Summary
La microdissection laser (LMD) est une technique sensible et hautement reproductible qui peut être utilisée pour découvrir des voies qui médité glioma hétérogénéité et invasion. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour isoler les zones discrètes du tissu de gliome utilisant le LMD laser suivi de l’analyse transcriptomique.
Abstract
Les gliomes sont des tumeurs cérébrales primaires caractérisées par leur invasivité et leur hétérogénéité. Des modèles histologiques spécifiques tels que les pseudopalisades, la prolifération microvasculaire, la transformation mésenchymale et la nécrose caractérisent l’hétérogénéité histologique des gliomes de haute qualité. Notre laboratoire a démontré que la présence de densités élevées de cellules mésenchymales, nommées oncostreams, corrèlent avec la malignité de tumeur. Nous avons développé une approche unique pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent la croissance et l’invasion du gliome. Ici, nous décrivons un protocole complet qui utilise la microdissection de capture de laser (LMD) et le séquençage d’ARN pour analyser l’expression différentiele d’ARNm des structures multicellulaires intra-tumorales (c.-à-d. les secteurs mésenchymal ou les secteurs de l’invasion de tumeur). Cette méthode maintient une bonne histologie tissulaire et l’intégrité de l’ARN. La perfusion, la congélation, l’intégration, la section et la coloration ont été optimisées pour préserver la morphologie et obtenir des échantillons de microdissection laser de haute qualité. Les résultats indiquent que la perfusion de souris porteuses de gliome utilisant 30% de saccharose fournit une bonne morphologie et la qualité d’ARN. En outre, les sections de tumeur de coloration avec 4% de violette de Cresyl et 0.5% d’éosine a comme conséquence la bonne coloration nucléaire et cellulaire, tout en préservant l’intégrité d’ARN. La méthode décrite est sensible et hautement reproductible et elle peut être employée pour étudier la morphologie de tumeur dans divers modèles de tumeur. En résumé, nous décrivons une méthode complète pour effectuer LMD qui préserve la morphologie et la qualité d’ARN pour le séquençage pour étudier les dispositifs moléculaires des structures multicellulaires hétérogènes dans les tumeurs solides.
Introduction
Les gliomes sont les tumeurs primaires les plus agressives du système nerveux central. Ils sont très envahissants et hétérogènes1. L’analyse des composants cellulaires et moléculaires de la tumeur révélera de nouvelles cibles thérapeutiques.
Parmi les différentes méthodes actuellement disponibles, la microdissection de capture laser (LMD) du tissu tumoral congelé est une technique rentable et fiable qui permet l’isolement des zones anatomiques discrètes ou des populations cellulaires spécifiques des tissus tumoraux pour étudier leur profil moléculaire2,3. LMD permet l’analyse des profils d’expression des gènes de l’ARNm de certaines cellules individuelles ou structures multicellulaires4,5. LMD peut être utilisé pour acquérir des connaissances mécanistes approfondies sur les événements moléculaires qui ont lieu pendant la progression tumorale. Amélioration dans le traitement des tissus tumoraux est nécessaire pour obtenir une résolution optique optimale de la morphologie tissulaire et de la qualité de l’ARN6. Bien que la fixation du paraformaldéhyde soit la meilleure option pour l’analyse morphologique, la qualité de l’ARN est affectée et dégradée dans ces conditions, ce qui entraîne une mauvaise qualité d’ARN pour l’analyse ARN-seq. L’utilisation de sections de tissu congelé évite la formation de cristaux de glace, qui pourrait briser les membranes cellulaires et produire des trous dans les cellules, et reste la meilleure option pour l’analyse ARN-Seq7.
Ici, nous décrivons une méthode optimisée de fixation et de coloration de section pour traiter les tissus congelés de tumeur de cerveau de souris pour LMD. Pour empêcher la formation de cristaux de glace dans le tissu, nous avons perfusé les souris avec une solution de saccharose de 30%. Cette solution perturbe les interactions entre les molécules d’eau polaire et empêche la formation de cristaux de glace, préservant la morphologie tissulaire. La coloration des tissus est nécessaire pour différencier et obtenir une population spécifique de cellules ou des zones anatomiquement distinctes dans la tumeur. Il est essentiel de fixer et de tacher le tissu avec des colorants inoffensifs pour maintenir l’intégrité de l’ARN. Il a été précédemment montré que le tissu de coloration avec l’hématoxyline/eosine (H et E) détériore l’intégrité de l’ARN8. Nous avons fixé et taché le tissu d’intérêt avec l’éthanol, Cresyl violet 4% et eosin Y 0.5% solutions. La violette de cresyl est un colorant acidophile qui tache le noyau cellulaire avec une couleur bleu foncé. Eosin Y est un colorant basophile qui tache les composants de base des cellules, offrant une distinction entre le cytoplasme et d’autres structures cellulaires8. Les deux colorants sont solubles dans l’éthanol et ne détériorent pas la qualité de l’ARN. Pour éviter les lésions tissulaires et maintenir une haute résolution optique des structures cellulaires, nous avons monté les sections tissulaires avant LMD9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les méthodes décrites ici qui utilisent des animaux expérimentaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Michigan.
REMARQUE : Les néurosphères de Glioma générées à partir d’un GEMM ou de lignes stables peuvent être employées pour l’engraftment intracrânien de tumeur chez les souris10 et traitées pour le séquençage de LMD et d’ARN. Ces cellules expriment constitutivement la luciferase de luciole et les protéines de GFP, qui seront davantage employées pour l’analyse et la localisation de croissance de tumeur.
1. Génération de modèle intracrânienne de gliome de souris à partir de neurosphères dérivées de modèles de gliome génétiquement modifiés
- Pour générer une culture primaire des cellules de neurosphère à partir d’un modèle de souris génétiquement modifiée (GEMM), utilisez le protocole décrit précédemment10,11.
- Préparer le milieu de culture de la neurosphère tel que décrit : 500 ml de F-12 modifié d’aigle de Dulbecco (DMEM/F12) complétés par 10 ml de 50x B-27 et 5 ml de suppléments de culture neuronale N-2 de 100x N-2, 5 ml de 100x antibiotiques-anticomytiques, et 1 mL de Normocin. Avant de placage des neurosphères, ajoutez 20 ng/mL humain recombinant EGF et FGF au milieu de la culture.
- Neurosphères de gliome de culture dans un incubateur de culture de tissu à 37 oC et 5% de CO2 pendant 2-3 jours avant l’engraftment de tumeur intracrânienne.
- Le jour de la chirurgie, recueillir les neurosphères de gliome et les faire tourner à 550 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Retirez soigneusement le supernatant sans déranger la boulette de cellule.
