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Neuroscience

विट्रो में संवेदी और मोटर नसों से फाइब्रोब्लास्ट और श्वार्न कोशिकाओं का शुद्धिकरण

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/60952
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Neuroregeneration of Jiangsu and Ministry of Education, Co-Innovation Center of Neuroregeneration, Jiangsu Clinical Medicine Center of Tissue Engineering and Nerve Injury Repair, Nantong University

Summary

यहां, हम विट्रो में संवेदी और मोटर नसों से फाइब्रोब्लास्ट और श्वार्न कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

परिधीय तंत्रिका तंत्र में प्रमुख कोशिकाएं श्वान कोशिकाएं (एससी) और फाइब्रोब्लास्ट हैं। ये दोनों कोशिकाएं न्यूरोट्रोफिक कारक जीन अभिव्यक्ति और अन्य जैविक प्रक्रियाओं के विभिन्न पैटर्न में शामिल संवेदी और मोटर फेनोटाइप को स्पष्ट रूप से व्यक्त करती हैं, जो तंत्रिका उत्थान को प्रभावित करती हैं। वर्तमान अध्ययन ने अत्यधिक शुद्ध चूहा संवेदी और मोटर एससी और फाइब्रोब्लास्ट को अधिक तेजी से प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है। नवजात चूहों (7 दिन पुराने) की वेंट्रल रूट (मोटर तंत्रिका) और पृष्ठीय जड़ (संवेदी तंत्रिका) को अलग किया गया था और कोशिकाओं को 4-5 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था, इसके बाद संवेदी और मोटर फाइब्रोब्लास्ट और एससी के अलगाव के बाद अंतर पाचन और अंतर पालन विधियों को क्रमिक रूप से जोड़ दिया गया था। इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषणों के परिणामों से पता चला है कि संवेदी और मोटर एससी और फाइब्रोब्लास्ट की शुद्धता >90% थी। इस प्रोटोकॉल का उपयोग बड़ी संख्या में संवेदी और मोटर फाइब्रोब्लास्ट/एससी को अधिक तेजी से प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, जो संवेदी और मोटर तंत्रिका उत्थान की खोज में योगदान देता है ।

Introduction

परिधीय तंत्रिका तंत्र में, तंत्रिका फाइबर में मुख्य रूप से एक्सॉन, श्वान कोशिकाएं (एससी), और फाइब्रोब्लास्ट होते हैं, और इसमें मैक्रोफेज, माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक छोटी संख्या भी होती है1। अनुसूचित जाति एक 1:1 अनुपात में अक्षतंतु लपेटें और एक संयोजी ऊतक परत से घिरा हुआ है जिसे एंडोनेरियम कहा जाता है। इसके बाद एक्सोन्स को एक साथ बंडल किया जाता है ताकि वे फेसिकल्स नामक समूह बन सकें, और प्रत्येक फैक्स को एक कनेक्टिव ऊतक परत में लपेटा जाता है जिसे परिणीति के रूप में जाना जाता है। अंत में, पूरे तंत्रिका फाइबर को कनेक्टिव ऊतक की एक परत में लपेटा जाता है, जिसे एपिनेरियम कहा जाता है। एंडोनेरियम में, पूरी सेल आबादी में 48% एससी शामिल हैं, और शेष कोशिकाओं के एक बड़े हिस्से में फाइब्रोब्लास्ट2शामिल है। इसके अलावा, फाइब्रोब्लास्ट सभी तंत्रिका डिब्बों के महत्वपूर्ण घटक हैं, जिनमें एपिनेयूरियम, परिणीति, और एंडोन्यूरियम3शामिल हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि परिधीय तंत्रिका चोटों के बाद पुनर्जनन प्रक्रिया में एससी और फाइब्रोब्लास्ट महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं4,5,6. परिधीय तंत्रिका के ट्रांसेक्शन के बाद, पेरिन्यूरियल फाइब्रोब्लास्ट अनुसूचित जाति और फाइब्रोब्लास्ट के बीच एफ्रिन-बी/एफएचबी2 सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से सेल छंटाई को विनियमित करते हैं, और घावों के माध्यम से अक्षीय पुनर्विकास का मार्गदर्शन करते हैं5। परिधीय तंत्रिका फाइब्रोब्लास्ट टेनासिन-सी प्रोटीन को स्रावित करते हैं और 1-तेग्रीन सिग्नलिंग पाथवे7के माध्यम से तंत्रिका उत्थान के दौरान एससी के प्रवास को बढ़ाते हैं। हालांकि, उपरोक्त अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले एससी और फाइब्रोब्लास्ट सियाटिक तंत्रिका से प्राप्त किए गए थे, जिसमें संवेदी और मोटर तंत्रिकाएं दोनों शामिल हैं।

