Summary
Her presenterer vi en metode for å rense fibroblaster og Schwann-celler fra sensoriske og motoriske nerver in vitro.
Abstract
Hovedcellene i det perifere nervesystemet er Schwann-cellene (SCs) og fibroblastene. Begge disse cellene uttrykker tydelig sensoriske og motoriske fenotyper involvert i ulike mønstre av nevrotrofisk faktor genuttrykk og andre biologiske prosesser, som påvirker nerveregenerering. Den nåværende studien har etablert en protokoll for å oppnå svært renset rotte sensorisk og motor SCer og fibroblaster raskere. Den ventrale roten (motornerven) og dorsalroten (sensorisk nerve) av nyfødte rotter (7 dager gamle) ble dissosiert og cellene ble dyrket i 4-5 dager, etterfulgt av isolering av sensoriske og motorfibroblaster og SCer ved å kombinere differensial fordøyelse og differensialtilslutningsmetoder sekvensielt. Resultatene av immunocytokjemi og flow cytometri analyser viste at renheten av sensoriske og motoriske SCer og fibroblaster var > 90%. Denne protokollen kan brukes til å oppnå et stort antall sensoriske og motoriske fibroblaster / SCer raskere, noe som bidrar til utforskning av sensorisk og motornerve regenerering.
Introduction
I det perifere nervesystemet består nervefibrene hovedsakelig av aksoner, Schwann-celler (SCer) og fibroblaster, og inneholder også et lite antall makrofager, mikrovaskulære endotelceller og immunceller1. SCs bryte aksoner i en 1: 1 ratio og er omsluttet av en bindevev lag kalt endoneurium. Aksonene er deretter samlet sammen for å danne grupper kalt fascicles, og hver fascicle er pakket inn i et bindevev lag kjent som perineurium. Til slutt er hele nervefiberen pakket inn i et lag med bindevev, som kalles epineurium. I endoneurium består hele cellepopulasjonen av 48% SCer, og en betydelig del av de gjenværende cellene innebærer fibroblaster2. Videre er fibroblaster viktige komponenter i alle nerverom, inkludert epineurium, perineurium og endoneurium3. Mange studier har indikert at SCer og fibroblaster spiller en avgjørende rolle i regenereringsprosessen etter perifere nerveskader4,5,6. Etter transeksjon av perifer nerve, perineurial fibroblasts regulere celle sortering via ephrin-B/EphB2 signalveien mellom SCs og fibroblaster, ytterligere guiding den axonal gjenvekst gjennom sår5. Perifer nerve fibroblaster utskiller tenascin-C protein og forbedre migrering av SCs under nerve regenerering gjennom β1-integrin signalvei7. Imidlertid ble SCs og fibroblaster som brukes i de ovennevnte studiene avledet fra isjiasnerven, som inkluderer både sensoriske og motoriske nerver.
I det perifere nervesystemet utfører sensoriske nerver (afferent nerver) sensorisk signalering fra reseptorene til sentralnervesystemet (CNS), mens motornervene (efferent nerver) utfører signaler fra CNS til musklene. Tidligere studier har indikert at SCs uttrykker distinkte motoriske og sensoriske fenotyper og utskiller nevrotrofiske faktorer for å støtte perifer nerveregenerering8,9. Ifølge en nylig studie, fibroblaster også uttrykke ulike motoriske og sensoriske fenotyper og påvirke migrering av SCs10. Dermed gjør utforskning av forskjeller mellom motoriske og sensoriske nervefibroblaster / SCer oss til å studere de kompliserte underliggende molekylære mekanismene for perifer nervespesifikk regenerering.
I dag er det mange måter å rense SCs og fibroblaster, inkludert anvendelse av antimitotiske midler, antistoffmediert cytolyse11,,12,sekvensiell immunopanning13 og laminin substratum14. Men alle de ovennevnte metodene fjerner fibroblaster og bevarer bare SCs. Høyt renset SCs og fibroblaster kan oppnås ved strømningscytometrisorteringsteknologi15, men det er en tidkrevende og kostbar teknikk. Derfor, i denne studien, en enkel differensial fordøyelse og differensial etterlevelse metode for rensing og isolere sensorisk og motor nerve fibroblaster og SCs ble utviklet for å få et stort antall fibroblaster og SCs raskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i samsvar med Institusjonelle Animal Care Guidelines of Nantong University. Alle prosedyrene, inkludert dyrefagene, ble etisk godkjent av administrasjonskomiteen for eksperimentelle dyr, Jiangsu-provinsen i Kina.
