Summary
Burada, fibroblastlar ve Schwann hücrelerini in vitro olarak duyusal ve motor sinirlerden arındırmak için bir yöntem salıyoruz.
Abstract
Periferik sinir sistemindeki başlıca hücreler Schwann hücreleri (SCs) ve fibroblastlardır. Her iki hücre de sinir rejenerasyonunu etkileyen nörotrofik faktör gen ekspresyonu ve diğer biyolojik süreçlerin farklı desenlerinde yer alan duyusal ve motor fenotipleri belirgin bir şekilde ifade eder. Bu çalışma, yüksek oranda saflaştırılmış sıçan duyusal ve motor SC'leri ve fibroblastları daha hızlı elde etmek için bir protokol oluşturmuştur. Yenidoğan sıçanlarının ventral kökü (motor sinir) ve dorsal kökü (duyusal sinir) ayrıştırıldı ve hücreler 4-5 gün boyunca kültürlendi, ardından ayırıcı sindirim ve diferansiyel yapışma yöntemlerini sırayla birleştirerek duyusal ve motor fibroblastlar ve SC'lerin izolasyonu yapıldı. İmmünositokimya ve akış sitometrisi analizlerinin sonuçları duyusal ve motor SC'lerin ve fibroblastların saflığının %gt;90 olduğunu gösterdi. Bu protokol duyusal ve motor sinir rejenerasyonu keşfine katkıda, duyusal ve motor fibroblastlar / SCs çok sayıda elde etmek için kullanılabilir.
Introduction
Periferik sinir sisteminde, sinir lifleri esas olarak akson oluşur, Schwann hücreleri (SCs), ve fibroblastlar, ve aynı zamanda makrofajlar az sayıda içerir, mikrovasküler endotel hücreleri, ve bağışıklık hücreleri1. SC'ler aksonlar1:1 oranında sarılır ve endoneurium adı verilen bağ dokusu tabakası ile çevrilidir. Aksonlar daha sonra fasikül adı verilen gruplar oluşturmak için bir araya toplanır ve her fasikül perineurium olarak bilinen bir bağ dokusu tabakasına sarılır. Son olarak, tüm sinir lifi bağ dokusu bir tabaka sarılır, hangi epineurium olarak denir. Endoneurium'da, tüm hücre popülasyonu %48'lik SC'lerden oluşur ve kalan hücrelerin2önemli bir kısmı fibroblastlar 2'dir. Ayrıca, fibroblastlar epineurium, perineurium ve endoneurium3dahil olmak üzere tüm sinir kompartmanlarının önemli bileşenleridir. Birçok çalışma, SCs ve fibroblastlar periferik sinir yaralanmaları sonra rejenerasyon sürecinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir4,5,6. Periferik sinirin ranzeksiyonundan sonra, perineurial fibroblastlar SC'ler ve fibroblastlar arasındaki efrin-B/EphB2 sinyal yolu üzerinden hücre sıralamasını düzenler, yaralar la aksonal yeniden büyümeye rehberlik eder5. Periferik sinir fibroblastları tenascin-C proteini salgılar ve β1-integrin sinyalyolu7 ile sinir rejenerasyonu sırasında SC'lerin göçünü artırır. Ancak, yukarıdaki çalışmalarda kullanılan SCs ve fibroblastlar siyatik sinir türetilmiştir, hangi duyusal ve motor sinirler hem de içerir.
Periferik sinir sisteminde, duyusal sinirler (afferent sinirler) merkezi sinir sistemi (CNS) reseptörlerinden duyusal sinyal yapmak, motor sinirler (efferent sinirler) kaslara CNS sinyalleri ilerlerken. Önceki çalışmalar, SCs farklı motor ve duyusal fenotipler ifade ve periferik sinir rejenerasyon desteklemek için nörotrofik faktörler salgılargöstermiştir 8,9. Yakın tarihli bir araştırmaya göre, fibroblastlar da farklı motor ve duyusal fenotipler ifade ve SCs göç etkiler10. Böylece, motor ve duyusal sinir fibroblastları/SC'leri arasındaki farkların araştırılması, periferik sinir spesifik rejenerasyonunun karmaşık altta yatan moleküler mekanizmalarını incelememizi sağlar.
