Summary
Ici, nous présentons une méthode pour purifier les fibroblastes et les cellules de Schwann des nerfs sensoriels et moteurs in vitro.
Abstract
Les principales cellules du système nerveux périphérique sont les cellules Schwann (SC) et les fibroblastes. Ces deux cellules expriment distinctement les phénotypes sensoriels et moteurs impliqués dans différents modèles d’expression de gène de facteur neurotrophique et d’autres processus biologiques, affectant la régénération de nerf. La présente étude a établi un protocole pour obtenir des SCs et des fibroblastes hautement purifiés de rat sensoriels et moteurs plus rapidement. La racine ventrale (nerf moteur) et la racine dorsale (nerf sensoriel) des rats néonatals (7 jours) ont été dissociées et les cellules ont été cultivées pendant 4-5 jours, suivies par l’isolement des fibroblastes sensoriels et moteurs et des SC en combinant la digestion différentielle et les méthodes d’adhérence différentiellement. Les résultats des analyses d’immunocytochimie et de cytométrie de flux ont montré que la pureté des SC et des fibroblastes sensoriels et moteurs était de >90%. Ce protocole peut être utilisé pour obtenir un grand nombre de fibroblastes sensoriels et moteurs / SC plus rapidement, contribuant à l’exploration de la régénération sensorielle et motrice des nerfs.
Introduction
Dans le système nerveux périphérique, les fibres nerveuses se composent principalement d’axones, de cellules Schwann (SC) et de fibroblastes, et contient également un petit nombre de macrophages, de cellules endothéliales microvasculaires et de cellules immunitaires1. Les SC enveloppent les axones dans un rapport de 1:1 et sont entourés d’une couche de tissu conjonctif appelée endoneurium. Les axones sont ensuite regroupés pour former des groupes appelés fascicles, et chaque fascicle est enveloppé dans une couche de tissu conjonctif connue sous le nom de périneurium. Enfin, la fibre nerveuse entière est enveloppée dans une couche de tissu conjonctif, qui est appelé l’épineurium. Dans l’endoneurium, la population cellulaire entière est composée de 48% SC, et une partie substantielle des cellules restantes implique des fibroblastes2. En outre, les fibroblastes sont des composants importants de tous les compartiments nerveux, y compris l’épineurium, le périneurium, et l’endoneurium3. De nombreuses études ont indiqué que les SC et les fibroblastes jouent un rôle crucial dans le processus de régénération après les lésions nerveuses périphériques4,5,6. Après la transection du nerf périphérique, les fibroblastes périneuriaux régulent le tri cellulaire par l’intermédiaire de la voie de signalisation ephrin-B/Ephb2 entre les SC et les fibroblastes, guidant davantage la repousse axonale à travers les blessures5. Les fibroblastes périphériques de nerf sécrètent la protéine de tenascine-C et améliorent la migration des SC pendant la régénération de nerf par la voie de signalisation β1-intégrine7. Cependant, les SC et les fibroblastes utilisés dans les études ci-dessus ont été dérivés du nerf sciatique, qui inclut les nerfs sensoriels et moteurs.
Dans le système nerveux périphérique, les nerfs sensoriels (nerfs afférents) conduisent la signalisation sensorielle des récepteurs au système nerveux central (SNC), tandis que les nerfs moteurs (nerfs efferents) conduisent des signaux du SNC aux muscles. Des études antérieures ont indiqué que les SC expriment des phénotypes moteurs et sensoriels distincts et sécrètent des facteurs neurotrophiques pour soutenir la régénération périphérique du nerf8,9. Selon une étude récente, les fibroblastes expriment également différents phénotypes moteurs et sensoriels et affectent la migration des SC10. Ainsi, l’exploration des différences entre les fibroblastes/SC des nerfs moteurs et sensoriels nous permet d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents complexes de la régénération spécifique du nerf périphérique.
À l’heure actuelle, il existe de nombreuses façons de purifier les SC et les fibroblastes, y compris l’application d’agents antimitotiques, cytolyse à médiation d’anticorps11,12, immunopanning séquentiel13 et laminine substrat14. Cependant, toutes les méthodes ci-dessus éliminent les fibroblastes et ne préservent que les SC. Les SC et les fibroblastes hautement purifiés peuvent être obtenus par la technologie de tri de cytométrie de flux15, mais c’est une technique longue et coûteuse. Ainsi, dans cette étude, une simple méthode de digestion différentielle et d’adhérence différentielle pour purifier et isoler les fibroblastes et les SC des nerfs sensoriels et moteurs a été développée afin d’obtenir un grand nombre de fibroblastes et de SC plus rapidement.