1. Isolasjon og kultur av motoriske og sensoriske nervefibroblaster og SCer
- Bruk syv-dagers gamle Sprague-Dawley (SD) rotter (n = 4) levert av Experimental Animal Center of Nantong University of China. Plasser rottene i en tank som inneholder 5% isofluran i 2-3 minutter, la dyrene puste sakte og har ingen uavhengig aktivitet, og deretter rense ved hjelp av 75% etanol før halshugging.
- Bruk saks til å kutte bakhuden i ca 3 cm og fjern ryggsøylen. Åpne vertebralkanalen forsiktig for å eksponere ryggmargen.
- Oppretthold ryggmargen i en 60 mm petriskål med 2-3 ml iskald D-Hanks' balanserte saltløsning (HBSS).
- Basert på den anatomiske strukturen, forbruker den ventrale roten (motornerven) og deretter dorsalroten (sensorisk nerve) under et dissekere mikroskop. Deretter plasserer du dem i en iskald D-Hanks' balanserte saltløsning (HBSS).
- Etter at HBSS har fjernet, skjærer du nervene i 3-5 mm stykker med saks og fordøyer med 1 ml 0,25 % (w/v) trypsin ved 37 °C i 18-20 min. Deretter supplere med 3-4 ml DMEM som inneholder 10% foster storfe serum (FBS) for å stoppe fordøyelsen.
- Pipetten blandingen opp og ned forsiktig ca 10 ganger og sentrifuger ved 800 x g i 5 min. Deretter kast supernatanten og suspender utfellingen i 2-3 ml DMEM supplert med 10% FBS.
- Filtrer cellefjæringen ved hjelp av et 400-nettfilter, og inokuler cellene i 60 mm Petriskål og kultur ved 37 °C i nærvær av 5 % CO2. Etter 4-5 dager med kulturing, isolere passasjen 0 (p0) fibroblaster og SCs etter å ha nådd 90% samløpet.
- Isolasjon og kultur av SCer (Figur 1)
- Vask cellene én gang ved hjelp av 1x PBS. Tilsett 1 ml 0,25 % (w/v) trypsin (37 °C) per 60 mm Petriskål for å fordøye cellene i 8-10 s ved romtemperatur. Deretter legger du til 3 ml DMEM supplert med 10% FBS for å stoppe fordøyelsen.
- Blås forsiktig blandingen for å løsne SC-ene med en pipette. Deretter samle og sentrifugere SCs på 800 x g i 5 min.
- Kast supernatanten og overse bunnfallet i 3 ml DMEM med 10 % FBS, 1 % penicillin/streptomycin, 2 μM forskolin og 10 ng/ml HRG, og inokuler deretter cellene i ubestrøket 60 mm petriskål. Etter kulturing ved 37 °C i 30-45 min, fibroblasts (et par antall fibroblaster er fordøyd med SCs) feste til bunnen av parabolen.
- Overfør supernatanten (inkludert SCer) til en annen poly-L-lysin (PLL)-belagt mellomrett og kultur ved 37 °C i 2 dager.
- Isolasjon og kultur av fibroblaster (Figur 1)
- Etter å ha fjernet SCs (som vist i trinn 1.8), vask de resterende fibroblastene i oppvasken med 1x PBS og tilsett deretter 1 ml 0,25% (w / v) trypsin for å fordøye fibroblastene i 2 min ved 37 °C.
- Legg DMEM supplert med 10% FBS for å avslutte fordøyelsen. Blås fibroblaster ved hjelp av en pipette, og samle og deretter samle og sentrifugere dem på 800 x g i 5 min.