- Pour dissocier les néurosphères, réutilisez la pastille cellulaire dans 1 ml de solution de décollement cellulaire et incuber à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 2-4 min. Après la période d’incubation, pipette les neurosphères de haut en bas avec une micropipette de 1 mL pour assurer une suspension à cellule unique.
- Inactivez la solution de détachement cellulaire en diluant la suspension de la neurosphère avec 10 ml de support DMEM/F12 non complété. Tourner les neurosphères à 550 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Soigneusement, retirez le supernatant.
- Réutilisez la pastille de cellules dans 100 L de DMEM/F12 média sans suppléments. Faire une dilution de 1:50 de la suspension cellulaire, puis ajouter 50 L de Trypan Blue pour compter les cellules viables. Utilisez la formule suivante pour déterminer la concentration des cellules :
cellules/mL [((cellules comptées par carré) / - de carrés comptés) x 50 x 10 000 cellules/mL] - Après avoir déterminé le nombre de cellules, pour atteindre une concentration cible de 30.000 cellules/ 'L en volume de 100 'L, faire tourner les neurosphères vers le bas et les ressaisissons dans le volume approprié de DMEM/F12 ne contenant aucun supplément.
- Placer les neurosphères dans un tube préétiqueté de 0,6 mL sur la glace.
- Préparer les solutions de travail de l’anesthésie, de l’analgésique, et l’inversion de l’anesthésie avant l’implantation : Pour l’anesthésie de kétamine/dexmedetomidine, ajoutez 0,6 mL d’hydrochlorure de kétamine de 100 mg/mL et 0,8 mL de 0,5 mg/mL d’hydrochlorure de dexmedetomidine à 8,6 mL stériles de 0,9% de NaCl contenant de la vial. Pour l’analgésique buprénorphine, ajouter 1 ml de buprénorphine de 0,3 mg/mL à 9 ml de 0,9% de NaCl contenant de la fiole. Pour l’inversion de l’anesthésie atipamezole, ajouter 1 ml d’atipamezole de 5 mg/mL à 9 ml de 0,9% de NaCl contenant de la fiole.
- Utilisez des souris femelles C57BL/6J de 6-8 semaines pour l’engraftment intracrânienne de tumeur.
- Dans une salle approuvée pour la chirurgie de survie de rongeur, installez des approvisionnements stériles pour l’engraftment intracrânienne de tumeur. Effectuez des chirurgies sur un cadre stéréotaxique de rongeur équipé d’une seringue Hamilton stérilisée de 10 L avec une aiguille amovible 33G. Utilisez un stérilisateur perlé pour stériliser les outils entre les chirurgies.
- Anesthésiez les souris avec une seule injection intraperitonéale (i.p.) de la solution anesthésique préparée à l’étape 1.11 (kétamine:75.0 mg/kg et dexmedetomidine:0.5 mg/kg). Environ, un volume de 250 l de la solution anesthésique sera livré à une souris pesant 20 g. Assurez-vous que la souris ne répond pas au réflexe de pédale avant de procéder.
- Une fois que la souris est dans un état profondément anesthésié, appliquer le lubrifiant ophtalmique trétalile petrolatum aux yeux pour empêcher le séchage. Rasez la fourrure sur le crâne de souris. Appliquer 10% de solution topique povidone-iode à la zone rasée afin de désinfecter.
- Fixez le crâne de la souris dans un cadre stéréotaxique. Tout d’abord, ouvrez soigneusement la bouche avec des forceps et tirez doucement la langue et déplacez-la d’un côté de la bouche pour éviter l’étouffement. Gardez la bouche ouverte avec les forceps et placez les incisives supérieures dans le trou de la serrure de la barre dent sur le cadre stéréotaxique.
- Tenant la tête de la souris par les oreilles, placez les barres d’oreille contre les os postorbitaux et fixez-les. Assurez-vous que le crâne de la souris est au niveau de la table chirurgicale. Fixez soigneusement les barres d’oreille sans appliquer de pression contre le crâne. Ensuite, fixer soigneusement la barre de nez.
- À l’aide d’une lame de scalpel de taille 15, faites une incision le long de la tête de la souris, exposant le crâne. Rétractez la peau sur le site d’incision à l’aide de rétracteurs Colibri. Utilisez un applicateur stérile pour enlever tout tissu pericranial.
- Identifiez la bregma et abaissez l’aiguille de la seringue Hamilton directement au-dessus. À l’aide du cadre, placez l’aiguille 1 mm antérieure de la bregma et 1,5 mm latérale. À l’aide d’une aiguille 26G, marquez cet endroit en marquant le crâne.
- Utilisez une perceuse d’alimentation sans fil équipée d’un perceuse de 0,45 mm pour créer un trou de bavures sur le site cible. Forez jusqu’à atteindre le dura mater sous-jacent. Extraire soigneusement le reste de l’os dans le trou de bavure avec une aiguille de 26G.
- À l’aide d’une pipette, homogénéiser les cellules à fond et établir 7 L de la suspension de la neurosphère dans la seringue. Pour s’assurer que la seringue fonctionne correctement, distribuez 1 lL de la suspension sur un tampon imbibé d’alcool de 70 %.
- Abaissez l’aiguille à la surface du mater dura. Baisser la seringue de 3,5 mm ventral et retirer 0,5 mm. Cela créera un espace de 0,5 mm dans le cerveau pour que les neurosphères se déposent lorsqu’elles sont injectées.
- Laisser l’aiguille en place pendant 2 min pour l’équilibre de pression. Lentement et en douceur livrer 1 l des cellules au cours de 1 min. Laisser les cellules se déposer pendant 6 min. Enlever la seringue lentement et en douceur du cerveau au cours de 2 min.
- À l’aide d’une solution saline stérile, lavez la surface du crâne trois fois. Distribuer l’excès de cellules dans la seringue sur un tampon d’alcool de 70% et essuyer l’aiguille propre avec un autre tampon d’alcool de 70%. Rincer la seringue à l’adresse stérile PBS pour éviter le colmatage de l’aiguille.
- Retirez les rétracteurs et sortez soigneusement la souris du cadre stéréotaxique. Fermez l’incision à l’aide de sutures en nylon 3-0, de forceps et d’un conducteur d’aiguille.
- Administrer l’atipamezole (1,0 mg/kg), environ 100 ll pour une souris de 20 g. Administrer la buprénorphine (0,1 mg/kg sous-cutanée) sous-cutanée, soit environ 70 ll pour une souris de 20 g. Placez les souris post-chirurgicales dans une cage de récupération propre et surveillez-les jusqu’à ce qu’elles soient alertes et actives.