परिधीय तंत्रिका तंत्र में, संवेदी तंत्रिकाएं (अफरेंट तंत्रिकाएं) रिसेप्टर्स से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) तक संवेदी संकेत का संचालन करती हैं, जबकि मोटर तंत्रिकाएं (इफेरेंट तंत्रिकाएं) सीएनएस से मांसपेशियों तक संकेतों का संचालन करती हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एससी अलग मोटर और संवेदी फेनोटाइप व्यक्त करते हैं और परिधीय तंत्रिका उत्थान8,9का समर्थन करने के लिए न्यूरोट्रोफिक कारकों को स्रावित करते हैं । हाल ही में हुए एक अध्ययन के अनुसार, फाइब्रोब्लास्ट विभिन्न मोटर और संवेदी फेनोटाइप को भी व्यक्त करते हैं और एससी10के प्रवास को प्रभावित करते हैं । इस प्रकार, मोटर और संवेदी तंत्रिका फाइब्रोब्लास्ट/एससी के बीच मतभेदों की खोज हमें परिधीय तंत्रिका विशिष्ट उत्थान के जटिल अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति देती है ।

वर्तमान में, अनुसूचित जाति और फाइब्रोब्लास्ट को शुद्ध करने के कई तरीके हैं, जिनमें एंटीमिटोटिक एजेंटों का आवेदन, एंटीबॉडी-मध्यस्थता साइटोलिसिस11,12,अनुक्रमिक इम्यूनोपैनिंग13 और लेमिनिन सबस्ट्रटम14शामिल हैं।, हालांकि, उपरोक्त सभी तरीके फाइब्रोब्लास्ट को हटा देते हैं और केवल एससी को संरक्षित करते हैं। अत्यधिक शुद्ध अनुसूचित जाति और फाइब्रोब्लास्ट प्रवाह साइटोमेट्री छंटाई प्रौद्योगिकी15द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन यह एक समय लेने वाली और महंगी तकनीक है। इसलिए, इस अध्ययन में, बड़ी संख्या में फाइब्रोब्लास्ट और एससी को अधिक तेजी से प्राप्त करने के लिए संवेदी और मोटर तंत्रिका फाइब्रोब्लास्ट और एससी को शुद्ध और अलग करने के लिए एक सरल अंतर पाचन और अंतर पालन विधि विकसित की गई थी।

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Protocol

यह अध्ययन नानटोंग विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था। पशु विषयों सहित सभी प्रक्रियाओं को नैतिकता की दृष्टि से प्रायोगिक पशुओं की प्रशासन समिति, जियांग्सू प्रांत, चीन द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. मोटर और संवेदी तंत्रिका फाइब्रोब्लास्ट और एससी की अलगाव और संस्कृति

