Summary
לייזר לחיתוך מיקרו (LMD) היא טכניקה רגישה ומאוד לגילוי שניתן להשתמש בה כדי לחשוף מסלולים כי בתווך glioma טרוגניות ופלישה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב כדי לבודד אזורים נפרדים מרקמת glioma באמצעות LMD לייזר ואחריו ניתוח טרנססקריפט.
Abstract
Gliomas הם גידולים המוח העיקרי המאופיינת בטרוגניות שלהם והחלטיות. דפוסי היסטולוגית ספציפיים כגון פסבדו, התפשטות microvascular, המרה mesenchymal ונמק לאפיין את טרוגניות היסטולוגית של gliomas בדרגה גבוהה. המעבדה שלנו הוכיחה כי נוכחות של צפיפות גבוהה של תאי mesenchymal, בשם אוננטים, לתאם עם ממאירות הגידול. פיתחנו גישה ייחודית כדי להבין את המנגנונים כי בחסר הצמיחה של glioma ופלישה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מקיף המבצע לכידת לייזר מיקרודיסקציה (LMD) ו-RNA רצף כדי לנתח את הביטוי mRNA הדיפרנציאלי של מבנים הטרוגנית בתוך הסביבה מוסרי (כלומר, אזורים mesenchymal או אזורים של הפלישה הגידול). שיטה זו שומרת על היסטולוגיה רקמה טובה ושלמות RNA. Perfusion, הקפאת, הטבעה, הפחתת וכתמים היו ממוטבים כדי לשמור על המבנה ולהשיג דגימות באיכות גבוהה לייזר מיקרולייזר. התוצאות מצביעות על כך שפרזיה של עכברים הנושאים glioma באמצעות 30% סוכרוז מספק טוב מורפולוגיה ו-RNA איכות. בנוסף, צביעת סעיפים הגידול עם 4% Cresyl סגול ו 0.5% התוצאות האאוזין הגרעין טוב והסלולר, תוך שמירה על שלמות RNA. השיטה המתוארת היא רגישה מאוד מיויית והיא יכולה להיות מנוצל כדי ללמוד מורפולוגיה של הגידול במודלים סרטניים שונים. לסיכום, אנו מתארים שיטה מלאה לבצע LMD השומרת על מורפולוגיה ואיכות ה-RNA עבור רצף כדי ללמוד את התכונות המולקולריות של מבנים רב-תאיים הטרוגנית בתוך גידולים מוצקים.
Introduction
Gliomas הם הגידולים העיקריים האגרסיביים ביותר של מערכת העצבים המרכזית. הם פולשניים מאוד והטרוגנית1. ניתוח של רכיבים סלולריים ומולקולריים של הגידול יגלה מטרות טיפוליות הרומן.
בין שיטות שונות הזמינות כרגע, לכידת לייזר מיקרודיסקציה (lmd) של רקמת סרטן קפואה המוח היא טכניקה חסכונית, אמין המאפשר בידוד של אזורים אנטומיים דיסקרטית או אוכלוסיות תאים ספציפיות מרקמות הגידול לחקור את הפרופיל המולקולרי שלהם2,3. Lmd מאפשר ניתוח של פרופילי mrna ביטוי גנים של תאים בודדים נבחרים או מבנים רב-תאיים4,5. LMD יכול להיות מנוצל כדי לקבל מעמיק ידע מכונאי על האירועים המולקולריים המתרחשים במהלך התקדמות הגידול. שיפור בעיבוד של רקמות הגידול הוא הכרחי כדי לקבל רזולוציה אופטית אופטימלית של מורפולוגיה רקמות ו-RNA באיכות6. למרות קיבוע פאראפורמלדהיד היא האופציה הטובה ביותר עבור ניתוח מורפולוגית, איכות ה-RNA מושפע ומושפל תחת תנאים אלה, וכתוצאה מכך איכות ה-RNA העני עבור ניתוח של RNA-seq. השימוש בסעיפים רקמות קפואות ימנע היווצרות גביש קרח, אשר יכול לשבור את קרום התא ולייצר חורים בתוך תאים, והוא נשאר האופציה הטובה ביותר לניתוח RNA-Seq7.
כאן, אנו מתארים קיבעון מקטע אופטימיזציה ושיטת הצביעת לעבד העכבר הקפוא רקמות סרטן המוח עבור LMD. כדי למנוע את היווצרות גבישי הקרח ברקמה, אנו מקימים עכברים בתמיסה של 30% סוכרוז. פתרון זה משבש את האינטראקציות בין מולקולות מים קוטביים ומונע היווצרות גבישי קרח, שמירה על מורפולוגיה של רקמות. מכתים רקמות הכרחי כדי להבדיל ולהשיג אוכלוסיה ספציפית של תאים או אזורים ברורים מבחינה אנטומית בתוך הגידול. חיוני לתקן ולהכתים את הרקמה עם צבעים לא מזיק כדי לשמור על שלמות RNA. זה כבר הוכח כי הצביעת רקמות עם המטאוקסילין/אאוזין (H & E) מתדרדר RNA שלמות ה-8. סידרנו והכתים את רקמת העניין עם אתנול, Cresyl סגול 4% ו אאוזין Y 0.5% פתרונות. קרסיל ויולט הוא צבע מאסיאני הכתמים על גרעין התא בצבע כחול כהה. אאוזין Y הוא צבע בסיסי הכתמים על המרכיבים הבסיסיים של התאים, ומספק הבחנה בין ציטופלסמה לבין מבנים סלולאריים אחרים8. שתי הצבעים הם מסיסים אתנול ואינם מידרדר איכות RNA. כדי למנוע נזק לרקמות ולשמור על רזולוציה אופטית גבוהה של המבנים הסלולריים, היינו רכוב על סעיפים הרקמה לפני LMD9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן המשתמשות בבעלי חיים ניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.
הערה: מחלות המוח Glioma שנוצרו מקווים GEMM או יציבה ניתן להשתמש עבור הגידול בתוך התוך העור בתוך הבית בעכברים10 מעובד עבור lmd ו-RNA רצפי. תאים אלה באופן מכונן לבטא גחלילית לוציפראז ו-GFP חלבונים, אשר יהיה מנוצל נוסף לניתוח גידול בגידולים ולוקליזציה.
1. הדור של מודל העכבר התוך-גולגולתי glioma מ נוירוספירות נגזר מדגמי glioma מהונדסים גנטית
- כדי ליצור תרבות ראשית של תאים נוירוספירה ממודל עכבר מהונדס גנטית (GEMM), השתמש בפרוטוקול המתואר בעבר10,11.
- הכנת בינוני תרבות נוירוספירה כפי שמתואר: 500 mL של מדיום הנשר שונה של Dulbecco F-12 (DMEM/F12) שיושלם עם 10 מ ל של 50x B-27 ו 5 מ ל של 100x N-2 תוספי תרבות עצביים, 5 מ ל של 100x אנטיביוטי-Antimycotic, ו-1 מ ל Normocin. לפני ציפוי הנוירוספירות, להוסיף 20 ng/mL האדם רקומביננטי EGF ו FGF למדיום התרבות.
- תרבות glioma נוירוספירות בחממה תרבות רקמה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 2-3 ימים לפני הגידול בתוך העור התוך.