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Protocol
Cette étude a été réalisée conformément aux Lignes directrices institutionnelles sur les soins aux animaux de l’Université de Nantong. Toutes les procédures, y compris les sujets animaux, ont été approuvées de manière éthique par le Comité d’administration des animaux expérimentaux, province du Jiangsu, Chine.
1. Isolement et culture des fibroblastes et des SC des nerfs moteurs et sensoriels
- Utilisez des rats Sprague-Dawley (SD) vieux de sept jours (n=4) fournis par le Experimental Animal Center de l’Université de Nantong en Chine. Placer les rats dans un réservoir contenant 5% d’isoflurane pendant 2-3 minutes, laisser les animaux respirer lentement et n’avoir aucune activité indépendante, puis désinfecter à l’aide de 75% d’éthanol avant la décapitation.
- Utilisez des ciseaux pour couper la peau arrière pendant environ 3 cm et enlever la colonne vertébrale. Ouvrez soigneusement le canal vertébral pour exposer la moelle épinière.
- Maintenir la moelle épinière dans une boîte de Pétri de 60 mm avec 2-3 mL de solution de sel équilibrée (HBSS) de D-Hanks glacée.
- Basé sur la structure anatomique, exciser la racine ventrale (nerf moteur) puis la racine dorsale (nerf sensoriel) sous un microscope de dissection. Ensuite, placez-les dans une solution de sel équilibrée (HBSS) glacée de D-Hanks.
- Après avoir enlevé le HBSS, couper les nerfs en morceaux de 3-5 mm avec des ciseaux et digérer avec 1 mL de 0,25% (w/v) trypsin à 37 °C pendant 18-20 min. Ensuite, compléter avec 3-4 mL de DMEM contenant 10% de sérum bovin foetal (FBS) pour arrêter la digestion.
- Pipette le mélange de haut en bas doucement environ 10 fois et la centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min. Après cela, jeter le supernatant et suspendre le précipité en 2-3 mL de DMEM complété par 10% FBS.
- Filtrer la suspension cellulaire à l’aide d’un filtre à mailles de 400, puis inoculer les cellules dans une boîte et une culture Petri de 60 mm à 37 °C en présence de 5 % de CO2. Après 4-5 jours de culture, isoler le passage 0 (p0) fibroblastes et SC après avoir atteint 90% confluence.
- Isolement et culture des SC (Figure 1)
- Laver les cellules une fois à l’aide de 1x PBS. Ajouter 1 mL de 0,25% (w/v) de trypsie (37 °C) par boîte de Pétri de 60 mm pour digérer les cellules de 8 à 10 s à température ambiante. Après cela, ajouter 3 mL de DMEM complété avec 10% FBS pour arrêter la digestion.
- Souffler doucement le mélange pour détacher les SC avec une pipette. Ensuite, recueillir et centrifuger les SC à 800 x g pendant 5 min.
- Jetez le supernatant et suspendez le précipité dans 3 ml de DMEM avec 10% FBS, 1% de pénicilline/streptomycine, 2 μM de forskolin et 10 ng/mL HRG, puis inoculer les cellules dans une boîte de 60 mm petri non enduite. Après avoir cuté à 37 °C pendant 30-45 min, les fibroblastes (un certain nombre de fibroblastes sont digérés avec des SC) s’attachent au fond du plat.
- Transférer le supernatant (y compris les SC) dans un autre plat et une culture mi-couchés poly-L-lysine (PLL) à 37 °C pendant 2 jours.
- Isolement et culture des fibroblastes (Figure 1)
- Après avoir enlevé les SC (comme indiqué à l’étape 1.8), laver les fibroblastes restants dans la vaisselle avec 1x PBS, puis ajouter 1 mL de 0,25% (w/v) trypsin pour digérer les fibroblastes pendant 2 min à 37 °C.
- Ajouter DMEM complété avec 10% FBS pour mettre fin à la digestion. Soufflez les fibroblastes à l’aide d’une pipette, puis collectez-les et centrifugez à 800 x g pendant 5 min.