  1. चीन के नानटोंग विश्वविद्यालय के प्रायोगिक पशु केंद्र द्वारा प्रदान किए गए सात दिवसीय स्प्राग-डावले (एसडी) चूहों (एन = 4) का उपयोग करें। चूहों को 2-3 मिनट के लिए 5% आइसोफ्लुनेलन वाले टैंक में रखें, जानवरों को धीरे-धीरे सांस लेने की अनुमति दें और कोई स्वतंत्र गतिविधि न हो, और फिर डेपुटेशन से पहले 75% इथेनॉल का उपयोग करके साफ करें।
  2. लगभग 3 सेमी तक पीछे की त्वचा को काटने और रीढ़ की हड्डी के कॉलम को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें। रीढ़ की हड्डी को बेनकाब करने के लिए कशेरुकी नहर को सावधानी से खोलें।
  3. रीढ़ की हड्डी को 60 एमएम पेट्री डिश में बरकरार रखें, जिसमें 2-3 एमएल बर्फ से ठंडे डी-हैंक्स के बैलेंस्ड सॉल्ट (एचबीबीएस) होते हैं।
  4. शारीरिक संरचना के आधार पर, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे वेंट्रल रूट (मोटर तंत्रिका) और फिर पृष्ठीय जड़ (संवेदी तंत्रिका) को उत्पादित करें। इसके बाद, उन्हें बर्फ से ठंडे डी-हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में रखें।
  5. एचबीएसएस को हटाने के बाद, नसों को कैंची के साथ 3-5 मिमी टुकड़ों में काट लें और 18-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% (w/v) ट्राइपसिन के 1 मिलियन के साथ पचा लें। इसके बाद, पाचन को रोकने के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) युक्त डीएमईएम के 3-4 एमसीएल के साथ पूरक करें।
  6. मिश्रण को धीरे-धीरे लगभग 10 बार और 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। उसके बाद, सुपरनेट को त्यागें और डीएमईएम के 2-3 एमएल में 10% एफबीएस के साथ पूरक होने पर वर्षा को निलंबित करें।
  7. 400 जाल फ़िल्टर का उपयोग करके सेल सस्पेंशन को फ़िल्टर करें, और फिर 5% सीओ2की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिमी पेट्री डिश और संस्कृति में कोशिकाओं को टीका लगाएं। 4-5 दिनों की खेती के बाद, 90% संगम तक पहुंचने के बाद मार्ग 0 (पी0) फाइब्रोब्लास्ट और एससी को अलग करें।
  8. अनुसूचित जाति के अलगाव और संस्कृति(चित्रा 1)
    1. 1x पीबीएस का उपयोग करके एक बार कोशिकाओं को धो लें। कमरे के तापमान पर 8-10 एस के लिए कोशिकाओं को पचाने के लिए 0.25% (w/v) ट्राइप्सिन (37 डिग्री सेल्सियस) प्रति 60 मिमी पेट्री डिश का 1 मिलियन मिलियन जोड़ें। उसके बाद, पाचन को रोकने के लिए 10% एफबीएस के साथ पूरक डीएमईएम के 3 एमसीएल जोड़ें।
    2. धीरे-धीरे मिश्रण को एक पिपेट के साथ अनुसूचित जाति को अलग करने के लिए उड़ा दें। फिर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर अनुसूचित जाति को इकट्ठा और अपकेंद्रित्र करें।
    3. सुपरनेट को त्यागें और डीएमईएम के 3 एमसीएल में 10% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 माइक्रोन फोरस्कोलिन और 10 एनजी/एमएल एचआरजी के साथ वर्षा को निलंबित करें, और फिर अनकोटेड 60 एमएम पेट्री डिश में कोशिकाओं को टीका लगाएं। 30-45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर खेती करने के बाद, फाइब्रोब्लास्ट (कुछ संख्या में फाइब्रोब्लास्ट एससी के साथ पचा जाते हैं) पकवान के नीचे से जुड़ते हैं।
    4. सुपरनिटेंट (एससी सहित) को दूसरे पॉली-एल-लिसिन (पीएलएल) में स्थानांतरित करें- लेपित मध्यम डिश और संस्कृति को 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
  9. आइसोलेशन और फाइब्रोब्लास्ट की संस्कृति(चित्रा 1)
    1. अनुसूचित जाति को हटाने के बाद (जैसा कि चरण 1.8 में दिखाया गया है), 1x पीबीएस के साथ व्यंजनों में शेष फाइब्रोब्लास्ट धोएं और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए फाइब्रोब्लास्ट को पचाने के लिए 0.25% (w/v) ट्राइप्सिन के 1 मिलियन जोड़ें।
    2. पाचन समाप्त करने के लिए 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम को जोड़ें। एक पिपेट का उपयोग करके फाइब्रोब्लास्ट को उड़ाएं, और फिर उन्हें 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर इकट्ठा और अपकेंद्री करें।
    3. सुपरनेट को छोड़ दें, 10% एफबीएस वाले डीएमईएम के 2 मिलील के साथ वर्षा को निलंबित करें, और फिर अनकोटेड 60 मिमी पेट्री डिश में कोशिकाओं को टीका लगाएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30-45 मिनट के लिए खेती के बाद फाइब्रोब्लास्ट पकवान के नीचे से देते हैं। सुपरनेट (एससी की कुछ संख्या सहित) को त्याग दें। फिर 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फाइब्रोब्लास्ट डिश और संस्कृति में 10% एफबीएस के साथ पूरक डीएमईएम के 3 एमसीएल जोड़ें।
  10. जब तक वे 90% संगम तक नहीं पहुंच जाते तब तक पी 1 कोशिकाओं को मार्ग करें। फिर उन्हें अंतर पाचन और अंतर पालन द्वारा फिर से शुद्ध के रूप में वर्ग 1.8 और 1.9 में वर्णित है।
  11. 2 दिनों के लिए खेती के बाद P2 फाइब्रोब्लास्ट और एससी को पचा लें, और फिर कोशिकाओं को इकट्ठा करें, गिनती करें और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी) के लिए पीएलएल-लेपित स्लाइड पर 1 x10 5 नंबरों/अच्छी तरह से टीका लगाएं ।