- ביום הניתוח, לאסוף את מעצבי glioma ולסובב אותם ב 550 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את הסופרנטנט. מבלי להפריע לגלולה הסלולרית
- כדי לנתק את הנוירוספירות, להשעות מחדש את הגלולה תא 1 מ ל של התנתקות תא פתרון ו-דגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 2-4 דקות. בעקבות תקופת הדגירה, פיפטה את הנוירוכדורים למעלה ולמטה עם מיקרופיפטה 1 mL כדי להבטיח השעיה תא אחד.
- הפוך את פתרון התנתקות התא על ידי דילול ההשעיה נוירוספירה עם 10 mL של מדיה בלתי מצורפים/F12. הספין הנוירוספירות ב 550 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. . בזהירות, הסר את הסופרנטאנט
- השהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-100 μL של מדיית DMEM דיה/F12 ללא תוספי מזון. לבצע דילול 1:50 של ההשעיה התא, ולאחר מכן להוסיף 50 μL של טרילאן כחול לספור תאים קיימא. השתמש בנוסחה הבאה כדי לקבוע את ריכוז התאים:
תאים/mL = [(((∑ תאים שנספרו לריבוע)/של ריבועים שנספרו) x 50 x 10,000 תאים/mL] - לאחר קביעת ספירת תאים, כדי להשיג ריכוז היעד של 30,000 תאים/μL בתוך 100 μL נפח, לסובב את הנוירוספירות למטה ולהשעות אותם בנפח המתאים של DMEM/F12 המכילים ללא תוספי מזון.
- מניחים כדורי נוירו בצינור 0.6 mL מתויג מראש על קרח.
- הכנת פתרונות עבודה של הרדמה, כאבים, והרדמה ההרדמה לפני השרשה: עבור הרדמה קטמין/dexmedetomidine, להוסיף 0.6 mL של 100 mg/mL קטמין הידרוכלוריד ו 0.8 mL של 0.5 mg/mL dexmedetomidine הידרוכלוריד ל-מכיל ב8.6 ליטר של 0.9. עבור כאבים בופרנורפין, להוסיף 1 מ ל של 0.3 mg/ml בופרנורפין עד 9 מ ל של 0.9% מכיל בקבוקון. לקבלת הרדמה לאטיפיאזול, להוסיף 1 מ ל של 5 מ"ג/mL atipamezole עד 9 מ ל של 0.9% מכיל בקבוקון.
- השתמש 6-8 שבוע בן C57BL/6J עכברים נקבה עבור הגידול בתוך העור התוך.
- בחדר אושרה ניתוח הישרדות מכרסם, להגדיר אספקה סטרילית עבור הגידול בתוך הצוואר. לבצע ניתוחים על מסגרת סטריאוטקאית מכרסם מצויד מזרק מעוקר 10 μL המילטון עם מחט נשלף 33G. לנצל מעקר חרוז לעקר כלים בין ניתוחים.
- עכברים בעלי הזרקה של תמיסת הרדמה המוכנה בשלב 1.11 (קטמין: 75.0 mg/kg ו-dexmedetomidine: 0.5 מ"ג/ק"ג). בקירוב, כמות 250 μL של פתרון ההרדמה תימסר לעכבר במשקל 20 גרם. ודא שהעכבר אינו מגיב לרפלקס הדוושה לפני שתמשיך.
- לאחר העכבר נמצא במצב מורדם עמוקות, להחיל חומר סיכה לעיניים מעוקרים של פטרוליום כדי למנוע ייבוש. תגלח את הפרווה. על הגולגולת של העכבר החל 10% povidone-הפתרון האקטואלי יוד לאזור מגולח כדי לחטא.
- אבטחו את גולגולת העכבר במסגרת סטריאוטקטיקה. ראשית, בזהירות לפתוח את הפה עם מלקחיים ולמשוך בעדינות את הלשון ולהעביר אותו לצד אחד של הפה כדי למנוע חנק. שמרו על הפה פתוח עם הלקחיים והניחו את החותכות העליונים אל חור המנעול של בר השן במסגרת הסטריאוטקטיקה.
- מחזיק את ראש העכבר על ידי האוזניים, למקם את פסי האוזן נגד העצמות הpostorbital ולאבטח אותם. ודא כי הגולגולת של העכבר היא רמה עם השולחן הכירורגי. אבטחו את פסי האוזן בזהירות. שלא מיישמים לחץ על הגולגולת לאחר מכן, אבטח בזהירות את בר האף.
- , לחתוך לאורך ראש העכבר. ולחשוף את הגולגולת למשוך את העור באתר החתך באמצעות Coליבריס מחדש. השתמש במוליך סטרילי כדי להסיר את כל הרקמה הpericranial.
- זהה את הברגמה והנמך את המחט של מזרק המילטון ישירות מעליו. באמצעות המסגרת, למקם את המחט 1 מ"מ הקדמי של ברז ו 1.5 מ"מ לרוחב. באמצעות מחט 26G, לסמן את המקום הזה על ידי הבקיע את הגולגולת.
- השתמש בתרגיל כוח אלחוטי מצויד עם מקדחה 0.45 מ"מ ליצור חור בגולגולת באתר היעד. מקדחה עד להגיע הבסיס דורא. בזהירות לחלץ את העצם שנותר בחור בגולגולת עם מחט 26G.
- באמצעות פיפטה, המגון להתאים את התאים ביסודיות לצייר את 7 μL של השעיית הנוירוספירה לתוך המזרק. כדי להבטיח כי מזרק פועל כראוי, לוותר 1 μL של ההשעיה על 70% משטח ספוג אלכוהול.
- הורידו את המחט למשטח. של משטח הדורא הנמך את המזרק 3.5 מ"מ ולאחר מכן המשך 0.5 מ"מ. זה יהיה ליצור שטח 0.5 מ"מ במוח עבור נוירוספירות להפקיד כאשר הוזרק.
- הניחו את המחט במקומה למשך 2 דקות לצורך הפעלת לחץ. לאט ובצורה חלקה להעביר 1 μL של התאים במהלך 1 דקות. אפשר לתאים להתיישב במשך 6 דקות. הסר את המזרק לאט ובצורה חלקה מהמוח במהלך 2 דקות.
- , בעזרת תמיסת מלח סטרילית. שטוף את פני הגולגולת שלוש פעמים לחלק את התאים העודפים במזרק על 70% כרית אלכוהול, ולנגב את המחט נקי עם עוד כרית 70% אלכוהול. לשטוף את המזרק עם PBS סטרילי כדי למנוע סתימת המחט.
- הסר את הטרקטורים והוצא את העכבר בזהירות ממסגרת הסטריאוטקטיקה. סגור את החתך באמצעות 3-0 תפרים ניילון, מלקחיים, ונהג מחט.
- מנהל (1.0 מ"ג/ק"ג), כ 100 μL עבור עכבר 20 גרם. ניהול בופראוצין (0.1 מ"ג/ק"ג תת עורית) תת-עורי, כ 70 μL עבור העכבר 20 גרם. המקום עכברים שלאחר ניתוח לתוך כלוב שחזור נקי לנטר אותם עד התראה ופעיל.
2. היתוך בעלי חיים ושימור המוח
- כדי לפקח על התקדמות הגידול, לקבוע vivo biלומינסנציה באמצעות מערכת הדמיה vivo עד בעלי חיים להראות סימנים של נטל הגידול. המתת חסד כאשר הם מגיעים לאות בין 106 אל 107 פוטון/s.