2. Perfusion animale et préservation du cerveau
- Pour surveiller la progression tumorale, déterminer la bioluminescence in vivo à l’aide d’un système d’imagerie in vivo jusqu’à ce que les animaux montrent des signes de charge tumorale. Euthanasiez les souris lorsqu’elles atteignent un signal entre10 6 et10 7 photon/s.
- Anesthésiez les souris affichant des signes de charge tumorale avec l’injection intraperitoneal (i.p.) de la kétamine (75.0mg/kg) et de dexmedetomidine (0.5 mg/kg) solution. Livrer environ 250 l à une souris pesant 20 g. Ensuite, assurez-vous que la souris en insensible au réflexe de pédale.
- À l’aide de forceps, maintenez la peau au-dessus de la cavité péritonéale, et à l’aide d’une grande paire de ciseaux de dissection font une incision « Y » en pénétrant la paroi péritonéale, perforez le diaphragme, puis coupez la cage thoracique.
- Insérez une canule émoussée de 20G dans le ventricule gauche du cœur de la souris. Puis couper l’oreillette droite du cœur pour permettre l’exsanguination.
- Autoriser la solution de Tyrode oxygénée (0,8% NaCl, 0.0264% CaCl2, 0.005% NaH2PO4, 0.1% glucose, 0.1% NaHCO3, 0.02% KCl) pour couler à travers le système circulatoire de souris jusqu’à ce que le foie et les poumons ont effacé complètement en raison de l’enlèvement du sang (min 5'
- Continuer à perfuser l’animal avec 30% de solution de saccharose dissous dans la solution de Tyrode pour un supplément de 15 minutes. Pour évaluer le succès de la perfusion, confirmer que le cou, la queue et les jambes sont rigides après 30% de circulation de saccharose.
- À l’aide d’une petite paire de ciseaux de dissection, couper le cuir chevelu à la ligne médiane. Commencer à l’os occipital et travailler vers l’avant vers le museau. Cela exposera le crâne.
- À l’aide d’une paire de rongeurs, percer le crâne à partir de l’os occipital et continuer vers l’avant pour exposer totalement les surfaces du cerveau. Tournez ensuite le côté de la tête vers le haut et disséquez les nerfs à la base du cerveau pour le libérer du crâne.
- Préparer la solution saccharose à 30 % avec de l’eau libre RNase et filtrer à travers un filtre en maille de nylon de 40 m pour réduire la dégradation de l’ARN.
- Pour maximiser l’infiltration de solution de saccharose, placez les cerveaux disséqués dans la solution de saccharose de 30 % et entreposez-les à 4 oC pendant la nuit. Avant de traiter davantage, assurez-vous que le cerveau atteint le fond des tubes contenant la solution de saccharose.
3. Cryopreservation des cerveaux hébergeant des tumeurs de gliome
- Avant de cryoconserver le cerveau, préparer un pot rempli d’isopentane froid/2-méthylbutane et placer le bocal dans un récipient rempli d’azote liquide. Laissez le solvant refroidir.
- Retirez le cerveau de la solution de saccharose de 30 % et épongez-le à sécher sur un papier filtre.
- Étiquetez le cryomold avec un marqueur permanent. Soigneusement, ajouter environ 5 ml d’OCT (composé optimal de température de coupe) dans le centre de la cryomold évitant les bulles d’air.
- Placez le cerveau dans le cryomold contenant l’OCT dans l’orientation désirée. Remplissez le moule d’OCT jusqu’à ce que le cerveau soit complètement submergé. À l’aide de forceps propres, placez rapidement le cryomold avec l’OCT et le cerveau dans l’isopentane froid/2-méthylbutane.
- Une fois que l’OCT se solidifie (30-40 s), retirez le cryomold avec le cerveau et placez-le dans de la glace sèche. Ne laissez pas le moule contenant le cerveau dans 2-méthylbutane passé 2 min car cela peut causer des fissures dans l’OCT solide. Envelopper le cryomold avec le cerveau dans du papier d’aluminium et le stocker à -80 oC.
4. Section des tissus de tumeurs cérébrales congelés
- L’étiquette 2 m de naphtalate de polyéthylène (PEN) glisse avec les informations de l’échantillon. Les sections tissulaires seront placées directement sur ces diapositives après la section.
- Fixez la température de la chambre cryostat entre -20 et -24 oC. Avant de sectionner, placez le bloc d’échantillon dans la chambre cryostat et laissez-le équilibrer à la température dans la chambre pendant 30-60 min.
- Nettoyez la chambre cryostat et le porte-couteau avec 100% d’éthanol et vaporisez les brosses à utiliser avec la solution de nettoyage RNase. Travailler à l’intérieur de la chambre cryostat, enlever le moule et attacher le bloc OCT contenant le cerveau au disque de spécimen cryostat avec OCT. Placez le bloc dans le support du disque et alignez le bloc avec la lame du couteau.
- Installer une lame jetable dans le support de sectionnement.
- Section du cerveau à 10 m d’épaisseur. Assurez-vous qu’il n’y a pas de stries ou de lignes de rayures dans le tissu. À l’aide d’un pinceau, aplatissez prudemment et décurlez le tissu sur la surface de coupe.
- Montez soigneusement le tissu contenant les sections du cerveau sur les toboggans en verre PEN gratuits de RNase. Retournez les glissades de verre chargées positives avec les doigts en direction du tissu et appuyez doucement sur la glissade en verre vers le bas vers la section tissulaire.
REMARQUE : La température des mains aidera le tissu à s’attacher au verre. - Après avoir monté les sections du cerveau sur les toboggans, gardez les diapositives dans une boîte à l’intérieur de la chambre cryostat, puis entreposez-les à -80 oC. Ne gardez jamais les toboggans à température ambiante.
REMARQUE : Le pliage du tissu et la déchirure sont fréquents. Pour une analyse postérieure précise, il est important de minimiser ces artefacts.
5. Fixation et coloration des sections cryoconservées des tissus cérébraux
- Pour préserver l’intégrité de l’ARN, nettoyez tous les instruments à utiliser avec la solution de nettoyage RNase. Procédez avec le protocole de fixation et de coloration à l’intérieur d’une hotte à fumée.
- Préparer les solutions fixatives décrites dans des tubes propres de 50 ml sans RNase. Faire toutes les solutions avec de l’eau sans RNase le jour de la coloration.
- Le même jour, la microdissection laser sera effectuée, préparer 100%, 95%, 70% et 50% des solutions d’éthanol. Gardez les solutions dans des tubes bien fermés à température ambiante.
- Préparer 4 % de violette de cresyl et 0,5 % d’éosine Y dans une solution d’éthanol de 75 %. Vortex la solution vigoureusement pendant 1 min et filtrez-les à travers un filtre en nylon de 0,45 m pour éliminer les traces de poudre non résolue.
