die Nadel für 2 min für druckausgleich. Geben Sie die Zellen im Laufe von 1 min langsam und reibungslos ab. Lassen Sie die Zellen 6 min einleben. Entfernen Sie die Spritze im Laufe von 2 min langsam und glatt aus dem Gehirn.
- Mit steriler Herzlösung die Oberfläche des Schädels dreimal waschen. Geben Sie die überschüssigen Zellen in der Spritze auf ein 70% Alkoholpad, und wischen Sie die Nadel mit einem weiteren 70% Alkoholpad sauber. Spülen Sie die Spritze mit sterilem PBS, um eine Verstopfung der Nadel zu vermeiden.
- Entfernen Sie die Retraktoren und nehmen Sie vorsichtig die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen. Schließen Sie den Schnitt mit 3-0 Nylon Nähten, Zange, und einem Nadeltreiber.
- Atipamesol (1,0 mg/kg) verabreichen, ca. 100 l für eine 20 g Maus. Buprenorphin (0,1mg/kg subkutan) subkutan verabreichen, ca. 70 l für eine 20 g Maus. Legen Sie postoperative Mäuse in einen sauberen Erholungskäfig und überwachen Sie sie, bis sie wachsam und aktiv sind.
2. Tierische Perfusion und Erhaltung des Gehirns
- Um die Tumorprogression zu überwachen, bestimmen Sie die In-vivo-Biolumineszenz mit einem In-vivo-Bildgebungssystem, bis Tiere Anzeichen einer Tumorbelastung aufweisen. Euthanisieren Sie Mäuse, wenn sie ein Signal zwischen 106 und 107 Photonen/s erreichen.
- Anästhesisieren VonMäusen, die Anzeichen einer Tumorbelastung mit intraperitonealer (i.p.) Injektion von Ketamin (75,0mg/kg) und Dexmedetomidin (0,5 mg/kg) Lösung aufweisen. Liefern Sie ca. 250 l an eine Maus mit einem Gewicht von 20 g. Stellen Sie dann sicher, dass die Maus nicht auf Pedalreflex reagiert.
- Mit Zangen, halten Sie die Haut über der Peritonealhöhle, und mit einem großen Paar Sezierschere machen einen "Y" Schnitt durch Eindringen in die Peritonealwand, punktieren Sie die Membran, und dann schneiden Sie den Rippenkäfig.
- Legen Sie eine stumpfe 20G Kanüle in die linke Herzkammer des Mausherzens ein. Dann schnippeln Sie das rechte Atrium des Herzens, um für Exsanguination zu ermöglichen.
- Die mit Sauerstoff versorgte Tyrodes Lösung (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl2, 0,005% NaH2PO4, 0,1% Glukose, 0,1% NaHCO3, 0,02% KCl) durch das Mauskreislaufsystem fließen lassen, bis sich Leber und Lunge aufgrund der Blutentfernung vollständig gelichtet haben (ca. 5 min).
- Setzen Sie das Tier mit 30% Saccharoselösung in Tyrodes Lösung für weitere 15 min gelöst durch. Um den Erfolg der Perfusion zu bewerten, bestätigen Sie, dass Hals, Schwanz und Beine nach 30% Saccharosezirkulation starr sind.
- Schneiden Sie mit einer kleinen Sezierschere die Kopfhaut an der Mittellinie. Beginnend am okzipitalen Knochen und vorwärts in Richtung schnauchung. Dadurch wird der Schädel entlarven.
- Mit einem Paar Rongeurs, durchbrechen Sie den Schädel beginnend am Okzipitalknochen und weiter vorwärts, um die Oberflächen des Gehirns vollständig freizulegen. Drehen Sie dann die Kopfseite nach oben und sezieren Sie die Nerven an der Basis des Gehirns, um sie aus dem Schädel zu befreien.
- Bereiten Sie 30% Saccharoselösung mit RNase-freiem Wasser vor und filtern Sie sie durch einen 40-m-Nylon-Netzfilter, um den RNA-Abbau zu reduzieren.
- Um die Infiltration der Saccharoselösung zu maximieren, legen Sie die sezierten Gehirne in 30% Saccharoselösung und lagern Sie sie über Nacht bei 4 °C. Vor der weiteren Verarbeitung stellen Sie sicher, dass das Gehirn den Boden der Rohre erreicht, die die Saccharoselösung enthalten.
3. Kryokonservierung von Gehirnen, die Gliom-Tumoren beherbergen
- Vor der Kryokonservierung der Gehirne, bereiten Sie ein Glas mit kaltem Isopentan/2-Methylbutan gefüllt und legen Sie das Glas in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff gefüllt. Lassen Sie das Lösungsmittel abkühlen.
- Entfernen Sie das Gehirn aus der 30% Saccharoselösung und bersten Sie es auf einem Filterpapier trocken.
- Beschriften Sie den Kryomold mit einem permanenten Marker. Fügen Sie vorsichtig ca. 5 ml OCT (optimale Schnitttemperaturverbindung) in die Mitte des Kryomolds hinzu, um Luftblasen zu vermeiden.
- Legen Sie das Gehirn in Cryomold enthalten OCT in der gewünschten Ausrichtung. Füllen Sie die Form mit OCT, bis das Gehirn vollständig untergetaucht ist. Mit sauberen Zangen, legen Sie schnell die Kryomold mit OCT und das Gehirn in die kälte Isopentan/2-Methylbutan.
- Sobald das OCT erstarrt (ca. 30-40 s), entfernen Sie den Kryomold mit dem Gehirn und legen Sie es in Trockeneis. Lassen Sie die Form, die das Gehirn enthält, nicht in 2-Methylbutan nach 2 min, da dies Risse in festen OCT verursachen kann. Wickeln Sie das Kryomold mit dem Gehirn in Aluminiumfolie und lagern Sie es bei -80 °C.