2. सेल शुद्धता की पहचान के लिए आईसीसी

  1. संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं और अंतर पाचन और मोटर और संवेदी फाइब्रोब्लास्ट और अनुसूचित जाति के अंतर पालन के बाद आईसीसी धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
  2. मोटर और संवेदी फाइब्रोब्लास्ट और एससी को 1x पीबीएस के साथ धोएं और उन्हें कमरे के तापमान पर 18 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीएच 7.4) के 200μL/well में ठीक करें।
  3. 0.01 एम पीबीएस में बफर (0.1% ट्राइटन एक्स-100) को अवरुद्ध करने वाले नमूना एससी को ब्लॉक करें और तीन बार पीबीएस के साथ धोने के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए बफर (0.01 एम पीबीएस युक्त 5% बकरी सीरम) को अवरुद्ध करने के साथ नमूना फाइब्रोब्लास्ट को ब्लॉक करें।
  4. अवरुद्ध बफर को हटा दें, और निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें: माउस मोनोक्लोनल एंटी-सीडी 90 एंटीबॉडी (फाइब्रोब्लास्ट के लिए एक विशिष्ट मार्कर) (1:1000) फाइब्रोब्लास्ट और माउस एंटी-S100 एंटीबॉडी (एससी के लिए एक विशिष्ट मार्कर) (1:400) एससी के लिए रात 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी को त्यागें, तीन बार पीबीएस के साथ धोएं, और निम्नलिखित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें: एलेक्सा फ्लोर 594 बकरी एंटी-माउस आईजीजी (1:400) फाइब्रोब्लास्ट के लिए और 488-संयुग्मित बकरी एंटी-माउस आईजीजी (1:400) अनुसूचित जाति के लिए 1.5 एच के लिए कमरे के तापमान पर।
  6. पीबीएस के साथ तीन बार नमूनों को धोएं, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 5 μg/mL Hoechst ३३३४२ डाई के साथ नाभिक दाग । नमूना को तीन बार 1x पीबीएस के साथ धोएं और ग्लास स्लाइड पर बढ़ते माध्यम (20 μL/स्लाइड) का उपयोग करके उन्हें माउंट करें।
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से तीन यादृच्छिक क्षेत्रों में कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप द्वारा सेल तस्वीरों को लें। नाभिक और CD90-सकारात्मक कोशिकाओं, S100-सकारात्मक कोशिकाओं की कुल संख्या का मूल्यांकन करें और फिर क्रमशः CD90-सकारात्मक कोशिकाओं और S100-सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करें। ट्रिपलकेट में धुंधला प्रदर्शन करें।