Şu anda, antimitotik ajanların uygulanması da dahil olmak üzere, SCs ve fibroblastlar arındırmak için birçok yolu vardır, antikor aracılı sitoz11,12, sıralı immünpanning13 ve laminin substratum14. Ancak, yukarıdaki tüm yöntemler fibroblastlar kaldırmak ve sadece SCs korumak. Yüksek saflaştırılmış SCs ve fibroblastlar akış sitometri sıralama teknolojisi15elde edilebilir , ama zaman alıcı ve pahalı bir tekniktir. Bu nedenle, bu çalışmada, duyusal ve motor sinir fibroblastları ve SC'leri daha hızlı bir şekilde elde etmek için basit bir diferansiyel sindirim ve diferansiyel bağlılık yöntemi geliştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Nantong Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan denekleri de dahil olmak üzere tüm prosedürler etik Deneysel Hayvanlar, Jiangsu Eyaleti, Çin İdare Komitesi tarafından onaylandı.
1. Motor ve duyusal sinir fibroblastları ve SC'lerin izolasyonu ve kültürü
- Çin Nantong Üniversitesi Deneysel Hayvan Merkezi tarafından sağlanan yedi günlük Sprague-Dawley (SD) sıçanlarını (n=4) kullanın. Sıçanları %5 izofluran içeren bir tanka 2-3 dakika yerleştirin, hayvanların yavaşça nefes almasına ve bağımsız bir aktivitesi olmamasına izin verin ve sonra kafa kesmeden önce %75 etanol kullanarak dezenfekte edin.
- Yaklaşık 3 cm için arka deri kesmek ve omurilik kaldırmak için makas kullanın. Omuriliği ortaya çıkarmak için vertebrakanalını dikkatlice açın.
- Omuriliği 60 mm'lik petri kabında 2-3 mL buz gibi d-Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile koruyun.
- Anatomik yapıya dayanarak, ventral kök (motor sinir) ve daha sonra dorsal kök (duyusal sinir) bir diseksiyon mikroskop altında çıkarmak. Daha sonra, buz gibi d-Hanks 'dengeli tuz çözeltisi (HBSS) yerleştirin.
- HBSS'yi çıkardıktan sonra sinirleri makasla 3-5 mm'ye bölün ve 1 mL %0,25 (w/v) tripsin ile 37 °C'de 18-20 dk. Daha sonra, sindirimi durdurmak için % 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 3-4 mL DMEM ile ek.
- Pipet karışımı yavaşça yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı ve santrifüj 800 x g 5 dakika için. Bundan sonra, supernatant atın ve DMEM 2-3 mL% 10 FBS ile takviye çökelti askıya.
- Hücre süspansiyonuna 400 örgü filtre kullanarak filtre uygulayın ve 60 mm Petri kabındaki hücreleri ve kültürü %5 CO2varlığında 37 °C'de aşılamak. 4-5 günlük bir kültü nden sonra % 90 birleştiğinde 0 (p0) fibroblast ve SC'yi izole edin.
- SC'lerin izolasyonu ve kültürü (Şekil 1)
- Hücreleri 1x PBS kullanarak bir kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 8-10 s sindirmek için 60 mm Petri kabıbaşına %0,25 (w/v) tripsin (37 °C) 1 mL ekleyin. Bundan sonra, sindirimi durdurmak için % 10 FBS ile desteklenen 3 mL DMEM ekleyin.
- SC'leri pipetle ayırmak için karışımı hafifçe üfler. Daha sonra 5 dk için 800 x g'da SC'leri toplayın ve santrifüj edin.