- עכברים בהרדמה המציגה סימנים של נטל הגידול עם הזרקה של הצפק (כיתה) הזרקת קטמין (75.0 mg/ק"ג) ו dexmedetomidine (0.5 מ"ג/ק"ג) פתרון. לספק כ 250 μL לעכבר במשקל 20 g. לאחר מכן, ודא שהעכבר אינו מגיב לרפלקס הדוושה.
- באמצעות מלקחיים, להחזיק את העור מעל חלל הצפק, ובאמצעות זוג גדול של מספריים לחיתוך לעשות חתך Y על ידי חדירה לקיר הצפק, נקב את הסרעפת, ואז לחתוך את כלוב הצלעות.
- הכנס צינורית בוטה של 20 גרם. לחדר השמאלי של הלב של העכבר ואז לגזור את הפרוזדור הימני של הלב כדי לאפשר הדימום.
- אפשר הפתרון של Tyrode (0.8% הנאגל, 0.0264% CaCl2, 0.005% נה2PO4, 0.1% גלוקוז, 0.1% נחקו3, 0.02% kcl) לזרום באמצעות מערכת הדם של העכבר עד הכבד והריאות נוקו לחלוטין עקב הסרת דם (~ 5 דקות).
- המשך לשכן את החיה עם 30% הפתרון המומס הומס בתמיסה של טירכבו במשך 15 דקות נוספות. כדי להעריך את הצלחת הפרזיה, לוודא כי הצוואר, הזנב והרגליים הם נוקשה לאחר 30% מחזור הזרימה.
- , באמצעות זוג קטן של מספריים לחיתוך. חותכים את הקרקפת בקו האמצע מתחיל בעצם העורף. ועובד קדימה לכיוון החוטם . זה יחשוף את הגולגולת
- באמצעות זוג rongeurs, לשבור דרך הגולגולת החל עצם העורף ולהמשיך קדימה כדי לחשוף לחלוטין את המשטחים של המוח. ואז לסובב את הצד הראש למעלה ולנתח את העצבים בבסיס המוח כדי לשחרר אותו מהגולגולת.
- הכינו 30% סוכרוז פתרון עם מים חינם rnase ולסנן אותו באמצעות מסנן רשת הניילון מ40 יקרומטר שינוי כדי להפחית את השפלה RNA.
- כדי למקסם את החדירה לפתרון הפתרונות, הניחו את המוח לתוך 30% מתמיסת השאיבה ואחסנו אותם ב -4 ° c בלילה. לפני עיבוד נוסף להבטיח כי המוח מגיע לתחתית הצינורות המכילים את הפתרון הסוכרוז.
3. הקפאה של מוחות מחסה גידולים glioma
- לפני הקפאת המוח, להכין צנצנת ממולא קר איזופנטאן/2-מתילבוטאן ומניחים את הצנצנת לתוך מיכל מלא חנקן נוזלי. תן לממס להתקרר.
- להסיר את המוח מהפתרון 30% סוכרוז ולמחוק אותו להתייבש על נייר סינון.
- לסמן את הקריומיושן עם סמן קבוע. בזהירות, להוסיף כ 5 מ ל של אוקטובר (מתחם הטמפרטורה האופטימלית החיתוך) לתוך המרכז של בועות האוויר הקפאה הימנעות.
- מניחים את המוח לתוך cryomold המכיל את OCT בכיוון הרצוי. למלא את העובש עם OCT עד המוח הוא שקוע לגמרי. באמצעות מלקחיים נקיים, במהירות למקם את הcryomold עם OCT ואת המוח לתוך הקור איזופנטאן/2-מתילבוטאן.
- ברגע OCT מתגבש (~ 30-40 s), להסיר את cryomold עם המוח ולמקם אותו בקרח יבש. אין להשאיר את העובש המכיל את המוח ב 2-מתילבוטאן העבר 2 דקות כמו זה עלול לגרום סדקים ב OCT מוצק. לעטוף את cryomold עם המוח ברדיד אלומיניום ולאחסן אותו ב-80 ° c.
4. הקפאת רקמות גידול במוח קפוא
- תווית 2 יקרומטר מחליק פוליאתילן (עט) עם מידע לדוגמה. מקטעי רקמות ימוקמו ישירות על השקופיות הבאות לאחר ההנחה.
- הגדר את טמפרטורת חדר הקריוסטט בין 20 ל-24 ° c. לפני החסימה, למקם את הבלוק לדוגמה בחדר קריוסטט ולתת לו להאביק את הטמפרטורה בתא עבור 30-60 דקות.
- נקה את תא קריוסטט ואת מחזיק הסכין עם 100% אתנול וריסוס מברשות לשמש עם פתרון RNase ניקוי. עבודה בתוך תא קריוסטט, להסיר את העובש ולצרף את בלוק OCT המכיל את המוח בדיסק דגימה לקריוסטט עם OCT. מקם את הבלוק במחזיק הדיסק ויישר את הבלוק עם להב הסכין.
- להתקין להב חד פעמי לתוך המחזיק.
- מדור המוח בעובי של 10 יקרומטר. ודא שאין פסים או קווי שריטות ברקמה. באמצעות מברשת צבע, בזהירות לשטח ולהתיר את הרקמה על פני השטח חיתוך.
- הר בזהירות את הרקמה המכילה את מקטעי המוח על RNase מגלשות זכוכית חינם לעט. הפוך את שקופיות הזכוכית טעונה חיובי עם האצבעות לכיוון של הרקמה בצורה חלקה ללחוץ על השקופית זכוכית למטה לכיוון מקטע הרקמה.
הערה: טמפרטורת הידיים תעזור להצמיד את הרקמה לזכוכית. - לאחר שהרכבת את מקטעי המוח על השקופיות, השאר את השקופיות בקופסה בתוך תא הקריוסטט ולאחר מכן אחסן אותן ב-80 ° c. לעולם אל תשאיר את. השקופיות בטמפרטורת החדר
הערה: קיפול הרקמה, והקריעה נפוצה. לניתוח אחורי מדויק, חשוב למזער את הפריטים הללו.
5. קיבוע וכתמים של הקפאת רקמות המוח מקטעים
- כדי לשמר את שלמות RNA, נקה את כל המכשירים כדי לשמש עם פתרון ניקוי RNase. המשיכו בקיבוע הפרוטוקול. בתוך מכסה המנוע
- הכינו את פתרונות התיקונים המתוארים בניקוי RNase בחינם 50 mL. להפוך את כל הפתרונות עם RNase מים חינם ביום של ההכתמים.
- באותו יום הניתוח מיקרו לייזר יבוצעו, להכין 100%, 95%, 70% ו 50% הפתרונות אתנול. שמרו את הפתרונות בצינורות סגורים היטב בטמפרטורת החדר.
- הכינו 4% Cresyl סגול ו 0.5% אאוזין Y ב 75% אתנול פתרון. מערבולת הפתרון במרץ עבור 1 דקות ולסנן אותם דרך מסנן ניילון 0.45 יקרומטר כדי לחסל עקבות של אבקה ללא הומס.
