Summary
Aqui, apresentamos um método para purificar fibroblastos e células Schwann de nervos sensoriais e motores in vitro.
Abstract
As principais células do sistema nervoso periférico são as células Schwann (SCs) e os fibroblastos. Ambas as células expressam claramente os fenótipos sensoriais e motores envolvidos em diferentes padrões de expressão genética de fator neurotrófico e outros processos biológicos, afetando a regeneração nervosa. O presente estudo estabeleceu um protocolo para obter SCs sensoriais e motores de ratos altamente purificados e mais rapidamente. A raiz ventral (nervo motor) e a raiz dorsal (nervo sensorial) de ratos neonatais (7 dias de idade) foram dissociadas e as células foram cultivadas por 4-5 dias, seguidas pelo isolamento de fibroblastos sensoriais e motores e SCs, combinando métodos diferenciais de digestão e adesão diferencial sequencialmente. Os resultados das análises de imunocytoquímica e citometria de fluxo mostraram que a pureza das SCs sensoriais e motoras e dos fibroblastos foi de >90%. Este protocolo pode ser usado para obter um grande número de fibroblastos/SCs sensoriais e motores mais rapidamente, contribuindo para a exploração da regeneração sensorial e do nervo motor.
Introduction
No sistema nervoso periférico, as fibras nervosas consistem principalmente de axônios, células schwann (SCs) e fibroblastos, e também contém um pequeno número de macrófagos, células endoteliais microvasculares e células imunes1. Os SCs envolvem os axônios em uma proporção de 1:1 e são fechados por uma camada de tecido conjuntivo chamada endoneurium. Os axônios são então empacotados para formar grupos chamados fascicles, e cada fascículo é envolto em uma camada de tecido conjuntivo conhecida como perineúrio. Finalmente, toda a fibra nervosa é envolta em uma camada de tecido conjuntivo, que é denominada como epineurium. No endônio, toda a população celular é composta por 48% de SCs, e uma parte substancial das células remanescentes envolve fibroblastos2. Além disso, os fibroblastos são componentes importantes de todos os compartimentos nervosos, incluindo o epineurium, o perineúrio e o endônio3. Muitos estudos indicaram que as SCs e os fibroblastos desempenham um papel crucial no processo de regeneração após as lesões nervosas periféricas4,,5,6. Após a transeção do nervo periférico, os fibroblastos perineurial regulam a classificação celular através da via de sinalização efrinina-B/EphB2 entre SCs e fibroblastos, orientando ainda mais o recrescimento axonal através das feridas5. Os fibroblastos nervosos periféricos secretam a proteína tenascin-C e aumentam a migração de SCs durante a regeneração nervosa através da via de sinalização β1-integrin7. No entanto, os SCs e os fibroblastos utilizados nos estudos acima foram derivados do nervo ciático, que inclui nervos sensoriais e motores.
No sistema nervoso periférico, os nervos sensoriais (nervos aferentes) conduzem sinalização sensorial dos receptores para o sistema nervoso central (SNC), enquanto os nervos motores (nervos eferentes) conduzem sinais do SNC aos músculos. Estudos anteriores indicaram que as SCs expressam fenótipos motores e sensoriais distintos e secretam fatores neurotróficos para suportar a regeneração nervosa periférica8,,9. De acordo com um estudo recente, os fibroblastos também expressam diferentes fenótipos motores e sensoriais e afetam a migração das SCs10. Assim, a exploração das diferenças entre fibroblastos/SCs motores e nervosos sensoriais nos permite estudar os complicados mecanismos moleculares subjacentes da regeneração específica do nervo periférico.
Atualmente, existem muitas maneiras de purificar SCs e fibroblastos, incluindo a aplicação de agentes antimitóticos, citolise mediada por anticorpos11,,12, imunopanning sequencial13 e substrato de laminina14. No entanto, todos os métodos acima removem fibroblastos e preservam apenas os SCs. SCs e fibroblastos altamente purificados podem ser obtidos pela tecnologia de classificação de citometria de fluxo15,mas é uma técnica demorada e cara. Assim, neste estudo, foi desenvolvido um método simples de digestão diferencial e adesão diferencial para purificar e isolar fibroblastos sensoriais e motores e SCs, a fim de obter um grande número de fibroblastos e SCs mais rapidamente.
