Summary
Qui, presentiamo un metodo per purificare i fibroblasti e le cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in vitro.
Abstract
Le cellule principali del sistema nervoso periferico sono le cellule di Schwann (SC) e i fibroblasti. Entrambe queste cellule esprimono distintamente i fenotipi sensoriali e motori coinvolti in diversi modelli di espressione genica del fattore neurotrofico e altri processi biologici, che influenzano la rigenerazione dei nervi. Il presente studio ha stabilito un protocollo per ottenere più rapidamente SC e fibroblasti di ratti altamente purificati e motori. La radice ventrale (nervo motore) e la radice dorsale (nervo sensoriale) dei ratti neo-cicliali (7 giorni) sono state dissociate e le cellule sono state coltivate per 4-5 giorni, seguite dall'isolamento dei fibroblasti sensoriali e motori e delle SC combinando in sequenza metodi differenziali di digestione e aderenza differenziale. I risultati delle analisi di immunocitochimica e citometria di flusso hanno mostrato che la purezza delle SC e dei fibroblasti sensoriali e motori era >90%. Questo protocollo può essere utilizzato per ottenere un gran numero di fibroblasti/SC sensoriali e motori, contribuendo all'esplorazione della rigenerazione del nervo sensoriale e motorio.
Introduction
Nel sistema nervoso periferico, le fibre nervose sono costituite principalmente da assoni, cellule di Schwann (SC) e fibroblasti, e contiene anche un piccolo numero di macrofagi, cellule endoteliali microvascolari e cellule immunitarie1. Le SC avvolgono gli assoni in un rapporto 1:1 e sono racchiuse da uno strato di tessuto connettivo chiamato endoneurium. Gli assoni vengono poi raggruppati insieme per formare gruppi chiamati fascicle, e ogni fascicolo è avvolto in uno strato di tessuto connettivo noto come perineurium. Infine, l'intera fibra nervosa è avvolta in uno strato di tessuto connettivo, che è chiamato l'epineurium. Nell'endoneurium, l'intera popolazione cellulare è composta da 48% SC, e una parte sostanziale delle cellule rimanenti coinvolge fibroblasti2. Inoltre, i fibroblasti sono componenti importanti di tutti i compartimenti nervosi, tra cui l'epineurium, il perineurium e l'endoneurium3. Molti studi hanno indicato che SC e fibroblasti svolgono un ruolo cruciale nel processo di rigenerazione dopo le lesioni nervose periferiche4,5,6. Dopo la transezione del nervo periferico, i fibroblasti perineuriali regolano lo smistamento delle cellule attraverso il percorso di segnalazione ephrin-B/EphB2 tra SC e fibroblasti, guidando ulteriormente la ricrescita assonale attraverso le ferite5 . I fibroblasti nervosi periferici secernono la proteina tenascina-C e migliorano la migrazione delle SC durante la rigenerazione dei nervi attraverso il percorso di segnalazione dell'integrazione diz1 7. Tuttavia, le SC e i fibroblasti utilizzati negli studi di cui sopra sono stati derivati dal nervo sciatico, che include nervi sensoriali e motori.
Nel sistema nervoso periferico, i nervi sensoriali (nervi afferenti) conducono segnali sensoriali dai recettori al sistema nervoso centrale (SNC), mentre i nervi motori (nervi efferenti) conducono segnali dal SNC ai muscoli. Studi precedenti hanno indicato che le Ccs esprimono fenotipi motori e sensoriali distinti e secernono fattori neurotrofici per sostenere la rigenerazione del nervo periferico8,9. Secondo un recente studio, i fibroblasti esprimono anche diversi fenotipi motori e sensoriali e influenzano la migrazione delle SC10. Pertanto, l'esplorazione delle differenze tra fibroblasti nervosi motori e sensoriali/SC ci permette di studiare i complicati meccanismi molecolari sottostanti della rigenerazione specifica del nervo periferico.
Attualmente, ci sono molti modi per purificare Le SC e i fibroblasti, tra cui l'applicazione di agenti antimitotici, citolisi mediata da anticorpi11,12, immunopanning sequenziale13 e substrato di laminina14. Tuttavia, tutti i metodi di cui sopra rimuovono i fibroblasti e conservano solo le SCs. SCs altamente purificate e i fibroblasti possono essere ottenuti con la tecnologia di selezione della citometria di flusso15, ma è una tecnica che richiede tempo e denaro. Quindi, in questo studio, è stata sviluppata una semplice digestione differenziale e un metodo di aderenza differenziale per purificare e isolare i fibroblasti nervosi sensoriali e motori e le SC al fine di ottenere un gran numero di fibroblasti e SC più rapidamente.