4. Schnitt eingefrorener Hirntumorgewebe
- Etikett 2 'm Polyethylennaphthalat (PEN) gleitet mit den Probeninformationen. Gewebeabschnitte werden nach abschnittsteilen direkt auf diesen Folien platziert.
- Stellen Sie die Temperatur der Kryostatkammer zwischen -20 bis -24 °C ein. Vor dem Schnitt den Probenblock in die Kryostatkammer legen und 30-60 min auf die Temperatur in der Kammer ausgrenzen lassen.
- Reinigen Sie die Kryostatkammer und den Messerhalter mit 100% Ethanol und sprühen Sie die Bürsten, die mit RNase Reinigungslösung verwendet werden. Arbeiten Sie in der Kryostatkammer, entfernen Sie die Form und befestigen Sie den OCT-Block, der das Gehirn enthält, an der Kryostat-Probenscheibe mit OCT. Legen Sie den Block in den Scheibenhalter und richten Sie den Block an der Messerklinge aus.
- Installieren Sie ein Einwegblatt in den Schnitthalter.
- Schneiden Sie das Gehirn mit einer Dicke von 10 m ab. Stellen Sie sicher, dass sich keine Streifen oder Kratzlinien im Gewebe befinden. Mit einem Pinsel das Gewebe vorsichtig abflachen und auf die Schnittfläche aufziehen.
- Montieren Sie das Gewebe, das die Hirnabschnitte enthält, vorsichtig auf RNase-freie PEN-Glasglyse. Drehen Sie die positiv geladenen Glasgleitet mit den Fingern in Richtung des Gewebes und drücken Sie den Glasschlitten glatt nach unten in Richtung des Gewebeabschnitts.
HINWEIS: Die Temperatur der Hände wird dem Gewebe helfen, sich am Glas zu befestigen. - Nachdem Sie die Hirnteile auf die Dias montiert haben, lassen Sie die Dias in einer Box in der Kryostatkammer aufbewahren und lagern Sie sie dann bei -80 °C. Halten Sie die Dias niemals bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Falten des Gewebes, und Reißen sind üblich. Für eine genaue posteriore Analyse ist es wichtig, diese Artefakte zu minimieren.
5. Fixierung und Färbung von kryokonservierten Hirngewebeabschnitten
- Um die RNA-Integrität zu erhalten, reinigen Sie alle Instrumente, die mit der RNase-Reinigungslösung verwendet werden. Fahren Sie mit dem Fixierungs- und Färbeprotokoll in einer Dunstabzugshaube fort.
- Bereiten Sie die beschriebenen Fixierlösungen in sauberen RNase-freien 50 ml-Rohren vor. Machen Sie alle Lösungen mit RNase freies Wasser am Tag der Färbung.
- Am selben Tag wird die Laser-Mikrodissektion durchgeführt, 100%, 95%, 70% und 50% Ethanol-Lösungen vorbereiten. Halten Sie die Lösungen in dicht geschlossenen Rohren bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie 4% Cresyl violett und 0,5% Eosin Y in 75% Ethanollösung vor. Wirbeln Sie die Lösung kräftig für 1 min und filtern Sie sie durch einen 0,45 m Nylonfilter, um Spuren von ungelöstem Pulver zu beseitigen.
- Das Gewebe in einen Behälter mit 95% Ethanol für 30 s legen. Transferrutschen in das Rohr mit 75% Ethanol; lassen Sie Rutschen dort für 30 s.
- Dias auf 50% Ethanol übertragen und dort für 25 s lassen. An diesem Punkt wird das ÜLG aufgelöst. Übertragen Sie die Rutsche auf 4% Cresyl violette Lösung für 20 s, und dann auf 0,5% eosin Y Lösung für 5 s übertragen.
- Nehmen Sie die Folie aus der Farbstofflösung und färben Sie das Dia mit einem Filterpapier trocken. Dann legen Sie die Dias in 50% Ethanol für 25 s. Übertragen Sie die Dias auf 75% Ethanol für 25 s. Übertragen Sie die Dias auf 95% Ethanol für 30 s. Übertragen Sie die Dias auf 100% Ethanol für 60 s.
- Spülen Sie die Folie mit Xylol. Übertragen Sie sie in einen Behälter mit Xylol und warten Sie 3 min.
- Bereiten Sie Montagemedium (z.B. Pinpoint Gum) in RNase-freiem Wasser vor. Um Maushirnabschnitte zu montieren, verdünnen Sie das Montagemedium in RNase-freiem Wasser im Verhältnis 1:10.
- Trocknen Sie die Dias auf einer RNase-freien Oberfläche bei Raumtemperatur für 10 s. Bevor das Xylol trocknet, fahren Sie mit der Montage der Dias mit den Gewebeabschnitten fort.
- Mit einem sterilen und RNase-freien dünnen Pinsel kann die Montagelösung auf dem Gewebe auf dem Schlitten vorsichtig dispergieren. Warten Sie 10-20 s, und übertragen Sie dann sofort die Gewebegrutschen auf die Mikroskop-Mikrosektionsplattform.
HINWEIS: Das Verhältnis von Montagemedium zu RNase-freiem Wasser, das für die Montage verwendet wird, variiert je nach Interessesgewebe. Das Montagemedium/Wasserverhältnis bewahrt die Gliomgewebemorphologie für die Lasermikrosektion, ohne die RNA-Integrität zu beeinträchtigen.
6. Laser-Capture-Mikrodissektion
HINWEIS: Ein Laser-Capture-Mikrodissektionsmikroskop muss verwendet werden, um bestimmte Bereiche von Interesse im Tumorgewebe zu lasern. Um die Zeit für die Gewebelaser-Mikrosektion zu minimieren, lassen Sie das LMD-Mikroskop vor der Fixierung und Färbung vorbereiten.