3. सेल शुद्धता की पहचान के लिए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण (एफसीए)

  1. एफसीए16द्वारा पहले वर्णित मोटर और संवेदी फाइब्रोब्लास्ट और एससी की शुद्धता का मूल्यांकन करें । संक्षेप में, पी 2 मोटर और संवेदी फाइब्रोब्लास्ट और एससी को 0.25% (w/v) ट्राइप्सिन के साथ पचाएं, कोशिका छर्रों को फिर से खर्च करें और उन्हें 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर निर्धारण माध्यम में इनक्यूबेट करें।
  2. क्रमशः 30 मिनट के लिए तापमान पर अनुसूचित जाति के लिए अनुसूचित जाति के लिए माउस मोनोक्लोनल एंटी-सीडी90 एंटीबॉडी (0.1 μg/106 कोशिकाओं, 200 माइक्रोन) का उपयोग करके पारमेबिलाइजेशन माध्यम और जांच के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. 30 मिनट के लिए 488-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। प्रवाह साइटोमेट्री करने के लिए FACS कैलिबर का उपयोग करें, और सेल क्वेस्ट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें।
  4. कोशिकाओं को केवल 488-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी (फाइब्रोब्लास्ट्स ग्रुप) और माउस आईजीजी 1 कापा [एमओपीसी-21] (फिटसी) के साथ इनक्यूबेट करें - आइसोटाइप नियंत्रण (एससी समूह), जो नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।

4. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. सभी डेटा को ± SEM के रूप में प्रस्तुत करें। ग्राफपैड चश्मे 6.0 का उपयोग करके अकर्मित टी-टेस्टद्वारा डेटा में सांख्यिकीय अंतर का आकलन करें। पी &0.05 पर सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करें। ट्रिपलआईटी में सभी परखें करें।

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Representative Results

हल्का सूक्ष्म अवलोकन
अनुसूचित जाति और फाइब्रोब्लास्ट तंत्रिका ऊतकों से प्राथमिक कोशिका संस्कृति में प्राप्त दो मुख्य कोशिका आबादी हैं। 1 घंटे के लिए टीका लगाने के बाद, अधिकांश कोशिकाओं ने पकवान के नीचे का पालन किया, और सेल आकृतिविज्ञान गोल से अंडाकार में बदल गया। 24 घंटे तक खेती करने के बाद, अनुसूचित जाति ने एक द्विध्रुवी या त्रिपोलर आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया और इनकी लंबाई 100 से 200 माइक्रोन तक थी। 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं का एकत्रीकरण और प्रसार हुआ, जिसमें कई कोशिकाओं को अंत से अंत तक, कंधे से कंधे, भंवर या बाड़ जैसी व्यवस्था में एकत्रित किया गया था। अन्य फाइब्रोब्लास्ट जो एससी से बड़े हैं, ने फ्लैट और अनियमित आकार का प्रदर्शन किया। लंबे समय तक संस्कृति के समय के साथ, अनुसूचित जाति और फाइब्रोब्लास्ट की संख्या धीरे-धीरे बढ़ गई थी। अनुसूचित जाति फाइब्रोब्लास्ट के रिक्त स्थान के बीच एक साथ संकुल या फाइब्रोब्लास्ट की सतह पर स्थित थे(चित्रा 2ए, 2B)। कोशिकाओं को अलग फाइब्रोब्लास्ट और अनुसूचित जाति के लिए अंतर पाचन और अंतर पालन के अधीन हैं। 8-10 एस के लिए पाचन के बाद, अनुसूचित जाति गोल के रूप में दिखाई दिया और आसानी से उड़ा रहे हैं, जबकि फाइब्रोब्लास्ट फ्लैट और पकवान के नीचे से जुड़े रहेहै (चित्रा 2सी, 2 डी)। दो बार अंतर पाचन और अंतर पालन के बाद, प्राथमिक सुसंस्कृत एससी और फाइब्रोब्लास्ट को अलग किया गया और मोटर और संवेदी अनुसूचित जाति और फाइब्रोब्लास्ट की विशिष्ट कोशिका आकृतिविज्ञान(चित्रा 2ई-2एच)देखी गई।