- Placer les diapositives de tissu dans un récipient avec 95% d’éthanol pendant 30 s. Transférer les diapositives dans le tube contenant 75% d’éthanol; laisser des diapositives là pour 30 s.
- Transférer les diapositives à 50% d’éthanol et les laisser là pour 25 s. À ce stade, l’OCT sera dissoute. Transférer la diapositive à 4% de la solution violette Cresyl pour 20 s, puis transférer à 0,5% eosin Y solution pour 5 s.
- Sortez la diapositive de la solution de teinture et épongez la glissière à l’eau à l’eau avec un papier filtre. Ensuite, placez les diapositives dans 50% d’éthanol pour 25 s. Transférer les diapositives à 75% d’éthanol pour 25 s. Transférer les diapositives à 95% d’éthanol pour 30 s. Transférer les diapositives à 100% d’éthanol pour 60 s.
- Rincer la lame avec du xylène. Transférez-les dans un contenant avec du xylène et attendez 3 min.
- Préparer le milieu de montage (p. ex. la gomme Pinpoint) dans de l’eau sans RNase. Pour monter des sections du cerveau de souris, diluer le milieu de montage dans l’eau sans RNase à un rapport de 1:10.
- Sécher les lames sur une surface sans RNase à température ambiante pendant 10 s. Avant que le xylène sèche, procéder à monter les diapositives avec les sections de tissu.
- Dispersez doucement la solution de montage sur le dessus du tissu sur la glissière avec un pinceau mince stérile et sans RNase. Attendez 10-20 s, puis transférez immédiatement les diapositives de tissu à la plate-forme de microdissection de microscope.
REMARQUE : Le rapport entre l’eau de montage moyenne et sans RNase utilisé pour le montage varie selon le tissu d’intérêt. Le rapport moyen/eau de montage préserve la morphologie de tissu de glioma pour la microdissection laser sans affecter l’intégrité d’ARN.
6. Microdissection de capture au laser
REMARQUE : Un microscope microdissection de capture laser doit être utilisé pour microdissect laser secteurs spécifiques d’intérêt dans le tissu de tumeur. Pour minimiser le temps de la microdissection au laser tissulaire, préparez le microscope LMD avant la fixation et la coloration.
- Pour démarrer le système, allumez d’abord la bande de puissance, puis allumez le laser. Ensuite, allumez le contrôleur de microscope et l’ordinateur. Démarrez le logiciel LMD.
- Sous contrôle microscope, sélectionnez le grossissement 10x. Sous contrôle laser, définissez les paramètres laser pour la dissection des tissus. Définissez une fréquence laser de 120 Hz pour obtenir les meilleurs résultats de coupe. Toujours régler le courant laser à 100%.
- Pour une microdissection laser précise, réglez la vitesse à 10 et un réglage d’ouverture à 2,0-10,0 m. Réglez la puissance à 53. Avoir la puissance laser à un réglage plus élevé peut causer des gravures en verre.
- Chargez le collecteur de tissus qui captera le tissu après la dissection. Cliquez sur le deuxième bouton de déchargement. Retirez le collecteur vide et placez le tampon DNase/RNase gratuit de 0,5 mL PCR contenant 30 L de tampon de lyse dans le collecteur. Placez le collecteur dans la machine et cliquez sur Continuer sur le logiciel pour procéder.
- Charger le spécimen traité (fixe et taché) sur le microscope. Tout d’abord, cliquez sur décharger sur le logiciel LMD. Ensuite, montez l’échantillon sur le porte-glissières et placez le porte-toboggan sur la scène. Cliquez sur Continuer sur le logiciel pour procéder.
- Sous les fenêtres Cut Shapes, sélectionnez Draw ' Cut. Utilisez les commandes de microscope pour trouver la zone d’intérêt. Dessinez la région d’intérêt (ROI) et sélectionnez un tube de collection de destination. Il est possible de dessiner plusieurs ROI pour disséquer micro différentes zones d’une seule diapositive en même temps.
- Cliquez sur Démarrer Cut pour procéder à la dissection micro tissulaire. Après avoir sectionner les zones d’intérêt enlever les tubes de collecteur du support et placer les tubes sur de la glace sèche. Transférer les échantillons de tissus d’ARN prélevés à -80 oC pour le stockage à long terme.
7. Isolement d’ARN du tissu de gliome micro-disséqué
- Pour l’extraction de l’ARN de LMD utiliser un kit d’isolation ARN optimisé pour les petits échantillons et faible rendement d’ARN (voir Tableau des matériaux). Suivez les instructions de fabrication. Effectuer toutes les étapes d’isolement à température ambiante (25 oC). Pour maintenir la qualité de l’ARN, travaillez rapidement. Préparer toutes les solutions telles qu’indiquées par le fabricant.
- Ajuster le volume de l’échantillon à 350 l avec tampon de lyse avec 1% de mercaptoethanol. Vortex l’échantillon pour 40 s afin de réduire la viscosité de l’échantillon et d’augmenter l’efficacité de la colonne de spin d’elution d’ARN.
- Transférer la totalité de l’échantillon dans une colonne de spin d’éliminateur de l’ADN gDNA placée dans un tube de collecte de 2 ml. Centrifuge le tube pour 30 s à 8.000 x g. Enregistrez le flux et assurez-vous qu’aucun liquide n’est laissé sur la colonne après centrifugation.
- Ajouter 350 L d’éthanol de 70 % à l’écoulement et bien mélanger en faisant de la canalisation de haut en bas. Transférer l’échantillon dans une colonne de spin d’elution d’ARN placée dans un tube de collecte de 2 ml. Fermez doucement le couvercle et centrifugeuse pour 15 s à 8 000 x g. Jetez le flux,through, en économisant la colonne.
- Ajouter 700 l de tampon de lavage d’ARN 1 (20 % d’éthanol, 900 mM GITC, 10 mM Tris-HCl pH 7.5) à la colonne de spin d’elution d’ARN. Fermez doucement le couvercle et centrifugeuse pendant 15 s à 8 000 x g pour laver la membrane de la colonne de rotation. Jetez le flux- à travers.
- Après centrifugation, retirez soigneusement la colonne de spin d’elution d’ARN du tube de collecte afin que la colonne ne contacte pas le flux-through.
- Ajouter 500 lil du deuxième tampon de lavage d’ARN (éthanol 80%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7.5) à la colonne de spin. Fermez le couvercle de la colonne et tournez 8 000 x g pendant 20 s pour laver la membrane de la colonne. Disposez le flux- travers.
- Pour laver la colonne d’elution d’ARN, ajoutez 500 L d’éthanol de 80 %, fermez le couvercle de la colonne et centrifugeuse à 8000 x g pendant 2 min. Jetez les tubes avec la solution d’elution.
