Summary
Aquí, presentamos un método para purificar fibroblastos y células Schwann de nervios sensoriales y motores in vitro.
Abstract
Las principales células del sistema nervioso periférico son las células Schwann (SCs) y los fibroblastos. Ambas células expresan claramente los fenotipos sensoriales y motores implicados en diferentes patrones de expresión génica del factor neurotrófico y otros procesos biológicos, afectando la regeneración nerviosa. El presente estudio ha establecido un protocolo para obtener SCs y fibroblastos sensoriales y motores altamente purificados más rápidamente. La raíz ventral (nervio motor) y la raíz dorsal (nervio sensorial) de ratas neonatales (7 días de edad) se disociaron y las células se cultivaron durante 4-5 días, seguidos por el aislamiento de fibroblastos sensoriales y motores y CC mediante la combinación secuencial de digestión diferencial y adherencia diferencial. Los resultados de los análisis de inmunocitoquímica y citometría de flujo mostraron que la pureza de los CC y fibroblastos sensoriales y motores eran >90%. Este protocolo se puede utilizar para obtener un gran número de fibroblastos/SCs sensoriales y motores más rápidamente, contribuyendo a la exploración de la regeneración sensorial y nerviosa motora.
Introduction
En el sistema nervioso periférico, las fibras nerviosas consisten principalmente en axones, células Schwann (SCs) y fibroblastos, y también contiene un pequeño número de macrófagos, células endoteliales microvasculares, y células inmunitarias1. Los SCs envuelven los axones en una proporción de 1:1 y están encerrados por una capa de tejido conectivo llamada endoneurium. Los axones se agrupan para formar grupos llamados fascículos, y cada fascículo se envuelve en una capa de tejido conectivo conocida como perineurium. Finalmente, toda la fibra nerviosa se envuelve en una capa de tejido conectivo, que se denomina epineurio. En el endoneurium, toda la población celular se compone de 48% DE SCs, y una porción sustancial de las células restantes involucra fibroblastos2. Además, los fibroblastos son componentes importantes de todos los compartimentos nerviosos, incluyendo el epineurium, el perineurium y el endoneurium3. Muchos estudios han indicado que los SCs y los fibroblastos desempeñan un papel crucial en el proceso de regeneración después de las lesiones del nervio periférico4,,5,6. Después de la transección del nervio periférico, los fibroblastos perineuriales regulan la clasificación celular a través de la vía de señalización de ephrin-B/EphB2 entre SCs y fibroblastos, guiando aún más el recrecimiento axonal a través de las heridas5. Los fibroblastos nerviosos periféricos secretan la proteína tenascina-C y mejoran la migración de los SCs durante la regeneración nerviosa a través de la vía de señalización de 1-integrina7. Sin embargo, los SCs y fibroblastos utilizados en los estudios anteriores se derivaron del nervio ciático, que incluye los nervios sensoriales y motores.
En el sistema nervioso periférico, los nervios sensoriales (nervios aferentes) llevan a cabo la señalización sensorial desde los receptores al sistema nervioso central (SNC), mientras que los nervios motores (nervios eferentes) conducen señales desde el SNC hasta los músculos. Estudios previos han indicado que los SCs expresan fenotipos motores y sensoriales distintos y secretan factores neurotróficos para apoyar la regeneración de los nervios periféricos8,,9. Según un estudio reciente, los fibroblastos también expresan diferentes fenotipos motores y sensoriales y afectan la migración de SCs10. Así, la exploración de las diferencias entre los fibroblastos/SC motores y nerviosos sensoriales nos permite estudiar los complicados mecanismos moleculares subyacentes de la regeneración específica del nervio periférico.