आईसीसी द्वारा मोटर और संवेदी फाइब्रोब्लास्ट और एससी की शुद्धता का मूल्यांकन
संवेदी और मोटर फाइब्रोब्लास्ट को CD90 का उपयोग करके लेबल किया गया था और एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप(चित्र 3ए, 3 डी)का उपयोग करके कल्पना की गई थी। होचस्ट 33342 डाई का उपयोग सेल न्यूक्लियस(चित्रा 3बी, 3E)को लेबल करने के लिए किया गया था। फाइब्रोब्लास्ट इम्यूनोस्टेपिंग और न्यूक्लियर स्टेनिंग(चित्रा 3सी, 3एफ)की विलय छवियों ने संकेत दिया कि क्रमशः मोटर और संवेदी फाइब्रोब्लास्ट(चित्रा 3जी)में 92.51% और सीडी 90 और होचस्ट सह-लेबल कोशिकाओं के 92.51% और 92.64% मौजूद थे।

संवेदी और मोटर एससी को S100 का उपयोग करके लेबल किया गया था और क्रमशः एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप(चित्रा 4ए, 4डी)का उपयोग करके कल्पना की गई थी। होचस्ट 33342 डाई का उपयोग सेल न्यूक्लियस(चित्रा 4बी, 4E)को लेबल करने के लिए किया गया था। एससी इम्यूनोस्टेपिंग और न्यूक्लियर स्टेनिंग(चित्रा 4सी, 4F)की विलय छवियों ने मोटर और संवेदी अनुसूचित जाति(चित्रा 4जी)में क्रमशः 91.61% और S100 के 93.56% और होचस्ट सह-लेबल कोशिकाओं की उपस्थिति का संकेत दिया।

एफसीए द्वारा संवेदी और मोटर फाइब्रोब्लास्ट और एससी की शुद्धता का मूल्यांकन
दो बार अंतर पाचन और अंतर पालन के बाद, प्राथमिक सुसंस्कृत फाइब्रोब्लास्ट और अनुसूचित जाति अलग-थलग पड़ गए थे। जैसा कि चित्र 5एमें दिखाया गया है, मोटर और संवेदी एफबी संस्कृति में लगभग और 90% कोशिकाएं फाइब्रोब्लास्ट थीं, जिसे एम2 द्वारा दर्शाया गया था, जबकि शेष & 10% (एम 1 द्वारा इंगित) एससी थे । चित्रा 5बी से पता चला है कि मोटर और संवेदी अनुसूचित जाति संस्कृति में सभी कोशिकाओं के >92% अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति थे, जो M2 द्वारा दर्शाया गया था, जबकि शेष और एलटी;8% (M1 द्वारा इंगित) फाइब्रोब्लास्ट थे ।

