Summary

Microdisección de captura láser de las subregiones de Glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión

Published: April 12, 2020
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Summary

La microdisección láser (LMD) es una técnica sensible y altamente reproducible que se puede utilizar para descubrir vías que median la heterogeneidad e invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar áreas discretas del tejido glioma usando LMD láser seguido de análisis transcriptomático.

Abstract

Los gliomas son tumores cerebrales primarios caracterizados por su invasividad y heterogeneidad. Patrones histológicos específicos como pseudopalisades, proliferación microvascular, transformación mesenquimal y necrosis caracterizan la heterogeneidad histológica de los gliomas de alto grado. Nuestro laboratorio ha demostrado que la presencia de altas densidades de células mesenquimales, llamadas oncostreams, se correlacionan con la neoplasia tumoral. Hemos desarrollado un enfoque único para entender los mecanismos que subyacen al crecimiento y la invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo integral que utiliza microdisección de captura láser (LMD) y secuenciación de ARN para analizar la expresión diferencial de ARNm de estructuras multicelulares heterogéneas intratumorales (es decir, áreas mesenquimales o áreas de invasión tumoral). Este método mantiene una buena histología tisular y la integridad del ARN. La perfusión, la congelación, la incrustación, la seccionamiento y la tinción se optimizaron para preservar la morfología y obtener muestras de microdisección láser de alta calidad. Los resultados indican que la perfusión de ratones portadores de glioma utilizando 30% de sacarosa proporciona una buena morfología y calidad de ARN. Además, la tinción de secciones tumorales con un 4% de cresyl violeta y 0,5% de eosina da como resultado una buena tinción nuclear y celular, preservando al mismo tiempo la integridad del ARN. El método descrito es sensible y altamente reproducible y se puede utilizar para estudiar la morfología tumoral en varios modelos tumorales. En resumen, describimos un método completo para realizar LMD que preserva la morfología y la calidad del ARN para la secuenciación para estudiar las características moleculares de las estructuras multicelulares heterogéneas dentro de tumores sólidos.

Introduction

Los gliomas son los tumores primarios más agresivos del sistema nervioso central. Son altamente invasivos y heterogéneos1. El análisis de los componentes celulares y moleculares del tumor revelará nuevas dianas terapéuticas.

Entre los diferentes métodos disponibles actualmente, la microdisección de captura láser (LMD) del tejido tumoral cerebral congelado es una técnica rentable y fiable que permite el aislamiento de áreas anatómicas discretas o poblaciones celulares específicas de los tejidos tumorales para estudiar su perfil molecular2,,3. LMD permite el análisis de perfiles de expresión génica mRNA de células individuales seleccionadas o estructuras multicelulares4,5. LmD se puede utilizar para obtener un conocimiento mecánico en profundidad sobre los eventos moleculares que tienen lugar durante la progresión del tumor. La mejora en el procesamiento de los tejidos tumorales es necesaria para obtener una resolución óptica óptima de la morfología tisular y la calidad del ARN6. Aunque la fijación de paraformaldehído es la mejor opción para el análisis morfológico, la calidad del ARN se ve afectada y degradada en estas condiciones, lo que resulta en una mala calidad del ARN para el análisis de ARN-seq. El uso de secciones de tejido congelado evita la formación de cristales de hielo, que podrían romper las membranas celulares y producir agujeros dentro de las células, y sigue siendo la mejor opción para el análisis de ARN-Seq7.