- Kast supernatanten, hold utfellingen med 2 ml DMEM som inneholder 10 % FBS, og inokuler cellene i ubestrøket 60 mm petriskål. Fibroblaster etter kulturing i 30-45 min ved 37 °C feste til bunnen av fatet. Kast supernatanten (inkludert noen få mengder SCer). Tilsett deretter 3 ml DMEM supplert med 10% FBS i fibroblasterretten og kulturen ved 37 °C i 2 dager.
- Passer p1-cellene til de nådde 90% samløpet. Deretter rense dem ved differensial fordøyelse og differensial etterlevelse igjen som beskrevet i pkt. 1.8 og 1.9.
- Fordøy p2 fibroblasts og SCs etter kulturing i 2 dager, og samle deretter cellene, telle og inokulere i 1 x 105 tall / godt på PLL-belagt lysbilder for immunocytokchemistry (ICC).
2. ICC for identifisering av cellerenhet
- Kultur cellene for 24 h ved 37 °C og utfør ICC-farging etter differensial fordøyelse og differensialtilslutning av motoriske og sensoriske fibroblaster og SCer.
- Vask motoren og sensoriske fibroblaster og SCer med 1x PBS og fest dem i 200 μL/ brønn på 4% paraformaldehyd (pH 7.4) i 18 min ved romtemperatur.
- Blokker prøve-PCC-ene med blokkeringsbuffer (0,1 % Triton X-100 i 0,01 M PBS som inneholder 5 % geitesterum) og blokker prøvefibroslene med blokkeringsbuffer (0,01 M PBS som inneholder 5 % geitesterum) i 45 min ved 37 °C etter å ha vasket dem med PBS tre ganger.
- Fjern blokkeringsbufferen og inkuber med følgende primære antistoffer: mus monoklonalt anti-CD90 antistoff (en bestemt markør for fibroblaster) (1:1000) for fibroblaster og musanti-S100 antistoff (en bestemt markør for SCer) (1:400) for SCer ved 4 °C over natten.
- Kast de primære antistoffene, vask med PBS tre ganger og inkuber med følgende sekundære antistoffer: Alexa Fluor 594 geit anti-mus IgG (1:400) for fibroblaster og 488-konjugert geit anti-mus IgG (1:400) for SCer ved romtemperatur for 1,5 h.
- Vask prøvene tre ganger med PBS, og flekker kjernene med 5 μg/ml Hoechst 33342 fargestoff i 10 min ved romtemperatur. Vask prøven med 1x PBS tre ganger og monter dem med monteringsmediet (20 μL/slide) på glasssklie.
- Ta cellefotografiene ved konfusersk laserskanning mikroskop i tre tilfeldige felt for hver brønn. Evaluer det totale antallet kjerner og CD90-positive celler, S100-positive celler og beregn deretter prosentandelen av CD90-positive celler og S100-positive celler. Utfør fargingen i triplicate.
3. Flow cytometrianalyse (FCA) for identifisering av cellerenhet
- Evaluer renheten av motoriske og sensoriske fibroblaster og SCer som beskrevet tidligere av FCA16. Kort, fordøye p2 motor og sensoriske fibroblaster og SCer med 0,25% (w / v) trypsin, resuspend celle pellets og inkubere dem i fiksering medium ved romtemperatur i 15 min.
- Inkuber cellene med permeabiliseringsmedium og sonde ved hjelp av mus monoklonalt anti-CD90 antistoff (0,1 μg/106 celler, 200 μL) for fibroblaster og musanti-S100 antistoff (1:400, 200 μL) for stifter ved romtemperatur i henholdsvis 30 min.
- Inkuber cellene med 488-konjugert geit anti-mus IgG i 30 min. Bruk FACS kaliber til å utføre flyt cytometri, og analysere dataene ved hjelp av Cell Quest programvare.
- Inkuber cellene bare med 488-konjugert geit anti-mus IgG (fibroblaster Gruppe) og mus IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype kontroll (SCs gruppe), som fungerer som negativ kontroll.