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Protocol
Questo studio è stato effettuato in conformità con le Linee guida istituzionali per la cura degli animali dell'Università di Nantong. Tutte le procedure, compresi i soggetti animali, sono state approvate eticamente dal Comitato di Amministrazione degli Animali Sperimentali, provincia di Jiangsu, Cina.
1. Isolamento e coltura di fibroblasti nervosi motori e sensoriali e SC
- Usa i ratti Sprague-Dawley (SD) di sette giorni forniti dal Centro Sperimentale degli Animali della Nantong University of China. Mettere i ratti in un serbatoio contenente il 5% di isoflurane per 2-3 minuti, permettere agli animali di respirare lentamente e non hanno alcuna attività indipendente, e quindi sanificare utilizzando il 75% di etanolo prima della decapitazione.
- Utilizzare le forbici per tagliare la pelle posteriore per circa 3 cm e rimuovere la colonna vertebrale. Aprire accuratamente il canale vertebrale per esporre il midollo spinale.
- Mantenere il midollo spinale in una piastra Petri da 60 mm con 2-3 mL di soluzione di sale bilanciato di D-Hanks ghiacciato (HBSS).
- Sulla base della struttura anatomica, accise la radice ventrale (nervo motore) e poi la radice dorsale (nervo sensoriale) sotto un microscopio dissetante. Successivamente, metterli in una soluzione di sale equilibrato di D-Hanks ghiacciato (HBSS).
- Dopo aver rimosso l'HBSS, affettare i nervi in pezzi da 3-5 mm con le forbici e digerire con 1 mL dello 0,25% (w/v) trypsin a 37 gradi centigradi per 18-20 min. Successivamente, integrare con 3-4 mL di DMEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS) per fermare la digestione.
- Pipette il composto su e giù delicatamente circa 10 volte e centrifugare a 800 x g per 5 min. Dopo di che, scartare il supernatore e sospendere il precipitato in 2-3 mL di DMEM integrato con 10% FBS.
- Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro a 400 maglie, quindi inoculare le cellule in parabola Petri da 60 mm e coltura a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO2. Dopo 4-5 giorni di coltura, isolare il passaggio 0 (p0) fibroblasti e SC dopo aver raggiunto il 90% di confluenza.
- Isolamento e cultura degli SCs (Figura 1)
- Lavare le cellule una volta utilizzando 1x PBS. Aggiungere 1 mL di 0,25% (w/v) di metapsina (37 gradi centigradi) per la piastra Petri a 60 mm per digerire le cellule per 8-10 s a temperatura ambiente. Dopo di che, aggiungere 3 mL di DMEM integrato con 10% FBS per fermare la digestione.
- Soffiare delicatamente la miscela per staccare le SC con una pipetta. Quindi raccogliere e centrifugare le SC a 800 x g per 5 min.
- Scartare il supernatante e sospendere il precipitato in 3 mL di DMEM con 10% FBS, 1% penicillina / streptomicina, 2 forskolin e 10 ng/mL HRG, quindi inoculare le cellule in piatto Petri non rivestito da 60 mm. Dopo la coltura a 37 o 45 min, i fibroblasti (alcuni dei fibroblasti vengono digeriti con SCs) si attaccano sul fondo del piatto.
- Trasferire il supernatante (comprese le SC) in un altro piatto medio rivestito di poli-L (PLL) e cultura a 37 gradi centigradi per 2 giorni.
- Isolamento e coltura di fibroblasti (Figura 1)
- Dopo aver rimosso i SC (come mostrato al punto 1.8), lavare i fibroblasti rimanenti nei piatti con 1x PBS e quindi aggiungere 1 mL di 0,25% (w/v) trypsin per digerire i fibroblasti per 2 min a 37 .
- Aggiungere DMEM integrato con 10% FBS per terminare la digestione. Soffiare i fibroblasti con una pipetta, quindi raccoglierli e centrifugarli a 800 x g per 5 min.