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Protocol
Este estudo foi realizado de acordo com as Diretrizes Institucionais de Cuidados Com Animais da Universidade de Nantong. Todos os procedimentos, incluindo os animais, foram eticamente aprovados pelo Comitê de Administração de Animais Experimentais, província de Jiangsu, China.
1. Isolamento e cultura de fibroblastos motores e sensoriais e SCs
- Use ratos esponjosos de sete dias de idade (SD) fornecidos pelo Centro Animal Experimental da Universidade de Nantong da China. Coloque os ratos em um tanque contendo 5% de isoflurane por 2-3 minutos, permita que os animais respirem lentamente e não tenham atividade independente e, em seguida, higienize usando 75% de etanol antes da decapitação.
- Use uma tesoura para cortar a pele traseira por cerca de 3 cm e remover a coluna vertebral. Abra o canal vertebral cuidadosamente para expor a medula espinhal.
- Mantenha a medula espinhal em uma placa de Petri de 60 mm com 2-3 mL de solução de sal balanceada D-Hanks (HBSS).
- Com base na estrutura anatômica, extirve a raiz ventral (nervo motor) e, em seguida, a raiz dorsal (nervo sensorial) sob um microscópio dissecando. Em seguida, coloque-os em uma solução de sal balanceada D-Hanks (HBSS).
- Depois de remover o HBSS, corte os nervos em pedaços de 3-5 mm com tesoura e digerir com 1 mL de 0,25% (w/v) trypsin a 37 °C por 18-20 min. Em seguida, suplemento com 3-4 mL de DMEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) para parar a digestão.
- Pipeta a mistura para cima e para baixo suavemente cerca de 10 vezes e centrífuga a 800 x g por 5 min. Depois disso, descarte o supernasal e suspenda o precipitado em 2-3 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS.
- Filtre a suspensão da célula usando um filtro de malha de 400 e, em seguida, inocular as células em placa de Petri de 60 mm e cultura a 37 °C na presença de 5% de CO2. Após 4-5 dias de cultivo, isole a passagem 0 (p0) de fibroblastos e SCs após atingir 90% de confluência.
- Isolamento e cultura das SCs (Figura 1)
- Lave as células uma vez usando 1x PBS. Adicione 1 mL de 0,25% (w/v) trippsina (37 °C) por placa de Petri de 60 mm para digerir as células para 8-10 s em temperatura ambiente. Depois disso, adicione 3 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS para parar a digestão.
- Sopre suavemente a mistura para separar os SCs com uma pipeta. Em seguida, colete e centrifuge os SCs a 800 x g por 5 min.
- Descarte o supernasciante/estreptomicina, 2 μM forskolin e 10 ng/mL HRG, e depois inocula as células em placa de Petri de 60 mm não revestida. Depois de culminar a 37 °C por 30-45 min, os fibroblastos (um número de fibroblastos são digeridos com SCs) anexam ao fundo do prato.
- Transfira o supernasciente (incluindo os SCs) para outro prato médio revestido de poli-L(PLL) e cultura a 37 °C por 2 dias.
- Isolamento e cultura de fibroblastos (Figura 1)
- Depois de remover os SCs (como mostrado na etapa 1.8), lave os fibroblastos restantes nos pratos com 1x PBS e, em seguida, adicione 1 mL de 0,25% (w/v) trypsin para digerir os fibroblastos por 2 min a 37 °C.
- Adicione DMEM suplementado com 10% de FBS para acabar com a digestão. Exploda os fibroblastos usando uma pipeta, e depois colete e centrifuge-os a 800 x g por 5 min.