Figure 1
चित्रा 1: संवेदी और मोटर फाइब्रोब्लास्ट और अनुसूचित जाति के जुदाई और शुद्धिकरण कदम दिखा योजनाबद्ध आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: चरण-विपरीत माइक्रोग्राफ (ए) प्राथमिक सुसंस्कृत मोटर और (बी) संवेदी फाइब्रोब्लास्ट और एससी की कोशिका आकृति विज्ञान दिखाता है। 10 एस के लिए पाचन के बाद, अनुसूचित जाति की कोशिका आकृति विज्ञान गोल था (जैसा कि तीर द्वारा इंगित किया गया था), जबकि फाइब्रोब्लास्ट फ्लैट बने रहे और पकवान के तल पर जुड़े हुए थे(सी: मोटर फाइब्रोब्लास्ट और एससी; डी: संवेदी फाइब्रोब्लास्ट और एससी)। अंतर पाचन और अंतर पालन के बाद, एससी और फाइब्रोब्लास्ट अलग-थलग पड़ गए और मोटर और संवेदी फाइब्रोब्लास्ट(ई: मोटर फाइब्रोब्लास्ट) की विशिष्ट सेल आकृति विज्ञान; एफ: संवेदी फाइब्रोब्लास्ट) और अनुसूचित जाति(जी: मोटर एससी; एच: संवेदी एससी) दिखाए गए। (स्केल बार: 50 माइक्रोन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: आईसीसी द्वारा मोटर और संवेदी फाइब्रोब्लास्ट की शुद्धता की पहचान । सुसंस्कृत मोटर(ए-सी)और संवेदी फाइब्रोब्लास्ट(डी-एफ)की फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपिक तस्वीरें सीडी 90(ए और डी,लाल), होचस्ट 33342 परमाणु धुंधला(बी और ई,ब्लू) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोसटेनिंग दिखा रही हैं, और दोनों दाग(सी और एफ)का विलय करते हैं। (जी)सुसंस्कृत फाइब्रोब्लास्ट की शुद्धता का सांख्यिकीय विश्लेषण। (स्केल बार: 100 माइक्रोन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: आईसीसी द्वारा मोटर और संवेदी अनुसूचित जाति की शुद्धता की पहचान । सुसंस्कृत मोटर(ए-सी)और संवेदी एससी(डी-एफ)की फ्लोरेसेंस सूक्ष्म तस्वीरें S100(ए और डी,लाल), होचस्ट 33342 परमाणु धुंधला(बी और ई,नीला) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोसटेनिंग दिखा रही हैं, और दोनों धुंधला(सी और एफ)का विलय करते हैं। (जी)सुसंस्कृत अनुसूचित जाति की शुद्धता का सांख्यिकीय विश्लेषण। (स्केल बार: 100 माइक्रोन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एफसीए द्वारा संवेदी और मोटर फाइब्रोब्लास्ट और एससी की शुद्धता की पहचान। एफसीए ग्राफ में सुसंस्कृत मोटर और संवेदी फाइब्रोब्लास्ट/एससी की सीडी90-पॉजिटिव कोशिकाओं (एम2) का प्रतिशत दर्शाया गया है । सुसंस्कृत फाइब्रोब्लास्ट(ए)और एससी(बी)की शुद्धता का सांख्यिकीय विश्लेषण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

परिधीय नसों की दो प्रमुख कोशिका आबादी में एससी और फाइब्रोब्लास्ट शामिल थे । मुख्य रूप से सुसंस्कृत फाइब्रोब्लास्ट और एससी परिधीय तंत्रिका विकास और पुनर्जनन के दौरान फाइब्रोब्लास्ट और एससी के शरीर विज्ञान को मॉडलिंग करने में सटीक सहायता कर सकते हैं। अध्ययन से पता चला है कि P7 चूहा sciatic तंत्रिका कोशिकाओं S100 के बारे में ८५%-सकारात्मक अनुसूचित जाति, OX7 सकारात्मक फाइब्रोब्लास्ट के 13% और OX42 के केवल १.५% पॉजिटिव मैक्रोफेज13निहित । हालांकि फाइब्रोब्लास्ट की संख्या अनुसूचित जाति की तुलना में कम है, लेकिन फाइब्रोब्लास्ट की प्रारंभिक प्रसार दर अनुसूचित जाति की तुलना में तेज है। इसलिए, आरा-सी कई अध्ययनों में फाइब्रोब्लास्ट को हटाने के लिए सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला एंटीमिटोटिक एजेंट है। हालांकि, आरा-सी सेल माइटोसिस के लिए विशिष्ट नहीं है, और यह विभाजन के जोरदार चरण के दौरान अनुसूचित जाति के प्रसार को भी रोक सकता है। एंटीबॉडी-मध्यस्थता साइटोलिसिस या इम्यूनोपैनिंग विधि के साथ, फाइब्रोब्लास्ट या तो खो गए थे या मर गए थे। यद्यपि प्रवाह साइटोमेट्री छंटाई प्रौद्योगिकी का उपयोग एक ही समय में उच्च शुद्धता वाले फाइब्रोब्लास्ट और एससी प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन इसे बड़ी संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, और सेल अधिग्रहण दर कम रही। हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, यह संवेदी और मोटर अनुसूचित जाति और फाइब्रोब्लास्ट की शुद्धि विधि दिखाने के लिए पहला अध्ययन था ।