- Supernatant atın ve% 10 FBS ile DMEM 3 mL çökelti askıya, 1% penisilin / streptomisin, 2 μM forskolin ve 10 ng / mL HRG, ve sonra kaplamasız hücreleri aşılamak 60 mm Petri kabı. 37 °C'de 30-45 dakika küllettikten sonra, fibroblastlar (birkaç sayıda fibroblast SC ile sindirilir) yemeğin dibine bağlanır.
- Supernatant 'ı (SC'ler dahil) 37 °C'de başka bir poli-L-l-lizin (PLL) kaplamalı orta yemek ve kültüre 2 gün aktarın.
- Fibroblastların izolasyonu ve kültürü (Şekil 1)
- SC'leri çıkardıktan sonra (adım 1.8'de gösterildiği gibi), kalan fibroblastları 1x PBS ile yıkayın ve daha sonra fibroblastları 37 °C'de 2 dk sindirmek için %0,25 (w/v) trypsin 1 mL ekleyin.
- Sindirimi sona erdirmek için %10 FBS ile desteklenen DMEM ekleyin. Bir pipet kullanarak fibroblastlar darbe ve sonra toplamak ve 5 dakika için 800 x g onları santrifüj.
- Süpernatant atın, % 10 FBS içeren DMEM 2 mL ile çökelti askıya, ve sonra kaplamasız hücreleri aşılamak 60 mm Petri çanak. 37 °C'de 30-45 dk.'da kültürden sonra fibroblastlar yemeğin dibine bağlanır. Supernatant atın (SCs birkaç sayı dahil). Daha sonra 37 °C'de fibroblastlar yemeğine ve kültürüne %10 FBS ile takviye edilmiş 3 mL DMEM ekleyin.
- P1 hücrelerini %90'a ulaşana kadar iletin. Daha sonra bölüm 1.8 ve 1.9'da açıklandığı gibi diferansiyel sindirim ve diferansiyel bağlılık ile tekrar arındırın.
- 2 gün boyunca kültürden sonra p2 fibroblastlar ve SCs sindirin ve sonra hücreleri toplamak, saymak ve 1 x 105 sayı / iyi immünositokimya (ICC) için PLL kaplı slaytlar üzerinde.
2. Hücre saflığının belirlenmesi için ICC
- 37 °C'de hücreleri 24 saat kültüre ve diferansiyel sindirim ve motor ve duyusal fibroblastlar ve SC'lerin diferansiyel yapışması sonrasında ICC boyama gerçekleştirin.
- Motor ve duyusal fibroblastları ve SC'leri 1x PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 18 dakika boyunca %4 paraformaldehit (pH 7.4) 200 μL/iyi olarak düzeltin.
- Numune SC'lerini bloke edici tamponile (%0,1 Triton X-100% 0,01 M PBS içinde %5 keçi serumu içeren) bloke edin ve numune fibroblastlarını %5 keçi serumu içeren blokajlı (%5 keçi serumu içeren 0,01 M PBS) 37 °C'de 45 dk'da PBS üç kez yıkayarak engelleyin.
- Engelleme tamponunu çıkarın ve aşağıdaki birincil antikorlarla kuluçkaya yatın: fare monoklonal anti-CD90 antikor (fibroblastlar için özel bir belirteç) (1:1000) fibroblastlar ve fare anti-S100 antikorları (SC'ler için özel bir belirteç) (1:400) gecede 4 °C'de SC'ler için.
- Birincil antikorları atın, PBS ile üç kez yıkayın ve aşağıdaki ikincil antikorlarla kuluçkaya yatın: Fibroblastlar için Alexa Fluor 594 keçi anti-fare IgG (1:400) ve 488 konjuge keçi anti-fare IgG (1:400) oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca sc'ler için.