- Descarte o supernasce, suspenda o precipitado com 2 mL de DMEM contendo 10% de FBS e, em seguida, inocular as células em placa de Petri de 60 mm não revestida. Os fibroblastos após a colheita por 30-45 min a 37 °C anexam ao fundo do prato. Descarte o supernatante (incluindo alguns números de SCs). Em seguida, adicione 3 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS no prato e cultura dos fibroblastos a 37 °C por 2 dias.
- Passagem das células p1 até atingirem 90% de confluência. Em seguida, purificá-los por digestão diferencial e adesão diferencial novamente como descrito nas seções 1.8 e 1.9.
- Digerir os fibroblastos p2 e SCs após a colheita por 2 dias e, em seguida, coletar as células, contar e inocular em 1 x 105 números/bem em lâminas revestidas de PLL para imunocitoquímica (ICC).
2. ICC para identificação da pureza celular
- Cultuize as células por 24h a 37 °C e realize a coloração do ICC após digestão diferencial e adesão diferencial de fibroblastos motor e sensoriais e SCs.
- Lave os fibroblastos motor e sensorial e os SCs com 1x PBS e fixe-os em 200 μL/well de 4% de paraformaldeído (pH 7.4) por 18 minutos à temperatura ambiente.
- Bloqueie os SCs amostrais com tampão de bloqueio (0,1% Triton X-100 em 0,01 M PBS contendo 5% de soro de cabra) e bloqueie os fibroblastos amostrais com tampão de bloqueio (0,01 M PBS contendo 5% de soro de cabra) por 45 min a 37 °C depois de lavá-los com PBS três vezes.
- Remova o tampão de bloqueio e incuba com os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-CD90 monoclonal do rato (um marcador específico para fibroblastos) (1:1000) para fibroblastos e anticorpos anti-S100 do rato (um marcador específico para SCs) (1:400) para SCs a 4 °C durante a noite.
- Descarte os anticorpos primários, lave com PBS três vezes e incuba com os seguintes anticorpos secundários: Alexa Fluor 594 igG anti-rato de cabra (1:400) para fibroblastos e IgG anti-rato de cabra conjugado de 488 (1:400) para SCs à temperatura ambiente por 1,5 h.
- Lave as amostras três vezes com PBS e manche os núcleos com 5 μg/mL Hoechst 33342 de corante por 10 minutos à temperatura ambiente. Lave a amostra com 1x PBS três vezes e monte-as usando o meio de montagem (20 μL/slide) na lâmina de vidro.
- Tire as fotografias celulares pelo microscópio de varredura a laser confocal em três campos aleatórios para cada poço. Avalie o número total de núcleos e células CD90 positivas, células S100 positivas e, em seguida, calcule a porcentagem de células CD90 positivas e células S100 positivas, respectivamente. Realize a coloração em triplicado.
3. Análise da citometria de fluxo (FCA) para identificação da pureza celular
- Avalie a pureza dos fibroblastos motor e sensoriais e dos SCs, conforme descrito anteriormente pela FCA16. Brevemente, digerir os fibroblastos motor e sensorial P2 e SCs com trippsina de 0,25%, resuspensar as pelotas celulares e incubar-as em meio de fixação à temperatura ambiente por 15 minutos.
- Incubar as células com meio de permeabilização e sonda utilizando anticorpo anti-CD90 monoclonal do rato (0,1 μg/106 células, 200 μL) para fibroblastos e anticorpos anti-S100 do rato (1:400, 200 μL) para SCs à temperatura ambiente por 30 min, respectivamente.
- Incubar as células com IgG anti-rato de cabra conjugado de 488 por 30 minutos. Use o calibre FACS para realizar a citometria de fluxo e analise os dados usando o software Cell Quest.
- Incubar as células apenas com IgG anti-rato de cabra conjugada de 488 (fibroblastos Group) e mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Controle de isótipo (grupo SCs), que serve como controle negativo.
4. Análise estatística
- Apresentar todos os dados como meio ± SEM. Avaliar diferenças estatísticas nos dados por t-testenão pago usando GraphPad Prism 6.0. Definir significância estatística em p<0,05. Realize todos os ensaios em triplicado.