- Utilisez un nouveau tube de collecte, ouvrez le couvercle de la colonne de spin et la centrifugeuse à 8000 x g pendant 5 minutes pour sécher la colonne. Jeter le tube d’elution.
- Placez la colonne de spin d’elution d’ARN dans un nouveau tube de collecte de 1,5 mL. Ajouter 12 L d’eau sans RNase réchauffée à 37 oC directement au centre de la membrane de la colonne de spin. Attendez 4 min et centrifugeuse pendant 1 min à pleine vitesse pour elute ARN.
8. Contrôle de la qualité de l’ARN, préparation de la bibliothèque et analyse ARN-Seq
- Après l’extraction et la purification de l’ARN, amplifiez l’ARN et créez une bibliothèque d’ADNC à l’aide d’un kit spécial adapté à l’isolement de l’ARN aux concentrations pico-molaires suivant les instructions du fabricant (voir tableau des matériaux). Suivez les instructions du fabricant. Poste de travail propre afin d’éviter la contamination par d’autres produits PCR et la dégradation des nucléases des échantillons.
- Si l’ARN a une valeur RIN supérieure à 4, ce qui signifie que l’ARN est de bonne qualité ou seulement partiellement dégradé, procéder à l’étape de fragmentation. Préparer tous les articles sur la glace.
- Créer un mélange principal tel qu’indiqué (tableau 1). Créez un mélange de réaction dans un tube PCR à parois minces sans nucléase. Incuber les tubes à 94 oC dans un cycle thermique à couvercle chaud. Le temps d’incubation de fragmentation dépend de la qualité de l’ARN. RIN 7: 4 min, RIN 5-6: 3 min, RIN 4-5: 2 min.
- Après l’incubation, placez les tubes sur une grille de refroidissement PCR qui était auparavant refroidie à -20 oC et laissez-la reposer pendant 2 min.
- Pour chaque tube d’échantillon d’ARN, préparer le premier mélange de maître de réaction de synthèse de brin(tableau 2). Incuber les tubes dans un cycle thermique à couvercle chaud dans des conditions décrites dans le tableau 3. Les produits cDNA peuvent être congelés à -20 oC jusqu’à deux semaines avant de passer à l’étape suivante.
- Créez le mélange de maître PCR tel qu’indiqué dans le tableau 4. Placez les tubes dans un cycle thermique à couvercle chaud et exécutez la réaction pcR sous les paramètres indiqués dans le tableau 5.
- Laissez les perles, qui seront utilisées pour purifier l’ADN, pour se réchauffer à température ambiante. Une fois réchauffé, ajouter 40 L des perles à chaque échantillon. Vortex les tubes pour mélanger et tourner brièvement pour recueillir le liquide au fond du tube. Laisser les tubes incuber à température ambiante pendant 8 minutes pour permettre à l’ADN de se lier aux perles.
- Placez les tubes sur un dispositif de séparation magnétique et laissez reposer pendant environ 5 minutes, ou jusqu’à ce que la solution devienne complètement claire. Garder les tubes sur le dispositif de séparation, utiliser une pipette pour enlever le supernatant soigneusement sans déranger les perles.
- En gardant les tubes sur le dispositif de séparation, ajoutez 200 L d’éthanol fraîchement fait à 80% aux perles pour laver sans déranger les perles. Attendez 30 s avant de retirer l’éthanol de 80 %. Répétez cette étape.
- Tournez brièvement les tubes et remettez les tubes sur le dispositif de séparation. Enlever tout éthanol résiduel de 80 % sans déranger les perles.
- Laisser sécher l’air des tubes avec les bouchons ouverts pendant 5 min. Ne le laissez pas reposer plus longtemps que les perles seront trop sèches.
- Garder les tubes sur le dispositif de séparation, ajouter 52 L d’eau sans nucléase pour couvrir les perles. Retirer les tubes du dispositif de séparation et de la pipette de haut en bas jusqu’à ce que toutes les perles soient résiliées. Incuber à 5 min à température ambiante.
- Remettre les tubes sur le dispositif de séparation jusqu’à ce que la solution devienne claire, environ 1 min. Transférer 50 l’un du supernatant résultant vers les puits d’une bande de 8 puits. Ajoutez 40 L de nouvelles perles à chaque échantillon. Vortex à fond pour mélanger. Laisser les perles se lier à l’ADN en incuber à température ambiante pendant 8 min.
- Pendant cette période d’incubation, commencez à décongeler les composants à utiliser pour tout ARN présent dans les échantillons. Une fois décongelés, placez-les sur la glace. En outre, pré-chauffer un cycle thermique à 72 oC.
- Placez les échantillons sur le dispositif de séparation magnétique jusqu’à ce que la solution se dégage (environ 5 min). Aliquot 1.5 'L de sondes par échantillon à un tube DE PCR réfrigéré. Placer le tube dans le cycle thermique préchauffé sous les réglages de 72 oC pendant 2 min et 4 oC.
- Garder les tubes d’échantillon dans le dispositif de séparation magnétique, enlever le supernatant avec un tuyau sans déranger les perles. Ajoutez ensuite 200 L d’éthanol fraîchement fait à 80 % aux perles pour laver sans déranger les perles. Attendez 30 s avant de retirer l’éthanol de 80 %. Répétez cette étape.
- Tournez brièvement les tubes et remettez les tubes sur le dispositif de séparation. Enlever tout éthanol résiduel de 80 % sans déranger les perles. Laisser sécher l’air des tubes avec les bouchons ouverts pendant 2 min. Ne laissez pas reposer plus longtemps que les perles seront trop sèches.
- Préparer le mélange principal pour tous les échantillons en combinant les composants suivants dans l’ordre présenté (tableau 6).
- Mélanger le mélange principal par vortexing et ajouter 22 L du mélange aux perles séchées de chaque échantillon et bien mélanger pour le résuspender. Laisser incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Tourner les tubes et les placer sur le dispositif de séparation magnétique pendant 1 minute ou jusqu’à ce que les échantillons deviennent clairs. Transférer 20 L du supernatant, sans déranger les perles vers de nouveaux tubes PCR. Placez les tubes dans un cycle thermique préchauffé sous les réglages du tableau 7.
- Préparer un mélange de maître PCR pour assez pour les réactions pour chaque échantillon. Ajouter les composants suivants au mélange principal dans le tableau 8indiqué. Ajoutez 80 L du mélange principal de PCR à chacun des tubes de l’échantillon de l’étape 8.20 et placez-le dans le cycleur thermique aux réglages suivants (tableau 9).