- Scartare il supernatante, sospendere il precipitato con 2 mL di DMEM contenente il 10% di FBS, quindi inoculare le cellule nella parabola Petri da 60 mm non rivestita. I fibroblasti dopo la coltura per 30-45 min a 37 gradi centigradi si attaccano al fondo del piatto. Scartare il super-attante (compresi alcuni numeri di SC). Quindi aggiungere 3 mL di DMEM integrato con 10% FBS nel piatto fibroblasts e la coltura a 37 gradi centigradi per 2 giorni.
- Passare le cellule p1 fino a raggiungere 90% confluenza. Poi purificarli con la digestione differenziale e l'aderenza differenziale di nuovo come descritto nelle sezioni 1.8 e 1.9.
- Digerire i fibroblasti p2 e le SC dopo la coltura per 2 giorni, quindi raccogliere le cellule, contare e inoculare in 1 x 105 numeri / bene su diapositive Rivestite di PLL per l'immunocitochimica (ICC).
2. ICC per l'identificazione della purezza cellulare
- Coltura le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi ed eseguire la colorazione ICC dopo la digestione differenziale e l'aderenza differenziale dei fibroblasti motori e sensoriali e degli SC.
- Lavare i fibroblasti motori e sensoriali e le SC con 1x PBS e fissarli in 200 gradi centigradi di paraformaldeide del 4% (pH 7,4) per 18 min a temperatura ambiente.
- Bloccare le SC campione con buffer di blocco (0,1% Triton X-100 in 0,01 M PBS contenente il siero di capra 5%) e bloccare i fibroblasti del campione con buffer di blocco (0,01 M PBS contenente 5% siero di capra) per 45 min a 37 gradi centigradi dopo averli lavati con PBS trecento.
- Rimuovere il buffer di blocco e incubare con i seguenti anticorpi primari: anticorpo monoclonale anti-CD90 del topo (un marcatore specifico per i fibroblasti) (1:1000) per i fibroblasti e gli anticorpi anti-S100 del topo (un marcatore specifico per sCs) (1:400) per le SC a 4 gradi centigradi.
- Eliminare gli anticorpi primari, lavare con PBS tre volte, e incubare con i seguenti anticorpi secondari: Alexa Fluor 594 capra anti-topo IgG (1:400) per fibroblasti e 488-coniugato capra anti-topo IgG (1:400) per SCs a temperatura ambiente per 1.5 h.
- Lavare i campioni tre volte con PBS, e macchiare i nuclei con 5 g/mL Hoechst 33342 coloranti per 10 min a temperatura ambiente. Lavare il campione con 1x PBS tre volte e montarli utilizzando il supporto di montaggio (20 gradi centigradi/scorrimento) sul vetrino di vetro.
- Prendere le fotografie delle cellule con microscopio a scansione laser confocale in tre campi casuali per ogni pozzo. Valutare il numero totale di nuclei e cellule CD90-positive, cellule S100-positive e quindi calcolare la percentuale di cellule CD90-positivo e S100-positivo, rispettivamente. Eseguire la colorazione in triplice copia.
3. Analisi della citometria di flusso (FCA) per l'identificazione della purezza cellulare
- Valutare la purezza dei fibroblasti motori e sensoriali e delle SC come descritto in precedenza da FCA16. In breve, digerire il motore p2 e i fibroblasti sensoriali e le SC con 0,25% (w/v) trypsin, risospendere i pellet cellulari e incubarli nel mezzo di fissazione a temperatura ambiente per 15 min.
- Incubare le cellule con mezzo di permeabilizzazione e sonda utilizzando anticorpi monoclonali del topo (0,1 g/106 cellule, 200 l) per fibrolanti e topo anti-S100 anticorpi (1:400, 200 - L) per SCs a temperatura ambiente per 30 min, rispettivamente.
- Incubare le cellule con 488 capre con coniugata IgG per 30 min.
- Incubare le cellule solo con 488-coniugato capra anti-toro IgG (fibroblasts Group) e topo IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Controllo isotipo (gruppo SCs), che serve come controllo negativo.
4. Analisi statistica
- Presentare tutti i dati come mezzi - SEM. Valutare le differenze statistiche nei dati tramite test tnon accoppiato utilizzando GraphPad Prism 6.0. Impostare la significatività statistica su p<0.05. Esegui tutti i saggi in triplice copia.