- Numuneleri PBS ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca çekirdekleri 5 μg/mL Hoechst 33342 boya ile lekeleyin. Numuneyi üç kez 1x PBS ile yıkayın ve cam kaydırak üzerine montaj ortamını (20 μL/slayt) kullanarak monte edin.
- Her kuyu için üç rasgele alanda confocal lazer tarama mikroskobu ile hücre fotoğrafları çekin. Toplam çekirdek ve CD90 pozitif hücre sayısını, S100-pozitif hücreleri değerlendirin ve ardından sırasıyla CD90-pozitif hücrelerin ve S100-pozitif hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Boyamayı triplicate olarak gerçekleştirin.
3. Hücre saflığının belirlenmesi için akış sitometri analizi (FCA)
- FCA16tarafından daha önce açıklandığı gibi motor ve duyusal fibroblastların ve SC'lerin saflığını değerlendirin. Kısaca, p2 motor ve duyusal fibroblastlar ve SCs% 0.25 (w / v) tripsin ile sindirmek, hücre pelet resuspend ve 15 dakika oda sıcaklığında fiksasyon ortamda onları kuluçka.
- Permeabilizasyon ortamı olan hücreleri kuluçkaya yatırın ve fibroblastlar için fare monoklonal anti-CD90 antikorunu (0.1 μg/106 hücre, 200 μL) ve 30 dakika oda sıcaklığındaki SC'ler için fare anti-S100 antikor (1:400, 200 μL) kullanarak sonda yıkıntın.
- Hücreleri 488 konjuge keçi anti-fare IgG ile 30 dk. Akış sitometrisi gerçekleştirmek için FACS kalibrekullanın ve Cell Quest yazılımı kullanarak verileri analiz.
- Hücreleri sadece 488 konjuge keçi anti-fare IgG (fibroblastlar Grubu) ve fare IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - İzotip kontrolü (SCs grubu), negatif kontrol olarak hizmet veren ile kuluçkaya yatırın.
4. İstatistiksel analiz
- Tüm verileri ± SEM. GraphPad Prism 6.0 kullanarak eşleşmemiş t-testi ile verilerdeki istatistiksel farklılıkları değerlendirin. P<0.05'te istatistiksel anlamlılığı ayarlayın. Tüm tahlilleri triplicate olarak gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Işık mikroskobik gözlem
SC'ler ve fibroblastlar sinir dokularından primer hücre kültüründe elde edilen iki ana hücre popülasyonudur. 1 saat için aşılama sonra, hücrelerin çoğu çanak altına yapışmış ve hücre morfolojisi yuvarlak oval değişti. 24 saat kültürden sonra, SC'ler bipolar veya tripolar morfoloji sergilediler ve bunların uzunluğu 100 ile 200 m arasında değişmektedir. 48 saat sonra, hücrelerin toplanması ve çoğalması meydana geldi, hangi birçok hücre uçtan uca, omuz omuza, girdap veya çit benzeri düzenleme toplandı. SC'lerden daha büyük olan diğer fibroblastlar düz ve düzensiz şekil ler sergiledi. Uzun süren kültür süresi ile, SCs ve fibroblastların sayısı giderek artmıştır. SC'ler fibroblastların boşlukları arasında veya fibroblastların yüzeyinde bir araya toplanmışlardı(Şekil 2A, 2B). Hücreler fibroblastlar ve SC'leri izole etmek için diferansiyel sindirim etüt ve diferansiyel yapışma tabi tutulur. 8-10 s için sindirim sonra, SCs yuvarlak olarak ortaya çıktı ve kolayca üflenir, fibroblastlar düz ve çanak altına bağlı iken(Şekil 2C, 2D). Diferansiyel sindirim ve diferansiyel bağlılık tan sonra primer kültürlü SC'ler ve fibroblastlar izole edildi ve motor ve duyusal SC'lerin ve fibroblastların tipik hücre morfolojisi gözlendi (Şekil 2E-2H).