En la actualidad, existen muchas formas de purificar los CC y los fibroblastos, incluida la aplicación de agentes antimitoticos, citolisis mediada por anticuerpos11,12, inmunopanning secuencial13 y sustrato de laminina14. Sin embargo, todos los métodos anteriores eliminan los fibroblastos y preservan sólo los SCs altamente purificados y los fibroblastos se pueden obtener mediante la tecnología de clasificación de citometría de flujo15,pero es una técnica lenta y costosa. Por lo tanto, en este estudio, se desarrolló un método simple de digestión diferencial y adherencia diferencial para purificar y aislar fibroblastos sensoriales y nerviosos y SCs con el fin de obtener un gran número de fibroblastos y SCs más rápidamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las Directrices Institucionales de Cuidado animal de la Universidad de Nantong. Todos los procedimientos, incluidos los sujetos animales, fueron aprobados éticamente por el Comité de Administración de Animales Experimentales, provincia de Jiangsu, China.
1. Aislamiento y cultivo de fibroblastos nerviosos motores y sensoriales y SCs
- Utilice ratas Sprague-Dawley (SD) de siete días de edad (n-4) proporcionadas por el Centro Animal Experimental de la Universidad de Nantong de China. Colocar las ratas en un tanque que contenga 5% de isoflurano durante 2-3 minutos, permitir que los animales respiren lentamente y no tengan actividad independiente, y luego desinfectar usando 75% de etanol antes de la decapitación.
- Use tijeras para cortar la piel posterior durante unos 3 cm y retire la columna vertebral. Abra el canal vertebral cuidadosamente para exponer la médula espinal.
- Mantener la médula espinal en un plato Petri de 60 mm con 2-3 ml de solución de sal equilibrada de D-Hanks (HBSS).
- Basado en la estructura anatómica, extirpar la raíz ventral (nervio motor) y luego la raíz dorsal (nervio sensorial) bajo un microscopio diseccionado. A continuación, colóquelos en una solución de sal equilibrada (HBSS) de D-Hanks helada.
- Después de retirar el HBSS, cortar los nervios en trozos de 3-5 mm con tijeras y digerir con 1 ml de 0.25% (p/v) tripina a 37 oC durante 18-20 min. A continuación, suplemento con 3-4 ml de DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) para detener la digestión.
- Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo suavemente unas 10 veces y centrifugar a 800 x g durante 5 min. Después de eso, desechar el sobrenadante y suspender el precipitado en 2-3 mL de DMEM complementado con 10% FBS.
- Filtrar la suspensión celular usando un filtro de malla 400, y luego inocular las células en plato Petri de 60 mm y cultivo a 37 oC en presencia de 5% CO2. Después de 4-5 días de cultivo, aísle el paso 0 (p0) fibroblastos y SCs después de alcanzar el 90% de confluencia.
- Aislamiento y cultura de SCs (Figura 1)
- Lave las células una vez usando 1x PBS. Añadir 1 ml de 0,25% (p/v) de trippsina (37 oC) por plato de Petri de 60 mm para digerir las células durante 8-10 s a temperatura ambiente. Después de eso, añadir 3 mL de DMEM complementado con 10% FBS para detener la digestión.
- Sople suavemente la mezcla para separar los SCs con una pipeta. A continuación, recoger y centrifugar los SCs a 800 x g durante 5 min.
- Desechar el sobrenadante y suspender el precipitado en 3 mL de DMEM con 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina, forskoline de 2 m y 10 ng/mL HRG, y luego inocular las células en un plato de Petri de 60 mm sin recubrimiento. Después de cultivar a 37 oC durante 30-45 min, los fibroblastos (un número de fibroblastos se digieren con SCs) se unen a la parte inferior del plato.
- Transfiera el sobrenadante (incluidos los SCs) a otro plato mediano recubierto de poli-L-lisina (PLL) y el cultivo a 37 oC durante 2 días.
- Aislamiento y cultivo de fibroblastos (Figura 1)
- Después de retirar los SCs (como se muestra en el paso 1.8), lave los fibroblastos restantes en los platos con 1x PBS y luego agregue 1 ml de 0.25% (p/v) de trippsina para digerir los fibroblastos durante 2 min a 37 oC.
- Añadir DMEM complementado con 10% FBS para terminar la digestión. Soplar los fibroblastos con una pipeta, y luego recogerlos y centrifugarlos a 800 x g durante 5 min.