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Representative Results
Osservazione microscopica leggera
Le SC e i fibroblasti sono le due principali popolazioni di cellule ottenute nella coltura cellulare primaria dai tessuti nervosi. Dopo l'inoculazione per 1 h, la maggior parte delle cellule ha aderito al fondo del piatto e la morfologia cellulare è cambiata da rotonda a ovale. Dopo la coltura per 24 h, le SCs hanno esibito una morfologia bipolare o tripolare e la lunghezza di questi variava da 100 a 200 m. Dopo 48 h, si è verificata l'aggregazione e la proliferazione delle cellule, in cui molte cellule sono state aggregate in una disposizione end-to-end, spalla a spalla, vortice o recinzione. Gli altri fibroblasti più grandi delle SC hanno mostrato una forma piatta e irregolare. Con un tempo di coltura prolungato, il numero di SC e fibroblasti è stato gradualmente aumentato. Le SC sono state raggruppate tra spazi di fibroblasti o situate sulla superficie dei fibroblasti (Figura 2A, 2B). Le cellule sono soggette a digestione differenziale e aderenza differenziale per isolare fibroblasti e SC. Dopo la digestione per 8-10 s, SCs è apparso come rotondo e vengono soffiati via facilmente, mentre i fibroblasti sono piatti e attaccati alla parte inferiore del piatto (Figura 2C, 2D). Dopo due volte la digestione differenziale e l'aderenza differenziale, sono stati isolati i principali SC e fibroblasti coltivati ed è stata osservata la tipica morfologia cellulare di SC e fibroblasti motori e sensoriali (Figura 2E-2H).
Valutazione della purezza dei fibroblasti motori e sensoriali e delle SC da parte dell'ICC
I fibroblasti sensoriali e motori sono stati etichettati con CD90 e visualizzati utilizzando un microscopio a scansione laser confocale (Figura 3A, 3D). Hoechst 33342 tintura è stato utilizzato per etichettare il nucleo cellulare (Figura 3B, 3E). Le immagini unite dell'immunostaining fibroblasto e della colorazione nucleare (Figura 3C, 3F) hanno indicato che il 92,51% e il 92,64% delle cellule co-etichettate CD90 e Hoechst erano presenti rispettivamente nei fibroblasti motori e sensoriali (Figura 3G).
Le SC sensoriali e motorie sono state etichettate utilizzando S100 e visualizzate utilizzando un microscopio a scansione laser confocale (Figura 4A, 4D). Hoechst 33342 tintura è stato utilizzato per etichettare il nucleo cellulare (Figura 4B, 4E). Le immagini unite dell'immunostaining SC e della colorazione nucleare (Figura 4C, 4F) indicavano la presenza rispettivamente del 91,61% e del 93,56% delle cellule S100 e Hoechst nelle SC motorie e sensoriali (Figura 4G).
Valutazione della purezza dei fibroblasti sensoriali e motori e delle SC da parte di FCA
Dopo due volte la digestione differenziale e l'aderenza differenziale, i fibroblasti e le SC coltivati primari sono stati isolati. Come mostrato nella Figura 5A, quasi >90% delle cellule nella coltura Fb motoria e sensoriale erano fibroblasti, come è stato indicato da M2, mentre il restante <10% (indicato da M1) erano SCs. La figura 5B ha mostrato che >il 92% di tutte le cellule nella coltura Motoria e Sensoriale SC erano SC, che era indicato da M2, mentre il restante <8% (indicato da M1) erano fibroblasti.
