Summary
Fluorescens livstid imaging monitorer, kvantifierar och skiljer aggregering tendenser av proteiner i levande, åldrande, och stressade C. elegans sjukdom modeller.
Abstract
Amyloid fibriller är associerade med ett antal neurodegenerativa sjukdomar såsom Huntingtons, Parkinsons eller Alzheimers sjukdom. Dessa amyloid fibriller kan binda endogena metastabila proteiner samt komponenter i proteostas nätverket (PN) och därmed förvärra protein felvikning i cellen. Det finns ett begränsat antal verktyg tillgängliga för att bedöma aggregeringsprocessen av amyloidproteiner inom ett djur. Vi presenterar ett protokoll för fluorescens livstidmikroskopi (FLIM) som möjliggör övervakning samt kvantifiering av amyloid fibrilization i specifika celler, såsom nervceller, på ett noninvasive sätt och med utvecklingen av åldrande och vid störning av pn. FLIM är oberoende av fluorofores uttrycksnivåer och möjliggör en analys av aggregeringsprocessen utan ytterligare färgning eller blekning. Fluorofores släcks när de är i närheten av amyloidstrukturer, vilket resulterar i en minskning av fluorescensens livstid. Kylningen korrelerar direkt med aggregeringen av amyloidproteinet. FLIM är en mångsidig teknik som kan tillämpas för att jämföra fibrilization processen av olika amyloid proteiner, miljömässiga stimuli, eller genetiska bakgrunder in vivo på ett icke-invasivt sätt.
Introduction
Protein aggregering förekommer både i åldrande och sjukdom. De vägar som leder till bildandet och nedfallet av stora amyloids eller amorfa inneslutningar är svåra att följa och deras kinetik är lika utmanande att riva upp. Proteiner kan misfold på grund av inneboende mutationer inom deras kodning sekvenser, som i fallet med genetiska sjukdomar. Proteiner också felgång eftersom proteostas nätverk (PN) som håller dem lösliga och ordentligt vikta är nedsatt, som händer under åldrandet. PN innehåller molekylära förkläde och nedbrytningsmaskinerier och ansvarar för biogenes, vikning, människohandel och nedbrytning av proteiner1.
C. elegans har vuxit fram som en modell för att studera åldrande och sjukdom på grund av dess korta livslängd, isogenic natur, och enkel genetisk manipulation. Flera C. elegans transgena stammar som uttrycker mänskliga sjukdomsframkallande proteiner i sårbara vävnader har skapats. Viktigt, många av de stammar som innehåller aggregering-benägen proteiner rekapitulera kännetecknet för amyloid störningar, bildandet av stora inneslutningar. Tack vare C. eleganss genomskinliga kropp kan dessa aggregat visualiseras in vivo, noninvasively och nondestructively2. Generera något protein av intresse (POI) i fusion med en fluorofore gör det möjligt att undersöka dess platser, människohandel, interaktion nätverk, och allmänna öde.
Vi presenterar ett protokoll för att övervaka aggregering av sjukdomsframkallande proteiner i levande och åldrande C. elegans via fluorescens livstid imaging mikroskopi (FLIM). FLIM är en kraftfull teknik baserad på livslängden för en fluorofore, snarare än dess utsläppsspektra. Livslängden (tau, τ) definieras som den genomsnittliga tid som krävs av en foton att förfalla från sitt upphetsade tillstånd tillbaka till sitt marktillstånd. Livslängden för en viss molekyl beräknas med tid-domän teknik tid-korrelerade enda foton räkna (TCSPC). I TCSPC-FLIM erhålls lysrörsfunktionen genom spännande fluorofore med korta, högfrekventa laserpulser och mätning av den avgivna fotonens ankomsttider till en detektor med avseende på pulserna. När du skannar ett prov skapas en tredimensionell datamatris för varje pixel: matrisen innehåller information om fördelningen av fotonerna i deras x,y-rumsliga koordinater och deras temporala sönderfallskurva. Ett visst prov blir därför en karta över livstider som avslöjar information om proteinets struktur, bindning och miljö3,4. Varje fluorescerande protein har en inneboende och exakt definierad livslängd, vanligtvis av några nanoseconds (ns), beroende på dess fysiokemiska egenskaper. Viktigt är livslängden för en fluorofore oberoende av dess koncentration, fluorescerande intensitet, och bildframställning metodik. Men inom ett biologiskt system kan det påverkas av miljöfaktorer som pH, temperatur, jonkoncentrationer, syremättnad och dess interaktionspartners. Livstider är också känsliga för interna strukturella förändringar och orientering. Att smälta samman en fluorofore till en seb resulterar i en förändring i sin livstid och därmed information om beteendet hos det smälta proteinet. När en fluorofore omges eller inkapslas i en tätt bunden miljö, såsom antiparallel beta ark av en amyloid struktur, förlorar den energi icke-radiatively, en process som kallas släckning5. Kylning av fluorofore resulterar i en förkortning av dess uppenbara livslängd. När lösligt, ett protein livstid kommer att stanna närmare sitt ursprungliga, högre värde. Däremot, när ett protein börjar aggregera, kommer dess livslängd oundvikligen att övergå till ett lägre värde6,7. Därför blir det möjligt att övervaka aggregering benägenheten hos alla amyloidbildande protein i olika åldrar i levande C. elegans.