- Desechar el sobrenadante, suspender el precipitado con 2 ml de DMEM que contiene 10% FBS, y luego inocular las células en un plato petri de 60 mm sin recubrimiento. Los fibroblastos después del cultivo durante 30-45 min a 37 oC se unen a la parte inferior del plato. Deseche el sobrenadante (incluyendo algunos números de SCs). A continuación, añadir 3 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS en el plato de fibroblastos y cultivo a 37 oC durante 2 días.
- Pasar las células p1 hasta que alcanzaron el 90% de confluencia. A continuación, purificarlos por digestión diferencial y adherencia diferencial de nuevo como se describe en las secciones 1.8 y 1.9.
- Digerir los fibroblastos p2 y SCs después de cultivar durante 2 días, y luego recoger las células, contar e inocular en 1 x 105 números/bien en diapositivas recubiertas de PLL para inmunocitoquímica (ICC).
2. ICC para la identificación de la pureza celular
- Cultivo de las células durante 24 h a 37 oC y realizar tinción ICC después de la digestión diferencial y adherencia diferencial de fibroblastos motores y sensoriales y SCs.
- Lavar los fibroblastos motores y sensoriales y los SCs con 1x PBS y fijarlos en 200 l/pozo de 4% de paraformaldehído (pH 7.4) durante 18 min a temperatura ambiente.
- Bloquear los SCs de muestra con tampón de bloqueo (0,1% Tritón X-100 en 0,01 M PBS que contiene un 5% de suero de cabra) y bloquear los fibroblastos de la muestra con tampón de bloqueo (0,01 M PBS que contiene 5% de suero de cabra) durante 45 minutos a 37 oC después de lavarlos con PBS tres veces.
- Retire el tampón de bloqueo e incubar con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo anti-CD90 monoclonal de ratón (un marcador específico para fibroblastos) (1:1000) para fibroblastos y anticuerpos anti-S100 de ratón (un marcador específico para SCs) (1:400) para SCs a 4 oC durante la noche.
- Deseche los anticuerpos primarios, lávelos con PBS tres veces e incubar con los siguientes anticuerpos secundarios: IgG antiratón de cabra Alexa Fluor 594 (1:400) para fibroblastos y IgG antiratón de cabra conjugado con 488 (1:400) para SCs a temperatura ambiente durante 1,5 h.
- Lave las muestras tres veces con PBS y manche los núcleos con un tinte Hoechst 33342 de 5 g/ml durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave la muestra con 1 veces PBS tres veces y móntela utilizando el medio de montaje (20 l/deslizamiento) en el portaobjetos de vidrio.
- Tome las fotografías celulares mediante un microscopio de escaneo láser confocal en tres campos aleatorios para cada pozo. Evalúe el número total de núcleos y células cd90 positivas, células S100 positivas y luego calcule el porcentaje de células CD90 positivas y células S100 positivas, respectivamente. Realizar la tinción por triplicado.
3. Análisis de citometría de flujo (FCA) para la identificación de la pureza celular
- Evaluar la pureza de los fibroblastos y SCs motores y sensoriales como se describió anteriormente por FCA16. En resumen, digiere los fibroblastos motores y sensoriales p2 y los SCs con 0,25% (p/v) de tripina, resuspendi los gránulos celulares y incubarlos en medio de fijación a temperatura ambiente durante 15 min.
- Incubar las células con medio de permeabilización y sonda utilizando anticuerpos anti-CD90 monoclonales de ratón (0,1 g/106 células, 200 l) para fibroblastos y anticuerpos anti-S100 de ratón (1:400, 200 l) para SCs a temperatura ambiente durante 30 min, respectivamente.
- Incubar las células con 488-conjugado de cabra anti-ratón IgG durante 30 min. Utilice el calibre FACS para realizar la citometría de flujo, y analizar los datos utilizando el software Cell Quest.
- Incubar las células sólo con 488-conjugados de cabra anti-ratón IgG (Grupo de fibroblastos) y ratón IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Control de isotipo (grupo SCs), que sirve como control negativo.