4. Statistisk analyse
- Presenter alle data som midler ± SEM. Vurder statistiske forskjeller i dataene ved å ikke-vurdere ulønnet t-testved hjelp av GraphPad Prism 6.0. Angi statistisk signifikans på p<0,05. Utfør alle analyser i triplicate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lett mikroskopisk observasjon
SCs og fibroblaster er de to viktigste cellepopulasjonene oppnådd i den primære cellekulturen fra nervevev. Etter inokulasjon i 1 h, holdt de fleste cellene seg til bunnen av parabolen, og cellemorfologien endret seg fra rund til oval. Etter å ha kultisert i 24 timer, viste SCs en bipolar eller tripolar morfologi og lengden på disse varierte fra 100 til 200 μm. Etter 48 timer oppstod aggregering og spredning av celler, der mange celler ble aggregert i en ende-til-ende, skulder-til-skulder, boblebad eller gjerdelignende arrangement. De andre fibroblaster som er større enn SCs utstilt flat og uregelmessig form. Med lengre kulturtid ble antall SCer og fibroblaster gradvis økt. SCs ble gruppert sammen mellom rom av fibroblaster eller plassert på overflaten av fibroblaster (Figur 2A, 2B). Cellene blir utsatt for differensial fordøyelse og differensialtilslutning for å isolere fibroblaster og SCer. Etter fordøyelsen i 8-10 s, SCs dukket opp som rund og blåses av lett, mens fibroblaster er flat og festet til bunnen av fatet (Figur 2C, 2D). Etter differensial fordøyelse og differensial etterlevelse to ganger, ble de primære kultiverte SCer og fibroblaster isolert og den typiske cellemorfologien til motoriske og sensoriske SCer og fibroblaster ble observert (Figur 2E-2H).
Evaluering av renhet av motoriske og sensoriske fibroblaster og SCer fra ICC
Sensoriske og motoriske fibroblaster ble merket ved hjelp av CD90 og visualisert ved hjelp av et konfusisk laserskanningsmikroskop (figur 3A, 3D). Hoechst 33342 fargestoff ble brukt til å merke cellekjernen (Figur 3B, 3E). De sammenslåtte bildene av fibroblast immunostaining og kjernefysisk farging (Figur 3C, 3F) indikerte at 92,51% og 92,64% av CD90 og Hoechst co-labeled celler var til stede i motoren og sensoriske fibroblaster (Figur 3G), henholdsvis.
Sensoriske og motoriske SCer ble merket med S100 og visualisert ved hjelp av et konfusisk laserskanningsmikroskop ( henholdsvisfigur 4A, 4D). Hoechst 33342 fargestoff ble brukt til å merke cellekjernen (figur 4B, 4E). De sammenslåtte bildene av SC immunostaining og kjernefysisk farging (Figur 4C, 4F) indikerte tilstedeværelsen av henholdsvis 91,61 % og 93,56 % av S100 og Hoechst medmerkede celler i motor- og sensoriske SCer (figur 4G).
Evaluering av renhet av sensoriske og motoriske fibroblaster og SCer av FCA
Etter differensial fordøyelse og differensial etterlevelse to ganger, ble de primære kultiverte fibroblastene og SCs isolert. Som vist i figur 5Avar nesten > 90% av cellene i motoren og sensorisk Fb-kulturen fibroblaster, som ble indikert av M2, mens de resterende <10 % (indikert av M1) var SCer. Figur 5B viste at >92 % av alle cellene i motoren og sensorisk SC-kultur var SCer, som ble indikert av M2, mens de resterende <8 % (indikert av M1) var fibroblaster.