- Um das System zu starten, schalten Sie zuerst den Netzteil ein, gefolgt vom Einschalten des Lasers. Schalten Sie dann den Mikroskopcontroller und den Computer ein. Starten Sie die LMD-Software.
- Unter Mikroskop-Kontrollewählen Sie 10x Vergrößerung. Legen Sie unter Lasersteuerungdie Laserparameter für die Gewebesektion fest. Stellen Sie eine Laserfrequenz von 120 Hz ein, um beste Schnittergebnisse zu erzielen. Stellen Sie den Laserstrom immer auf 100% ein.
- Für eine genaue Laser-Mikrodissektion, stellen Sie die Geschwindigkeit auf 10 und eine Blendeneinstellung auf 2,0-10,0 m. Stellen Sie die Leistung auf 53. Wenn die Laserleistung in einer höheren Einstellung ist, kann dies zu Glasätzen führen.
- Laden Sie den Gewebesammler, der das Gewebe nach der Zerlegung erfasst. Klicken Sie auf die zweite Entladeschaltfläche. Entfernen Sie den leeren Kollektor und legen Sie die DNase/RNase frei 0,5 ml PCR-Flachkopfrohre mit 30 l Lysepuffer in den Kollektor. Legen Sie den Kollektor wieder in die Maschine und klicken Sie auf Weiter auf die Software, um fortzufahren.
- Die verarbeitete (feste und gebeizt) Probe auf das Mikroskop legen. Klicken Sie zunächst auf Entladen der LMD-Software. Als nächstes montieren Sie das Sample auf dem Schiebehalter und legen Sie den Schiebehalter auf die Bühne. Klicken Continue Sie auf Weiter in der Software, um fortzufahren.
- Wählen Sie unter Fenster "Schnittformen" die Option Zeichnen + Ausschneidenaus. Verwenden Sie die Mikroskopsteuerung, um den Interessenbereich zu finden. Zeichnen Sie die Region von Interesse (ROI) und wählen Sie eine Zielkollektorröhre aus. Es ist möglich, mehrere ROIs zu zeichnen, um verschiedene Bereiche von einem einzelnen Dia gleichzeitig zu sezieren.
- Klicken Sie auf Cut starten, um zur Gewebemikrosektion zu gelangen. Nach dem Schnitt entfernen Sie die Vonsetzgebiete aus dem Halter und legen Sie die Rohre auf Trockeneis. Übertragen Sie die gesammelten RNA-Gewebeproben zur Langzeitlagerung auf -80 °C.
7. RNA-Isolierung von mikrodissektiertem Gliomgewebe
- Für die RNA-Extraktion aus LMD verwenden Sie ein RNA-Isolationskit, das für kleine Proben und eine geringe RNA-Ausbeute optimiert ist (siehe Tabelle der Materialien). Befolgen Sie die Herstellungsanweisungen. Führen Sie alle Isolationsschritte bei Raumtemperatur (25 °C) durch. Um die RNA-Qualität zu erhalten, arbeiten Sie schnell. Bereiten Sie alle Lösungen vor, wie vom Hersteller angegeben.
- Passen Sie das Probenvolumen auf 350 l mit Lysepuffer mit 1% Wirbeln Sie die Probe für 40 s, um die Probenviskosität zu reduzieren und die Effizienz der RNA-Elutionsspin-Säulen zu erhöhen.
- Übertragen Sie die gesamte Probe in eine gDNA-Eliminator-Spin-Säule, die in einem 2 ml-Sammelrohr platziert ist. Zentrifugieren Sie das Rohr für 30 s bei 8.000 x g. Speichern Sie den Durchfluss und stellen Sie sicher, dass nach der Zentrifugation keine Flüssigkeit auf der Säule zurückbleibt.
- Fügen Sie dem Durchfluss 350 l 70 % Ethanol hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Übertragen Sie die Probe in eine RNA-Elutionsspin-Säule, die in einem 2 ml-Sammelrohr platziert ist. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und Zentrifugen für 15 s bei 8.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss, und speichern Sie die Spalte.
- Fügen Sie der RNA-Elutionsspin-Säule 700 l RNA-Waschpuffer 1 (20% Ethanol, 900 mM GITC, 10 mM Tris-HCl pH 7.5) hinzu. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und Zentrifugen für 15 s bei 8.000 x g, um die Spinsäulenmembran zu waschen. Entsorgen Sie den Durchfluss.
- Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig die RNA-Elutionsspin-Säule aus dem Entnahmerohr, damit die Säule nicht mit dem Durchfluss in Berührung kommt.
- Fügen Sie der Spinsäule 500 l des zweiten RNA-Waschpuffers (Ethanol 80%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7.5) hinzu. Schließen Sie den Deckel der Säule und drehen Sie 8.000 x g für 20 s, um die Säulenmembran zu waschen. Entsorgen Sie den Durchfluss.
- Um die RNA-Elutionssäule zu waschen, fügen Sie 500 l 80% Ethanol hinzu, schließen Sie den Deckel der Säule und zentrifugieren Sie 2 min bei 8000 x g. Werfen Sie die Rohre mit der Elutionslösung heraus.
- Verwenden Sie ein neues Sammelrohr, öffnen Sie den Deckel der Spinsäule und Zentrifuge bei 8000 x g für 5 min, um die Säule zu trocknen. Entsorgen Sie das Elutionsrohr.
- Legen Sie die RNA-Elutionsspin-Säule in ein neues 1,5 ml-Sammelrohr. Fügen Sie 12 L RNase-freies Wasser, das bei 37 °C erwärmt wird, direkt in die Mitte der Spinsäulenmembran geben. Warten Sie 4 min und Zentrifuge für 1 min bei voller Geschwindigkeit, um RNA zu elute.