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Representative Results
Observação microscópica leve
As SCs e os fibroblastos são as duas principais populações celulares obtidas na cultura celular primária a partir de tecidos nervosos. Após a inoculação por 1h, a maioria das células aderiu ao fundo do prato, e a morfologia celular mudou de redonda para oval. Após a colheita por 24 h, os SCs apresentaram uma morfologia bipolar ou tripolar e o comprimento destes variou de 100 a 200 μm. Após 48 h, ocorreu a agregação e proliferação de células, nas quais muitas células foram agregadas em um arranjo de ponta a ponta, ombro a ombro, redemoinho ou cerca. Os outros fibroblastos maiores que os SCs apresentaram forma plana e irregular. Com o tempo de cultura prolongado, o número de SCs e fibroblastos foi gradualmente aumentado. Os SCs foram agrupados entre espaços de fibroblastos ou localizados na superfície dos fibroblastos (Figura 2A, 2B). As células são submetidas à digestão diferencial e à adesão diferencial para isolar fibroblastos e SCs. Após a digestão para 8-10 s, os SCs apareceram como redondos e são explodidos facilmente, enquanto os fibroblastos são planos e presos ao fundo do prato(Figura 2C, 2D). Após digestão diferencial e adesão diferencial duas vezes, foram isoladas as SCs e fibroblastos de cultura primária e a morfologia celular de SCs motor e sensorial e fibroblastos(Figura 2E-2H).
Avaliação da pureza de fibroblastos motor e sensoriais e SCs por ICC
Os fibroblastos sensoriais e motores foram rotulados usando CD90 e visualizados utilizando um microscópio de varredura a laser confocal(Figura 3A, 3D). O corante Hoechst 33342 foi utilizado para rotular o núcleo celular (Figura 3B, 3E). As imagens mescladas de imunossus fibroblastos e manchas nucleares(Figura 3C, 3F) indicaram que 92,51% e 92,64% das células cd90 e hoechst co-rotuladas estavam presentes nos fibroblastos motor e sensorial(Figura 3G),respectivamente.
Os SCs sensoriais e motores foram rotulados utilizando S100 e visualizados utilizando um microscópio de varredura a laser confocal(Figura 4A, 4D), respectivamente. O corante Hoechst 33342 foi usado para rotular o núcleo celular (Figura 4B, 4E). As imagens mescladas de imunostaining SC e coloração nuclear (Figura 4C, 4F) indicaram a presença de 91,61% e 93,56% das células S100 e Hoechst co-rotuladas em SCs motor e sensorial(Figura 4G),respectivamente.
Avaliação da pureza de fibroblastos sensoriais e motores e SCs pela FCA
Após digestão diferencial e adesão diferencial duas vezes, os fibroblastos e SCs cultivados primários foram isolados. Como mostrado na Figura 5A, quase >90% das células na cultura motora e sensorial Fb eram fibroblastos, que foi indicado por M2, enquanto o restante <10% (indicado por M1) foram SCs. A Figura 5B mostrou que >92% de todas as células da cultura motora e sensorial de SC eram SCs, o que foi indicado por M2, enquanto os restantes <8% (indicados por M1) eram fibroblastos.