Aquí, describimos un método optimizado de fijación y tinción de sección para procesar tejidos tumorales cerebrales de ratón congelados para LMD. Para evitar que se formen cristales de hielo en el tejido, perfundimos ratones con una solución de 30% de sacarosa. Esta solución interrumpe las interacciones entre las moléculas de agua polar y evita la formación de cristales de hielo, preservando la morfología del tejido. La tinción de tejido es necesaria para diferenciar y obtener población específica de células o áreas anatómicamente distintas dentro del tumor. Es esencial fijar y manchar el tejido con colorantes inocuos para mantener la integridad del ARN. Se ha demostrado previamente que la tinción de tejido con hematoxilina/eosina (H&E) deteriora la integridad del ARN8. Fijamos y tiñimos el tejido de interés con etanol, Cresyl violeta 4% y eosina Y 0.5% soluciones. Cresyl violeta es un tinte acidofílico que tiñe el núcleo celular con un color azul oscuro. EosinY es un tinte basófilo que tiñe los componentes básicos de las células, proporcionando una distinción entre el citoplasma y otras estructuras celulares8. Ambos tintes son solubles en etanol y no deterioran la calidad del ARN. Para evitar daños tisulares y mantener una alta resolución óptica de las estructuras celulares, montamos las secciones de tejido antes de LMD9.

Protocol

Todos los métodos descritos aquí que utilizan animales experimentales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Michigan. NOTA: Las neuroesferas de Glioma generadas a partir de un GEMM o líneas estables se pueden utilizar para el injerto de tumor intracraneal en ratones10 y procesarse para la secuenciación de LMD y ARN. Estas células expresan constitutivamente la luciferasa de la luciérnaga y las prot…

Representative Results

Nuestro laboratorio ha generado modelos de ratón genéticamente diseñados (GEMM) utilizando el sistema de transposasa de belleza durmiente(Figura 1A). Este sistema incorpora alteraciones genéticas específicas en el genoma de las células progenitoras neuronales en ratones neonatales. Estas células progenitoras alteradas forman tumores glioma endógenos. Las secuencias de plásmidos utilizadas para generar los tumores fueron: (1) pT2C-Luc…

Discussion

Comprender los mecanismos moleculares subyacentes a la heterogeneidad e invasión del glioma es de vital importancia para descubrir nuevas dianas terapéuticas13. En este manuscrito, describimos un método detallado y optimizado para analizar el paisaje molecular de la heterogeneidad e invasión del glioma utilizando microdisección de captura láser (LMD) seguida de análisis transcriptomico.

La microdisección de captura láser (LMD) se puede utilizar para identificar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, (NIH/NINDS) Subvenciones: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 a M.G.C.; (NIH/NINDS) Subvenciones R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 a P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; el Departamento de Neurocirugía, Rogel Cancer Center en la Universidad de Michigan, ChadTough Foundation, y Leah’s Happy Hearts Foundation to M.G.C. and P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 to M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) Proyecto F049768 a A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, un Premio Médico-Científico de Investigación para Prevenir la Ceguera, Inc. (RPB), otorga R01 EY022633 de la NEI del NIH (AK), y una subvención sin restricciones de RPB al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales. Esta investigación utilizó el Núcleo de Investigación de la Visión (P30 EY007003), y el Núcleo de Investigación del Centro de Cáncer (P30 CA046592). AK cuenta con el apoyo del Premio De Académico Emergente Mrs. William Davidson del Instituto de Investigación Médica A. Alfred Taubman.

Materials

Accutase Cell Detachment Solution Biolegend 423201
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240062
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
Buffer RLT Qiagen 79216
Corning PCR Tubes Sigma Aldrich CLS6530
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 Gibco 11330057
Eosin Y Sigma Aldrich E4009
HiSeq 4000 Illumina N/A
Laser Microdissection (LMD) System Leica LMD7000
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
Normocin – Antimicrobial Reagent Invivogen ant-nr-1
Peel Away Disposable Embedding Molds Electron Microscopy Sciences 70182
PEN Membrane Glass Slide (2 µm) Lieca 1150518
Pinpoint Solution Zymo Research D3001-1
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B-1MG
Research Cryostat Leica CM3050s
RNaseZap RNase Decontamination Solution Fisher Scientific AM9780
RNeasy Plus Micro Kit Qiagen 74034
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian Takara Bio 634411
Tissue-Plus O.C.T. Compound Fisher Scientific 23-730-571

References

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Comba, A., Dunn, P. J., Kish, P. E., Kadiyala, P., Kahana, A., Castro, M. G., Lowenstein, P. R. Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion. J. Vis. Exp. (158), e60939, doi:10.3791/60939 (2020).

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