- מניחים את שקופיות רקמת לתוך מיכל עם 95% אתנול עבור 30 s. העברת שקופיות לצינור המכיל 75% אתנול; . תשאירו שקופיות לשלושים
- העבר שקופיות ל 50% אתנול ולהשאיר אותם שם עבור 25 s. . בנקודה זו, הטה א יתפרק העבר את השקופית ל 4% הפתרון הסגול Cresyl עבור 20 s, ולאחר מכן העברה ל 0.5% פתרון אאוזין Y עבור 5 s.
- להוציא את השקופית מתוך פתרון הצבע ולמחוק את השקופית יבשה עם נייר סינון. לאחר מכן, מקם את השקופיות ב-50% אתנול עבור 25 s. העבר את השקופיות ל-75% אתנול עבור 25 s. העבר את השקופיות ל95% אתנול עבור 30 s. העבר את השקופיות ל100% אתנול עבור 60 s.
- שטפו את השקופית בעזרת קסילן. להעביר אותם מיכל עם קסילן ולחכות 3 דקות.
- הכנת בינונית הרכבה (למשל, מסטיק לאתר) ב RNase-מים ללא תשלום. כדי לעלות על מקטעי המוח העכבר, לדלל את מדיום ההרכבה במים RNase-חינם ביחס של 1:10.
- יבש את השקופיות על פני שטח של RNase בטמפרטורת החדר במשך 10 ס מ. לפני שהמגרד מתייבש, המשך. לסדר את השקופיות עם חתכי הרקמה
- לפזר בעדינות פתרון הרכבה על גבי הרקמה בשקופית עם מברשת צבע סטרילית ו-RNase-חינם דק. לחכות 10-20 s, ולאחר מכן מיד להעביר את שקופיות הרקמה לפלטפורמת מיקרודיסקציה מיקרוסקופ.
הערה: היחס של בינונית הרכבה ל-RNase-מים חופשיים המשמשים להרכבה משתנה בהתאם לרקמת הריבית. יחס בינוני/מים הרכבה שומרת מורפולוגיה רקמות glioma עבור לייזר לנתיחה מיקרו מבלי להשפיע על שלמות RNA.
6. לכידת לייזר מיקרוניתוח
הערה: לכידת לייזר מיקרוסקופ מיקרודיסקציה צריך להיות מנוצל כדי לייזר באזורים ספציפיים העניין בתוך רקמת הגידול. כדי למזער את הזמן עבור ניתוח מיקרו לייזר רקמות, יש את מיקרוסקופ LMD מוכן לפני קיבוע וכתמים.
- כדי להפעיל את המערכת, הפעל תחילה את רצועת הכוח ולאחריה הפעלת הלייזר. לאחר מכן, הפעל את בקר המיקרוסקופ ואת המחשב. הפעל את תוכנת LMD.
- תחת בקרת מיקרוסקופ, בחר הגדלה של 10x . , תחת שליטה בלייזר. קבע את פרמטרי הלייזר לניתוח רקמות קבעו תדירות לייזר של 120 Hz לקבלת תוצאות החיתוך הטובות ביותר. הגדר תמיד את זרם הלייזר ל-100%.
- לניתוח מיקרו לייזר מדויק, הגדר את המהירות 10 ואת הגדרת הצמצם ב 2.0-10.0 μm.. הגדר את הכוח ל53 לאחר שעוצמת הלייזר בסביבה גבוהה יותר עלולה לגרום לחריטה בזכוכית.
- לטעון את אספן הרקמה כי יהיה ללכוד את הרקמה לאחר הניתוח. לחץ על לחצן הטעינה השני. הסר את אספן ריק ולמקם את DNase/RNase חינם 0.5 mL PCR צינורות הראש המכיל 30 μL של מאגר הליזה לתוך אספן. מקם את האספן בחזרה למחשב ולחץ על המשך בתוכנה כדי להמשיך.
- טען את הדגימה המעובדת (קבועה ומוכתמת) על המיקרוסקופ. תחילה, לחץ על בטל טעינה בתוכנת lmd. לאחר מכן, יש לטעון את המדגם על מחזיק השקופיות ולמקם את מחזיק השקופיות על הבמה. לחץ על המשך בתוכנה כדי להמשיך.
- תחת גזור צורות windows, בחר בצייר + גזור. השתמש בלחצני המיקרוסקופ כדי למצוא את תחום ההתעניינות. ציירו את אזור הריבית (ROI) ובחרו צינור מלקט יעד. ניתן לצייר ROIs מרובים כדי מיקרו לנתח אזורים שונים משקופית אחת בו.
- לחץ על התחל גזור כדי להמשיך ניתוח מיקרו רקמות. לאחר הסרת שטחי הריבית להסיר את צינורות אספן מן המחזיק ולמקם את הצינורות על קרח יבש. להעביר את הדגימות של רקמת RNA שנאספו-80 ° c עבור אחסון לטווח ארוך.
7. רנ א בידוד של רקמת glioma מיקרו
- להפקת RNA מ-LMD להשתמש בערכת בידוד RNA ממוטב עבור דגימות קטנות ותשואה נמוכה RNA (ראה טבלת חומרים). בצע את ההוראות לייצור. ביצוע כל צעדי הבידוד בטמפרטורת החדר (25 ° c). כדי לשמור על איכות ה-RNA, עבוד במהירות. הכן את כל הפתרונות כפי שמצוין על-ידי היצרן.
- כוונן את עוצמת הקול לדוגמה ל-350 μL עם מאגר הוליזיס עם 1% β-mercaptoethanol. וורטקס המדגם עבור 40 s כדי להפחית צמיגות לדוגמה ולהגדיל את ה-RNA משחרלי יעילות עמודה ספין.
- העבר את כולו של המדגם לטור מאלימינייטור gDNA ממוקם בצינור אוסף של 2 מ ל. צנטריפוגה את הצינור עבור 30 s ב 8,000 x g. שמרו את הזרימה והקפידו ששום נוזל לא יישאר בעמודה הבאה צנטריפוגה.
- הוסף 350 μL של 70% אתנול לזרום-דרך ולערבב היטב על ידי ליטוף למעלה ולמטה. להעביר את הדגימה, לטור הספין RNA הממוקם בצינור האוסף 2 mL. סגור את המכסה בעדינות, ואת צנטריפוגה עבור 15 s ב 8,000 x g. מחק את הזרימה ושומר את העמודה.
- הוסף 700 μL של מאגר כביסה של RNA 1 (20% אתנול, 900 mM גילק, 10 מ"מ טריס-HCl pH 7.5) לטור הספין של RNA. סגור את המכסה בעדינות, ואת צנטריפוגה עבור 15 s ב 8,000 x g כדי לשטוף את קרום טור ספין. התעלם מהזרימה.
- לאחר צנטריפוגה, הסר בזהירות את עמודת הספין של ה-RNA מתוך שפופרת האוסף כך שהעמודה אינה מפנה את הזרימה.
- הוסף 500 μL של מאגר כביסה RNA השני (אתנול 80%, המשך 100 מ"מ, טריס-HCl 10 מ"מ pH 7.5) לטור הספין. סגור את המכסה של העמודה ספין 8,000 x g עבור 20 s כדי לשטוף את קרום העמודה. . היפטר מהזרימה
- כדי לשטוף את העמודה הימנעות RNA, להוסיף 500 μL של 80% אתנול, לסגור את המכסה של הטור ואת צנטריפוגה ב 8000 x g עבור 2 דקות. לזרוק את הצינורות עם הפתרון להתחמק.