- Permettre aux perles, qui seront utilisées pour purifier l’ADN, de se réchauffer à température ambiante. Une fois réchauffé, ajouter 100 L des perles à chaque échantillon. Laisser les tubes incuber à température ambiante pendant 8 minutes pour permettre à l’ADN de se lier aux perles.
- Placez les tubes sur un dispositif de séparation magnétique et laissez reposer pendant environ 5 minutes, ou jusqu’à ce que la solution devienne complètement claire.
- Garder les tubes sur le dispositif de séparation, utiliser une pipette pour enlever le supernatant soigneusement sans déranger les perles.
- En gardant les tubes sur le dispositif de séparation, ajoutez 200 L d’éthanol fraîchement fait à 80% aux perles pour laver sans déranger les perles. Attendez 30 s avant de retirer l’éthanol de 80 %. Répétez cette étape.
- En bref, tourner les tubes et remettre les tubes sur le dispositif de séparation. Enlever tout éthanol résiduel de 80 % sans déranger les perles.
- Laisser sécher l’air des tubes avec les bouchons ouverts pendant 5 min. Ne laissez pas reposer plus longtemps que les perles seront tropry. Pipette 20 L de Tris Buffer à la boulette séchée. Retirer le tube du dispositif de séparation et bien mélanger avec un tuyau pour réanimer les perles. Laisser incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Placez les tubes sur le dispositif de séparation pendant 2 min, ou jusqu’à ce que la solution devienne claire. Acquérir le supernatant et le transférer à de nouveaux tubes. Conservez ensuite la solution collectée à -20 oC.
- Vérifiez que les bibliothèques finales ont besoin pour le contrôle de la qualité et de la quantité. Mettez les échantillons, regroupés et séquence, comme l’appariement de 50 nt lit, selon les protocoles recommandés par le fabricant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Notre laboratoire a généré un modèle de souris génétiquement modifié (GEMM) à l’aide du système de transposase de beauté endormie(figure 1A). Ce système intègre des altérations génétiques spécifiques dans le génome des cellules progénitrices neurales chez les souris néonatales. Ces cellules progénitrices altérées forment des tumeurs endogènes de glioma. Les séquences plasmides utilisées pour générer les tumeurs étaient : (1) pT2C-LucPGK-SB100X pour le transposon de la Belle au bois dormant et ; expression de luciferase, (2) pT2-NRASSV12 pour l’expression NRAS, (3) pT2-shp53-GFP4 pour p53 knock-down et expression de protéine de GFP, et (4) pT2-shATRx-GFP4 pour ATRX knock-down. Des plasmides ont été injectés dans le ventricule latéral des chiots néonatals d’un jour comme décrit précédemment11. L’absorption et la formation de tumeur de Plasmid ont été surveillées par le système d’imagerie de bioluminescence in vivo. Une fois que les souris tumorales-portantes ont montré des signes de charge de tumeur, elles ont été sacrifiées. Les tumeurs ont été utilisées pour générer des cultures de neurosphère ou directement cryo-préservées pour le traitement de LMD(figure 1A).
Les cultures cellulaires commencées à partir du GEMM ont été utilisées pour générer un modèle de gliome traduisible(figure 1B). Les néurosphères de Glioma dérivées des tumeurs de GEMM ont été cultivées et implantées intracranially dans le striatum des souris immuno-compétentes. Les suspensions à cellule unique obtenues de la culture des néurosphères ont été utilisées pour générer des tumeurs de gliome par implantation intracrânienne comme décrit précédemment par notre laboratoire10,11,12. Cette méthodologie permet d’implanter une quantification soigneuse du nombre de cellules par souris (30 000 cellules/1 l/souris). Ce protocole permet la reproductibilité des résultats entre différentes implantations expérimentales. Cependant, l’implantation des neurosphères pourrait être une option alternative pour générer des tumeurs de gliome de souris et l’analyse suivante de LMD et d’ARN-Seq. Néanmoins, cette méthode est considérée comme plus précise. La progression de tumeur a été surveillée par le système in vivo d’imagerie de spectre de bioluminescence. Les souris affichant des signes de charge de tumeur ont été transcardialement perfusées et le cerveau a été cryo-préservé pour le traitement de LMD (figure 1C).
Les sections de tissu ont été microdissected de laser pour caractériser le transcriptome des structures multicellulaires dans des gliomes. Les procédures de perfusion, de congélation et d’intégration décrites ont été optimisées pour préserver la morphologie des tissus et obtenir l’ARN de bonne qualité après la microdissection au laser. Différentes approches de perfusion ont été évaluées afin d’acquérir des tissus ayant une morphologie supérieure et une intégrité de l’ARN(tableau 10). Pour disséquer les zones d’intérêt, il était nécessaire de tacher le tissu avec des colorants inoffensifs pour l’ARN(figure 2). Nous avons observé que perfusing tumeur portant la souris avec la solution de Tyrode pour 5 min, puis 30% saccharose pendant 15 min, suivie par le stockage de nuit du cerveau disséqué dans 30% saccharose préserve la morphologie et l’intégrité de l’ARN du tissu tumoral (figure 3D). La perfusion avec la solution de saccharose de 30% a empêché la formation de cristal de glace dans le tissu. Bien que, la fixation du tissu paraformaldéhyde a eu comme conséquence la morphologie de tissu de haute qualité, l’intégrité d’ARN a été affectée négativement (figure 3B). D’autres approches telles que la solution de Tyrode pour 5 min ou la solution de Tyrode pour la solution de saccharose de 5 min et 30 % pour 15 min(figure 3A et C) n’ont pas affecté la qualité de l’ARN. Dans ces conditions, les cerveaux n’ont pas été conservés dans 30% de saccharose pendant la nuit; nous avons observé la résolution réduite dans la morphologie de tissu.
Nous avons effectué diverses techniques de coloration suivies par l’analyse de contrôle de la qualité de l’intégrité de l’ARN. Nous avons observé que 4% de violette de Cresyl et 0.5% de colorant eosin Y était suffisant pour identifier les structures multicellulaires de glioma et maintenir l’intégrité d’ARN. La violette de cresyl est un colorant acidophile qui tache le noyau des cellules avec une couleur bleu foncé. Eosin Y est un colorant basophile qui tache les composants de base des cellules.
Nous avons observé que si le tissu n’était pas monté avec le milieu de montage, les sections sont devenues déshydratées et la morphologie s’est détériorée (figure 4A). Pour maintenir la morphologie de tissu de haute qualité, nous avons monté le tissu avec le milieu de montage. Nous avons observé que 15 % de montage moyen dissous dans l’eau (30 l dans 200 l’eau) maintenait la morphologie des tissus de haute qualité(figure 4B).