8. RNA-Qualitätskontrolle, Bibliotheksvorbereitung und RNA-Seq-Analyse
- Nach der RNA-Extraktion und -Reinigung, verstärken Sie die RNA und erstellen Sie eine cDNA-Bibliothek mit einem speziellen Kit, das für die RNA-Isolierung bei Pico-Molar-Konzentrationen nach Herstelleranweisungen geeignet ist (siehe Tabelle der Materialien). Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Saubere Arbeitsstation, um Kontaminationen mit anderen PCR-Produkten und Nukleaseabbau von Proben zu vermeiden.
- Wenn RNA einen RIN-Wert größer als 4 hat, d. h. die RNA von guter Qualität ist oder nur teilweise abgebaut ist, fahren Sie mit dem Fragmentierungsschritt fort. Bereiten Sie alle Artikel auf Eis vor.
- Erstellen Sie einen Mastermix wie angegeben (Tabelle 1). Erzeugen Sie ein Reaktionsgemisch in einem nukleasefreien Dünnwand-0,2-ml-PCR-Rohr. Inkubieren Sie die Rohre bei 94 °C in einem Thermalzyklus mit heißem Deckel. Die Inkubationszeit der Fragmentierung hängt von der Qualität der RNA ab. RIN 7: 4 min, RIN 5-6: 3 min, RIN 4-5: 2 min.
- Legen Sie die Rohre nach der Inkubation auf ein zuvor bei -20 °C gekühltes PCR-Kühlregal und lassen Sie es 2 min sitzen.
- Für jede Röhre rna-Probe, bereiten Sie erste Strang Synthese Reaktion Master Mix (Tabelle 2). Inkubieren Sie die Rohre in einem Thermalzyklus mit heißem Deckel unter den in Tabelle 3beschriebenen Bedingungen. cDNA-Produkte können bei -20 °C eingefroren werden, bis sie zwei Wochen lang eingefroren werden, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Erstellen Sie den PCR-Mastermix, wie in Tabelle 4angegeben. Legen Sie die Rohre in einen Thermalzyklus mit heißem Deckel und führen Sie die PCR-Reaktion unter den in Tabelle 5angegebenen Einstellungen aus.
- Lassen Sie die Perlen, die verwendet werden, um die DNA zu reinigen, auf Raumtemperatur erwärmen. Nach dem Aufwärmen fügen Sie jeder Probe 40 L der Perlen hinzu. Wirbeln Sie die Rohre zu mischen und drehen Sie kurz nach unten, um Flüssigkeit an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Lassen Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 8 min brüten, damit die DNA an die Perlen binden kann.
- Legen Sie die Rohre auf eine magnetische Trennvorrichtung und lassen Sie sie ca. 5 min sitzen, oder bis die Lösung vollständig klar wird. Halten Sie die Rohre auf der Trennvorrichtung, verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand sorgfältig zu entfernen, ohne die Perlen zu stören.
- Halten Sie die Schläuche auf der Trennvorrichtung, fügen Sie 200 l frisch hergestelltes 80% Ethanol zu den Perlen, um zu waschen, ohne die Perlen zu stören. Warten Sie 30 s, bevor Sie das 80% Ethanol entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
- Drehen Sie die Rohre kurz nach unten und legen Sie die Rohre wieder auf die Trennvorrichtung. Entfernen Sie alle verbleibenden 80% Ethanol, ohne die Perlen zu stören.
- Lassen Sie die Rohre lufttrocknen, wobei die Kappen 5 min geöffnet sind. Lassen Sie es nicht länger sitzen, da die Perlen übertrocknen.
- Halten Sie die Rohre auf der Trennvorrichtung, fügen Sie 52 L nukleasefreies Wasser hinzu, um die Perlen zu bedecken. Entfernen Sie die Rohre von der Trennvorrichtung und Pipette nach oben und unten, bis alle Perlen wieder aufgehängt sind. Bei 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Legen Sie die Rohre wieder auf die Trennvorrichtung, bis die Lösung klar wird, ca. 1 min. Übertragen Sie 50 l des resultierenden Überstandes auf die Brunnen eines 8-Well-Streifens. Fügen Sie jeder Probe 40 L neue Perlen hinzu. Wirbel gründlich zu mischen. Lassen Sie Perlen an die DNA binden, indem Sie bei Raumtemperatur für 8 min inkubieren.
- Während dieser Inkubationszeit beginnen Sie mit dem Auftauen der Komponenten, die für jede in den Proben enthaltene rRNA verwendet werden sollen. Einmal aufgetaut, legen Sie sie auf Eis. Erhitzen Sie einen Thermischen Cycler auch auf 72 °C.
- Legen Sie die Proben auf die magnetische Trennvorrichtung, bis die Lösung klar ist (ca. 5 min). Aliquot 1,5 l Sonden pro Probe zu einem gekühlten PCR-Rohr. Legen Sie das Rohr in den vorgeheizten Thermocycler unter die Einstellungen von 72 °C für 2 min und 4 °C.
- Halten Sie die Probenröhrchen in der magnetischen Trennvorrichtung, entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, ohne die Perlen zu stören. Dann fügen Sie 200 l frisch hergestellte 80% Ethanol zu den Perlen zu waschen, ohne die Perlen zu stören. Warten Sie 30 s, bevor Sie das 80% Ethanol entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
- Drehen Sie die Rohre kurz nach unten und legen Sie die Rohre wieder auf die Trennvorrichtung. Entfernen Sie alle verbleibenden 80% Ethanol, ohne die Perlen zu stören. Lassen Sie die Rohre lufttrocknen, wobei die Kappen 2 min geöffnet sind. Lassen Sie nicht länger sitzen, da die Perlen übertrocknen.