- Jetez le supernatant, suspendez le précipité avec 2 mL de DMEM contenant 10% de FBS, puis inoculez les cellules dans une boîte de Pétri non garnie de 60 mm. Les fibroblastes après la culture pendant 30-45 min à 37 °C s’attachent au fond du plat. Jetez le supernatant (y compris quelques nombres de SC). Ajouter ensuite 3 mL de DMEM complétés par 10% de FBS dans le plat et la culture des fibroblastes à 37 °C pendant 2 jours.
- Passer les cellules p1 jusqu’à ce qu’elles atteignent 90% confluence. Ensuite, purifier par la digestion différentielle et l’adhérence différentielle à nouveau comme décrit dans les sections 1.8 et 1.9.
- Digestez les fibroblastes p2 et les SC après la culture pendant 2 jours, puis recueillir les cellules, compter et inoculer en 1 x 105 nombres/bien sur des diapositives enduites de PLL pour l’immunocytochimie (ICC).
2. ICC pour l’identification de la pureté cellulaire
- Culturez les cellules pendant 24 h à 37 °C et effectuez la coloration icc après la digestion différentielle et l’adhérence différentielle des fibroblastes et des SC moteurs et sensoriels.
- Laver les fibroblastes et les SC moteurs et sensoriels avec 1x PBS et les fixer en 200 μL/puits de paraformaldéhyde à 4 % (pH 7,4) pendant 18 min à température ambiante.
- Bloquer l’échantillon de SC avec un tampon de blocage (0,1 % de Triton X-100 dans 0,01 M de SÉRUM CONTENANT 5 % de sérum de chèvre) et bloquer les fibroblastes d’échantillon avec un tampon de blocage (0,01 M pbs contenant 5 % de sérum de chèvre) pendant 45 min à 37 °C après les avoir lavés avec trois fois de PBS.
- Retirez la mémoire tampon de blocage et incuber avec les anticorps primaires suivants : anticorps anti-CD90 monoclonal souris (marqueur spécifique pour les fibroblastes) (1:1000) pour les fibroblastes et les anticorps anti-S100 de souris (marqueur spécifique pour les SC) (1:400) pour les SC à 4 °C pendant la nuit.
- Jetez les anticorps primaires, lavez-les trois fois avec pbs et incuber avec les anticorps secondaires suivants : Alexa Fluor 594 goatoile igG (1:400) pour les fibroblastes et IgG anti-souris de chèvre conjuguée à 488 (1:400) pour les SC à température ambiante pendant 1,5 h.
- Laver les échantillons trois fois avec pbs, et tacher les noyaux avec 5 μg/mL Hoechst 33342 colorant pendant 10 min à température ambiante. Laver l’échantillon avec 1x PBS trois fois et les monter à l’aide du support de montage (20 μL/slide) sur la glissière en verre.
- Prenez les photographies cellulaires par microscope à balayage laser confocal dans trois champs aléatoires pour chaque puits. Évaluez le nombre total de cellules positives cd90, de cellules S100 positives, puis calculez le pourcentage de cellules CD90 positives et de cellules S100 positives, respectivement. Effectuer la coloration en triple.
3. Analyse de cytométrie de flux (FCA) pour l’identification de la pureté cellulaire
- Évaluer la pureté des fibroblastes et des SC moteurs et sensoriels tels que décrits précédemment par FCA16. En bref, digérer les fibroblastes et les SC moteurs et sensoriels p2 avec une trypsie de 0,25 % (w/v), réutilir les granulés cellulaires et les incuber en milieu de fixation à température ambiante pendant 15 min.
- Incuber les cellules avec un milieu de perméabilisation et une sonde à l’aide d’anticorps anti-CD90 monoclonal souris (0,1 μg/106 cellules, 200 μL) pour les fibroblastes et les anticorps anti-S100 de souris (1:400, 200 μL) pour les SC à température ambiante pendant 30 min, respectivement.
- Incuber les cellules avec igG igG anti-souris de chèvre conjuguée à 488 pendant 30 min. Utilisez le calibre FACS pour effectuer la cytométrie de flux et analysez les données à l’aide du logiciel Cell Quest.
- Incuber les cellules uniquement avec 488-conjugués chèvre anti-souris IgG (fibroblastes Group) et la souris IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Contrôle de l’isotype (groupe SC), qui sert de contrôle négatif.