Dans la figure 5A, les zones d’hétérogénéité de glioma sont montrées. Des images ont été acquises à l’aide d’un microscope microdissection de capture laser précédant la dissection. Les lignes rouges représentent des zones avec des cellules mésenchymales abondantes (cellules allongées). Les lignes bleues représentent des zones sans cellules mésenchymales (cellules arrondies)(figure 5A, image moyenne). La figure 5B montre des images de zones tumorales micro-disséquées au laser (lignes rouges) et de zones normales de tissu cérébral (lignes bleues). La sélection du retour sur investissement est faite pour disséquer les zones d’intérêt(figure 5A et B, images inférieures). Nous pouvons observer dans ces images le succès dans la dissection des zones sélectionnées.
L’extraction de l’ARN a été effectuée à l’aide d’un kit commercial. Il a été déterminé qu’une superficie totale de tissu disséqué entre 2,5 x 106 - 7 x 106 m2 était nécessaire pour l’extraction de l’ARNm et la préparation de la bibliothèque de l’ADNC pour le séquençage ultérieur de l’ARN. Le contrôle de qualité d’ARN a déterminé un RIN entre 6 à 7 dans le tissu de gliome après microdissection de laser. Un RIN de 6 a été jugé approprié pour la préparation de la bibliothèque de l’ADNC. Après l’extraction de l’ARN, un kit pour l’isolement d’ARN aux concentrations picomolar a été employée pour générer une bibliothèque d’ADNC appropriée pour le séquençage de prochaine génération.
| 0,25 ng - 10 ng (1-8 'L) d’ARN |
| 4 L du 5x First-Strand Buffer |
| 1 L du Mélange Oligos V2 |
| L’eau sans nucléase au volume final de 13 ll |
Tableau 1 : Contrôle de la qualité de l’ARN et préparation de la bibliothèque : Préparation de la composition principale pour l’étape 8.3.
| Mélange V2 de 4,5 L |
| Inhibiteur RNase de 0,5 L |
| Transcriptase inverse de 2 l |
| Volume final de 7 ll |
| Ajouter le 7 L au tube d’échantillon d’ARN |
Tableau 2 : Contrôle de la qualité de l’ARN et préparation de la bibliothèque : Préparation de master Mix pour l’étape 8.5.
| 42 oC pour 90 min |
| 70 oC pour 10 min |
| 4 oC de prise |
Tableau 3 : Contrôle de la qualité de l’ARN et préparation de la bibliothèque : Conditions thermocycler pour l’étape 8.5.
| 2 l’eau sans nucléase |
| Tampon PCR de 25 ll |
| 1 l de polymérase d’ADN pour chaque réaction |
| Mélanger doucement et tourner brièvement |
| Ajouter 28 L du mélange principal à chacun des tubes de l’échantillon |
| Ajouter 1 L de chaque amorce de 5 et 3' à chaque tube |
| Mélanger les réactions doucement et tourner brièvement |
Tableau 4 : Contrôle de la qualité de l’ARN et préparation de la bibliothèque : Préparation de master Mix pour l’étape 8.6.
| 1 cycle |
| 94 oC pour 1 min |
| 5 cycles |
| 98 oC pour 15 s |
| 55 oC pour 15 s |
| 68 oC pour 30 s |
| 1 cycle |
| 68 oC pour 2 min, 4 oC de prise |
Tableau 5 : Contrôle de la qualité de l’ARN et préparation de la bibliothèque : Conditions thermocycler pour l’étape 8.6.
| 16,8 l 'eau sans nucléase |
| 2.2 L 10x R Buffer |
| 1.5 L R v2 |
| 1.5 L R-Probes v2 |
Tableau 6 : Contrôle de la qualité de l’ARN et préparation de la bibliothèque : Préparation de la composition principale pour l’étape 8.18.
| 37 oC 60 min |
| 72 oC 10 min |
| 4 oC de prise |
Tableau 7 : Contrôle de la qualité de l’ARN et préparation de la bibliothèque : Conditions thermocycler pour l’étape 8.20.
| 26 l’eau sans nucléase |
| Tampon PCR CB de 50 lil |
| 2 L PCR2 Primers v2 |
| 2 L de polymérase d’ADN |
Tableau 8 : Contrôle de la qualité de l’ARN et préparation de la bibliothèque : Préparation de la composition principale pour l’étape 8.21.
| 1 cycle |
| 94 oC pour 1 min |
| X cycles |
| 98 oC pour 15 s |
| 55 oC pour 15 s |
| 68 oC pour 30 s |
| 1 cycle |
| 68 oC pour 2 min, 4 oC de prise |
Tableau 9 : Contrôle de la qualité de l’ARN et préparation de la bibliothèque : Conditions thermocycler pour l’étape 8.21.
| Étape 1 | Étape 2 | Étape 3 | |
| Méthode 1 | Tyrode’s 15' | -- | -- |
| Méthode 2 | Tyrode 5' | Sucrose 30% 15' | -- |
| Méthode 3 | Tyrode 5' | 4% PFA 10' | -- |
| Méthode 4 | Tyrode 5' | 30% Sucrose 15' | Cerveau dans 30% Sucrose Nuit |
Tableau 10 : Méthodes pour différentes approches de perfusion.