Figura 1: O diagrama esquemático mostrando os passos de separação e purificação de fibroblastos e SCs sensoriais e motores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Micrografo de contraste de fase mostrando a morfologia celular de (A) fibroblastos sensoriais e (B) sensoriais e SCs. Após a digestão para 10 s, a morfologia celular dos SCs foi redonda (como indicado pelas setas), enquanto os fibroblastos permaneceram planos e foram anexados na parte inferior do prato (C: Fibroblastos motorizados e SCs; D: Fibroblastos sensoriais e SCs). Após digestão diferencial e adesão diferencial, os SCs e Fibroblastos foram isolados e a morfologia celular típica dos Fibroblastos Motor e Sensorial (E: Fibroblastos Motores; F: Fibroblastos Sensoriais) e SCs(G: SCs motor; H: SCs sensoriais) foram mostrados. (Barra de escala: 50 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Identificação da pureza dos fibroblastos motores e sensoriais pelo ICC. Fotografias microscópicas de fluorescência de motorcultura(A-C) e fibroblastos sensoriais(D-F)mostrando imunostensão com anticorpos contra CD90(A e D, vermelho), Mancha nuclear Hoechst 33342(B e E, azul), e fusão de ambas as manchas(C e F). (G) Análise estatística da pureza dos fibroblastos cultivados. (Barra de escala: 100 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Identificação da pureza dos SCs motores e sensoriais por ICC. Fotografias microscópicas de fluorescência de motores cultivados (A-C) e SCs sensoriais(D-F)mostrando imunostensão com anticorpos contra S100(A e D, vermelho), Mancha nuclear Hoechst 33342(B e E, azul), e fusão de ambas as manchas(C e F). (G) Análise estatística da pureza dos SCs cultivados. (Barra de escala: 100 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Identificação da pureza de fibroblastos sensoriais e motores e SCs pela FCA. O gráfico da FCA mostra a porcentagem de células CD90-positivas/células S100 positivas (M2) de Fibroblastos/SCs motores e sensoriais cultivados. Análise estatística da pureza de Fibroblastos cultivados(A)e SCs(B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As duas principais populações celulares de nervos periféricos incluíam SCs e fibroblastos. Os fibroblastos e SCs principalmente cultivados podem auxiliar com precisão na modelagem da fisiologia de fibroblastos e SCs durante o desenvolvimento e regeneração do nervo periférico. O estudo mostrou que as células nervosas ciáticas de ratos P7 continham cerca de 85% das SCs S100-positivas, 13% dos fibroblastos OX7 positivos e apenas 1,5% dos macrófagos OX42 positivos13. Embora o número de fibroblastos seja menor que os SCs, a taxa inicial de proliferação de fibroblastos é mais rápida que a das SCs. Portanto, ara-C é o agente antimitotético mais usado para remover fibroblastos em muitos estudos. No entanto, ara-C não é específica para mitose celular, e também pode inibir a proliferação de SCs durante estágio vigoroso de divisão. Com o método de citolise mediada por anticorpos ou imunopanning, os fibroblastos foram perdidos ou morreram. Embora a tecnologia de classificação da citometria de fluxo possa ser usada para obter fibroblastos e SCs de alta pureza ao mesmo tempo, ela precisa de um grande número de células, e a taxa de aquisição de células permaneceu baixa. Pelo que sabemos, este foi o primeiro estudo a mostrar o método de purificação de SCs e fibroblastos sensoriais e motores.
Neste estudo, um grande número de fibroblastos sensoriais e motores e SCs foi obtido ao mesmo tempo pela combinação de digestão diferencial, bem como adesão diferencial sequencialmente, não causando danos às células. Os resultados da coloração do ICC e da FCA mostraram que todos os SCs/fibroblastos sensoriais e motoros eram de alta pureza (>90%). O passo crítico deste método é controlar o tempo de digestão diferencial. Se o tempo é muito curto, torna os SCs difíceis de desprender, e se o tempo for muito longo, faz com que alguns fibroblastos digeram com SCs. No estudo de Weiss, o Accutase gelado é usado para separar SCs de fibroblastos, mas isso é mais caro do que o trypsin17. A digestão diferencial com a trippsina pode ajudar efetivamente na separação de SCs e fibroblastos. A limitação deste protocolo é que não é fácil extircularmente e nervos motores de ratos neonatais, o que requer mais prática com o microscópio dissecando. O protocolo para cultivo é muito útil para estudar as características biológicas dos fibroblastos e SCs nervosos sensoriais e motores, e para o mecanismo de regeneração sensorial e motora ou fibroblastos e transplante de SCs para promover a regeneração nervosa.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (Grant No. 2017YFA0104703), a Fundação Natural Nacional da China (Grant No. 31500927).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
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