- Bereiten Sie den Mastermix für alle Stichproben vor, indem Sie die folgenden Komponenten in der dargestellten Reihenfolge kombinieren (Tabelle 6).
- Mischen Sie die Master-Mischung durch Wirbeln und fügen Sie 22 l der Mischung zu den getrockneten Perlen jeder Probe und mischen Gründlich zu resuspendieren. Lassen Sie es bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren.
- Drehen Sie die Rohre herunter und legen Sie sie 1 Minute lang auf die magnetische Trennvorrichtung oder bis die Proben frei werden. Übertragen Sie 20 L des Überstandes, ohne die Perlen zu stören, auf neue PCR-Röhren. Stellen Sie die Rohre in einen vorgeheizten Thermocycler unter die Einstellungen in Tabelle 7.
- Bereiten Sie einen PCR-Master-Mix vor, der für jede Probe ausreicht. Fügen Sie dem Master-Mix in der angegebenen Tabelle 8die folgenden Komponenten hinzu. Fügen Sie jedem der Probenröhrchen ab Schritt 8.20 80 l des PCR-Master-Mix hinzu und platzieren Sie den Thermocycler unter den folgenden Einstellungen (Tabelle 9).
- Lassen Sie Perlen, die verwendet werden, um die DNA zu reinigen, auf Raumtemperatur zu erwärmen. Nach dem Aufwärmen fügen Sie jeder Probe 100 L der Perlen hinzu. Lassen Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 8 min brüten, damit die DNA an die Perlen binden kann.
- Legen Sie die Rohre auf eine magnetische Trennvorrichtung und lassen Sie sie ca. 5 min sitzen, oder bis die Lösung vollständig klar wird.
- Halten Sie die Rohre auf der Trennvorrichtung, verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand sorgfältig zu entfernen, ohne die Perlen zu stören.
- Halten Sie die Schläuche auf der Trennvorrichtung, fügen Sie 200 l frisch hergestelltes 80% Ethanol zu den Perlen, um zu waschen, ohne die Perlen zu stören. Warten Sie 30 s, bevor Sie das 80% Ethanol entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
- Drehen Sie kurz die Rohre herunter und legen Sie die Rohre wieder auf die Trennvorrichtung. Entfernen Sie alle verbleibenden 80% Ethanol, ohne die Perlen zu stören.
- Lassen Sie die Rohre lufttrocknen, wobei die Kappen 5 min geöffnet sind. Lassen Sie nicht länger sitzen, da die Perlen übertrocknen. Pipette 20 l Tris Buffer auf das getrocknete Pellet. Entfernen Sie das Rohr von der Trennvorrichtung und mischen Sie es gründlich mit einer Pipette, um die Perlen wieder aufzuhängen. Lassen Sie es bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren.
- Legen Sie die Rohre für 2 min auf die Trennvorrichtung, oder bis die Lösung klar wird. Erwerben Sie den Überstand und übertragen Sie ihn in neue Schläuche. Dann die gesammelte Lösung bei -20 °C aufbewahren.
- Überprüfen Sie, ob die endgültigen Bibliotheken Qualitäts- und Mengenkontrolle benötigen. Poolen Sie die Samples, gruppiert auf und Sequenz, wie paired-end 50 nt liest, nach den vom Hersteller empfohlenen Protokollen.
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Representative Results
Unser Labor hat eine gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) mit dem Schlafschönheitstransposase-System(Abbildung 1A) erstellt. Dieses System integriert spezifische genetische Veränderungen in das Genom von neuronalen Vorläuferzellen bei neonatalen Mäusen. Diese veränderten Vorläuferzellen bilden endogene Gliom-Tumoren. Plasmidsequenzen zur Generierung der Tumoren waren: (1) pT2C-LucPGK-SB100X für Dornröschentransposon & luciferase Expression, (2) pT2-NRASSV12 für NRAS-Expression, (3) pT2-shp53-GFP4 für p53 Knock-down und GFP Proteinexpression und (4) pT2-shATRx-GFP4 für ATRX Knock-down. Plasmide wurden in den seitlichen Ventrikel von 1 Tage alten neonatalen Welpen injiziert, wie zuvorbeschrieben 11. Die Plasmidaufnahme und Tumorbildung wurde über das in vivo Biolumineszenz-Bildgebungssystem überwacht. Sobald tumortragende Mäuse Anzeichen einer Tumorbelastung zeigten, wurden sie geopfert. Tumore wurden entweder zur Erzeugung von Neurosphärenkulturen verwendet oder direkt kryoerhalten für die LMD-Verarbeitung (Abbildung 1A).
Zellkulturen, die vom GEMM aus gestartet wurden, wurden verwendet, um ein übersetzbares Gliommodell zu erzeugen (Abbildung 1B). Gliom-Neurosphären, die von GEMM-Tumoren abgeleitet wurden, wurden kultiviert und intrakraniell in das Striatum immunkompetenter Mäuse implantiert. Einzelzellsuspensionen aus Neurosphären Kultur wurden verwendet, um Gliom-Tumoren durch intrakranielle Implantation zu erzeugen, wie zuvor von unserem Laborbeschrieben 10,11,12. Diese Methode ermöglicht eine sorgfältige Quantifizierung der Anzahl der Zellen, die pro Maus implantiert werden sollen (30.000 Zellen/1 L/Maus). Dieses Protokoll ermöglicht die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zwischen verschiedenen experimentellen Implantationen. Die Implantation von Neurosphären könnte jedoch eine alternative Option zur Erzeugung von Mausgliomtumoren und anschließender LMD- und RNA-Seq-Analyse sein. Dennoch wird diese Methode als genauer angesehen. Die Tumorprogression wurde durch das In-vivo-Biolumineszenzspektrum-Bildgebungssystem überwacht. Mäuse mit Anzeichen einer Tumorbelastung wurden transkardial durchforsst und das Gehirn für die LMD-Verarbeitung kryokoerhalten (Abbildung 1C).