Figure 1 : Modèles de gliomes de souris utilisés pour la microdissection laser. (A) Beauté endormie GEMM utilisé pour développer de novo glioma. Les images affichent la progression de tumeur : (i) injection plasmide dans le ventricule latéral des nouveau-nés, (ii) charge de tumeur. (B) Génération de modèle de gliome transplantable utilisant des cultures de cellules de gliome. Les cellules de neurosphère cultivées à partir de GEMM sont implantées intracranially dans le striatum. (C) Représentation de cryo-sectioning du cerveau incorporé dans l’orientation coronale suivant la perfusion. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Représentation schématique de la méthode utilisée pour tacher les sections tissulaires cryo-préservées avec la violette de Cresyl et l’éosine. Les diapositives utilisées pour la coloration ont été manipulées avec des outils nettoyés avec de l’eau sans RNase. Toutes les solutions ont été préparées avec de l’eau libre RNase/DNase le jour de la coloration. Cresyl violet taches violettes et eosin Y taches cytoplasme rose. Les teints ont été dissous dans 70% d’éthanol. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Comparaison de diverses approches de perfusion pour préserver la morphologie des tissus et l’intégrité de l’ARN. Les images de H et E représentent la morphologie comparative des tissus cérébraux qui ont été soumis à la perfusion sous différentes méthodes : (A) La solution de Tyrode pendant 15 min, (B) La solution de Tyrode pour 5 min, 4% de PFA pour 10 min, (C) la solution de Tyrode pour 5 min, 30% de saccharose pendant 15 min, et (D) la solution de Tyrode pour 5 min, 30% de saccharose pendant 15 min avec immersion de nuit dans 30% de saccharose. L’évaluation de la qualité de l’ARN est affichée pour chaque méthode de perfusion. Les parcelles représentent les pics de rRNA des années 18 et 28 et le pic de marqueur initial. Le rapport de 18s et 28s rRNA est utilisé pour déterminer la qualité de l’ARN. Une image de gel des fragments d’ARN est affichée à droite des parcelles. La qualité de l’ARN a été évaluée à l’aide des valeurs RIN. La qualité de l’ARN était élevée dans les méthodes A, C, et D. La morphologie des tissus était supérieure dans les méthodes C et D. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Images représentatives de tissu gliome monté et non monté. (A) Images représentatives de tissus tachés de H et E. Ce tissu a été laissé non monté et est devenu déshydraté affichant une morphologie pauvre avec des ruptures dans le tissu. (B) Images représentatives de tissus tachés de H et E et montés avec le milieu de montage. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Images représentatives du tissu de gliome utilisées pour la microdissection laser. (A-B) Images représentatives de tissus tachés de H et E et zones de structures multicellulaires sélectionnées pour LMD. (A) Sur la gauche, des zones de cellules allongées (rouges) et de zones de contrôle (bleu) ont été sélectionnées pour LMD. (B) Sur la droite, les zones d’invasion collective (rouge) et de zone de contrôle (bleu) ont été sélectionnées pour LMD. (C) Contrôle représentatif de la qualité de l’ARN pour les zones microdissectées au laser. Une superficie totale de 6,5 x 106 m2 a été microdissectée. L’analyse montre la concentration d’ARN de 2 346 pg/L et le numéro d’intégrité de l’ARN (RIN) : 6,8. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’hétérogénéité et à l’invasion du gliome sont d’une importance cruciale pour découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques13. Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode détaillée et optimisée pour analyser le paysage moléculaire de l’hétérogénéité et de l’invasion du gliome à l’aide de la microdissection de capture laser (LMD) suivie d’une analyse transcriptomique.
La microdissection de capture de laser (LMD) peut être employée pour identifier différentes zones ou cellules simples dans la tumeur, fournissant un échantillon spécifique pour analyser davantage le modèle moléculaire maintenant le contexte spatial de la tumeur14. Cette technique est fiable et à bas prix par rapport à d’autres méthodes utilisées pour analyser le transcriptome spatial dans les tumeurs solides15. Nous avons analysé l’hétérogénéité et l’invasion de glioma dans des modèles génétiquement modifiés de tumeur de souris ou des modèles implantables intracrânaux utilisant LMD. Ces modèles récapitulent les caractéristiques saillantes des gliomes humains, permettant l’étude de l’hétérogénéité et de l’invasion de gliome10,12.
Maintenir la morphologie des tissus tumoraux de haute qualité et l’intégrité de l’ARN est l’une des limites pour LMD. Pour améliorer la morphologie des tissus, nous avons perfusé des souris avec la solution de Tyrode pendant 5 minutes, suivie de 30% de saccharose dissous dans la même solution. Une fois que le cerveau a été disséqué, nous l’avons conservé dans 30% de saccharose dissous dans l’eau RNase/DNase-libre pendant la nuit ou jusqu’à ce que le cerveau atteigne le fond du récipient de stockage. Ces étapes améliorent considérablement la morphologie du tissu et réduisent la formation de cristaux de glace dans le tissu pendant la cryo-préservation. Bien que le tissu humain de glioma n’ait pas été employé pour ce protocole, l’incubation des échantillons humains dans la solution de saccharose de 30% pendant la nuit pourrait être une méthodologie faisable pour améliorer la morphologie des cryosections. Une autre limitation possible pour LMD est la préservation de l’intégrité de l’ARN après la coloration8. Bien que d’autres équipes de recherche aient effectué une microdissection laser sur le tissu de gliome suivie d’une analyse ARN-seq, elles n’illustrent aucun ARN et/ou morphologie et ne commentent pas non plus la qualité morphologique, ni les contrôles particuliers pour les sections congelées de glioma16. Dans ce protocole l’identification morphologique précise était essentielle afin de microdissecter les structures macrocellulaires précises de laser dans les gliomes. Nous avons observé que la fixation du tissu de gliome avec la solution d’éthanol et le colorant avec 4% de violette de Cresyl et 0.5% eosin Y dissous dans la qualité d’ARN éthanol-maintenu et a permis l’identification microscopique des cellules simples et des structures multicellulaires. Nous avons démontré que le montage des sections de gliome avec la solution de montage est une étape critique qui empêche la fissuration et la formation de fissure dans le tissu. Veuillez noter que le milieu de montage doit être préparé dans l’eau, car l’utilisation du milieu de montage dissous dans l’éthanol entraînera une mauvaise morphologie des tissus. La microdissection au laser doit être effectuée le plus rapidement possible dans un environnement exempt de RNase. Nous recommandons également de sectionr jusqu’à 2,5 x 106 m2 superficie totale de tumeur/tissu afin d’obtenir des quantités appropriées d’ARN, à la fois pour le contrôle de la qualité de l’ARN et l’analyse transcriptomique.
LMD permet l’analyse des voies de signalisation moléculaire qui régulent l’hétérogénéité et l’invasion du gliome. Cette analyse pourrait révéler de nouvelles cibles potentielles pour le diagnostic, le pronostic et le développement translationnel futur dans les modèles preclinical de glioma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tous les auteurs de cet article ne déclarent aucun conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
Les travaux ont été soutenus par les National Institutes of Health (NIH/NINDS) Subventions: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 à M.G.C.; (NIH/NINDS) Subventions R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 à P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; le Département de neurochirurgie, le Rogel Cancer Center de l’Université du Michigan, la ChadTough Foundation et la Happy Hearts Foundation de Leah à M.G.C. et P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 à M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 pour le Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) Le projet F049768 à l’Institut forbes de recherche sur le cancer de l’Université du Michigan, un prix médecin-scientifique de la recherche pour prévenir la cécité, Inc. (RPB), accorde R01 EY022633 de l’ONI des NIH (AK) et une subvention sans restriction de la RPB au Département d’ophtalmologie et de sciences visuelles. Cette recherche a utilisé le Centre de recherche de la vision (P30 EY007003) et le Centre de recherche du Centre de cancérologie (P30 CA046592). AK est soutenu par le Prix De la recherche émergente Mme William Davidson de l’Institut de recherche médicale A. Alfred Taubman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin - Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
References
- Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Rabien, A., Kristiansen, G. Tissue Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).
- Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).
- Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection. Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).
- Núñez, F. J., et al. IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response. Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Brat, D. J., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing. Science. 358 (6359), 64-69 (2017).
- Gagner, J. P., Zagzag, D. Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).