Figura 1: Il diagramma schematico che mostra le fasi di separazione e purificazione dei fibroblasti sensoriali e motori e delle SC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Micrografo a contrasto di fase che mostra la morfologia cellulare dei fibroblasti e SCs motori e (B) motori colture primari e (B). Dopo la digestione per 10 s, la morfologia cellulare delle SC era rotonda (come indicato dalle frecce), mentre i fibroblasti rimasero piatti e furono attaccati nella parte inferiore del piatto (C: Fibroblasti motori e SC; D: Fibroblasti sensoriali e SC). Dopo la digestione differenziale e l'adesione differenziale, le SC e i Fibroblasti sono stati isolati e la tipica morfologia cellulare dei Fibroblasti motori e sensoriali (E: Fibroblasti motori; F: Fibroblasti sensoriali) e SCs(G: SC motore; H: SCs sensoriali) sono stati mostrati. (Barra di scala: 50 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Identificazione della purezza dei fibroblasti motori e sensoriali da parte dell'ICC. Fotografie microscopiche di fluorescenza microscopiche di motori coltivati (A-C) e fibroblasti sensoriali (D-F) che mostrano l'immunostaining con anticorpi contro CD90 (A e D, rosso), Hoechst 33342 colorazione nucleare (B ed E, blu), e la fusione di entrambe le colorazioni (C e F). (G) Analisi statistica della purezza dei fibroblasti colti. (Barra di scala: 100 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Identificazione della purezza delle SC motorie e sensoriali da parte dell'ICC. Fotografie microscopiche di fluorescenza microscopiche di motore coltivato (A-C) e SCs sensoriali (D-F) che mostrano l'immunostaining con anticorpi contro S100 (A e D, rosso), Hoechst 33342 colorazione nucleare (B ed E, blu), e la fusione di entrambe le colorazioni (C e F). (G) Analisi statistica della purezza delle SC coltivate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Identificazione della purezza dei fibroblasti sensoriali e motori e delle SC da parte di FCA. Il grafico FCA che mostra la percentuale di cellule CD90 positive/cellule S100-positive (M2) di fibroblasti motori e sensoriali coltivati/SC. Analisi statistica della purezza dei Fibroblasti coltivati (A) e SC (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le due principali popolazioni cellulari di nervi periferici includevano SC e fibroblasti. I fibroblasti e le SC coltivati principalmente possono aiutare con precisione a modellare la fisiologia di fibroblasti e SC durante lo sviluppo e la rigenerazione dei nervi periferici. Lo studio ha mostrato che le cellule nervose sciatiche di ratti P7 contenevano circa l'85% degli SC S100 positivi, il 13% dei fibroblasti positivi a OX7 e solo l'1,5% dei macrofagi oX42 positivi13. Anche se il numero di fibroblasti è inferiore a SCs, il tasso di proliferazione iniziale dei fibroblasti è più veloce di quello delle SC. Pertanto, Ara-C è l'agente antimitotico più comunemente usato per rimuovere i fibroblasti in molti studi. Tuttavia, Ara-C non è specifico per la mitosi cellulare, e può anche inibire la proliferazione di SCs durante la fase vigorosa di divisione. Con la citolisi mediata dagli anticorpi o il metodo immunopanning, i fibroblasti sono andati persi o sono morti. Anche se la tecnologia di selezione della citometria a flusso può essere utilizzata per ottenere fibroblasti e SC ad alta purezza allo stesso tempo, ha bisogno di un gran numero di cellule e il tasso di acquisizione delle cellule è rimasto basso. Per quanto ne sappiamo, questo è stato il primo studio a mostrare il metodo di purificazione delle SC e dei fibroblasti sensoriali e motori.
In questo studio, un gran numero di fibroblasti sensoriali e motori e SC è stato ottenuto allo stesso tempo combinando la digestione differenziale e l'aderenza differenziale in sequenza, non causando alcun danno alle cellule. I risultati della colorazione ICC e della FCA hanno mostrato che tutti gli SC/fibroblasti sensoriali e motori erano di elevata purezza (>90%). La fase critica di questo metodo consiste nel controllare il tempo di digestione differenziale. Se il tempo è troppo breve, rende le SCs difficili da staccare, e se il tempo è troppo lungo, provoca alcuni fibroblasti a digerire con SCs. Nello studio di Weiss, l'Accutase freddo ghiaccio viene utilizzato per staccare le SC dai fibroblasti, ma questo è più costoso della prova17. La digestione differenziale con la trypsina può aiutare efficacemente a separare SC e fibroblasti. La limitazione di questo protocollo è che non è facile accise i nervi sensoriali e motori dai ratti neooatali, che richiede più pratica con il microscopio dissetante. Il protocollo per la coltura è molto utile per studiare le caratteristiche biologiche dei fibroblasti nervosi sensoriali e motori e delle SC, e per il meccanismo della rigenerazione sensoriale e motoria dei nervi o dei fibroblasti e dei trapianti di SC per promuovere la rigenerazione dei nervi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), dalla National Natural Foundation of China (Grant n. 31500927).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
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