Summary
在这里，我们提出了一种方法，从体外感觉和运动神经中纯化成纤维细胞和Schwann细胞。
Abstract
周围神经系统的主要细胞是施万细胞（SCs）和成纤维细胞。这两个细胞都清楚地表达在神经营养因子基因表达和其他生物过程的不同模式中涉及的感官和运动表型，影响神经再生。本研究已建立一种方案，以更快获得高度纯化的老鼠感官和运动SCS和成纤维细胞。新生儿大鼠的腹根（运动神经）和后根（感觉神经）分离，细胞培养4-5天，随后通过组合差分消化和差分粘附方法分离感觉和运动成纤维细胞和SC。免疫细胞化学和流式细胞学分析结果表明，感觉和运动SCs和成纤维细胞的纯度为>90%。该协议可用于获得大量的感官和运动成纤维细胞/SCs更快，有助于探索感官和运动神经再生。
Introduction
在外周神经系统中，神经纤维主要由轴子、施万细胞（SCs）和成纤维细胞组成，还含有少量的巨噬细胞、微血管内皮细胞和免疫细胞1。SCs 以 1：1 的比例包裹轴子，并由称为内结组织层的连接组织层封闭。轴子然后捆绑在一起形成称为分柱的组，每个分膜被包裹在称为"内皮"的结缔组织层中。最后，整个神经纤维被包裹在一层结缔组织中，称为肾上腺素。在末体中，整个细胞群体由48%的SC组成，其余细胞中相当一部分涉及成纤维细胞2。此外，成纤维细胞是所有神经隔间的重要组成部分，包括肾上腺素、内膜和内膜3。许多研究表明，在外周神经损伤4、5、6之后，SCs和成纤维细胞4在再生过程中起着至关重要的作用。外周神经转切后，周利尿成纤维细胞通过SCs和成纤维细胞之间的ephrin-B/EphB2信号通路调节细胞分选，进一步引导弓弦再生通过伤口5。外周神经成纤维细胞分泌泰纳辛-C蛋白，并通过+1-integrin信号通路7增强SCs在神经再生期间的迁移。然而，上述研究中使用的SCs和成纤维细胞来自坐骨神经，包括感觉神经和运动神经。
在外周神经系统中，感觉神经（发热神经）从受体到中枢神经系统（CNS）进行感官信号，而运动神经（发热神经）则从CNS传导到肌肉的信号。先前的研究表明，SCs表达不同的运动和感官表型和分泌神经营养因子，以支持周围神经再生,8，9。根据最近的一项研究，成纤维细胞也表达不同的运动和感官表型，并影响SC10的迁移。因此，探索运动和感觉神经成纤维细胞/SCs之间的差异使我们能够研究周围神经特异性再生的复杂底层分子机制。
目前，有许多方法可以净化SCs和成纤维细胞，包括应用抗米氏剂、抗体中联细胞分析11、12、,12顺序免疫平移13和层压基14。然而，上述所有方法都去除成纤维细胞，只保留SCs。高度纯化的SC和成纤维细胞可以通过流式细胞分理技术获得，但它是一种耗时且昂贵的技术。因此，在这项研究中，开发了一种简单的差分消化和差分粘附方法，用于净化和隔离感觉和运动神经成纤维细胞和SC，以便更快获得大量的成纤维细胞和SC。
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Protocol
本研究是根据南通大学《机构动物保护指南》进行的。包括动物主体在内的所有程序都经过中国江苏省实验动物管理委员会的道德批准。
1. 运动和感觉神经成纤维细胞和SC的隔离与培养
- 使用中国南通大学实验动物中心提供的七天大的斯普拉格-道利（SD）大鼠（n=4）。将大鼠放在含有5%异氟素的水箱中2-3分钟，让动物缓慢呼吸，没有独立活动，然后在斩首前使用75%乙醇进行消毒。
- 使用剪刀切割背部皮肤约3厘米，并删除脊柱。小心打开椎管，露出脊髓。
- 使用 2-3 mL 的冷 D-汉克斯平衡盐溶液 （HBS） 将脊髓保持在 60 mm 培养皿中。
- 根据解剖结构，在解剖显微镜下切除腹根（运动神经），然后切除后根（感觉神经）。接下来，将它们放在冰冷的D-汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中。