Motor ve duyusal fibroblastların ve SC'lerin saflıklarının ICC tarafından değerlendirilmesi
Duyusal ve motor fibroblastlar CD90 kullanılarak etiketlenmiş ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak görselleştirilmiştir(Şekil 3A, 3D). Çapachst 33342 boya hücre çekirdeğini etiketlemek için kullanılmıştır (Şekil 3B, 3E). Fibroblast immünboyama ve nükleer boyama(Şekil 3C, 3F)birleştirilmiş görüntüleri, cd90 ve Hoechst ortak etiketli hücrelerin% 92.51 ve% 92.64 motor ve duyusal fibroblastlar mevcut olduğunu belirtti(Şekil 3G), sırasıyla.
Duyusal ve motor LUC'ler S100 kullanılarak etiketlendi ve sırasıyla konfokal lazer tarama mikroskobu(Şekil 4A, 4D)kullanılarak görselleştirildi. Çapachst 33342 boya hücre çekirdeğini etiketlemek için kullanılmıştır (Şekil 4B, 4E). SC immünboyama ve nükleer boyama(Şekil 4C, 4F)birleştirilmiş görüntüleri, sırasıyla Motor ve duyusal SC'lerde(Şekil 4G)S100 ve Hoechst eş etiketli hücrelerin %91,61 ve %93,56'sının varlığını göstermiştir.
Duyusal ve motor fibroblastların ve SC'lerin saflıklarının FCA ile değerlendirilmesi
Diferansiyel sindirim ve diferansiyel yapışma dan sonra iki kez, primer kültürlü fibroblastlar ve SC'ler izole edildi. Şekil 5A'dagösterildiği gibi motor ve duyusal Fb kültüründeki hücrelerin neredeyse %90'ı M2 ile endike olan fibroblastlar iken, geri kalan <%10 (M1 ile gösterilir) SC'dir. Şekil 5B motor ve duyusal SC kültüründeki tüm hücrelerin %gt;92'sinin M2 ile gösterilen SC'ler olduğunu, geri kalan <8%'inin ise (Mblast ile gösterilir) olduğunu göstermiştir.
Şekil 1: Duyusal ve motor Fibroblastlar ve SC'lerin ayırma ve saflaştırma adımlarını gösteren şematik diyagram. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: (A) primer kültürlü motor ve (B) duyusal fibroblastlar ve SC'lerin hücre morfolojisini gösteren faz-kontrast mikrograf. 10 s için sindirim sonra, SCs hücre morfolojisi yuvarlak (oklar tarafından belirtildiği gibi), fibroblastlar düz kaldı ve çanak altına bağlı iken(C: Motorfibroblastlar ve SCs; D: Duyusal Fibroblastlar ve SCs). Diferansiyel sindirim ve diferansiyel yapışma sonrası, SC'ler ve Fibroblastlar izole edildi ve motor ve duyusal Fibroblastların tipik hücre morfolojisi(E: Motor Fibroblastlar; F: Duyusal Fibroblastlar) ve SC'ler(G: Motor SC'ler; H: Duyusal SCs) gösterildi. (Ölçek çubuğu: 50 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Motor ve duyusal fibroblastların Saflıklarının ICC ile belirlenmesi. Kültürmotor Floresan mikroskobik fotoğraflar (A-C) ve duyusal Fibroblastlar(D-F)CD90 karşı antikorlar ile immünboyama gösteren(A ve D, kırmızı), Hoechst 33342 nükleer boyama(B ve E, mavi), ve her iki boyama birleştirme(C ve F). (G) Kültürlü Fibroblastların saflık istatistiksel analizi. (Ölçek çubuğu: 100 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Motor ve duyusal SC'lerin Saflıklarının ICC tarafından tanımlanması. Kültürmotor Floresan mikroskobik fotoğraflar (A-C) ve duyusal SCs(D-F)S100 karşı antikorlar ile immünboyama gösteren(A ve D ,kırmızı), Hoechst 33342 nükleer boyama(B ve E, mavi), ve her iki boyama birleştirme(C ve F). (G) Kültürlü SC'lerin saflık istatistiksel analizi (Ölçek çubuğu: 100 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Duyusal ve motor fibroblastların ve SC'lerin FCA ile saflıklarının belirlenmesi. Kültürlü motor ve duyusal Fibroblastların /SC'lerin CD90-pozitif hücrelerinin (M2) yüzdesini