4. Analyse statistique
- Présenter toutes les données comme moyens ± SEM. Évaluer les différences statistiques dans les données par t-testnon apparié à l’aide de GraphPad Prism 6.0. Définissez la signification statistique à p<0.05. Effectuez tous les tests en triple.
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Representative Results
Observation microscopique légère
Les SC et les fibroblastes sont les deux principales populations cellulaires obtenues dans la culture cellulaire primaire à partir des tissus nerveux. Après l’inoculation pendant 1 h, la plupart des cellules ont adhéré au fond du plat, et la morphologie cellulaire est passée de ronde à ovale. Après avoir passé 24 h à cultiver, les SC ont présenté une morphologie bipolaire ou tripolaire et la longueur de ceux-ci variait de 100 à 200 μm. Après 48 h, l’agrégation et la prolifération des cellules se sont produites, dans lesquelles de nombreuses cellules ont été agrégées dans un arrangement de bout en bout, d’épaule à épaule, de tourbillon ou de clôture- comme arrangement. Les autres fibroblastes qui sont plus grands que les SC présentaient une forme plate et irrégulière. Avec le temps prolongé de culture, le nombre de SC et de fibroblastes a été graduellement augmenté. Les SC étaient regroupés entre des espaces de fibroblastes ou situés à la surface des fibroblastes (figure 2A, 2B). Les cellules sont soumises à la digestion différentielle et à l’adhérence différentielle pour isoler les fibroblastes et les SC. Après la digestion pendant 8-10 s, les SC sont apparus comme ronds et sont soufflés facilement, tandis que les fibroblastes sont plats et attachés au fond du plat (figure 2C, 2D). Après digestion différentielle et adhérence différentielle à deux reprises, les SC et les fibroblastes de culture primaire ont été isolés et la morphologie cellulaire typique des SC et des fibroblastes moteurs et sensoriels a été observée (Figure 2E-2H).
Évaluation de la pureté des fibroblastes et des CSC moteurs et sensoriels par icc
Les fibroblastes sensoriels et moteurs ont été étiquetés à l’aide de CD90 et visualisés à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal (Figure 3A, 3D). Le colorant Hoechst 33342 a été utilisé pour étiqueter le noyau cellulaire (figure 3B, 3E). Les images fusionnées de l’immunostaining de fibroblaste et de la coloration nucléaire (figure 3C, 3F) ont indiqué que 92,51 % et 92,64 % des cellules co-étiquetées CD90 et Hoechst étaient présentes dans les fibroblastes moteurs et sensoriels (figure 3G),respectivement.
Les SC sensoriels et moteurs ont été étiquetés à l’aide de S100 et visualisés à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal (figure 4A, 4D), respectivement. Le colorant Hoechst 33342 a été utilisé pour étiqueter le noyau cellulaire (figure 4B, 4E). Les images fusionnées de l’immunostaining sc et de la coloration nucléaire (figure 4C, 4F) indiquaient la présence de 91,61 % et 93,56 % des cellules co-étiquetées S100 et Hoechst dans les SCs moteurs et sensoriels (figure 4G),respectivement.
Évaluation de la pureté des fibroblastes sensoriels et moteurs et des SC par FCA
Après la digestion différentielle et l’adhérence différentielle deux fois, les fibroblastes et scs cultivés primaires ont été isolés. Comme le montre la figure 5A, presque >90% des cellules de la culture Fb motrice et sensorielle étaient des fibroblastes, qui a été indiquée par M2, tandis que les autres <10% (indiqués par M1) étaient des SC. La figure 5B a montré que >92% de toutes les cellules de la culture du moteur et de la SC sensorielle étaient des SC, ce qui était indiqué par M2, tandis que les autres <8% (indiqués par M1) étaient des fibroblastes.