- השתמש צינור אוסף חדש, לפתוח את המכסה של הטור ספין צנטריפוגה ב 8000 x g עבור 5 דקות כדי לייבש את העמודה. . התעלם מצינור המחיקה
- מניחים את הטור הספין RNA העמודה בצינור חדש 1.5 mL. הוסף 12 μL של מים חינם RNase התחמם ב 37 ° c ישירות למרכז קרום טור ספין. המתן 4 דקות וצנטריפוגה עבור 1 דקות במלוא המהירות לכיוון RNA.
8. בקרת איכות RNA, הכנת הספריה ו-RNA-Seq ניתוח
- בעקבות הפקת רנ א וטיהור, להגביר את RNA וליצור ספריית cDNA באמצעות ערכה מיוחדת המתאימה לבידוד RNA בריכוזים של פיקו-טוחנת לאחר הוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). בצע את הוראות היצרן. תחנת עבודה נקייה כדי למנוע זיהום עם מוצרי PCR אחרים והשפלה נוקלאז של דגימות.
- אם ל-RNA יש ערך RIN גדול מ-4, כלומר ה-RNA הוא באיכות טובה או רק מושפל חלקית, המשך בשלב הפיצול. הכינו את כל הפריטים על הקרח.
- צור תמהיל בסיס כמצוין (טבלה 1). ליצור תערובת התגובה של nuclease-חינם קיר דק 0.2 mL PCR שפופרת. מודאת הצינורות ב 94 מעלות צלזיוס בתוך מכסה חם הציקלונט תרמי. זמן דגירה של פיצול תלוי באיכות של ה-RNA. RIN ≥ 7:4 min, רין 5-6:3 min, RIN 4-5:2 min.
- בעקבות הדגירה, מניחים את הצינורות על מתלה מתקן ה-PCR שהיה מקורר בעבר ב-20 ° c ומניחים לו לשבת 2 דקות.
- עבור כל שפופרת של לדוגמה RNA, להכין הראשון שילוב סינתזה התגובה מאסטר לערבב (שולחן 2). המארת את החצוצרות בתוך מכסה חם המכסה התרמי בתנאים המתוארים בטבלה 3. מוצרי cDNA ניתן להקפיא ב-20 ° צ' עד שבועיים לפני שתמשיך לשלב הבא.
- צור את המיקס הראשי של ה-PCR כפי שמצוין בטבלה 4. מניחים את הצינורות בתוך מכסה חם המכסה התרמי ולהפעיל את תגובת ה-PCR תחת ההגדרות המצוין בטבלה 5.
- אפשר את החרוזים, אשר ישמש כדי לטהר את ה-DNA, כדי לחמם את טמפרטורת החדר. פעם מחומם, להוסיף 40 μL של החרוזים לכל מדגם. מערבולת את הצינורות לערבב ומסתובבים למטה זמן קצר כדי לאסוף נוזל בתחתית הצינור. תן את הצינורות דגירה בטמפרטורת החדר עבור 8 דקות כדי לאפשר את ה-DNA לאגד את החרוזים.
- מניחים את הצינורות על התקן הפרדה מגנטית ולתת לשבת כ 5 דקות, או עד הפתרון הופך ברור לחלוטין. שמירה על הצינורות במתקן ההפרדה, משתמשים בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטאנט בזהירות מבלי להפריע לחרוזים.
- שמירה על הצינורות על התקן ההפרדה, להוסיף 200 μL של טרי עשה 80% אתנול לחרוזים לשטוף מבלי להפריע את החרוזים. לחכות 30 s לפני הסרת 80% אתנול. חזור על שלב זה.
- בקצרה לסובב את הצינורות ולמקם את הצינורות חזרה על התקן ההפרדה. להסיר את כל שרידי 80% אתנול בלי להפריע את החרוזים.
- תן את צינורות האוויר יבש עם כובעים לפתוח 5 דקות. אל תתנו לו לשבת זמן רב ככל שחרוזים יהיו יבשים.
- שמירה על הצינורות על התקן ההפרדה, להוסיף 52 μL של מים חינם של nuclease לכסות את החרוזים. הסירו את הצינורות ממכשיר ההפרדה והפיפטה למעלה ולמטה עד שכל החרוזים מושעים מחדש. מודקון ב 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- מניחים את הצינורות חזרה על התקן ההפרדה עד הפתרון הופך להיות ברור, כ 1 דקות. העברת 50 μL של הסופרנט המתקבל לבארות של רצועה של 8 היטב. הוסף 40 μL של חרוזים חדשים לכל מדגם. . מערבולת ביסודיות לערבב אפשר חרוזים לאגד DNA על ידי הדגירה בטמפרטורת החדר עבור 8 דקות.
- במהלך תקופת הדגירה הזאת, התחילו להפשיר את הרכיבים שישמשו עבור כל הנוכחים בדגימות. . ברגע שהוא הופקר, הניחו אותם על קרח כמו כן, החום מקדם את הציקלאה תרמית עד 72 ° c.
- מניחים את הדגימות על התקן ההפרדה המגנטי עד הפתרון מנקה (כ 5 דקות). מ1.5 μL של בדיקה לכל מדגם לצינור PCR מקורר. הניחו את הצינור בציקלייר התרמי המחומם תחת ההגדרות של 72 ° c עבור 2 דקות ו-4 ° c.
- שמירה על הצינורות לדוגמה במכשיר הפרדה מגנטית, להסיר את supernatant עם בובה מבלי להפריע את החרוזים. ואז להוסיף 200 μL של טרי שנעשו 80% אתנול לחרוזים לשטוף מבלי להפריע את החרוזים. לחכות 30 s לפני הסרת 80% אתנול. חזור על שלב זה.
- בקצרה לסובב את הצינורות ולמקם את הצינורות חזרה על התקן ההפרדה. להסיר את כל שרידי 80% אתנול בלי להפריע את החרוזים. תן את צינורות האוויר יבש עם כובעים פתוחים עבור 2 דקות. אל תתנו לשבת יותר כאשר החרוזים יהיה יבש.
- הכן תמהיל מאסטר לכל הדגימות על-ידי שילוב הרכיבים הבאים לפי סדר הופעתן (טבלה 6).
- מערבבים את מיקס המאסטר על ידי vortexing ולהוסיף 22 μL של תערובת לחרוזים יבשים של כל מדגם ומערבבים ביסודיות כדי להשעות מחדש. תן לזה לעבור. בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות
- מסובבים את הצינורות ומניחים אותם על מתקן ההפרדה המגנטי במשך דקה אחת או עד שהדגימות הופכות לברורים. העברה 20 μL של סופרנטאנט, מבלי להפריע את החרוזים לצינורות ה-PCR החדשים. מניחים את הצינורות בתוך הציקלור תרמית טרום מחומם תחת הגדרות בטבלה 7.
- הכינו שילוב מאסטר של ה-PCR עבור תגובות לכל מדגם. הוסף את הרכיבים הבאים לתמהיל הראשי בטבלההמצוינת 8. הוסף 80 μL של המיקס הראשי של ה-PCR לכל אחד מהצינורות לדוגמה משלב 8.20 והמקום בציקלנר התרמי בהגדרות הבאות (טבלה 9).