- 取出HPSS后，用剪刀将神经切成3-5毫米，并在37°C下用1 mL 0.25%（w/v）的尝试消化18-20分钟。接下来，补充含有10%胎儿牛血清（FBS）的3-4 mL DMEM，以停止消化。
- 轻柔地上下移液约10次，以800 x g离心5分钟。之后，丢弃上经剂，在2-3 mL的DMEM中悬浮沉淀物，并辅以10%的FBS。
- 使用 400 网格过滤器过滤细胞悬浮液，然后在 5% CO2存在的情况下在 60 mm 培养皿中接种细胞和培养物。经过4-5天的培养，在达到90%汇合后分离通道0（p0）成纤维细胞和SC。
- SC 的隔离与培养（ 图 1）
- 使用 1x PBS 清洗细胞一次。每60毫米培养皿加入1 mL 0.25%（w/v）三辛（37°C），在室温下消化细胞8-10 s。之后，加入3 mL的DMEM，辅以10%的FBS，以停止消化。
- 轻轻吹吹混合物，用移液器分离 SC。然后以 800 x g 的 800 x g 收集并离心 SCs 5 分钟。
- 丢弃上一甲酸酯，用10%FBS、1%青霉素/链霉素、2μM福斯科林和10纳克/mL HRG悬浮在3 mL的DMEM中，然后在未涂覆的60毫米培养皿中接种细胞。在37°C下培养30-45分钟后，成纤维细胞（少数成纤维细胞用SC消化）附在菜底。
- 将上一液（包括SC）转移到另一个聚L-lysine（PLL）涂层的中盘和培养物，在37°C下进行2天。
- 成纤维细胞的隔离与培养（ 图1）
- 取出 SC 后（如步骤 1.8 所示），用 1x PBS 清洗菜中剩余的成纤维细胞，然后加入 1 mL 的 0.25% （w/v） trypsin，在 37 °C 下消化成纤维细胞 2 分钟。
- 添加DMEM辅以10%FBS，以结束消化。使用移液器吹出成纤维细胞，然后以 800 x g 收集并离心5 分钟。
- 丢弃上一杯，用含有10%FBS的2 mL DMEM悬浮沉淀物，然后在未涂覆的60毫米培养皿中接种细胞。培养30-45分钟后，在37°C附着在菜底的成纤维细胞。丢弃上一页（包括数个 SC）。然后加入3 mL的DMEM，并辅以10%的FBS到成纤维细胞菜和培养在37°C2天。
- 通过p1细胞，直到它们达到90%的汇合。然后再次通过差分消化和差分粘附来净化它们，如第 1.8 节和 1.9 节所述。
- 在培养2天后消化p2成纤维细胞和SC，然后收集细胞，计数和接种1 x 105个数字/井在PLL涂层幻灯片上进行免疫细胞化学（ICC）。
2. 国际商会鉴定细胞纯度
- 在37°C下培养细胞24小时，在运动和感觉成纤维细胞和SC的差分消化和差分粘附后进行ICC染色。
- 用 1x PBS 清洗电机和感觉成纤维细胞和 SCs，并在室温下在 200 μL/4% 甲醛 （pH 7.4） 的井中固定 18 分钟。
- 用阻断缓冲液阻断样品SC（0.01 M PBS中的0.1%Triton X-100，含有5%山羊血清），用阻塞缓冲液（含有5%山羊血清的0.01 M PBS）阻断样本成纤维细胞，用PBS三次洗涤后，在37°C下阻断45分钟。
- 去除阻断缓冲液，用以下原抗体孵育：小鼠单克隆抗CD90抗体（成纤维细胞的特定标记物）（1：1000），用于成纤维细胞和小鼠抗S100抗体（SCs的特定标记物）（1：400），在4°C下为SC。
- 丢弃原抗体，用PBS洗涤三次，用以下二次抗体孵育：Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG（1：400）用于成纤维细胞，488结合山羊抗小鼠IgG（1：400）用于SC，室温为1.5小时。
- 用 PBS 将样品洗涤三次，并在室温下用 5 μg/mL Hoechst 33342 染料将原子核染色 10 分钟。用 1x PBS 三次清洗样品，并使用玻璃滑梯上的安装介质（20 μL/滑动）安装样品。
