Microdisección de captura láser de las subregiones de Glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión
Summary
La microdisección láser (LMD) es una técnica sensible y altamente reproducible que se puede utilizar para descubrir vías que median la heterogeneidad e invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar áreas discretas del tejido glioma usando LMD láser seguido de análisis transcriptomático.
Abstract
Los gliomas son tumores cerebrales primarios caracterizados por su invasividad y heterogeneidad. Patrones histológicos específicos como pseudopalisades, proliferación microvascular, transformación mesenquimal y necrosis caracterizan la heterogeneidad histológica de los gliomas de alto grado. Nuestro laboratorio ha demostrado que la presencia de altas densidades de células mesenquimales, llamadas oncostreams, se correlacionan con la neoplasia tumoral. Hemos desarrollado un enfoque único para entender los mecanismos que subyacen al crecimiento y la invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo integral que utiliza microdisección de captura láser (LMD) y secuenciación de ARN para analizar la expresión diferencial de ARNm de estructuras multicelulares heterogéneas intratumorales (es decir, áreas mesenquimales o áreas de invasión tumoral). Este método mantiene una buena histología tisular y la integridad del ARN. La perfusión, la congelación, la incrustación, la seccionamiento y la tinción se optimizaron para preservar la morfología y obtener muestras de microdisección láser de alta calidad. Los resultados indican que la perfusión de ratones portadores de glioma utilizando 30% de sacarosa proporciona una buena morfología y calidad de ARN. Además, la tinción de secciones tumorales con un 4% de cresyl violeta y 0,5% de eosina da como resultado una buena tinción nuclear y celular, preservando al mismo tiempo la integridad del ARN. El método descrito es sensible y altamente reproducible y se puede utilizar para estudiar la morfología tumoral en varios modelos tumorales. En resumen, describimos un método completo para realizar LMD que preserva la morfología y la calidad del ARN para la secuenciación para estudiar las características moleculares de las estructuras multicelulares heterogéneas dentro de tumores sólidos.
Introduction
Los gliomas son los tumores primarios más agresivos del sistema nervioso central. Son altamente invasivos y heterogéneos1. El análisis de los componentes celulares y moleculares del tumor revelará nuevas dianas terapéuticas.
Entre los diferentes métodos disponibles actualmente, la microdisección de captura láser (LMD) del tejido tumoral cerebral congelado es una técnica rentable y fiable que permite el aislamiento de áreas anatómicas discretas o poblaciones celulares específicas de los tejidos tumorales para estudiar su perfil molecular2,,3. LMD permite el análisis de perfiles de expresión génica mRNA de células individuales seleccionadas o estructuras multicelulares4,5. LmD se puede utilizar para obtener un conocimiento mecánico en profundidad sobre los eventos moleculares que tienen lugar durante la progresión del tumor. La mejora en el procesamiento de los tejidos tumorales es necesaria para obtener una resolución óptica óptima de la morfología tisular y la calidad del ARN6. Aunque la fijación de paraformaldehído es la mejor opción para el análisis morfológico, la calidad del ARN se ve afectada y degradada en estas condiciones, lo que resulta en una mala calidad del ARN para el análisis de ARN-seq. El uso de secciones de tejido congelado evita la formación de cristales de hielo, que podrían romper las membranas celulares y producir agujeros dentro de las células, y sigue siendo la mejor opción para el análisis de ARN-Seq7.
Aquí, describimos un método optimizado de fijación y tinción de sección para procesar tejidos tumorales cerebrales de ratón congelados para LMD. Para evitar que se formen cristales de hielo en el tejido, perfundimos ratones con una solución de 30% de sacarosa. Esta solución interrumpe las interacciones entre las moléculas de agua polar y evita la formación de cristales de hielo, preservando la morfología del tejido. La tinción de tejido es necesaria para diferenciar y obtener población específica de células o áreas anatómicamente distintas dentro del tumor. Es esencial fijar y manchar el tejido con colorantes inocuos para mantener la integridad del ARN. Se ha demostrado previamente que la tinción de tejido con hematoxilina/eosina (H&E) deteriora la integridad del ARN8. Fijamos y tiñimos el tejido de interés con etanol, Cresyl violeta 4% y eosina Y 0.5% soluciones. Cresyl violeta es un tinte acidofílico que tiñe el núcleo celular con un color azul oscuro. EosinY es un tinte basófilo que tiñe los componentes básicos de las células, proporcionando una distinción entre el citoplasma y otras estructuras celulares8. Ambos tintes son solubles en etanol y no deterioran la calidad del ARN. Para evitar daños tisulares y mantener una alta resolución óptica de las estructuras celulares, montamos las secciones de tejido antes de LMD9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprender los mecanismos moleculares subyacentes a la heterogeneidad e invasión del glioma es de vital importancia para descubrir nuevas dianas terapéuticas13. En este manuscrito, describimos un método detallado y optimizado para analizar el paisaje molecular de la heterogeneidad e invasión del glioma utilizando microdisección de captura láser (LMD) seguida de análisis transcriptomico.
La microdisección de captura láser (LMD) se puede utilizar para identificar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, (NIH/NINDS) Subvenciones: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 a M.G.C.; (NIH/NINDS) Subvenciones R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 a P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; el Departamento de Neurocirugía, Rogel Cancer Center en la Universidad de Michigan, ChadTough Foundation, y Leah’s Happy Hearts Foundation to M.G.C. and P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 to M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) Proyecto F049768 a A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, un Premio Médico-Científico de Investigación para Prevenir la Ceguera, Inc. (RPB), otorga R01 EY022633 de la NEI del NIH (AK), y una subvención sin restricciones de RPB al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales. Esta investigación utilizó el Núcleo de Investigación de la Visión (P30 EY007003), y el Núcleo de Investigación del Centro de Cáncer (P30 CA046592). AK cuenta con el apoyo del Premio De Académico Emergente Mrs. William Davidson del Instituto de Investigación Médica A. Alfred Taubman.
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin – Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
References
- Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas – implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Rabien, A., Kristiansen, G. Tissue Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).
- Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).
- Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection. Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).
- Núñez, F. J., et al. IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response. Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Brat, D. J., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing. Science. 358 (6359), 64-69 (2017).
- Gagner, J. P., Zagzag, D. Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).