gösteren FCAgrafiği.B Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Periferik sinirlerin iki büyük hücre popülasyonları SCs ve fibroblastlar dahil. Öncelikle kültürlü fibroblastlar ve SCs doğru periferik sinir gelişimi ve rejenerasyon sırasında fibroblastlar ve SCs fizyolojisi modelleme yardımcı olabilir. Çalışma, P7 sıçan siyatik sinir hücrelerinin S100-pozitif SC'lerin yaklaşık %85'ini, OX7-pozitif fibroblastların %13'ünü ve OX42-pozitif makrofajların sadece %1,5'ini13'üiçerdiğini göstermiştir. Fibroblast ların sayısı SC'lerden daha az olmasına rağmen, fibroblastların ilk çoğalma hızı SC'lerden daha hızlıdır. Bu nedenle, Ara-C birçok çalışmada fibroblastlar kaldırmak için en sık kullanılan antimitotik ajandır. Ancak, Ara-C hücre mitoz için spesifik değildir, ve aynı zamanda bölünme güçlü aşamasında SCs çoğalmasını inhibe edebilir. Antikor aracılı sitoksis veya immünpanning yöntemi ile fibroblastlar ya kaybedildi ya da öldü. Akış sitometri sıralama teknolojisi aynı anda yüksek saflıkta fibroblastlar ve SCs elde etmek için kullanılabilir rağmen, hücrelerin çok sayıda ihtiyacı var, ve hücre edinim oranı düşük kaldı. Bilgimizin en iyi olduğu kadarıyla, bu duyusal ve motor SC'ler ve fibroblastlar arıtma yöntemi göstermek için ilk çalışma oldu.
Bu çalışmada, diferansiyel sindirimin yanı sıra diferansiyel yapışmanın ardışık olarak birleştirilmesi yle aynı anda çok sayıda duyusal ve motor fibroblast ve SC elde edilerek hücrelere zarar verilmedi. ICC boyama ve FCA sonuçları tüm duyusal ve motor SCs / fibroblastlar yüksek saflıkta olduğunu gösterdi (>90%). Bu yöntemin kritik adım diferansiyel sindirim süresini kontrol etmektir. Zaman çok kısaysa, SC'lerin ayrılmasızor hale getirir ve süre çok uzunsa, bazı fibroblastların SC'lerle sindirimine neden olur. Weiss çalışmada, buz gibi Accutase fibroblastlar SCs ayırmak için kullanılır, ama bu tripsin daha pahalı17. Tripsin ile diferansiyel sindirim etkili SCs ve fibroblastlar ayıran yardımcı olabilir. Bu protokolün sınırlaması, diseksiyon mikroskobu ile daha fazla uygulama gerektiren yenidoğan sıçanlardan duyusal ve motor sinirleri çıkarmak kolay olmadığıdır. Kültür leme protokolü duyusal ve motor sinir fibroblastları ve SC'lerin biyolojik özelliklerini incelemek ve sinir rejenerasyonunu teşvik etmek için duyusal ve motor sinir rejenerasyonu veya fibroblastlar ve SC'ler transplantasyonunun mekanizması için çok yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (Grant No. 2017YFA0104703), Çin Ulusal Doğal Vakfı (Grant No. 31500927) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
References
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
- Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
- Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
- Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
- Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
- Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
- Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
- He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016 (2018).
- Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
- Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
- Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
- Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
- He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
- Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).