इस अध्ययन में, अंतर पाचन के साथ-साथ क्रमिक रूप से अंतर पालन के संयोजन से एक ही समय में बड़ी संख्या में संवेदी और मोटर फाइब्रोब्लास्ट और एससी प्राप्त किए गए थे, जिससे कोशिकाओं को कोई नुकसान नहीं हुआ। आईसीसी धुंधला और एफसीए के परिणामों से पता चला है कि सभी संवेदी और मोटर अनुसूचित जाति/फाइब्रोब्लास्ट उच्च शुद्धता के थे (>90%) इस विधि का महत्वपूर्ण कदम अंतर पाचन के समय को नियंत्रित करना है। यदि समय बहुत कम है, तो यह एससी को अलग करना मुश्किल बना देता है, और यदि समय बहुत लंबा है, तो यह कुछ फाइब्रोब्लास्ट को एससी के साथ पचाने का कारण बनता है। Weiss के अध्ययन में, बर्फ ठंड Accutase फाइब्रोब्लास्ट से अनुसूचित जाति अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह ट्रिपसिन17की तुलना में अधिक महंगा है । ट्रिपसिन के साथ अंतर पाचन प्रभावी रूप से एससी और फाइब्रोब्लास्ट को अलग करने में सहायता कर सकता है। इस प्रोटोकॉल की सीमा यह है कि नवजात चूहों से संवेदी और मोटर नसों को उत्पादित करना आसान नहीं है, जिसके लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप के साथ अधिक अभ्यास की आवश्यकता होती है। संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल संवेदी और मोटर तंत्रिका फाइब्रोब्लास्ट और अनुसूचित जाति की जैविक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी है, और तंत्रिका उत्थान को बढ़ावा देने के लिए संवेदी और मोटर तंत्रिका उत्थान या फाइब्रोब्लास्ट और एससी प्रत्यारोपण के तंत्र के लिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (अनुदान संख्या 2017YFA0104703), नेशनल नेचुरल फाउंडेशन ऑफ चाइना (ग्रांट नंबर 31500927) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Life Technologies A11005 Dilution: 1:400
CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Proteintech SA00013-1 Dilution: 1:400
Confocal laser scanning microscope Leica Microsystems TCS SP5
Cell Quest software Becton Dickinson Biosciences
D-Hank's balanced salt solution Gibco 14170112
DMEM Corning 10-013-CV
Dissecting microscope Olympus SZ2-ILST
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10099-141C
Forskolin Sigma F6886-10MG
Fluoroshield Mounting Medium Abcam ab104135
Fixation medium/Permeabilization medium Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD GAS005
Flow cytometry Becton Dickinson Biosciences FACS Calibur
Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control Abcam ab106163 Dilution: 1:400
Mouse monoclonal anti-CD90 antibody Abcam ab225 Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt
Mouse anti-S100 antibody Abcam ab212816 Dilution: 1:400
Polylysine (PLL) Sigma P4832
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein R&D Systems 396-HB-050
0.25% (w/v) trypsin Gibco 25200-072

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References

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रिऐक्शन इश्यू 159 संवेदी श्वान कोशिकाएं मोटर श्वान कोशिकाएं संवेदी फाइब्रोब्लास्ट मोटर फाइब्रोब्लास्ट सेल कल्चर पेरिफेरल नर्वस सिस्टम
विट्रो में संवेदी और मोटर नसों से फाइब्रोब्लास्ट और श्वार्न कोशिकाओं का शुद्धिकरण
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He, Q., Yu, F., Li, Y., Sun, J.,… More

He, Q., Yu, F., Li, Y., Sun, J., Ding, F. Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro. J. Vis. Exp. (159), e60952, doi:10.3791/60952 (2020).

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