Figur 1: Det skjematiske diagrammet som viser separasjons- og rensetrinnene til sensoriske og motoriske fibroblaster og SCer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Mikrograf i fasekontrast som viser cellemorfologien til (A) primærdyrkært motor og (B) sensoriske fibroblaster og SCer. Etter fordøyelsen i 10 s, cellen morfologi av SCs var rund (som angitt av pilene), mens fibroblaster forble flat og var festet på bunnen av parabolen (C: Motor fibroblasts og SCs; D: Sensoriske fibroblaster og SCer). Etter differensial fordøyelse og differensial etterlevelse ble SCs og Fibroblaster isolert og den typiske cellemorfologien til motoriske og sensoriske fibroblaster (E: Motor fibroblaster; F: Sensoriske fibroblaster) og SCer (G: Motor SCs; H: Sensoriske SCer) ble vist. (Skala bar: 50 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Identifikasjon av renhet av motoriske og sensoriske fibroblaster av ICC. Fluorescens mikroskopiske fotografier av kultivert motor (A-C) og sensoriske fibroblaster (D-F) som viser immunostaining med antistoffer mot CD90 (A og D, rød), Hoechst 33342 kjernefysisk farging (B og E, blå), og sammenslåing av både farging (C og F). (G) Statistisk analyse av renhet av kultiverte fibroblaster. (Skala bar: 100 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Identifikasjon av renhet av motor- og sensoriske SCer fra ICC. Fluorescens mikroskopiske fotografier av kultivert motor (A-C) og sensoriske BRIKKER (D-F) som viser immunosier med antistoffer mot S100 (A og D, rød), Hoechst 33342 kjernefysisk farging (B og E, blå), og sammenslåing av både farging (C og F). (G) Statistisk analyse av renhet av kultiverte SCer. (Skala bar: 100 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Identifikasjon av renhet av sensoriske og motoriske fibroblaster og SCer av FCA. FCA-grafen som viser prosentandelen av CD90-positive celler/S100-positive celler (M2) av kultivert motor og sensorisk fibroblaster/SCer. Statistisk analyse av renhet av kultiverte fibroblaster (A) og SCer (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De to store cellepopulasjonene av perifere nerver inkluderte SCer og fibroblaster. De primært kultiverte fibroblaster og SCer kan nøyaktig bidra til å modellere fysiologien til fibroblaster og SCer under perifer nerveutvikling og regenerering. Studien viste at P7 rotte isjias nerveceller inneholdt ca 85% av S100-positive SCs, 13% av OX7-positive fibroblaster og bare 1,5% av OX42-positive makrofager13. Selv om antall fibroblaster er mindre enn SCs, den første spredningshastigheten av fibroblaster er raskere enn for SCs. Derfor er Ara-C det mest brukte antimetitotiske middelet for fjerning av fibroblaster i mange studier. Ara-C er imidlertid ikke spesifikk for cellemittose, og det kan også hemme spredning av SCer under kraftig divisjonsstadium. Med antistoffmediert cytolyse eller immunopanning metode, fibroblasts enten gikk tapt eller døde. Selv om flow cytometri sorteringsteknologi kan brukes til å oppnå høy renhet fibroblaster og SCer samtidig, den trenger et stort antall celler, og celleoppkjøpshastigheten forble lav. Så vidt vi vet, var dette den første studien som viste rensemetoden for sensoriske og motoriske SCer og fibroblaster.
I denne studien ble et stort antall sensoriske og motorfibroblaster og SCer oppnådd samtidig ved å kombinere differensial fordøyelse samt differensialtilslutning sekvensielt, forårsaker ingen skade på cellene. Resultatene av ICC farging og FCA viste at alle sensoriske og motoriske SCer / fibroblaster var av høy renhet (> 90%). Det kritiske trinnet for denne metoden er å kontrollere tidspunktet for differensial fordøyelse. Hvis tiden er for kort, gjør det SCs vanskelig å løsne, og hvis tiden er for lang, det fører til noen fibroblaster å fordøye med SCs. I Weisss studie brukes iskalde Accutase til å løsne SCer fra fibroblaster, men dette er dyrere enn trypsin17. Differensial fordøyelse med trypsin kan effektivt bidra til å skille SCer og fibroblaster. Begrensningen av denne protokollen er at det ikke er lett å avgiftsdirektoratet sensorisk og motornervene fra nyfødte rotter, noe som krever mer praksis med dissekeremikroskopet. Protokollen for dyrking er svært nyttig for å studere de biologiske egenskapene til sensoriske og motoriske nervefibroblaster og SCer, og for mekanismen for sensorisk og motorisk nerve regenerering eller fibroblaster og SCs transplantasjon for å fremme nerveregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), National Natural Foundation of China (Grant No. 31500927).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
References
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
- Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
- Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
- Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
- Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
- Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
- Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
- He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016 (2018).
- Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
- Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
- Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
- Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
- He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
- Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).