Figure 1 : Diagramme schématique montrant les étapes de séparation et de purification des fibroblastes et SC sensoriels et moteurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Micrographe de contraste de phase montrant la morphologie cellulaire du moteur (A) de culture primaire et des fibroblastes sensoriels (B) et des SC. Après digestion pendant 10 s, la morphologie cellulaire des SC était ronde (comme indiqué par les flèches), tandis que les fibroblastes sont restés plats et ont été attachés au bas du plat (C: Fibroblastes moteurs et SC; D. : Fibroblastes sensoriels et SC). Après digestion différentielle et adhérence différentielle, les SC et les fibroblastes ont été isolés et la morphologie cellulaire typique des fibroblastes moteurs et sensoriels (E : Fibroblastes moteurs ; F: Fibroblastes sensoriels) et SC(G: Moteur SC; H: Scs sensoriels) ont été montrés. (Barre d’échelle : 50 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Identification de la pureté des fibroblastes moteurs et sensoriels par la CPI. Photographies microscopiques de fluorescence du moteur cultivé (A-C) et des fibroblastes sensoriels (D-F) montrant l’immunostaining avec des anticorps contre CD90 (A et D, rouge), Hoechst 33342 tache nucléaire (B et E, bleu), et la fusion des deux colorations (C et F). (G) Analyse statistique de la pureté des fibroblastes cultivés. (Barre d’échelle : 100 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Identification de la pureté des SC motrices et sensoriels par la CPI. Photographies microscopiques de fluorescence du moteur cultivé (A-C) et des SC sensoriels (D-F) montrant l’immunostaining avec des anticorps contre S100 (A et D, rouge), Hoechst 33342 tache nucléaire (B et E, bleu), et la fusion des deux colorations (C et F). (G) Analyse statistique de la pureté des SC cultivées. (Barre d’échelle : 100 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Identification de la pureté des fibroblastes sensoriels et moteurs et des SC par FCA. Le graphique FCA montrant le pourcentage de cellules CD90-positives/S100-positives (M2) de fibroblastes/SC moteurs et sensoriels cultivés. Analyse statistique de la pureté des fibroblastes cultivés (A) et scs (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les deux principales populations cellulaires de nerfs périphériques comprenaient les SC et les fibroblastes. Les fibroblastes et SC principalement cultivés peuvent aider avec précision à modéliser la physiologie des fibroblastes et des SC pendant le développement et la régénération des nerfs périphériques. L’étude a montré que les cellules nerveuses sciatiques de rat P7 contenaient environ 85% des SC S100-positifs, 13% des fibroblastes OX7-positifs et seulement 1,5% des macrophages OX42-positifs13. Bien que le nombre de fibroblastes soit inférieur à celui des SC, le taux initial de prolifération des fibroblastes est plus rapide que celui des SC. Par conséquent, Ara-C est l’agent antimitotique le plus couramment utilisé pour enlever les fibroblastes dans de nombreuses études. Cependant, l’Ara-C n’est pas spécifique à la mitose cellulaire, et il peut également inhiber la prolifération des SC au cours d’un stade vigoureux de la division. Avec la cytolyse anticorps-médiée ou la méthode d’immunopanning, les fibroblastes ont été perdus ou sont morts. Bien que la technologie de tri de la cytométrie du débit puisse être utilisée pour obtenir des fibroblastes et des SC de haute pureté en même temps, elle a besoin d’un grand nombre de cellules, et le taux d’acquisition des cellules est resté faible. Au meilleur de notre connaissance, ce fut la première étude à montrer la méthode de purification des SC sensoriels et moteurs et des fibroblastes.
Dans cette étude, un grand nombre de fibroblastes sensoriels et moteurs et de SC a été obtenu en même temps en combinant la digestion différentielle ainsi que l’adhérence différentielle séquentiellement, ne causant aucun mal aux cellules. Les résultats de la coloration ICC et FCA ont montré que tous les SC sensoriels et moteurs / fibroblastes étaient de haute pureté (>90%). L’étape critique de cette méthode est de contrôler le temps de digestion différentielle. Si le temps est trop court, il rend les SC difficiles à détacher, et si le temps est trop long, il provoque quelques fibroblastes à digérer avec scs. Dans l’étude de Weiss, l’Accutase glacée est utilisée pour détacher les SC des fibroblastes, mais c’est plus cher que la trypsin17. La digestion différentielle avec la trypsine peut aider efficacement à séparer les SC et les fibroblastes. La limitation de ce protocole est qu’il n’est pas facile d’exciser les nerfs sensoriels et moteurs des rats néonatals, ce qui nécessite plus de pratique avec le microscope de dissection. Le protocole pour la culture est très utile pour étudier les caractéristiques biologiques des fibroblastes et des SC sensoriels et moteurs, et pour le mécanisme de régénération sensorielle et motrice des nerfs ou des fibroblastes et des SC transplantation pour promouvoir la régénération nerveuse.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), la National Natural Foundation of China (Grant No. 31500927).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
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