- לאפשר חרוזים, אשר ישמש כדי לטהר את ה-DNA, כדי לחמם את טמפרטורת החדר. פעם מחומם, להוסיף 100 μL של החרוזים לכל מדגם. תן את הצינורות דגירה בטמפרטורת החדר עבור 8 דקות כדי לאפשר את ה-DNA לאגד את החרוזים.
- מניחים את הצינורות על התקן הפרדה מגנטית ולתת לשבת כ 5 דקות, או עד הפתרון הופך ברור לחלוטין.
- שמירה על הצינורות במתקן ההפרדה, משתמשים בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטאנט בזהירות מבלי להפריע לחרוזים.
- שמירה על הצינורות על התקן ההפרדה, להוסיף 200 μL של טרי עשה 80% אתנול לחרוזים לשטוף מבלי להפריע את החרוזים. לחכות 30 s לפני הסרת 80% אתנול. חזור על שלב זה.
- בקצרה, לסובב את הצינורות ולמקם את הצינורות חזרה על התקן ההפרדה. להסיר את כל שרידי 80% אתנול בלי להפריע את החרוזים.
- תן את צינורות האוויר יבש עם כובעים לפתוח 5 דקות. אל תתנו לשבת יותר כמו החרוזים יהיה יבש מדי. פיפטה 20 μL של מאגר טריס לתוך הגלולה מיובש. להסיר את הצינור ממכשיר ההפרדה ולערבב היטב עם העוגה כדי להשעות מחדש את החרוזים. תן לזה לעבור. בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות
- הניחו את הצינורות על מתקן ההפרדה במשך 2 דקות, או עד שהפתרון יתבהר. השיגו את הסופרנטאנט. והעבירו אותו לצינורות חדשים לאחר מכן אחסן את הפתרון שנאסף ב-20 ° c.
- בדוק שהספריות הסופיות זקוקות לאיכות ולבקרת כמות. הוצא את הדגימות, המקובצים באשכולות ורצף, כאשר הקריאה משויכת ל-50 nt קוראת, בהתאם לפרוטוקולים המומלצים של היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המעבדה שלנו יצרה מודלים מהונדסים גנטית העכבר (GEMMs) באמצעות מערכת היופי שינה transposase (איור 1א). מערכת זו משלבת שינויים גנטיים ספציפיים לתוך הגנום של תאי קדמון עצביים בעכברים. אלה תאים שהשתנו מחולל בצורת גידולים glioma בצורה אנדוגניים. רצפי פלמיד השתמשו כדי לייצר את הגידולים היו: (1) pT2C-LucPGK-SB100X עבור שינה היופי טרנספסון & לוציפראז ביטוי, (2) pT2-NRASSV12 לביטוי NRAS, (3) pT2-shp53-GFP4 עבור p53 טוק-דאון ו-GFP ביטוי חלבון, ו (4) pT2-שאטוקס- פלמידים הוזרקו לתוך החדר הצדדי של גורי כלבלבים בני יום אחד, כמתואר קודם לכן ב-11. ספיגה פלמיד ואת היווצרות הגידול היה פיקוח דרך במערכת הדמיה vivo biלומינסנציה. ברגע שעכברים נושא הגידול הציגו סימנים של עול הגידול, הם הוקרבו. גידולים שימשו להפקת תרבויות נוירוספירה או השתמרו ישירות לעיבוד LMD (איור 1א).
תרביות תאים החל GEMM שימשו כדי לייצר מודל glioma לתרגום (איור 1B). Glioma מנוירוספירות נגזר גידולים GEMM היו תרבותי מושתל intracranially לתוך הסטריאטום של עכברים המוסמכים החיסונית. תא בודד השעיות שהתקבלו מן התרבות נוירוספירות שימשו כדי ליצור גידולים glioma על ידי השרשה בתוך גולגולתי כמתואר לפני המעבדה שלנו10,11,12. מתודולוגיה זו מאפשרת את הקוונפיקציה זהיר של מספר התאים להיות מושתל לכל עכבר (30,000 תאים/1 μL/עכבר). פרוטוקול זה מתיר את האפשרות לשגות בתוצאות בין מטעי ניסויים שונים. עם זאת, השרשה של נוירוספירות יכול להיות אפשרות חלופית כדי ליצור העכבר גידולים glioma ולאחר מכן LMD ו-RNA ניתוח Seq. עם זאת, שיטה זו נחשבת למדויקת יותר. התקדמות הגידול היה במעקב על ידי במערכת הדמיה vivo ביולומינסנציה ספקטרום. עכברים המציגים סימנים של נטל הגידול היו מבשם והמוח היה משומר על ההקפאה עיבוד LMD (איור 1ג).
מקטעי רקמות היו מיקרוגזור לייזר כדי לאפיין את הטראנסקריפט של מבנים רב-תאיים בתוך gliomas. הליכי perfusion, הקפאה והטבעה תיאר היו ממוטבים לשמר מורפולוגיה רקמות ולקבל באיכות טובה RNA לאחר לייזר לנתיחה. גישות שונות זלוף הוערכו על מנת לרכוש רקמות עם מורפולוגיה מעולה שלמות RNA (שולחן 10). כדי לנתח את תחומי העניין, היה צורך להכתים את הרקמה עם צבעים לא מזיק עבור RNA (איור 2). ראינו כי הנושא השפעה על העכבר עם הפתרון של Tyrode עבור 5 דקות, ולאחר מכן 30% סוכרוז עבור 15 דקות, ואחריו אחסון לילה של המוח בגזור ב 30% סוכרוז שומרת על המבנה ואת שלמות RNA של רקמת הגידול (איור 3ד). Perfusion עם 30% הפתרון סוכרוז מונע היווצרות קריסטל קרח בתוך הרקמה. למרות, קיבוע רקמות פאראפורמלדהיד הביא מורפולוגיה רקמות באיכות גבוהה, שלמות RNA הושפע לרעה (איור 3ב). גישות אחרות כגון הפתרון של Tyrode עבור 5 דקות או הפתרון של Tyrode עבור 5 דקות + 30% סוכות פתרון עבור 15 דקות (איור 3A ו- C) לא השפיעו על איכות RNA. בתנאים אלה לא נשתמרו המוחות ב-30% סוכרוז בן לילה; הבחנו ברזולוציה מופחתת במבנה הרקמה.
ביצעת טכניקות הצביעת שונים ואחריו בקרת איכות שלמות RNA ניתוח. הבחנו כי 4% Cresyl סגול ו 0.5% אאוזין Y כתמים היה מספיק כדי לזהות glioma מבנים רב-תאיים ולשמור על שלמות RNA. קרסיל ויולט הוא צבע מאסיאני שכתמי את גרעין התאים בצבע כחול כהה. אאוזין Y הוא צבע בסיסי הכתמים על רכיבים בסיסיים של התאים.
הבחנו בכך שאם הרקמה לא נטענה במדיום הגובר, החלקים הפכו יבשים ומורפולוגיה התדרדרה (איור 4א). כדי לשמור על איכות גבוהה מורפולוגיה רקמות, אנו רכוב על הרקמה עם הרכבה בינונית. הבחנו כי 15% בינוני גובר מומס במים (30 μL ב 200 μL של מים) מתוחזק באיכות גבוהה מורפולוגיה רקמות (איור 4ב).