- 通过共和激光扫描显微镜对每一井进行三个随机场拍摄细胞照片。评估核和CD90阳性细胞的总数，S100-阳性细胞，然后分别计算CD90阳性细胞和S100阳性细胞的百分比。在三钙中进行染色。
3. 流式细胞仪分析（FCA），用于识别细胞纯度
- 评估电机和感觉成纤维细胞和SCs的纯度，如FCA16前面所述。简言之，用0.25%（w/v）三辛消化p2电机和感觉成纤维细胞和SC，重新暂停细胞颗粒，并在室温下在固定介质中孵育15分钟。
- 用渗透介质孵育细胞，并在室温下分别用小鼠单克隆抗CD90抗体（0.1μg/106细胞、200 μL）为成纤维细胞和小鼠抗S100抗体（1：400，200μL）进行探针，用于SC30分钟。
- 用488个结合山羊抗小鼠IgG孵育细胞30分钟，使用FACS口径进行流式细胞测量，并使用细胞任务软件分析数据。
- 仅用488个结合山羊抗小鼠IgG（成纤维细胞组）和小鼠IgG1卡帕（MOPC-21]（FITC）-异型控制（SCs组）孵育细胞，作为负对照。
4. 统计分析
- 以方法形式显示所有数据 = Sem. 使用 GraphPad 棱镜 6.0 使用未配对t- test 评估数据的统计差异。在 p p<0.05 设置统计显著性。在三者中执行所有检测。
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Representative Results
光显微观察
SCs和成纤维细胞是从神经组织中获得的原细胞培养中的两个主要细胞群。接种1小时后，大部分细胞粘附在培养皿底部，细胞形态由圆形改为椭圆形。经过24小时培养后，SCs表现出双极性或三极形态，其长度从100微米到200μm之间。48小时后，细胞发生聚集和增殖，其中许多细胞被聚合在端到端，肩对肩，漩涡或围栏一样排列。其他比SCS大的成纤维细胞呈现出扁平和不规则的形状。随着养殖时间延长，SC和成纤维细胞的数量逐渐增加。SC 聚集在成纤维细胞空间之间或位于成纤维细胞表面（图 2A，2B）。细胞接受差分消化和差分粘附，以分离成纤维细胞和SC。消化8-10s后，SCs出现为圆形，很容易被吹掉，而成纤维细胞是平的，并连接到盘子的底部（图2C，2D）。在两次差分消化和差分粘附后，分离出原培养的SC和成纤维细胞，并观察了运动和感觉SC和成纤维细胞的典型细胞形态（图2E-2H）。
ICC对电机和感官成纤维细胞和SCs纯度的评价
感觉和运动成纤维细胞使用CD90进行标记，并使用共声激光扫描显微镜进行可视化（图3A，3D）。Hoechst 33342 染料用于标记细胞核（图 3B，3E）。合并的成纤维细胞免疫染色和核染色图像（图3C，3F）显示，在运动细胞和感觉成纤维细胞中分别存在92.51%和92.64%的CD90和霍赫斯特共同标记细胞（图3G）。
感觉和电机SC使用S100进行标记，并分别使用共声激光扫描显微镜（图4A、4D）进行可视化。Hoechst 33342 染料用于标记细胞核（图 4B，4E）。SC免疫染色和核染色的合并图像（图4C，4F）显示，在运动和感官SCs中，S100和霍赫斯特共同标记的细胞分别存在91.61%和93.56%（图4G）。
FCA对感官和运动成纤维细胞和SCs的纯度评价
经过两次差分消化和差分粘附，分离了原培养的成纤维细胞和SC。如图5 Figure 5A所示，运动和感觉 Fb 培养中几乎 >90% 的细胞是成纤维细胞， 由 M2 指示，而其余 <10% （由 M1 表示）为 SCs。 图5B显示，电机和感觉 SC 培养中所有细胞的 >92% 是 SCs，由 M2 指示，其余 <8%（由 M1 指示）为成纤维细胞。
