Fluorescens livstid imaging monitorer, kvantifierar och skiljer aggregering tendenser av proteiner i levande, åldrande, och stressade C. elegans sjukdom modeller.
Amyloid fibriller är associerade med ett antal neurodegenerativa sjukdomar såsom Huntingtons, Parkinsons eller Alzheimers sjukdom. Dessa amyloid fibriller kan binda endogena metastabila proteiner samt komponenter i proteostas nätverket (PN) och därmed förvärra protein felvikning i cellen. Det finns ett begränsat antal verktyg tillgängliga för att bedöma aggregeringsprocessen av amyloidproteiner inom ett djur. Vi presenterar ett protokoll för fluorescens livstidmikroskopi (FLIM) som möjliggör övervakning samt kvantifiering av amyloid fibrilization i specifika celler, såsom nervceller, på ett noninvasive sätt och med utvecklingen av åldrande och vid störning av pn. FLIM är oberoende av fluorofores uttrycksnivåer och möjliggör en analys av aggregeringsprocessen utan ytterligare färgning eller blekning. Fluorofores släcks när de är i närheten av amyloidstrukturer, vilket resulterar i en minskning av fluorescensens livstid. Kylningen korrelerar direkt med aggregeringen av amyloidproteinet. FLIM är en mångsidig teknik som kan tillämpas för att jämföra fibrilization processen av olika amyloid proteiner, miljömässiga stimuli, eller genetiska bakgrunder in vivo på ett icke-invasivt sätt.
Protein aggregering förekommer både i åldrande och sjukdom. De vägar som leder till bildandet och nedfallet av stora amyloids eller amorfa inneslutningar är svåra att följa och deras kinetik är lika utmanande att riva upp. Proteiner kan misfold på grund av inneboende mutationer inom deras kodning sekvenser, som i fallet med genetiska sjukdomar. Proteiner också felgång eftersom proteostas nätverk (PN) som håller dem lösliga och ordentligt vikta är nedsatt, som händer under åldrandet. PN innehåller molekylära förkläde och nedbrytningsmaskinerier och ansvarar för biogenes, vikning, människohandel och nedbrytning av proteiner1.
C. elegans har vuxit fram som en modell för att studera åldrande och sjukdom på grund av dess korta livslängd, isogenic natur, och enkel genetisk manipulation. Flera C. elegans transgena stammar som uttrycker mänskliga sjukdomsframkallande proteiner i sårbara vävnader har skapats. Viktigt, många av de stammar som innehåller aggregering-benägen proteiner rekapitulera kännetecknet för amyloid störningar, bildandet av stora inneslutningar. Tack vare C. eleganss genomskinliga kropp kan dessa aggregat visualiseras in vivo, noninvasively och nondestructively2. Generera något protein av intresse (POI) i fusion med en fluorofore gör det möjligt att undersöka dess platser, människohandel, interaktion nätverk, och allmänna öde.
Vi presenterar ett protokoll för att övervaka aggregering av sjukdomsframkallande proteiner i levande och åldrande C. elegans via fluorescens livstid imaging mikroskopi (FLIM). FLIM är en kraftfull teknik baserad på livslängden för en fluorofore, snarare än dess utsläppsspektra. Livslängden (tau, τ) definieras som den genomsnittliga tid som krävs av en foton att förfalla från sitt upphetsade tillstånd tillbaka till sitt marktillstånd. Livslängden för en viss molekyl beräknas med tid-domän teknik tid-korrelerade enda foton räkna (TCSPC). I TCSPC-FLIM erhålls lysrörsfunktionen genom spännande fluorofore med korta, högfrekventa laserpulser och mätning av den avgivna fotonens ankomsttider till en detektor med avseende på pulserna. När du skannar ett prov skapas en tredimensionell datamatris för varje pixel: matrisen innehåller information om fördelningen av fotonerna i deras x,y-rumsliga koordinater och deras temporala sönderfallskurva. Ett visst prov blir därför en karta över livstider som avslöjar information om proteinets struktur, bindning och miljö3,4. Varje fluorescerande protein har en inneboende och exakt definierad livslängd, vanligtvis av några nanoseconds (ns), beroende på dess fysiokemiska egenskaper. Viktigt är livslängden för en fluorofore oberoende av dess koncentration, fluorescerande intensitet, och bildframställning metodik. Men inom ett biologiskt system kan det påverkas av miljöfaktorer som pH, temperatur, jonkoncentrationer, syremättnad och dess interaktionspartners. Livstider är också känsliga för interna strukturella förändringar och orientering. Att smälta samman en fluorofore till en seb resulterar i en förändring i sin livstid och därmed information om beteendet hos det smälta proteinet. När en fluorofore omges eller inkapslas i en tätt bunden miljö, såsom antiparallel beta ark av en amyloid struktur, förlorar den energi icke-radiatively, en process som kallas släckning5. Kylning av fluorofore resulterar i en förkortning av dess uppenbara livslängd. När lösligt, ett protein livstid kommer att stanna närmare sitt ursprungliga, högre värde. Däremot, när ett protein börjar aggregera, kommer dess livslängd oundvikligen att övergå till ett lägre värde6,7. Därför blir det möjligt att övervaka aggregering benägenheten hos alla amyloidbildande protein i olika åldrar i levande C. elegans.
Här beskriver vi ett protokoll för att analysera aggregering av ett fusionsprotein bestående av olika polyglutamin (CAG, Q) sträckor (Q40, Q44 och Q85). Vi illustrerar hur tekniken kan tillämpas lika på olika fluorofores, såsom cyan fluorescerande protein (CFP), gult fluorescerande protein (YFP) och monomeriskt rött fluorescerande protein (mRFP); och i alla vävnader av C. elegans, inklusive nervceller, muskler, och tarmen. Dessutom, i samband med proteostas, FLIM är ett mycket användbart verktyg för att observera förändringar vid utarmning av molekylära förkläde. Slå ner en av de viktigaste molekylära förkläde, värme chock protein 1 (hsp-1), via RNA störningar producerar för tidig felvikning av proteiner. Ökningen av aggregering belastning som ett resultat av åldrande, sjukdom, eller bristfälliga förkläde, mäts sedan som en minskning av fluorescens livstid.
Det protokoll som presenteras här beskriver en mikroskopibaserad teknik för att identifiera aggregerade arter i C. elegans modellsystemet. FLIM kan exakt karakterisera förekomsten av både aggregerade och lösliga arter som smälts till en fluorofore genom mätning av deras fluorescenslivstidsförfall. När ett fusionsprotein börjar aggregera sin registrerade genomsnittliga livslängd kommer att skifta från en högre till ett lägre värde16. Aggregeringens benägenhet kan sedan här…
The authors have nothing to disclose.
Muskel-Q40-mRFP stam som tillhandahålls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Den neuronala-Q40-CFP var en slags gåva av Morimoto Lab. Vi erkänner DFG (KI-1988/5-1 till JK, NeuroCure PhD stipendium av NeuroCure Cluster of Excellence till MLP), EMBO (Kortsiktiga gemenskap till MLP) och Company of Biologer (resebidrag till CG och MLP) för finansiering. Vi bekräftar också Advanced Light Microscopy imaging facility vid Max Delbrück Centre for Molecular Medicine, Berlin, för att tillhandahålla installationen för att avbilda YFP-konstruktionerna.
Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |