Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Summary

Laser microdissectie (LMD) is een gevoelige en zeer reproduceerbare techniek die kan worden gebruikt om paden die glioom heterogeniteit en invasie te bemiddelen blootleggen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om discrete gebieden te isoleren van glioomweefsel met behulp van laser LMD, gevolgd door transcriptomische analyse.

Abstract

Gliomen zijn primaire hersentumoren gekenmerkt door hun invasieve en heterogeniteit. Specifieke histologische patronen zoals pseudopalissades, microvasculaire proliferatie, mesenchymale transformatie en necrose karakteriseren de histologische heterogeniteit van hoogwaardige gliomen. Ons laboratorium heeft aangetoond dat de aanwezigheid van hoge dichtheden van mesenchymale cellen, genaamd oncostreams, correleren met tumor maligniteit. We hebben een unieke aanpak ontwikkeld om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de groei en invasie van glioom. Hier beschrijven we een uitgebreid protocol dat gebruik maakt van laser capture microdissectie (LMD) en RNA sequencing om differentiële mRNA-expressie van intratumorale heterogene meercellige structuren (d.w.z. mesenchymale gebieden of gebieden van tumorinvasie) te analyseren. Deze methode handhaaft goede weefselhistologie en RNA integriteit. Perfusie, bevriezing, inbedding, doorsnede en kleuring werden geoptimaliseerd om morfologie te behouden en hoogwaardige lasermicrodissectiemonsters te verkrijgen. De resultaten geven aan dat perfusie van glioom dragende muizen met behulp van 30% sacharose een goede morfologie en RNA-kwaliteit biedt. Bovendien, kleuring tumor secties met 4% Cresyl violet en 0,5% eosine resulteert in een goede nucleaire en cellulaire kleuring, met behoud van RNA integriteit. De beschreven methode is gevoelig en zeer reproduceerbaar en kan worden gebruikt om tumormorfologie te bestuderen in verschillende tumormodellen. Samengevat beschrijven we een complete methode om LMD uit te voeren die morfologie en RNA-kwaliteit behoudt voor sequencing om de moleculaire kenmerken van heterogene meercellige structuren binnen vaste tumoren te bestuderen.

Introduction

Gliomen zijn de meest agressieve primaire tumoren van het centrale zenuwstelsel. Ze zijn zeer invasief en heterogeen¹. Analyse van cellulaire en moleculaire componenten van de tumor zal nieuwe therapeutische doelen onthullen.

Onder verschillende methoden die momenteel beschikbaar zijn, laser capture microdissectie (LMD) van bevroren hersentumor weefsel is een kosteneffectieve, betrouwbare techniek die het mogelijk maakt de isolatie van discrete anatomische gebieden of specifieke celpopulaties van tumorweefsels om hun moleculairprofiel te bestuderen^2,3. LMD maakt de analyse van mRNA-genexpressieprofielen van geselecteerde enkele cellen of meercellige structuren^4,5. LMD kan worden gebruikt om diepgaande mechanistische kennis op te doen over de moleculaire gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens tumorprogressie. Verbetering in de verwerking van tumorweefsels is noodzakelijk om een optimale optische resolutie van weefselmorfologie en RNA-kwaliteit te verkrijgen⁶. Hoewel paraformaldehyde fixatie de beste optie is voor morfologische analyse, wordt de RNA-kwaliteit onder deze omstandigheden aangetast en afgebroken, wat resulteert in een slechte RNA-kwaliteit voor RNA-seq-analyse. Het gebruik van bevroren weefselsecties vermijdt ijskristalvorming, die celmembranen kan breken en gaten in cellen kan produceren, en blijft de beste optie voor RNA-Seq analyse⁷.

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sectie fixatie en kleuring methode om bevroren muis hersentumor weefsels voor LMD te verwerken. Om te voorkomen dat ijskristallen zich in het weefsel vormen, hebben we muizen geperfundeerd met een oplossing van 30% sacharose. Deze oplossing verstoort de interacties tussen polaire watermoleculen en voorkomt de vorming van ijskristallen, waardoor de weefselmorfologie behouden blijft. Weefselkleuring is noodzakelijk om specifieke populaties cellen of anatomisch verschillende gebieden binnen de tumor te onderscheiden en te verkrijgen. Het is essentieel om het weefsel te fixeren en te bevlekken met onschadelijke kleurstoffen om de RNA-integriteit te behouden. Eerder is aangetoond dat kleurweefsel met hematoxyline/eosine (H&E) de RNA-integriteit^{verslechtert 8}. We vasten en bevlekten het weefsel van belang met ethanol, Cresyl violet 4% en eosiny Y 0,5% oplossingen. Cresylviolet is een acidophilic kleurstof die vlekken de celkern met een donkerblauwe kleur. Eosiny Y is een basophilic kleurstof die vlekken basiscomponenten van de cellen, waardoor een onderscheid tussen cytoplasma en andere cellulaire structuren⁸. Beide kleurstoffen zijn oplosbaar in ethanol en verslechteren de RNA-kwaliteit niet. Om weefselschade te voorkomen en een hoge optische resolutie van de cellulaire structuren te behouden, hebben we de weefselsecties voorafgaand aan LMD⁹gemonteerd.

Protocol

Alle hier beschreven methoden die gebruik maken van proefdieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Michigan.

OPMERKING: Glioma neurosferen gegenereerd uit een GEMM of stabiele lijnen kunnen worden gebruikt voor intracraniale tumor engraftment bij muizen¹⁰ en verwerkt voor LMD en RNA sequencing. Deze cellen vormen constitutief firefly luciferase en GFP eiwitten, die verder zal worden gebruikt voor tumorgroei analyse en lokalisatie.

1. Generatie van intracraniale muisglioom model uit neurosferen afgeleid van genetisch gemanipuleerdglioom modellen

1. Gebruik het eerder beschreven protocol^10,11om een primaire cultuur van neurosfeercellen te genereren uit een genetisch gemanipuleerd muismodel (GEMM).
2. Bereid neurosfeer cultuur medium zoals beschreven: 500 mL van Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 (DMEM/F12) aangevuld met 10 mL van 50x B-27 en 5 mL van 100x N-neuronale cultuur supplementen, 5 mL van 100x Antibioticum-Antimycotic, en 1 mL van Normocin. Voordat plating de neurosferen, voeg 20 ng/mL menselijke recombinant EGF en FGF aan de cultuur medium.
3. Cultuurglioom neurosferen in een weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende 2-3 dagen voorafgaand aan intracraniale tumorengraftment.
4. Op de dag van de operatie, verzamel de glioom neurosferen en draai ze op 550 x g voor 5 min bij kamertemperatuur. Verwijder de supernatant voorzichtig zonder de celpellet te storen.
5. Om de neurosferen te scheiden, moet u de celpellet in 1 mL cellosoplossing opnieuw opschorten en incubeeren bij 37 °C en 5% CO₂ voor 2-4 min. Na de incubatietijd pipetteer de neurosferen op en neer met een 1 mL micropipet om een eencellige suspensie te garanderen.
6. Activeer de cellosoplossing door de neurosfeersuspensie te verdunnen met 10 mL niet-aangevulde DMEM/F12-media. Draai de neurosferen op 550 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig de supernatant.
7. Resuspend de celpellet in 100 μL DMEM/F12 media zonder supplementen. Maak een verdunning van 1:50 van de celsuspensie en voeg vervolgens 50 μL Trypan Blue toe om levensvatbare cellen te tellen. Gebruik de volgende formule om de concentratie van cellen te bepalen:
   cellen/mL = [((cellen geteld per vierkant) / # van de getelde vierkanten) x 50 x 10.000 cellen/mL]
8. Na het bepalen van het aantal cellen, om een doelconcentratie van 30.000 cellen/μL in 100 μL-volume te bereiken, draai je de neurosferen naar beneden en stoook ze opnieuw op in het juiste volume van DMEM/F12 zonder supplementen.
9. Plaats neurosferen in een voorgelabelde 0,6 mL buis op ijs.
10. Bereid werkende oplossingen voor anesthesie, pijnstiller en anesthesieomkering voorafgaand aan de implantatie: Voeg voor ketamine/dexmedetomidine anesthesie 0,6 mL van 100 mg/mL ketaminehydrochloride en 0,8 mL van 0,5 mg/mL dexmedetomidinehydrochloride toe aan steriele 8,6 mL van 0,9% NaCl met flacon. Voor buprenorfine analgesic, voeg 1 mL van 0,3 mg/mL buprenorfine toe aan 9 mL van 0,9% NaCl met flacon. Voor atipamezol anesthesie omkering, voeg 1 mL van 5 mg/mL atipamezool tot 9 mL van 0,9% NaCl met flacon.
11. Gebruik 6-8-week oude C57BL/6J vrouwelijke muizen voor intracraniale tumor engraftment.
12. In een kamer goedgekeurd voor knaagdier overleving chirurgie, het opzetten van steriele leveringen voor intracraniale tumor engraftment. Voer operaties uit op een knaagdierstereotaxic frame uitgerust met een gesteriliseerde 10 μL Hamilton spuit met een verwijderbare 33G naald. Gebruik een kraal sterilisator om gereedschappen te steriliseren tussen operaties.
13. Verdoven muizen met een enkele intraperitoneale (i.p.) injectie van de verdovingsoplossing bereid in stap 1.11 (ketamine:75.0 mg/kg en dexmedetomidine:0,5 mg/kg). Ongeveer, een 250 μL volume van de verdovingsoplossing zal worden geleverd aan een muis met een gewicht van 20 g. Zorg ervoor dat de muis niet reageert op pedaalreflex voordat u verdergaat.
14. Zodra de muis is in een diep verdoofde staat, breng steriele petrolatum oogheelkundige smeermiddel op de ogen om te voorkomen dat drogen. Scheer de vacht op de muisschedel. Breng 10% povidone-jodium actuele oplossing aan op het geschoren gebied om te desinfecteren.
15. Zet de schedel van de muis vast in een stereotactisch frame. Open eerst voorzichtig de mond met tangen en trek de tong voorzichtig en beweeg deze naar één kant van de mond om verstikking te voorkomen. Houd de mond open met de tangen en plaats de bovenste incisors in het sleutelgat van de tandbalk op het stereotactische frame.
16. Houd de muiskop bij de oren, plaats de oorbalken tegen de postorbitale botten en zet ze vast. Zorg ervoor dat de schedel van de muis vlak is met het chirurgische tafelblad. Zet de oorbalken voorzichtig vast en zet geen druk op de schedel. Zet vervolgens voorzichtig de neusbalk vast.
17. Met behulp van een maat 15 scalpel mes, maak een incisie langs de muis hoofd, bloot de schedel. Trek de huid in op de incisieplaats met colibri-oprolmechanismen. Gebruik een steriele applicator om alle pericraniale weefsel te verwijderen.
18. Identificeer de bregma en laat de naald van de Hamilton spuit er direct overheen zakken. Plaats met het frame de naald 1 mm vooraan van de bregma en 1,5 mm laterale. Met behulp van een 26G naald, markeer deze plek door het scoren van de schedel.
19. Gebruik een draadloze boormachine uitgerust met een boorbit van 0,45 mm om een braamgat op de doellocatie te creëren. Boor tot het bereiken van de onderliggende dura mater. Haal het resterende bot in het braamgat voorzichtig uit met een 26G naald.
20. Met behulp van een pipet homogeniseer je de cellen grondig en stel je 7 μL van de neurosfeersuspensie op in de spuit. Om ervoor te zorgen dat die spuit goed werkt, moet u 1 μL van de suspensie op een 70% door alcohol doordrenkt eis kussen t.a.v.
21. Laat de naald naar het oppervlak van de dura mater zakken. Laat de spuit 3,5 mm ventral zakken en trek 0,5 mm in. Dit zal leiden tot een 0,5 mm ruimte in de hersenen voor de neurosferen te deponeren wanneer geïnjecteerd.
22. Laat de naald gedurende 2 min op zijn plaats voor drukevenwicht. Langzaam en soepel leveren 1 μL van de cellen in de loop van 1 min. Laat de cellen te vestigen in voor 6 min. Verwijder de spuit langzaam en soepel uit de hersenen in de loop van 2 min.
23. Met behulp van steriele zoutoplossing, was het oppervlak van de schedel drie keer. De overtollige cellen in de spuit op een 70% alcoholpad afdelen en veeg de naald schoon met nog eens 70% alcoholkussen. Spoel de spuit af met steriele PBS om verstopping van de naald te voorkomen.
24. Verwijder de oprolmechanismen en haal de muis voorzichtig uit het stereotactische frame. Sluit de incisie met behulp van 3-0 nylon hechtingen, tangen, en een naald driver.
25. Beheer atipamezool (1,0 mg/kg), ongeveer 100 μL voor een muis van 20 g. Toedienen buprenorfine (0,1 mg/kg onderhuids) onderhuids, ongeveer 70 μL voor een 20 g muis. Plaats postchirurgische muizen in een schone herstelkooi en controleer ze tot ze alert en actief zijn.

2. Dierlijke perfusie en hersenbehoud

1. Om de progressie van tumoren te controleren, u in vivo bioluminescentie bepalen met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem totdat dieren tekenen van tumorbelasting vertonen. Euthanaseer muizen wanneer ze een signaal bereiken tussen 10⁶ tot 10⁷ foton/s.
2. Verdovenmuizen die tekenen van tumorlast vertonen met intraperitoneale (i.p.) injectie van ketamine (75,0 mg/kg) en dexmedetomidine (0,5 mg/kg) oplossing. Lever ongeveer 250 μL aan een muis van 20 g. Zorg er vervolgens voor dat de muis niet reageert op de pedaalreflex.
3. Met behulp van tangen, houd de huid boven de buikholte, en met behulp van een groot paar dissectie schaar maken een "Y" incisie door het penetreren van de buikvlieswand, punctie het middenrif, en snijd vervolgens de ribbenkast.
4. Plaats een stompe 20G canule in de linker ventrikel van het hart van de muis. Knip vervolgens het rechteratrium van het hart om exsanguinatie mogelijk te maken.
5. Laat de oplossing van zuurstofrijke Tyrode (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl₂, 0,005% NaH₂PO₄, 0,1% glucose, 0,1% NaHCO₃, 0,02% KCl) door het systeem van de muiscirculerende systeem stromen totdat de lever en longen volledig zijn gewist als gevolg van de verwijdering van bloed (~ 5 min).
6. Blijf het dier met 30% sacharoseoplossing in Tyrode's oplossing voor 15 min verder doornemen. Om het succes van de perfusie te evalueren, bevestig dan dat de nek, staart en benen stijf zijn na 30% sacharosecirculatie.
7. Met behulp van een klein paar dissectie schaar, snijd de hoofdhuid op de middellijn. Beginnend bij het occipital bot en vooruit werken naar de snuit. Dit zal de schedel blootleggen.
8. Met behulp van een paar rongeurs, breken door de schedel te beginnen bij het occipital bot en blijven naar voren om volledig bloot de oppervlakken van de hersenen. Draai dan de kopkant omhoog en ontleed de zenuwen aan de basis van de hersenen om het los te laten van de schedel.
9. Bereid 30% sacharoseoplossing voor met RNase vrij water en filtreer het door een 40 μm nylon mesh filter om RNA afbraak te verminderen.
10. Om de infiltratie van sacharoseoplossingen te maximaliseren, plaatst u de ontleedde hersenen in een 30% sacharoseoplossing en slaat u ze 's nachts op bij 4 °C. Voordat verdere verwerking ervoor zorgen dat de hersenen de bodem van de buizen met de sacharose oplossing bereikt.

3. Cryopreservatie van hersenen die glioomtumoren herbergen

1. Voorafgaand aan cryopreservatie van de hersenen, bereiden een pot gevuld met koude isopentane/2-methylbutaan en plaats de pot in een container gevuld met vloeibare stikstof. Laat het oplosmiddel afkoelen.
2. Verwijder de hersenen uit de 30% sacharose oplossing en dep het droog op een filter papier.
3. Label de cryomold met een permanente marker. Voeg voorzichtig ongeveer 5 mL OCT (optimale snijtemperatuurverbinding) toe aan het midden van de cryomold en vermijd luchtbellen.
4. Plaats de hersenen in cryomold met OCT in de gewenste oriëntatie. Vul de mal met OCT tot de hersenen volledig onder water staan. Met behulp van schone tangen, snel plaats de cryomold met OCT en de hersenen in de koude isopentane/2-methylbutaan.
5. Zodra de OCT stolt (~ 30-40 s), verwijder de cryomold met de hersenen en plaats het in droogijs. Laat de mal met de hersenen in 2-methylbutaan verleden 2 min niet achter, omdat dit scheuren in vaste OCT. Wikkel de cryomold met de hersenen in aluminiumfolie en bewaar het op -80 °C.

4. Het doorsnijden van bevroren hersentumorweefsels

1. Label 2 μm polyethyleen naftalaat (PEN) dia's met de monsterinformatie. Weefselsecties worden direct op deze dia's geplaatst na sectie.
2. Stel de temperatuur van de cryostatkamer in tussen -20 en -24 °C. Plaats voor het doorsnede het monsterblok in de cryostatkamer en laat het 30-60 min afstellen met de temperatuur in de kamer.
3. Reinig de cryostat kamer en de meshouder met 100% ethanol en spuit de borstels te gebruiken met RNase reinigingsoplossing. Werken in de cryostat kamer, verwijder de mal en bevestig de OCT blok met de hersenen aan de cryostat specimen schijf met OCT. Plaats het blok in de schijfhouder en lijn het blok met het mes.
4. Installeer een wegwerpmes in de doorsnedehouder.
5. Doorsnede van de hersenen op 10 μm dikte. Zorg ervoor dat er geen strepen of kraslijnen in het weefsel zitten. Met behulp van een penseel, voorzichtig plat en ontkrullen het weefsel op het snijoppervlak.
6. Monteer het weefsel met de hersensecties voorzichtig op RNase vrije PEN glasplaten. Draai de positief geladen glazen dia's met de vingers in de richting van het weefsel en druk soepel op de glasschuif naar beneden naar de weefselsectie.
   LET OP: Temperatuur van de handen zal helpen het weefsel hechten aan het glas.
7. Na het monteren van de hersensecties op de dia's, bewaar dia's in een doos in de cryostat kamer en bewaar ze vervolgens op -80 °C. Bewaar de glijbanen nooit op kamertemperatuur.
   OPMERKING: Vouwen van het weefsel, en scheuren komen vaak voor. Voor nauwkeurige analyse achteraf is het belangrijk om deze artefacten te minimaliseren.

5. Fixatie en kleuring van cryopreserved hersenweefsel secties

1. Om de RNA-integriteit te behouden, reinigt u alle instrumenten die met rnase reinigingsoplossing kunnen worden gebruikt. Ga verder met de fixatie en kleuring protocol in een rookkap.
2. Bereid de beschreven fixatieve oplossingen voor in schone RNase-vrije buizen van 50 mL. Maak alle oplossingen met RNase vrij water op de dag van de kleuring.
3. Dezelfde dag zal de laser microdissectie worden uitgevoerd, voor te bereiden 100%, 95%, 70% en 50% ethanol oplossingen. Bewaar de oplossingen in goed gesloten buizen bij kamertemperatuur.
4. Bereid 4% Cresylviolet en 0,5% eosine Y in 75% ethanol oplossing. Draai de oplossing krachtig gedurende 1 min en filtreer ze door een 0,45 μm nylon filter om sporen van onopgelost poeder te elimineren.
5. Plaats het weefsel dia's in een container met 95% ethanol voor 30 s. Breng dia's naar de buis met 75% ethanol; laat dia's daar voor 30 s.
6. Breng dia's naar 50% ethanol en laat ze daar voor 25 s. Op dit punt zal de LGO worden ontbonden. Breng de dia over op 4% Cresyl violet oplossing voor 20 s, en vervolgens over te dragen aan 0,5% eosiny Y oplossing voor 5 s.
7. Haal de dia uit de kleurstofoplossing en dep de dia droog met een filterpapier. Plaats vervolgens de dia's in 50% ethanol voor 25 s. Breng de dia's naar 75% ethanol voor 25 s. Breng de dia's naar 95% ethanol voor 30 s. Breng de dia's naar 100% ethanol voor 60 s.
8. Spoel de dia af met xyleen. Breng ze naar een container met xyleen en wacht 3 min.
9. Bereid het montagemedium (bijvoorbeeld Pinpoint-gom) in RNase-vrij water. Om muishersensecties te monteren, verdunt u het montagemedium in RNase-vrij water met een verhouding van 1:10.
10. Droog de glijbanen op een RNase-vrij oppervlak bij kamertemperatuur gedurende 10 s. Voordat het xyleen droogt, gaat u verder met het monteren van de dia's met de weefselsecties.
11. Verdeel de montageoplossing voorzichtig over het weefsel op de glijbaan met een steriele en RNase-vrije dunne kwast. Wacht 10-20 s, en breng dan onmiddellijk de weefseldia's naar de microscoop microdissectie platform.
    OPMERKING: De verhouding tussen montagemedium en RNase-vrij water dat wordt gebruikt voor montage varieert afhankelijk van het weefsel van belang. De montage medium/water ratio behoudt glioom weefsel morfologie voor laser microdissectie zonder afbreuk te doen aan de RNA-integriteit.

6. Laser capture microdissectie

OPMERKING: Een laser capture microdissection microscoop moet worden gebruikt om microontleden specifieke gebieden van belang binnen het tumorweefsel laser. Om de tijd voor weefsellasermicrodissectie te minimaliseren, laat de LMD-microscoop worden voorbereid voordat de fixatie en kleuring worden aangebracht.

1. Om het systeem te starten, moet u eerst de stekkerdoos inschakelen, gevolgd door het inschakelen van de laser. Schakel vervolgens de microscoopcontroller en de computer in. Start de LMD-software.
2. Selecteer onder microscoopcontrole 10x vergroting. Stel onder lasercontrolede laserparameters in voor weefseldissectie. Stel een laserfrequentie van 120 Hz in voor de beste snijresultaten. Stel de laserstroom altijd in op 100%.
3. Voor nauwkeurige lasermicrodissectie stelt u de snelheid in op 10 en een diafragma-instelling op 2,0-10,0 μm. Stel het vermogen in op 53. Het hebben van de laserkracht op een hogere stand kan glasetsen veroorzaken.
4. Laad de weefselcollector die het weefsel zal vangen na dissectie. Klik op de knop Tweede uitladen. Verwijder de lege collector en plaats de DNase/RNase gratis 0,5 mL PCR platte kopbuizen met 30 μL lysisbuffer in de collector. Plaats de collector terug in de machine en klik op Doorgaan op de software om verder te gaan.
5. Laad het verwerkte (vaste en bevlekte) exemplaar op de microscoop. Klik eerst op uitladen op de LMD-software. Monteer vervolgens het monster op de schuifhouder en plaats de schuifhouder op het podium. Klik op Doorgaan op de software om verder te gaan.
6. Selecteer Onder De vensters Vormen knippen de optie Tekenen + Knippen. Gebruik de microscoop besturingselementen om het gebied van belang te vinden. Teken de interesseregio (ROI) en selecteer een bestemmingsverzamelbuis. Het is mogelijk om meerdere ROI's te tekenen om verschillende gebieden te ontleden van een enkele dia op hetzelfde moment.
7. Klik op Cut starten om over te gaan tot weefselmicrodissectie. Na het doorsnede van de gebieden van belang verwijder de collector buizen uit de houder en plaats de buizen op droogijs. Breng de verzamelde RNA-weefselmonsters over naar -80 °C voor langdurige opslag.

7. RNA-isolatie van microontleed glioomweefsel

1. Voor RNA-extractie uit LMD gebruik een RNA isolatie kit geoptimaliseerd voor kleine monsters en lage RNA-opbrengst (zie Tabel van materialen). Volg de fabricage-instructies. Voer alle isolatiestappen uit bij kamertemperatuur (25 °C). Om de RNA-kwaliteit te behouden, werk snel. Bereid alle oplossingen voor zoals aangegeven door de fabrikant.
2. Pas het monstervolume aan op 350 μL met lysisbuffer met 1% β-mercaptoethanol. Draai het monster voor 40 s om de viscositeit van het monster te verminderen en de efficiëntie van rna elution spinkolom te verhogen.
3. Breng het geheel van het monster over op een gDNA eliminatorspinkolom geplaatst in een 2 mL-verzamelbuis. Centrifugeer de buis 30 s op 8.000 x g. Sla de doorstroom op en zorg ervoor dat er na centrifugering geen vloeistof meer op de kolom achterblijft.
4. Voeg 350 μL ethanol toe aan de doorstroom en meng goed door op en neer te pipetteren. Breng het monster over naar een RNA elution spin kolom geplaatst in een 2 mL collectie buis. Sluit het deksel voorzichtig en centrifugeer 15 s op 8.000 x g. Gooi de doorstroom weg en slaat de kolom op.
5. Voeg 700 μL RNA wasbuffer 1 (20% ethanol, 900 mM GITC, 10 mM Tris-HCl pH 7.5) toe aan de RNA elution spin kolom. Sluit het deksel voorzichtig en centrifugeer 15 s op 8.000 x g om het membraan van de spinkolom te wassen. Gooi de doorstroom weg.
6. Verwijder na het centrifugeren voorzichtig de RNA-elutiespinkolom uit de verzamelbuis, zodat de kolom geen contact maakt met de doorstroom.
7. Voeg 500 μL van de tweede RNA wasbuffer (ethanol 80%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7.5) toe aan de spinkolom. Sluit het deksel van de kolom en draai 8.000 x g voor 20 s om het kolommembraan te wassen. Gooi de doorstroom weg.
8. Om de RNA elution kolom te wassen, voeg 500 μL van 80% ethanol, sluit het deksel van de kolom en centrifuge op 8000 x g gedurende 2 min. Gooi de buizen met de elutie oplossing.
9. Gebruik een nieuwe inzamelbuis, open het deksel van de spinkolom en centrifugeer op 8000 x g gedurende 5 min om de kolom te drogen. Gooi de elutiebuis weg.
10. Plaats de RNA elution spin kolom in een nieuwe 1,5 mL collectie buis. Voeg 12 μL RNase-vrij water dat bij 37 °C wordt opgewarmd direct toe aan het midden van het membraan van de spinkolom. Wacht 4 min en centrifugeer 1 min op volle snelheid tot losbandig RNA.

8. RNA kwaliteitscontrole, bibliotheekvoorbereiding en RNA-Seq analyse

1. Na RNA-extractie en -zuivering u RNA versterken en een cDNA-bibliotheek maken met behulp van een speciale kit die geschikt is voor RNA-isolatie in pico-molaire concentraties volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel van materialen). Volg de instructies van de fabrikant. Schoon werkstation om besmetting met andere PCR-producten en nuclease afbraak van monsters te voorkomen.
2. Als RNA een RIN-waarde heeft die groter is dan 4, wat betekent dat het RNA van goede kwaliteit is of slechts gedeeltelijk is afgebroken, ga dan verder met de fragmentatiestap. Bereid alle items op ijs.
3. Maak een hoofdmix zoals aangegeven(tabel 1). Maak reactiemengsel in een nuclease-vrije dunne wand 0,2 mL PCR buis. Incubeer de buizen bij 94 °C in een warmdekselthermische cycler. Fragmentatie incubatietijd is afhankelijk van de kwaliteit van het RNA. RIN ≥ 7: 4 min, RIN 5-6: 3 min, RIN 4-5: 2 min.
4. Plaats na incubatie de buizen op een PCR-koelrek dat eerder bij -20 °C werd gekoeld en laat het 2 min zitten.
5. Bereid voor elke tube RNA-monster de eerste strengsynthesereactiemastermix voor (tabel 2). De buizen ineenbrengen in een warmdekselthermisch cycler onder de in tabel 3beschreven omstandigheden . cDNA-producten kunnen bij -20 °C worden ingevroren tot twee weken voordat ze doorgaan naar de volgende stap.
6. Maak de PCR-hoofdmix zoals aangegeven in tabel 4. Plaats de buizen in een hete deksel thermische cycler en voer de PCR reactie onder de instellingen aangegeven in tabel 5.
7. Laat de kralen, die zullen worden gebruikt om het DNA te zuiveren, op te warmen tot kamertemperatuur. Voeg na warmheid 40 μL van de kralen toe aan elk monster. Draai de buizen om kort te mengen en te draaien om vloeistof aan de onderkant van de buis te verzamelen. Laat de buizen 8 min op kamertemperatuur uitbroeden zodat het DNA aan de kralen kan binden.
8. Plaats de buizen op een magnetische scheidingsinrichting en laat ongeveer 5 minuten zitten, of totdat de oplossing volledig duidelijk wordt. Houd de buizen op de scheidingsinrichting, gebruik een pipet om de supernatant zorgvuldig te verwijderen zonder de kralen te storen.
9. Houd de buizen op de scheidingsinrichting, voeg 200 μL vers gemaakte 80% ethanol toe aan de kralen om te wassen zonder de kralen te storen. Wacht tot 30 s voor het verwijderen van de 80% ethanol. Herhaal deze stap.
10. Draai de buizen kort naar beneden en plaats de buizen terug op het scheidingsapparaat. Verwijder eventuele resterende 80% ethanol zonder de kralen te storen.
11. Laat de buizen lucht drogen met de doppen open voor 5 min. Laat het niet langer zitten als de kralen zal over drogen.
12. Voeg de buizen op het scheidingsapparaat toe, voeg 52 μL nucleasevrij water toe om de kralen te bedekken. Verwijder de buizen van de scheidingsinrichting en pipet op en neer totdat alle kralen opnieuw worden opgehangen. Incubeer bij 5 min bij kamertemperatuur.
13. Plaats de buizen terug op het scheidingsapparaat totdat de oplossing duidelijk wordt, ongeveer 1 min. Breng 50 μL van de resulterende supernatant over naar de putten van een 8-well strip. Voeg 40 μL nieuwe kralen toe aan elk monster. Vortex grondig te mengen. Laat kralen aan DNA binden door 8 min op kamertemperatuur te komen.
14. Begin tijdens deze incubatietijd met het ontdooien van de componenten die moeten worden gebruikt voor alle rRNA die in de monsters aanwezig zijn. Eenmaal ontdooid, plaats ze op ijs. Verwarm ook een thermische cycler voor op 72 °C.
15. Plaats de monsters op het magnetische scheidingsapparaat totdat de oplossing is gewist (ongeveer 5 min). Aliquot 1,5 μL sondes per monster naar een gekoelde PCR-buis. Plaats de buis in de voorverwarmde thermische cycler onder de instellingen van 72 °C gedurende 2 min en 4 °C.
16. Houd de monsterbuizen in het magnetische scheidingsapparaat, verwijder de supernatant met een pipet zonder de kralen te storen. Voeg vervolgens 200 μL vers gemaakte 80% ethanol toe aan de kralen om te wassen zonder de kralen te storen. Wacht 30 s voor het verwijderen van de 80% ethanol. Herhaal deze stap.
17. Draai de buizen kort naar beneden en plaats de buizen terug op het scheidingsapparaat. Verwijder eventuele resterende 80% ethanol zonder de kralen te storen. Laat de buizen lucht drogen met de doppen open voor 2 min. Laat niet langer zitten als de kralen zal over drogen.
18. Bereid de hoofdmix voor alle monsters voor door de volgende componenten in de gepresenteerde volgorde te combineren(tabel 6).
19. Meng de mastermix door vortexing en voeg 22 μL van het mengsel toe aan de gedroogde kralen van elk monster en meng grondig om opnieuw op te schorten. Laat het 5 min uitbroeden bij kamertemperatuur.
20. Draai de buizen naar beneden en leg ze 1 minuut op het magnetische scheidingsapparaat of totdat de monsters duidelijk zijn. Breng 20 μL van de supernatant over, zonder de kralen te storen aan nieuwe PCR-buizen. Plaats de buizen in een voorverwarmde thermische cycler onder de instellingen in tabel 7.
21. Bereid een PCR-mastermix voor genoeg reacties voor elk monster. Voeg de volgende componenten toe aan de hoofdmix in de aangegeven tabel 8. Voeg 80 μL van het PCR-hoofdmengsel toe aan elk van de monsterbuizen vanaf stap 8.20 en plaats in de thermische cycler bij de volgende instellingen(tabel 9).
22. Laat kralen, die zullen worden gebruikt om het DNA te zuiveren, om op kamertemperatuur te verwarmen. Voeg na warmheid 100 μL van de kralen toe aan elk monster. Laat de buizen 8 min op kamertemperatuur uitbroeden zodat het DNA aan de kralen kan binden.
23. Plaats de buizen op een magnetische scheidingsinrichting en laat ongeveer 5 minuten zitten, of totdat de oplossing volledig duidelijk wordt.
24. Houd de buizen op de scheidingsinrichting, gebruik een pipet om de supernatant zorgvuldig te verwijderen zonder de kralen te storen.
25. Houd de buizen op de scheidingsinrichting, voeg 200 μL vers gemaakte 80% ethanol toe aan de kralen om te wassen zonder de kralen te storen. Wacht tot 30 s voor het verwijderen van de 80% ethanol. Herhaal deze stap.
26. Kort, draai de buizen naar beneden en plaats de buizen terug op de scheidingsinrichting. Verwijder eventuele resterende 80% ethanol zonder de kralen te storen.
27. Laat de buizen lucht drogen met de doppen open voor 5 min. Laat niet langer zitten als de kralen zal overdry. Pipetteer 20 μL Tris Buffer naar de gedroogde pellet. Haal de buis uit het scheidingsapparaat en meng grondig met een pipet om de kralen opnieuw op te schorten. Laat het 5 min uitbroeden bij kamertemperatuur.
28. Plaats de buizen op de scheidingsinrichting gedurende 2 minuten of totdat de oplossing duidelijk is. Verwerven van de supernatant en breng het naar nieuwe buizen. Bewaar de verzamelde oplossing vervolgens op -20 °C.
29. Controleer de uiteindelijke bibliotheken die behoefte hebben aan kwaliteits- en kwantiteitscontrole. Bundel de monsters, geclusterd op en sequentie, als paired-end 50 nt leest, volgens de aanbevolen protocollen van de fabrikant.

Representative Results

Ons laboratorium heeft een genetisch gemanipuleerde muis modellen (GEMMs) met behulp van de doornroosje transposase systeem (Figuur 1A). Dit systeem bevat specifieke genetische veranderingen in het genoom van neurale voorlopercellen in neonatale muizen. Deze veranderde voorlopercellen vormen endogene glioomtumoren. Plasmid sequenties gebruikt om de tumoren te genereren waren: (1) pT2C-LucPGK-SB100X voor Doornroosje transposon & luciferase expression, (2) pT2-NRASSV12 for NRAS expression, (3) pT2-shp53-GFP4 for p53 knock-down and GFP protein expression, and (4) pT2-shATRx-GFP4 for ATRX knock-down. Plasmiden werden geïnjecteerd in de laterale ventrikel van 1-daagse neonatale pups zoals eerder beschreven¹¹. Plasmidopname en tumorvorming werd gecontroleerd via in vivo bioluminescentiebeeldvormingssysteem. Zodra tumordragende muizen tekenen van tumorlast vertoonden, werden ze opgeofferd. Tumoren werden ofwel gebruikt om neurosfeerculturen te genereren of direct cryo-bewaard gebleven voor LMD-verwerking (Figuur 1A).

Celculturen die vanaf de GEMM werden gestart, werden gebruikt om een vertaalbaar glioommodel te genereren (figuur 1B). Glioom neurosferen afgeleid van GEMM tumoren werden gekweekt en intracraniaal geïmplanteerd in het striatum van immuun-competente muizen. Eencellige suspensingen verkregen uit neurosferen cultuur werden gebruikt om glioom tumoren te genereren door intracraniale implantatie zoals eerder beschreven door ons laboratorium^10,11,12. Deze methode maakt het mogelijk om het aantal cellen per muis (30.000 cellen/1 μL/muis) zorgvuldig te kwantificeren. Dit protocol maakt de reproduceerbaarheid van de resultaten tussen verschillende experimentele implantaties mogelijk. Echter, implantatie van neurosferen kan een alternatieve optie zijn om muis glioom tumoren en de daaropvolgende LMD en RNA-Seq analyse te genereren. Toch wordt deze methode als nauwkeuriger beschouwd. Tumorprogressie werd gemonitord door in vivo bioluminescentiespectrumbeeldvormingssysteem. Muizen die tekenen van tumorlast vertoonden, werden transcardiaal geperfundeerd en de hersenen werden cryo-bewaard voor LMD-verwerking (Figuur 1C).

Weefselsecties werden gemicroontmet om het transcriptoom van meercellige structuren binnen gliomen te karakteriseren. De beschreven perfusie-, vries- en inbeddingsprocedures werden geoptimaliseerd om weefselmorfologie te behouden en rna van goede kwaliteit te verkrijgen na lasermicrodissectie. Verschillende perfusiebenaderingen werden geëvalueerd om weefsels met superieure morfologie en RNA-integriteit te verkrijgen (tabel 10). Om de gebieden van belang te ontleden, was het noodzakelijk om het weefsel te bevlekken met onschadelijke kleurstoffen voor RNA (Figuur 2). We merkten op dat het doornemen van tumordragende muis met Tyrode's oplossing voor 5 min, en vervolgens 30% sacharose gedurende 15 min, gevolgd door 's nachts opslag van de ontleedhersenen in 30% sucrose behoudt morfologie en RNA integriteit van het tumorweefsel (Figuur 3D). Perfusie met 30% sacharoseoplossing voorkwam ijskristalvorming in het weefsel. Hoewel paraformaldehydele weefselfixatie resulteerde in hoogwaardige weefselmorfologie, werd de RNA-integriteit negatief beïnvloed(figuur 3B). Andere benaderingen zoals Tyrode's oplossing voor 5 min of Tyrode's oplossing voor 5 min + 30% sacharose oplossing voor 15 min (Figuur 3A en C) had geen invloed op de RNA-kwaliteit. Onder deze omstandigheden werden hersenen niet bewaard in 30% sacharose 's nachts; we hebben een verminderde resolutie in weefselmorfologie waargenomen.

We voerden verschillende kleuringstechnieken uit, gevolgd door RNA-integriteitskwaliteitscontrole analyse. We merkten op dat 4% Cresylviolet en 0,5% eosine Y-kleuring voldoende was om glioom meercellige structuren te identificeren en rna-integriteit te behouden. Cresylviolet is een acidophilic kleurstof die vlekken de kern van cellen met een donkerblauwe kleur. Eosin Y is een basophilic kleurstof die vlekken basiscomponenten van de cellen.

We merkten op dat als het weefsel niet was gemonteerd met montagemedium, de secties uitgedroogd raakten en de morfologie verslechterde(figuur 4A). Om weefselmorfologie van hoge kwaliteit te behouden, hebben we het weefsel met montagemedium gemonteerd. We merkten op dat 15% montagemedium opgelost in water (30 μL in 200 μL water) hoge kwaliteit weefselmorfologie(figuur 4B)handhaafde.

In figuur 5Aworden gebieden met glioomheterogeniteit getoond. Beelden werden verworven met behulp van een laser capture microdissectie microscoop voorafgaand aan dissectie. Rode lijnen verbeelden gebieden met overvloedige mesenchymale cellen (langwerpige cellen). Blauwe lijnen tonen gebieden zonder mesenchymale cellen (afgeronde cellen)(figuur 5A, middelste afbeelding). Figuur 5B toont beelden van laser micro-ontleed tumor gebieden (rode lijnen) en normale hersenweefsel gebieden (blauwe lijnen). ROI selectie wordt gemaakt om gebieden van belang te ontleden(figuur 5A en B,lagere beelden). We kunnen in deze beelden het succes in de dissectie van de geselecteerde gebieden waarnemen.

RNA extractie werd uitgevoerd met behulp van een commerciële kit. Vastgesteld werd dat een totale oppervlakte ontleed weefsel tussen 2,5 x 10⁶ - 7 x 10⁶ μm² nodig was voor mRNA-extractie en cDNA-bibliotheekvoorbereiding voor latere RNA-sequencing. RNA kwaliteitscontrole bepaalde een RIN tussen 6 tot 7 in glioomweefsel na lasermicrodissectie. Een RIN van 6 werd bepaald geschikt voor cDNA bibliotheekvoorbereiding. Na RNA-extractie werd een kit voor RNA-isolatie bij picomolaire concentraties gebruikt om een cDNA-bibliotheek te genereren die geschikt is voor de volgende generatie sequencing.

0,25 ng - 10 ng (1-8 μL) RNA

4 μL van de 5x First-Strand Buffer

1 μL van de Oligos Mix V2

Nuclease-vrij water tot eindvolume van 13 μL

Tabel 1: RNA kwaliteitscontrole en bibliotheekvoorbereiding: Master Mix voorbereiding voor stap 8.3.

4,5 μL Mix V2

0,5 μL RNase-remmer

2 μL Reverse Transcriptase

Eindvolume van 7 μL

Voeg de 7 μL toe aan de RNA-monsterbuis

Tabel 2: RNA kwaliteitscontrole en bibliotheekvoorbereiding: Master Mix voorbereiding voor stap 8.5.

42 °C voor 90 min

70 °C gedurende 10 min

4 °C houden

Tabel 3: RNA kwaliteitscontrole en bibliotheekvoorbereiding: Thermocycler voorwaarden voor stap 8.5.

2 μL nucleasevrij water

25 μL 2x PCR-buffer

1 μL DNA Polymerase voor elke reactie

Meng voorzichtig en draai kort naar beneden

Voeg 28 μL van het hoofdmengsel toe aan elk van de monsterbuizen

Voeg 1 μL van elke primer van 5' en 3' toe aan elke buis

Meng de reacties voorzichtig en draai kort naar beneden

Tabel 4: RNA kwaliteitscontrole en bibliotheekvoorbereiding: Master Mix voorbereiding voor stap 8.6.

1 cyclus

94 °C gedurende 1 min

5 cycli

98 °C voor 15 s

55 °C voor 15 s

68 °C voor 30 s

1 cyclus

68 °C gedurende 2 min, 4 °C hold

Tabel 5: RNA kwaliteitscontrole en bibliotheekvoorbereiding: Thermocycler voorwaarden voor stap 8.6.

16,8 μL nucleasevrij water

2,2 μL 10x R-buffer

1,5 μL R v2

1,5 μL R-Probes v2

Tabel 6: RNA kwaliteitscontrole en bibliotheekvoorbereiding: Master Mix voorbereiding voor stap 8.18.

37 °C 60 min

72 °C 10 min

4 °C houden

Tabel 7: RNA kwaliteitscontrole en bibliotheekvoorbereiding: Thermocycler voorwaarden voor stap 8.20.

26 μL nucleasevrij water

50 μL CB PCR-buffer

2 μL PCR2 Primers v2

2 μL DNA Polymerase

Tabel 8: RNA kwaliteitscontrole en bibliotheekvoorbereiding: Master Mix voorbereiding voor stap 8.21.

1 cyclus

94 °C gedurende 1 min

X-cycli

98 °C voor 15 s

55 °C voor 15 s

68 °C voor 30 s

1 cyclus

68 °C gedurende 2 min, 4 °C hold

Tabel 9: RNA kwaliteitscontrole en bibliotheekvoorbereiding: Thermocycler voorwaarden voor stap 8.21.

	Stap 1	Stap 2	Stap 3
Methode 1	Tyrode is 15'	--	--
Methode 2	Tyrode is 5'	Sacharose 30% 15'	--
Methode 3	Tyrode is 5'	4% PFA 10'	--
Methode 4	Tyrode is 5'	30% Sucrose 15'	Hersenen in 30% Sucrose Overnight

Tabel 10: Methoden voor verschillende perfusiebenaderingen.