באיור 5A, אזורים של glioma טרוגניות מוצגים. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ לכידת לייזר מיקרולידיסקציה לפני הניתוח. קווים אדומים מתארים אזורים עם תאי mesenchymal שופע (תאים מאורכים). קווים כחולים מתארים אזורים ללא תאי mesenchymal (תאים מעוגלים) (איור 5A, התמונה האמצעית). איור 5ב מראה תמונות של אזורי הגידול בלייזר מיקרו-גזור (קווים אדומים) ורגיל רקמת המוח אזורים (קווים כחולים). בחירת ROI מורכבת מנתח תחומי עניין (איור 5A ו- B, תמונות נמוכות). אנו יכולים להתבונן בדימויים אלה בהצלחה בניתוח האזורים הנבחרים.
הוצאת RNA בוצעה באמצעות ערכה מסחרית. היה נחוש כי האזור הכולל של לגזור בין 2.5 x 106 -7 x 106 יקרומטר2 נדרש עבור החילוץ mrna ו cdna הכנה לעריכת רצף RNA הבאים. RNA בקרת איכות קבע רין בין 6 אל 7 ברקמת glioma לאחר לייזר מיקרו. מרין של 6 היה נחוש להיות מתאים להכנה של הספרייה cDNA. בעקבות החילוץ RNA, ערכה עבור בידוד RNA ב ריכוזי picomolar היה מנוצל כדי ליצור ספריית cDNA מתאים רצף הדור הבא.
| 0.25 ng-10 ng (1-8 μL) של RNA |
| 4 μL של מאגר הגדיל הראשון 5x |
| 1 μL של התמהיל האוליגוס V2 |
| Nuclease-מים חינם לנפח הסופי של 13 μL |
שולחן 1: בקרת איכות RNA והכנת הספרייה: מיקס הכנה לשלב 8.3.
| 4.5 μL מיקס V2 |
| מעכבי 0.5 μL RNase |
| 2 μL הפוך טרנסקריפטאז |
| הנפח הסופי של 7 μL |
| הוסף את 7 μL למבחנה לדוגמה RNA |
שולחן 2: בקרת איכות RNA והכנת הספרייה: הכנה לערבב הורים לשלב 8.5.
| 42 ° צ' עבור 90 דקות |
| 70 ° c במשך 10 דקות |
| מחזיק 4 ° c |
שולחן 3: בקרת איכות RNA והכנת הספרייה: תנאי הציקלהטרטרנר לשלב 8.5.
| 2 השכרה-מים חינם |
| מאגר ה-PCR בגובה 25 μL |
| 1 μL DNA פולימראז עבור כל תגובה |
| מערבבים בעדינות ומסתובבים למטה בקצרה |
| הוסף 28 μL של התמהיל הראשי לכל אחד מהצינורות לדוגמה |
| הוסף 1 μL של כל 5 ' ו-3 ' פריימר לכל צינור |
| מערבבים בעדינות את התגובות ומסתובבים בקצרה |
שולחן 4: בקרת איכות RNA והכנת הספרייה: הכנה לערבב הורים לשלב 8.6.
| 1 מחזור |
| 94 ° c עבור 1 דקות |
| 5 מחזורים |
| 98 ° c עבור 15 ס |
| 55 ° c עבור 15 ס |
| 68 ° c עבור 30 ס מ |
| 1 מחזור |
| 68 ° צ' עבור 2 דקות, 4 ° c להחזיק |
שולחן 5: בקרת איכות RNA והכנת הספרייה: תנאי הציקלהתרמיים לשלב 8.6.
| 16.8 μL השכרה-מים ללא תשלום |
| מאגר ה2.2 μL 10x R |
| 1.5 μL R v2 |
| 1.5 μL R-רגשים v2 |
שולחן 6: בקרת איכות RNA והכנת הספרייה: הכנה לערבב הורים לשלב 8.18.
| 37 ° c 60 דקות |
| 72 ° צ' צלזיוס 10 דקות |
| מחזיק 4 ° c |
שולחן 7: בקרת איכות RNA והכנת הספרייה: תנאי הציקלהטרטרנר לשלב 8.20.
| 26 μL השכרה-מים חינם |
| מאגר PCR 50 μL |
| 2 μL PCR2 התחל v2 |
| 2 μL DNA פולימראז |
שולחן 8: בקרת איכות RNA והכנת הספרייה: הכנה לערבב הורים לשלב 8.21.
| 1 מחזור |
| 94 ° c עבור 1 דקות |
| מחזורי X |
| 98 ° c עבור 15 ס |
| 55 ° c עבור 15 ס |
| 68 ° c עבור 30 ס מ |
| 1 מחזור |
| 68 ° צ' עבור 2 דקות, 4 ° c להחזיק |
שולחן 9: בקרת איכות RNA והכנת הספרייה: תנאי הציקלהתרמיים עבור שלב 8.21.
| . צעד ראשון | . צעד 2 | . צעד שלישי | |
| שיטה 1 | טירכבה של 15 ' | -- | -- |
| שיטה 2 | טיירכב 5 ' | סוכרוז 30% 15 ' | -- |
| שיטה 3 | טיירכב 5 ' | 4% כיתה 10 | -- |
| שיטה 4 | טיירכב 5 ' | 30% סוכרוז 15 ' | מוח בתוך 30% סוכרוז לילה |
טבלה 10: שיטות לגישות שונות של פרזיה.
איור 1: העכבר מודלים glioma המשמשים לניתוח מיקרו לייזר. (א) היפהפייההנרדמת gemm משמש לפיתוח דה נובו glioma. תמונות להציג את ההתקדמות הגידול: (i) הזרקה פלמיד לתוך החדר הצדדי של neonates, (ii) הגידול בעול. (ב) הדור של מודל glioma שתילת הטבלה באמצעות תרבויות התאים glioma. התאים הנוירוספירה מתורבתים מ-GEMM מושתלים intracranially לתוך הסטריאטום. (ג) תיאור ההקפאה של המוח המוטבע באוריינטציה הקורלית לאחר הפרזיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ייצוג סכמטי של השיטה המשמשת לכתם מקטעי רקמה שהשתמרו בהקפאה עם קרסיל ויולט ואאוזין. שקופיות המשמשות לצביעת טופלו בכלים שנוקו באמצעות מים ללא RNase. כל הפתרונות הוכנו עם RNase/DNase מים חינם ביום של כתמים. Cresyl כתמי סגול גרעיני ויולט וכתמי אאוזין Y ציטופלסמה ורוד. הצבעים התפרקה ב 70% אתנול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השוואה בין גישות שונות לפרזיה לשימור מורפולוגיה של רקמות ושלמות RNA. תמונות H & E מייצגות מורפולוגיה השוואתית של רקמת המוח שהיתה נתונה לפרזיה בשיטות שונות: (א) הפתרון של טירכבו למשך 15 דקות, (ב) הפתרון של tyrode עבור 5 דקות, 4% בכיוון התכלת עבור 10 דקות, (ג) הפתרון של tyrode עבור 5 דקות, 30% סוכות עבור 15 דקות, ו (ד) הפתרון של tyrode עבור 5 דקות, 30% סוכות עבור 15 דקות עם טבילה לילה ב 30% הערכת האיכות RNA מוצגת עבור כל שיטת זלוף. מגרשים מתארים טוסי אף -18 פסגות rrna ופסגת הסמן הראשוני. היחס של טוסי אף -18 ו-28s rrna משמש כדי לקבוע את איכות ה-RNA. תמונת ג'ל של שברי RNA מוצגת מימין לחלקות. העריכו את איכות ה-RNA באמצעות ערכי RIN. איכות ה-RNA היה גבוה בשיטות A, C, D. המבנה הרקמה היה מעולה בשיטות C ו-D. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מייצגות של רקמת glioma רכוב שאינו רכוב. (א) דמויות מייצגות של רקמה מוכתמת עם H & E. רקמה זו הושאר ללא רכוב והפך מיובש הצגת מורפולוגיה עניים עם הפסקות ברקמה. (ב) דמויות מייצגות של רקמה מוכתמת עם H & E ו רכוב עם הרכבה בינונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תמונות מייצגות של רקמת glioma המשמשים לחיתוך לייזר בלייזר. (א-ב) תמונות מייצגות של רקמה מוכתמת עם H & E ואזורים של מבנים רב-תאיים שנבחרו LMD. (א) בצד שמאל, שטחים של תאים מאורכים (אדום) ואזורי בקרה (כחול) נבחרו עבור lmd. (ב) מימין, שטחי הפלישה הקולקטיבית (אדום) ואזורי הבקרה (כחול) נבחרו עבור lmd. (ג) נציג בקרת איכות RNA לאזורי מיקרו לייזר. שטח כולל של 6.5 x 106 יקרומטר2 היה מיקרוגזור. הניתוח מראה ריכוז RNA של 2,346 pg/μL ו-RNA מספר שלמות (RIN): 6.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבנת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים glioma טרוגניות ופלישה הם בעלי חשיבות קריטית לחשוף מטרות טיפוליות הרומן13. בכתב יד זה, אנו מתארים שיטה מפורטת וממוטבת כדי לנתח את הנוף המולקולרי של glioma טרוגניות ו הפלישה באמצעות מיקרו לכידת לייזר (LMD) ואחריו ניתוח טרנססקריפט.