Gewebeabschnitte wurden lasermikroseziert, um das Transkriptom multizellulärer Strukturen innerhalb von Gliomen zu charakterisieren. Die beschriebenen Perfusions-, Gefrier- und Einbettverfahren wurden optimiert, um die Gewebemorphologie zu erhalten und nach der Lasermikrosektion eine qualitativ hochwertige RNA zu erhalten. Es wurden verschiedene Perfusionsansätze evaluiert, um Gewebe mit überlegener Morphologie und RNA-Integrität zu erwerben (Tabelle 10). Um die Interessensgebiete zu sezieren, war es notwendig, das Gewebe mit harmlosen Farbstoffen für RNA zu färben (Abbildung 2). Wir beobachteten, dass perfusing Tumor-Lagermaus mit Tyrodes Lösung für 5 min, und dann 30% Saccharose für 15 min, gefolgt von über Nacht Lagerung des sezierten Gehirns in 30% Saccharose bewahrt Morphologie und RNA-Integrität des Tumorgewebes (Abbildung 3D). Perfusion mit 30% Saccharoselösung verhinderte Eiskristallbildung im Gewebe. Obwohl paraformaldehyd-Gewebefixierung zu einer qualitativ hochwertigen Gewebemorphologie führte, wurde die RNA-Integrität negativ beeinflusst (Abbildung 3B). Andere Ansätze wie Tyrodes Lösung für 5 min oder Tyrodes Lösung für 5 min + 30% Saccharoselösung für 15 min(Abbildung 3A und C) hatten keinen Einfluss auf die RNA-Qualität. Unter diesen Bedingungen wurden Gehirne nicht über Nacht in 30% Saccharose konserviert; beobachteten wir eine reduzierte Auflösung in der Gewebemorphologie.
Wir führten verschiedene Färbetechniken durch, gefolgt von einer Analyse der Qualität der RNA-Integrität. Wir beobachteten, dass 4% Cresylviolett und 0,5% Eosin-Y-Färbung ausreichten, um mehrzellige Gliomstrukturen zu identifizieren und die RNA-Integrität aufrechtzuerhalten. Cresylviolett ist ein acidophiler Farbstoff, der den Zellkern mit einer dunkelblauen Farbe färbt. Eosin Y ist ein basophiler Farbstoff, der grundlegende Bestandteile der Zellen färbt.
Wir beobachteten, dass, wenn das Gewebe nicht mit Montagemedium montiert wurde, die Abschnitte dehydriert wurden und die Morphologie verschlechtertwurde (Abbildung 4A). Um eine hochwertige Gewebemorphologie aufrechtzuerhalten, montierten wir das Gewebe mit Montagemedium. Wir beobachteten, dass 15% Montagemedium in Wasser gelöst (30 l in 200 l Wasser) eine qualitativ hochwertige Gewebemorphologie beibehielt (Abbildung 4B).
In Abbildung 5Asind Bereiche der Gliomheterogenität dargestellt. Die Bilder wurden mit einem Laseraufnahmemikroskop vor der Zerlegung aufgenommen. Rote Linien zeigen Bereiche mit reichlich mesenchymalen Zellen (längliche Zellen). Blaue Linien zeigen Bereiche ohne mesenchymale Zellen (gerundete Zellen)(Abbildung 5A, mittleres Bild). Abbildung 5B zeigt Bilder von mikrosezierten Tumorbereichen (rote Linien) und normalen Hirngewebebereichen (blaue Linien). Die ROI-Auswahl erfolgt, um Interessengebiete zu sezieren(Abbildung 5A und B, niedrigere Bilder). Wir können in diesen Bildern den Erfolg bei der Zerlegung der ausgewählten Bereiche beobachten.
Die RNA-Extraktion wurde mit einem kommerziellen Kit durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass eine Gesamtfläche des sezierten Gewebes zwischen 2,5 x 106 - 7 x 106 m2 für die mRNA-Extraktion und cDNA-Bibliotheksvorbereitung für die nachfolgende RNA-Sequenzierung erforderlich war. Die RNA-Qualitätskontrolle ermittelte eine RIN zwischen 6 und 7 im Gliomgewebe nach Lasermikrosektion. Eine RIN von 6 wurde als geeignet für die cDNA-Bibliotheksvorbereitung ermittelt. Nach der RNA-Extraktion wurde ein Kit zur RNA-Isolation bei Picomolar-Konzentrationen verwendet, um eine cDNA-Bibliothek zu erzeugen, die für die Sequenzierung der nächsten Generation geeignet ist.
| 0,25 ng - 10 ng (1-8 l) RNA |
| 4 l des 5x First-Strand Buffers |
| 1 L des Oligos Mix V2 |
| Nukleasefreies Wasser bis zum Endvolumen von 13 l |
Tabelle 1: RNA-Qualitätskontrolle und Bibliotheksvorbereitung: Master Mix Vorbereitung für Schritt 8.3.
| 4,5 l Mix V2 |
| 0,5 l RNase-Inhibitor |
| 2 L Reverse Transcriptase |
| Endvolumen von 7 l |
| Fügen Sie die 7 l in die RNA-Probenröhre |
Tabelle 2: RNA-Qualitätskontrolle und Bibliotheksvorbereitung: Master Mix Vorbereitung für Schritt 8.5.
| 42 °C für 90 min |
| 70 °C für 10 min |
| 4 °C halten |
Tabelle 3: RNA-Qualitätskontrolle und Bibliotheksvorbereitung: Thermocycler-Bedingungen für Schritt 8.5.