4. Análisis estadístico
- Evaluar las diferencias estadísticas en los datos mediante la prueba tno parís con GraphPad Prism 6.0. Establezca la significancia estadística en p<0.05. Realizar todos los ensayos en triplicado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Observación microscópica de luz
Los SCs y los fibroblastos son las dos poblaciones celulares principales obtenidas en el cultivo celular primario a partir de tejidos nerviosos. Después de la inoculación durante 1 h, la mayoría de las células se adhirieron a la parte inferior del plato, y la morfología celular cambió de redonda a ovalada. Después del cultivo durante 24 h, los SCs exhibieron una morfología bipolar o tripolar y la longitud de estos osciló entre 100 y 200 m. Después de 48 h, la agregación y proliferación de células se produjo, en la que muchas células se agregaron en una disposición de extremo a extremo, hombro a hombro, torbellino o cerca. Los otros fibroblastos que son más grandes que los SCs mostraron una forma plana e irregular. Con un tiempo de cultivo prolongado, el número de CC y fibroblastos se incrementó gradualmente. Los SCs se agruparon entre espacios de fibroblastos o se localizaron en la superficie de los fibroblastos(Figura 2A, 2B). Las células se someten a digestión diferencial y adherencia diferencial para aislar fibroblastos y CC. Después de la digestión durante 8-10 s, los SCs aparecieron como redondos y se soplan fácilmente, mientras que los fibroblastos son planos y unidos a la parte inferior de la placa(Figura 2C, 2D). Después de la digestión diferencial y la adherencia diferencial dos veces, se aislaron los SCs y fibroblastos cultivados primarios y se observó la morfología celular típica de los CC y fibroblastos motores y sensoriales(Figura 2E-2H).
Evaluación de la pureza de los fibroblastos motores y sensoriales y SCs por la CPI
Los fibroblastos sensoriales y motores fueron etiquetados con CD90 y visualizados utilizando un microscopio de escaneo láser confocal(Figura 3A, 3D). Se utilizó el tinte Hoechst 33342 para etiquetar el núcleo celular(Figura 3B, 3E). Las imágenes combinadas de inmunostaining de fibroblastos y tinción nuclear (Figura 3C, 3F) indicaron que el 92,51% y el 92,64% de las células coetiquetados CD90 y Hoechst estaban presentes en los fibroblastos sensoriales y motores(Figura 3G),respectivamente.
Los SCs sensoriales y motores fueron etiquetados con S100 y visualizados utilizando un microscopio de escaneo láser confocal(Figura 4A, 4D),respectivamente. Se utilizó el tinte Hoechst 33342 para etiquetar el núcleo celular(Figura 4B, 4E). Las imágenes combinadas de inmunostaining SC y tinción nuclear (Figura 4C, 4F) indicaron la presencia de 91,61% y 93,56% de las células etiquetadas por S100 y Hoechst en los CC motor y sensoriales (Figura 4G), respectivamente.
Evaluación de la pureza de los fibroblastos sensoriales y motores y SCs por FCA
Después de la digestión diferencial y la adherencia diferencial dos veces, los fibroblastos y SCs cultivados primarios fueron aislados. Como se muestra en la Figura 5A, casi >90% de las células en el motor y el cultivo sensorial de Fb eran fibroblastos, que fue indicado por M2, mientras que el restante <10% (indicado por M1) eran SCs. Figura 5B mostró que >92% de todas las células en el cultivo del SC motor y sensorial eran SC, que fue indicado por M2, mientras que el restante <8% (indicado por M1) eran fibroblastos.