Figuur 1: Muisglioommodellen die worden gebruikt voor lasermicrodissectie. (A) Doornroosje GEMM gebruikt om de novo glioom te ontwikkelen. Beelden tonen tumorprogressie: (i) plasmidinjectie in de laterale ventrikel van neonaten, (ii) tumorlast. (B) Generatie van transplanteerbaar glioom model met behulp van glioom celculturen. Neurosfeercellen gekweekt uit GEMM worden intracraniaal geïmplanteerd in het striatum. (C) Afbeelding van cryo-sectioning van de hersenen ingebed in coronale oriëntatie na perfusie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Schematische weergave van de methode die wordt gebruikt om cryo-bewaarde weefselsecties te bevlekken met Cresylviolet en Eosin. Glijbanen die voor kleuring werden gebruikt, werden behandeld met gereedschappen die met RNase-vrij water werden gereinigd. Alle oplossingen werden voorbereid met RNase/DNase vrij water op de dag van kleuring. Cresylviolet vlekken kernen violet en eosine Y vlekken cytoplasma roze. Kleurstoffen werden opgelost in 70% ethanol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Vergelijking van verschillende perfusiebenaderingen om weefselmorfologie en RNA-integriteit te behouden. H&E-beelden vertegenwoordigen vergelijkende morfologie van hersenweefsel dat volgens verschillende methoden aan perfusie werd onderworpen: (A) De oplossing van Tyrode gedurende 15 min, (B) Tyrode's oplossing voor 5 min, 4% PFA voor 10 min, (C) Tyrode's oplossing voor 5 min, 30% sacharose voor 15 min, en (D) Tyrode's oplossing voor 5 min, 30% sacharose voor 15 min met 's nachts onderdompeling in 30% sacharose. Voor elke perfusiemethode wordt een RNA-kwaliteitsbeoordeling weergegeven. Plots verbeelden 18s en 28s rRNA pieken en de eerste marker piek. De verhouding van 18s en 28s rRNA wordt gebruikt om rna kwaliteit te bepalen. Rechts van de percelen wordt een gelafbeelding van de RNA-fragmenten weergegeven. De RNA-kwaliteit werd beoordeeld aan de hand van de RIN-waarden. RNA kwaliteit was hoog in methoden A, C, en D. Tissue morfologie was superieur in methoden C en D. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Representatieve afbeeldingen van gemonteerd en niet-gemonteerd glioomweefsel. (A) Representatieve afbeeldingen van weefsel bevlekt met H&E. Dit weefsel werd ongemonteerd achtergelaten en werd uitgedroogd met een slechte morfologie met breuken in het weefsel. BB) Representatieve afbeeldingen van weefsel bevlekt met H&E en gemonteerd met bevestigingsmedium. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Representatieve afbeeldingen van glioomweefsel dat wordt gebruikt voor lasermicrodissectie. (A-B) Representatieve afbeeldingen van weefsel bevlekt met H&E en gebieden van meercellige structuren die zijn geselecteerd voor LMD. (A) Aan de linkerkant werden gebieden van langwerpige cellen (rood) en controlegebieden (blauw) geselecteerd voor LMD. (B) Aan de rechterkant, gebieden van collectieve invasie (rood) en controle gebieden (blauw) werden geselecteerd voor LMD. (C) Representatieve RNA kwaliteitscontrole voor laser microontleed gebieden. Een totale oppervlakte van 6,5 x 10⁶ μm² werd microontleed. De analyse toont de RNA-concentratie van 2.346 pg/μL en RNA Integrity Number (RIN): 6.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan glioom heterogeniteit en invasie zijn van cruciaal belang om nieuwe therapeutische doelen bloot te leggen¹³. In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerde en geoptimaliseerde methode om het moleculaire landschap van glioom heterogeniteit en invasie te analyseren met behulp van lasercapture microdissectie (LMD), gevolgd door transcriptieanalyse.

Laser capture microdissectie (LMD) kan worden gebruikt om verschillende gebieden of enkele cellen binnen de tumor te identificeren, het verstrekken van een specifiek monster om verder te analyseren van de moleculaire patroon behoud van de ruimtelijke context van de tumor¹⁴. Deze techniek is betrouwbaar en goedkoop in vergelijking met andere methoden die worden gebruikt om het ruimtelijke transcriptoom in vaste tumoren te analyseren¹⁵. We analyseerden glioom heterogeniteit en invasie in genetisch gemanipuleerde muis tumor modellen of intracraniale implanteerbare modellen met behulp van LMD. Deze modellen recapituleren de meest opvallende kenmerken van menselijke gliooma's, waardoor de studie van glioom heterogeniteit en invasie^10,12.

Het handhaven van hoogwaardige tumorweefselmorfologie en RNA-integriteit is een van de beperkingen voor LMD. Om de weefselmorfologie te verbeteren, hebben we muizen gedurende 5 minuten geperfundeerd met de oplossing van Tyrode, gevolgd door 30% sacharose opgelost in dezelfde oplossing. Zodra de hersenen werd ontleed, bewaarden we het in 30% sacharose opgelost in RNase / DNase-vrij water 's nachts of totdat de hersenen de bodem van de opslagcontainer bereikt. Deze stappen verbeteren de morfologie van het weefsel aanzienlijk en verminderden de vorming van ijskristallen in het weefsel tijdens cryo-conservering. Hoewel menselijk glioomweefsel niet werd gebruikt voor dit protocol, zou de incubatie van menselijke monsters in 30% sacharoseoplossing 's nachts een haalbare methode kunnen zijn om cryosecties morfologie te verbeteren. Een andere mogelijke beperking voor LMD is het behoud van RNA-integriteit na-kleuring⁸. Hoewel andere onderzoeksteams lasermicrodissectie op glioomweefsel hebben uitgevoerd, gevolgd door RNA-seq-analyse, illustreren ze geen RNA en/of morfologie, noch geven ze commentaar op morfologische kwaliteit, of bepaalde controles voor glioom bevroren secties¹⁶. In dit protocol was nauwkeurige morfologische identificatie essentieel om nauwkeurige macrocellulaire structuren binnen gliomen te laseren. We merkten op dat de vaststelling van glioomweefsel met ethanol oplossing en vlekken met 4% Cresyl violet en 0,5% eosine Y opgelost in ethanol-onderhouden RNA kwaliteit en in staat gesteld de microscopische identificatie van enkele cellen en meercellige structuren. We hebben aangetoond dat het monteren van glioomsecties met montageoplossing een kritieke stap is die scheurvorming en scheurvorming in het weefsel voorkomt. Houd er rekening mee dat het montagemedium in water moet worden bereid, omdat het gebruik van het in ethanol opgeloste montagemedium zal resulteren in een slechte weefselmorfologie. Lasermicrodissectie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd in een RNase-vrije omgeving. We raden ook aan om tot 2,5 x 10⁶ μm² totale tumor/weefselgebied te sectie om de juiste hoeveelheden RNA te verkrijgen, zowel voor RNA kwaliteitscontrole als transcriptomic analyse.

LMD maakt de analyse van de moleculaire signaleringstrajecten mogelijk die glioom heterogeniteit en invasie reguleren. Deze analyse zou nieuwe potentiële doelen voor diagnose, prognose en toekomstige translationele ontwikkeling in preklinische glioommodellen kunnen onthullen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Buffer RLT	Qiagen	79216
Corning PCR Tubes	Sigma Aldrich	CLS6530
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich	C5042
DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12	Gibco	11330057
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
HiSeq 4000	Illumina	N/A
Laser Microdissection (LMD) System	Leica	LMD7000
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
Normocin - Antimicrobial Reagent	Invivogen	ant-nr-1
Peel Away Disposable Embedding Molds	Electron Microscopy Sciences	70182
PEN Membrane Glass Slide (2 µm)	Lieca	1150518
Pinpoint Solution	Zymo Research	D3001-1
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B-1MG
Research Cryostat	Leica	CM3050s
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian	Takara Bio	634411
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571