| 2 L nukleasefreies Wasser |
| 25 l 2x PCR-Puffer |
| 1 L DNA-Polymerase für jede Reaktion |
| Sanft mischen und kurz nach unten drehen |
| Fügen Sie jedem der Probenröhrchen 28 L des Master-Mix hinzu |
| Fügen Sie jeder 5'- und 3'-Grundierung 1 L von jedem Röhrchen hinzu |
| Mischen Sie die Reaktionen sanft und drehen Sie sich kurz nach unten |
Tabelle 4: RNA-Qualitätskontrolle und Bibliotheksvorbereitung: Master Mix Vorbereitung für Schritt 8.6.
| 1 Zyklus |
| 94 °C für 1 min |
| 5 Zyklen |
| 98 °C für 15 s |
| 55 °C für 15 s |
| 68 °C für 30 s |
| 1 Zyklus |
| 68 °C für 2 min, 4 °C halten |
Tabelle 5: RNA-Qualitätskontrolle und Bibliotheksvorbereitung: Thermocycler-Bedingungen für Schritt 8.6.
| 16,8 l nukleasefreies Wasser |
| 2,2 l 10x R Puffer |
| 1,5 l R v2 |
| 1,5 l R-Sonden v2 |
Tabelle 6: RNA-Qualitätskontrolle und Bibliotheksvorbereitung: Master Mix Vorbereitung für Schritt 8.18.
| 37 °C 60 min |
| 72 °C 10 min |
| 4 °C halten |
Tabelle 7: RNA-Qualitätskontrolle und Bibliotheksvorbereitung: Thermocycler-Bedingungen für Schritt 8.20.
| 26 l nukleasefreies Wasser |
| 50 l CB-PCR-Puffer |
| 2 L PCR2 Primer v2 |
| 2 L DNA-Polymerase |
Tabelle 8: RNA-Qualitätskontrolle und Bibliotheksvorbereitung: Master Mix Vorbereitung für Schritt 8.21.
| 1 Zyklus |
| 94 °C für 1 min |
| X-Zyklen |
| 98 °C für 15 s |
| 55 °C für 15 s |
| 68 °C für 30 s |
| 1 Zyklus |
| 68 °C für 2 min, 4 °C halten |
Tabelle 9: RNA-Qualitätskontrolle und Bibliotheksvorbereitung: Thermocycler-Bedingungen für Schritt 8.21.
| Schritt 1 | Schritt 2 | Schritt 3 | |
| Methode 1 | Tyrodes 15' | -- | -- |
| Methode 2 | Tyrodes 5' | Saccharose 30% 15' | -- |
| Methode 3 | Tyrodes 5' | 4% PFA 10' | -- |
| Methode 4 | Tyrodes 5' | 30% Saccharose 15' | Gehirn in 30% Saccharose über Nacht |
Tabelle 10: Methoden für verschiedene Perfusionsansätze.
Abbildung 1: Mausgliommodelle für die Lasermikrodissektion. (A) Dornröschen GEMM verwendet, um de novo glioma zu entwickeln. Bilder zeigen Tumorprogression: (i) Plasmidinjektion in den lateralen Ventrikel von Neonaten, (ii) Tumorbelastung. (B) Erzeugung eines transplantierbaren Gliommodells unter Verwendung von Gliomzellkulturen. Neurosphärenzellen, die von GEMM kultiviert werden, werden intrakraniell in das Striatum implantiert. (C) Darstellung der Kryosektion des Gehirns eingebettet in die koronare Orientierung nach Perfusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Methode zur Färbung kryoerhaltener Gewebeabschnitte mit Cresylviolett und Eosin. Die für die Färbung verwendeten Dias wurden mit Werkzeugen behandelt, die mit RNase-freiem Wasser gereinigt wurden. Alle Lösungen wurden mit RNase/DNase freiem Wasser am Tag der Färbung vorbereitet. Cresyl violett Flecken Kerne violett und Eosin Y Flecken Zytoplasma rosa. Farbstoffe wurden zu 70 % in Ethanol gelöst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Vergleich verschiedener Perfusionsansätze zur Erhaltung der Gewebemorphologie und der RNA-Integrität. H&E-Bilder stellen eine vergleichende Morphologie des Hirngewebes dar, die einer Perfusion unter verschiedenen Methoden unterzogen wurde: (A) Tyrodes Lösung für 15 min, (B) Tyrodes Lösung für 5 min, 4% PFA für 10 min, (C) Tyrodes Lösung für 5 min, 30% Saccharose für 15 min und (D) Tyrodes Lösung für 5 min, 30% Saccharose für 15 min mit über Nacht Eintauchen in 30% Saccharose. Für jede Perfusionsmethode wird eine RNA-Qualitätsbewertung angezeigt. Plots zeigen 18s und 28s rRNA Peaks und den anfänglichen Marker-Peak. Das Verhältnis von 18s und 28s rRNA wird verwendet, um die RNA-Qualität zu bestimmen. Rechts neben den Plots wird ein Gelbild der RNA-Fragmente angezeigt. Die RNA-Qualität wurde anhand der RIN-Werte bewertet. Die RNA-Qualität war in den Methoden A, C und D. Die Gewebemorphologie war in den Methoden C und D überlegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Bilder des montierten und nicht montierten Gliomgewebes. (A) Repräsentative Bilder von mit H&E gefärbtem Gewebe. Dieses Gewebe wurde unmontiert gelassen und wurde dehydriert und zeigte eine schlechte Morphologie mit Brüchen im Gewebe. (B) Repräsentative Bilder von mit H&E gebeiztem Und mit Montagemedium beflecktem Gewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Bilder des Gliomgewebes, das für die Lasermikrodissektion verwendet wird. (A-B) Repräsentative Bilder von gewebegefärbt mit H&E und Bereiche von multizellulären Strukturen für LMD ausgewählt. (A) Auf der linken Seite wurden Bereiche von langgestreckten Zellen (rot) und Kontrollbereiche (blau) für LMD ausgewählt. (B) Rechts wurden Bereiche der kollektiven Invasion (rot) und Kontrollbereiche (blau) für LMD ausgewählt. (C) Repräsentative RNA-Qualitätskontrolle für lasermikrosezierte Bereiche. Eine Gesamtfläche von 6,5 x 106 m2 wurde mikroseziert. Die Analyse zeigt die RNA-Konzentration von 2.346 pg/l und die RNA-Integritätsnummer (RIN): 6,8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Gliomheterogenität und -invasion zugrunde liegen, ist von entscheidender Bedeutung, um neue therapeutische Ziele aufzudecken13. In diesem Manuskript beschreiben wir eine detaillierte und optimierte Methode zur Analyse der molekularen Landschaft der Gliomheterogenität und Invasion mittels Laser capture microdissection (LMD) gefolgt von transkriptomischer Analyse.