图1：示意图显示感觉和电机成纤维细胞和SC的分离和纯化步骤。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：相位对比显微图，显示（A）原培养电机和（B）感觉成纤维细胞和SC的细胞形态。消化10后，SCs的细胞形态是圆形的（如箭头所示），而成纤维细胞保持平坦，并附着在培养皿的底部（C：电机成纤维细胞和SC;D：感官纤维细胞和SC）。在差分消化和差分粘附后，分离SCs和成纤维细胞，分离运动细胞和感觉纤维细胞的典型细胞形态（E：运动纤维细胞;F：感官成纤维细胞）和SC（G：电机SC;H：显示感官 SCs）。（缩放栏：50 μm）。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：ICC对电机和感觉成纤维细胞纯度的鉴定。培养电机（A-C） 和感觉纤维细胞（D-F）的荧光显微照片显示免疫染色与抗体对 CD90（A 和 D， 红色）， Hoechst 33342 核染色（B 和 E，蓝色）， 并合并染色（C和F）.（G） 培养成纤维细胞纯度的统计分析.（缩放栏：100 μm）。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：ICC对电机和感官SC的纯度进行鉴定。培养电机（A-C）和感觉 SCs（D-F）的荧光显微照片显示免疫染色与抗体对 S100（A 和 D， 红色）， Hoechst 33342 核染色（B和E，蓝色）， 并合并染色（C和F）。（G） 培养性SC的纯度统计分析（比例杆：100μm）。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：FCA鉴定感觉和运动成纤维细胞和SC的纯度。FCA 图显示培养马达和感觉成纤维细胞/SCs 的 CD90 阳性细胞/S100 阳性细胞 （M2） 的百分比。AB请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
周围神经的两个主要细胞群包括SC和成纤维细胞。主要培养的成纤维细胞和SC可以准确地帮助在外周神经发育和再生期间对成纤维细胞和SC的生理学进行建模。研究表明，P7大鼠坐骨神经细胞含有约85%的S100阳性SCs，13%的OX7阳性成纤维细胞和只有1.5%的OX42阳性巨噬细胞13。虽然成纤维细胞的数量小于SCs，但成纤维细胞的初始增殖率比SCs快。因此，Ara-C是许多研究中最常用的抗米蒂剂，用于去除成纤维细胞。然而，Ara-C并不特定于细胞线粒体，它也可以抑制SC在分裂阶段的激增。使用抗体调节细胞解或免疫平移方法，成纤维细胞要么丢失，要么死亡。虽然流式细胞分理技术可用于同时获得高纯度成纤维细胞和SC，但它需要大量的细胞，细胞采集率仍然很低。据我们所知，这是首次研究传感器和运动SCS和成纤维细胞的纯化方法。
在这项研究中，通过组合差分消化和差分粘附顺序，同时获得了大量的感官和运动成纤维细胞和SC，对细胞没有造成任何伤害。ICC染色和FCA的结果表明，所有的感官和运动SCs/纤维细胞都是高纯度的（>90%）。这种方法的关键步骤是控制差分消化的时间。如果时间太短，它使SC难以分离，如果时间太长，它会导致一些成纤维细胞与SC消化。在韦斯的研究中，冰冷的Acutase用于将SC从成纤维细胞中分离出来，但这比尝试酶17贵。使用三辛的差分消化可以有效地帮助分离SC和成纤维细胞。该协议的局限性是，从新生儿大鼠身上切除感觉神经和运动神经并不容易，这需要更多的解剖显微镜练习。培养方案对于研究感觉和运动神经成纤维细胞和SC的生物特征，以及感觉和运动神经再生或成纤维细胞和SC移植的机制，促进神经再生非常有用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了中国国家重点研究发展计划（赠款2017YFA0104703），中国国家自然基金会（赠款号31500927）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
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