לכידת לייזר מיקרודיסקציה (LMD) ניתן להשתמש כדי לזהות אזורים שונים או תאים בודדים בתוך הגידול, מתן מדגם ספציפי כדי לנתח עוד את הדפוס המולקולרי שמירה על ההקשר המרחבי של הגידול14. טכניקה זו היא אמינה במחיר נמוך בהשוואה לשיטות אחרות המשמשות לניתוח מרחבי המרחב בגידולים מוצקים15. ניתחנו glioma טרוגניות ופלישה בשנת גנטית מהונדסים העכבר מודלים הגידול או הוהשתלות בתוך גולגולתי מודלים באמצעות LMD. מודלים אלה לכידה המאפיינים הבולטים של gliomas האדם, המאפשר לימוד של gliomas טרוגניות ופלישה10,12.
שמירה על איכות גבוהה רקמות הגידול מורפולוגיה ושלמות RNA היא אחת המגבלות של LMD. כדי לשפר את מורפולוגיה הרקמה, הרכבנו עכברים עם הפתרון של טירכבו למשך 5 דקות, ואחריו 30% סוכרוז מומס באותו פתרון. לאחר המוח היה גזור, שלמנו את זה ב 30% סוכרוז מומס RNase/DNase-מים בחינם לילה או עד המוח הגיע לתחתית המיכל אחסון. שלבים אלה משפרים באופן משמעותי את המבנה של הרקמה ומפחיתה את היווצרות גבישי הקרח ברקמה במהלך שימור ההקפאה. למרות רקמה glioma אנושית לא נעשה שימוש בפרוטוקול זה, דגירה של דגימות אנושיות 30% סוכרוז פתרון לילה יכול להיות מתודולוגיה אפשרית כדי לשפר את המבנה הקריוחלקי. עוד מגבלה אפשרית עבור LMD הוא שימור של שלמות RNA לאחר צביעת8. למרות צוותי מחקר אחרים ביצעו מיקרו לייזר על רקמת glioma ואחריו בניתוח RNA-seq הם לא להמחיש כל RNA ו/או מורפולוגיה ולא להגיב על איכות מורפולוגית, או שולטת במיוחד עבור מקטעים קפואים glioma16. בפרוטוקול זה הזיהוי מורפולוגית מדויק היה חיוני כדי לייזר מיקרונתחים מבנים מאקרוסלולאריים מדויקים בתוך gliomas. הבחנו כי תיקון רקמה glioma עם פתרון אתנול ומכתים אותו עם 4% Cresyl סגול ו 0.5% אאוזין Y התפרקה באיכות RNA מתוחזק אתנול ואיפשר זיהוי מיקרוסקופי של תאים בודדים מבנים רב-תאיים. הדגמנו כי מקטעים glioma הרכבה עם פתרון הרכבה הוא צעד קריטי אשר מונע סדיקה ומבנה הקרע ברקמה. לידיעתכם, המדיום הגובר צריך להיות מוכן במים, כאשר השימוש במדיום ההרכבה התפרקה באתנול יגרום למבנה רקמות עני. ניתוח מיקרו לייזר צריך להתבצע מהר ככל האפשר בסביבה RNase-free. אנו ממליצים גם מקטע של עד 2.5 x 106 יקרומטר2 גידול/רקמה הכולל אזור על מנת להשיג כמויות מתאימות של rna, הן עבור בקרת איכות rna וניתוח הטרנססקריפט.
LMD מאפשר ניתוח של מסלולים איתות מולקולרי המסדירים glioma טרוגניות ופלישה. ניתוח זה יכול לחשוף את היעדים הפוטנציאליים הרומן לאבחון, פרוגנוזה ופיתוח בעתיד במודלים glioma הקדם קלינית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים של הנייר הזה לא מצהירים על ניגודי אינטרסים פוטנציאליים.
Acknowledgments
העבודה נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות, (NIH/NINDS) מענקים: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 ל M.G.C.; (NIH/NINDS) מענקים R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 ל-P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; המחלקה לנוירוכירורגיה, רוגל מרכז הסרטן באוניברסיטת מישיגן, קרן חדלקשוחה, וקרן לבבות שמח של לאה ל M.G.C. ו P.R.L. RNA ביודיקטטין גרנט F046166 M.G.C. המכונים הלאומיים לבריאות, UL1 TR002240 עבור מכון מישיגן לחקר קליני ובריאות (MICHR), פוסט דוקטורט מלומדים התוכנית (PTSP פית) להעניק, פרויקט F049768 לאוניברסיטת מישיגן פורבס מכון לחקר הסרטן, מדען רופא פרס ממחקר כדי למנוע עיוורון, Inc. (RPB), להעניק R01 EY022633 מן ניי של NIH (AK), ומענק בלתי מוגבל מ RPB למחלקה של עיניים ומדעי הראייה. מחקר זה ניצל את הליבה מחקר חזון (P30 EY007003), ואת מרכז הסרטן מחקר ליבה (P30 CA046592). ה-AK תומך בפרס המלומד של גב' ויליאם דוידסון ממכון המחקר הרפואי א. אלפרד טאובמן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin - Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
References
- Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Rabien, A., Kristiansen, G. Tissue Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).
- Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).
- Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection. Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).
- Núñez, F. J., et al. IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response. Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Brat, D. J., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing. Science. 358 (6359), 64-69 (2017).
- Gagner, J. P., Zagzag, D. Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).