Lasercapture Microdissection (LMD) kann verwendet werden, um verschiedene Bereiche oder einzelne Zellen innerhalb des Tumors zu identifizieren, und liefert eine spezifische Probe, um das molekulare Muster weiter zu analysieren, das den räumlichen Kontext des Tumorsaufrechterhält 14. Diese Technik ist zuverlässig und kostengünstig im Vergleich zu anderen Methoden verwendet, um das räumliche Transkriptom in soliden Tumoren zu analysieren15. Wir analysierten Gliom-Heterogenität und Invasion in gentechnisch veränderten Maustumormodellen oder intrakraniellen implantierbaren Modellen mit LMD. Diese Modelle rekapitulieren die wichtigsten Eigenschaften menschlicher Gliome und ermöglichen die Untersuchung der Gliomheterogenität und Invasion10,12.
Die Aufrechterhaltung hochwertiger Tumorgewebemorphologie und RNA-Integrität ist eine der Einschränkungen für LMD. Um die Gewebemorphologie zu verbessern, durchfundierten wir Mäuse mit Tyrodes Lösung für 5 Minuten, gefolgt von 30% Saccharose, die in der gleichen Lösung gelöst wurde. Sobald das Gehirn seziert wurde, bewahrten wir es in 30% Saccharose, die über Nacht in RNase/DNase-freiem Wasser gelöst wurde, oder bis das Gehirn den Boden des Speicherbehälters erreichte. Diese Schritte verbessern die Morphologie des Gewebes erheblich und reduzierten die Bildung von Eiskristallen im Gewebe während der Kryokonservierung. Obwohl humanes Gliomgewebe für dieses Protokoll nicht verwendet wurde, könnte die Inkubation menschlicher Proben in 30% Saccharoselösung über Nacht eine praktikable Methode zur Verbesserung der Kryosektionsmorphologie sein. Eine weitere mögliche Einschränkung für LMD ist die Erhaltung der RNA-Integrität nach der Färbung8. Obwohl andere Forschungsteams Lasermikrodissektion auf Gliomgewebe gefolgt von RNA-Seq-Analyse durchgeführt haben, illustrieren sie weder RNA und/oder Morphologie noch kommentieren sie die morphologische Qualität oder bestimmte Kontrollen für Gliom-Gefrorene Abschnitte16. In diesem Protokoll war eine genaue morphologische Identifikation unerlässlich, um präzise makrozelluläre Strukturen innerhalb von Gliomen mikrodissektect zu lasern. Wir beobachteten, dass die Fixierung von Gliomgewebe mit Ethanollösung und die Färbung mit 4% Cresylviolett und 0,5% Eosin Y in ethanolerhaltener RNA-Qualität gelöst und die mikroskopische Identifizierung von Einzelzellen und mehrzelligen Strukturen ermöglicht. Wir haben gezeigt, dass die Montage von Gliomprofilen mit Montagelösung ein kritischer Schritt ist, der Risse und Risse bildung im Gewebe verhindert. Bitte beachten Sie, dass das Montagemedium in Wasser vorbereitet werden muss, da die Verwendung des in Ethanol gelösten Montagemediums zu einer schlechten Gewebemorphologie führt. Die Lasermikrodissektion muss so schnell wie möglich in einer RNase-freien Umgebung durchgeführt werden. Wir empfehlen auch, bis zu 2,5 x 106 'm2 Gesamttumor/Gewebebereich zu sektionen, um angemessene Mengen an RNA zu erhalten, sowohl für die RNA-Qualitätskontrolle als auch für die transkriptomische Analyse.
LMD ermöglicht die Analyse der molekularen Signalwege, die Die Heterogenität und Invasion des Glioms regulieren. Diese Analyse könnte neue potenzielle Ziele für Diagnose, Prognose und zukünftige translationale Entwicklung in präklinischen Gliommodellen aufzeigen.
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Disclosures
Alle Autoren dieses Papiers erklären keine potenziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Arbeiten wurden von den National Institutes of Health,(NIH/NINDS) Grants: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 to M.G.C.; (NIH/NINDS) Zuschüsse R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 an P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; das Department of Neurosurgery, Rogel Cancer Center an der University of Michigan, ChadTough Foundation, und Leah es Happy Hearts Foundation an M.G.C. und P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 an M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) Grant, Project F049768 an A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, ein Physician-Scientist Award von Research to Prevent Blindness, Inc. (RPB), Stipendium R01 EY022633 von der NEI des NIH (AK) und ein uneingeschränktes Stipendium des RPB an das Department of Ophthalmology and Visual Sciences. Diese Forschung nutzte den Vision Research Core (P30 EY007003) und den Cancer Center Research Core (P30 CA046592). Die AK wird durch den Mrs. William Davidson Emerging Scholar Award des A. Alfred Taubman Medical Research Institute unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin - Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
References
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