Figura 1: El diagrama esquemático que muestra los pasos de separación y purificación de fibroblastos sensoriales y motores y CC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Micrografía de contraste de fase que muestra la morfología celular de (A) motores primarios cultivados y (B) fibroblastos sensoriales y CC. Después de la digestión durante 10 s, la morfología celular de los SCs era redonda (como indicaban las flechas), mientras que los fibroblastos se mantuvieron planos y se unieron en la parte inferior del plato(C: Fibroblastos motor y CC; D: Fibroblastos sensoriales y SCs). Después de la digestión diferencial y la adherencia diferencial, los SCs y Fibroblastos fueron aislados y la morfología celular típica de los fibroblastos motores y sensoriales (E: Fibroblastos motores; F: Fibroblastos Sensoriales) y SCs (G: SCs de Motor; H: Se mostraron SCs sensoriales). (Barra de escala: 50 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Identificación de la pureza de los fibroblastos motores y sensoriales por CPI. Fotografías microscópicas de fluorescencia de motores cultivados(A-C)y fibroblastos sensoriales (D-F) que muestran inmunosu mancha con anticuerpos contra CD90(A y D, rojo), tinción nuclear Hoechst 33342 (B y E, azul), y fusión de ambas manchas (C y F). (G) Análisis estadístico de la pureza de los fibroblastos cultivados. (Barra de escala: 100 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Identificación de la pureza de los SCs motores y sensoriales por CPI. Fotografías microscópicas de fluorescencia de motores cultivados(A-C) y CC sensoriales (D-F) que muestran inmunostaining con anticuerpos contra S100(A y D, rojo), Tinción nuclear Hoechst 33342 (B y E, azul), y fusión de ambas manchas (C y F). (G) Análisis estadístico de la pureza de los SCs cultivados. (Barra de escala: 100 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Identificación de la pureza de los fibroblastos sensoriales y motores y SCs por FCA. El gráfico FCA que muestra el porcentaje de células CD90 positivas/células S100 positivas (M2) de fibroblastos/SCsAmotores y sensorialesBcultivados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las dos principales poblaciones celulares de los nervios periféricos incluían CC y fibroblastos. Los fibroblastos y SCs cultivados principalmente pueden ayudar con precisión a modelar la fisiología de fibroblastos y CC durante el desarrollo y la regeneración de los nervios periféricos. El estudio mostró que las células nerviosas ciáticas de rata P7 contenían alrededor del 85% de S100-positivas SCs, 13% de fibroblastos OX7 positivos y sólo 1.5% de macrófagos OX42 positivos13. Aunque el número de fibroblastos es menor que el DE, la tasa de proliferación inicial de fibroblastos es más rápida que la de los CCS. Por lo tanto, Ara-C es el agente antimitotico más comúnmente utilizado para la eliminación de fibroblastos en muchos estudios. Sin embargo, Ara-C no es específico para la mitosis celular, y también puede inhibir la proliferación de SCs durante la etapa vigorosa de división. Con el método de inmunolisis o inmunopación mediada por anticuerpos, los fibroblastos se perdieron o murieron. Aunque la tecnología de clasificación de citometría de flujo se puede utilizar para obtener fibroblastos y CC de alta pureza al mismo tiempo, necesita un gran número de células, y la tasa de adquisición celular se mantuvo baja. Hasta biencósticamos, este fue el primer estudio que mostró el método de purificación de SCs sensoriales y motores y fibroblastos.
En este estudio, se obtuvo al mismo tiempo un gran número de fibroblastos sensoriales y motores y CC al combinar la digestión diferencial y la adherencia diferencial secuencialmente, sin causar daño a las células. Los resultados de la tinción de la CPI y la FCA mostraron que todos los SCs/fibroblastos sensoriales y motores eran de alta pureza (>90%). El paso crítico de este método es controlar el tiempo de digestión diferencial. Si el tiempo es demasiado corto, hace que las SCs sean difíciles de separar, y si el tiempo es demasiado largo, hace que algunos fibroblastos se digieren con SCs. En el estudio de Weiss, la Accutase helada se utiliza para separar los SCs de los fibroblastos, pero esto es más caro que la trippsina17. La digestión diferencial con tripsina puede ayudar eficazmente a separar los CC y los fibroblastos. La limitación de este protocolo es que no es fácil extirpar los nervios sensoriales y motores de ratas neonatales, lo que requiere más práctica con el microscopio diseccionado. El protocolo para el cultivo es muy útil para estudiar las características biológicas de los fibroblastos sensoriales y nerviosos motores y SCs, y para el mecanismo de regeneración sensorial y nerviosa motora o fibroblastos y trasplante de SCs para promover la regeneración nerviosa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (Grant No. 2017YFA0104703), la Fundación Natural Nacional de China (Grant No. 31500927).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
References
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
- Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
- Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
- Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
- Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
- Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
- Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
- He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016 (2018).
- Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
- Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
- Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
- Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
- He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
- Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).