Här beskriver vi ett protokoll för att analysera aggregering av ett fusionsprotein bestående av olika polyglutamin (CAG, Q) sträckor (Q40, Q44 och Q85). Vi illustrerar hur tekniken kan tillämpas lika på olika fluorofores, såsom cyan fluorescerande protein (CFP), gult fluorescerande protein (YFP) och monomeriskt rött fluorescerande protein (mRFP); och i alla vävnader av C. elegans, inklusive nervceller, muskler, och tarmen. Dessutom, i samband med proteostas, FLIM är ett mycket användbart verktyg för att observera förändringar vid utarmning av molekylära förkläde. Slå ner en av de viktigaste molekylära förkläde, värme chock protein 1 (hsp-1), via RNA störningar producerar för tidig felvikning av proteiner. Ökningen av aggregering belastning som ett resultat av åldrande, sjukdom, eller bristfälliga förkläde, mäts sedan som en minskning av fluorescens livstid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synkronisering av C. elegans
- Synkronisera C. elegans antingen via behandling med alkalisk hypokloritlösning eller genom enkel äggläggning i 4 timmar vid 20 °C8.
- Odla och underhåll nematoder vid 20 °C på ngm-plattor (nematod growth medium) sådd med OP50 E. coli enligt standardförfaranden9. Ålder nematoderna tills det önskade utvecklingsstadiet eller dagen.
OBS: I detta protokoll avbildas unga vuxna dag 4 och gamla nematoder avbildas dag 8 i livet.
2. RNAi-medierad knockdown av förkläde maskiner via utfodring
OBS: Utför knockdown av värmechockprotein 1 (hsp-1) förkläde genom att mata motsvarande RNAi vektor till nematoderna10. HSP-1 RNAi plasmid erhölls från Ahringer biblioteket (klon ID: F26D10.3).
- Odla HT115 (DE3) E. coli uttrycker hsp-1 RNAi plasmid för 6 h till över natten i Luria Bertani (LB) medium som innehåller 50 μg/mL ampicillin.
- Förbered färska NGM-agarplattor som innehåller isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) och ampicillin (25 μg/ml) och utsäde med hsp-1 RNAi-bakterierna. Låt plattorna torka och inducera i rumstemperatur i 1-3 dagar.
- Placera synkroniserade ägg på en siRNA-platta och låt kläckas, eller placera gravidnematoder och låt lägga ägg i 4 timmar vid 20 °C innan du tar bort dem. Odla nematoderna till önskad ålder eller stadium.
OBS: Den andra generationen av nematoder kan presentera en starkare fenotyp av knockdown. SiRNA-protokollet och de villkor som beskrivs här är allmänna och anpassade till hsp1. RNA-interferens via siRNA av en specifik klon/gen måste upprättas och optimeras av slutanvändaren. Det är viktigt att notera att inte alla siRNA har samma effektivitet, och det rekommenderas därför att testa effekten av knockdown genom kvantifiering genom kvantitativ omvänd transkription polymeras kedjereaktion (RT-qPCR) eller Western blot.
3. Beredning av mikroskopi diabilder
- På bilddagen börjar du med att förbereda bildbilderna. Smält agarose i DDH2O vid en koncentration av 3% (w / v) och låt svalna något.
- Skär spetsen på en 1 ml pipettspets och ta ungefär 200 μL smält agaros. Pipett agarose på en ren glasskiva och omedelbart placera en andra ovanpå, undvika bildandet av eventuella bubblor. Låt torka och ta försiktigt bort den övre glasrutschbanan. Resultatet är en glasskiva med en jämn agaros yta där nematoderna kommer att placeras.
OBS: Varje bild kommer att användas för att avbilda mellan 5-10 nematoder. Diabilder kan beredas och förvaras i några timmar i en nynknämm låda för att förhindra att agaroset torkar ut.
4. Montering av nematoder på mikroskopirutschbanor
OBS: FLIM kräver att nematoderna immobiliseras. Utför det här steget när bildbehandlingsinställningen (t.ex. mikroskop, lasrar, detektorer) är klar att användas.
- Med hjälp av en platina tråd plocka, placera nematoder av önskad ålder på en ny oseedade plattan och låt dem krypa för att ta bort överskottet OP50 bakterier från sina kroppar.
- Förbered bedövningsmassan (natriumazid eller levamisole) för att immobilisera nematoden. Förvara ett 500 mM NaN3-lager i mörker vid 4 °C och späd i färsk ddH2O till en slutlig koncentration på 250 mM. Om du använder levamisole, späd en 20 mM lager till 2 mM arbetslösning i DDH2O.
VARNING: Natriumazid (NaN3) är mycket giftigt. Använd handskar och skyddsglasögon och arbeta under en ventilerad huva. - Arbeta under ett stereomikroskop, placera en 10 μL droppe bedövningsmedel förening på en agaros pad och försiktigt överföra 5-10 nematoder i den. Använd en ögonfransspets för att separera nematoderna. Håll dem nära varandra men inte röra för att möjliggöra enklare lokalisering av nematoderna under bildförvärv.
- Försiktigt överlägg nematoderna med ett täckslip. Gör mätningar inom 1 h efter montering.
OBS: Både bedövningsmedel kommer så småningom att döda C. elegans. Nematoderna måste vara helt orörliga under avbildningen, eftersom kartan för livslängden registreras från varje pixel. Varje rörelse av x,y parametrar förhindrar läsning av livet i samma upphetsade pixel.
5. Förvärv av FLIM-uppgifter
OBS: I detta protokoll förvärvas fluorofores livslängd via tcspc-metoden för tidsdomän. FLIM kräver en puls av ljus som genereras av lasern med en uppsättning och konstant upprepningshastighet. Upprepningshastigheten varierar beroende på lasertyp och måste vara känd av användaren. Livstidsmätningar uppnås genom detektorer och elektronisk utrustning som installeras tillsammans med ett konventionellt mikroskop. I detta protokoll utförs mätningar på tre olika laserscanningskonfocala mikroskop med detektorer och programvara från två olika företag (Table of Materials) för förvärv av mRFP, CFP respektive YFP-livstider. Kontrollera att rätt filter för utsläpp/excitation är på plats och minimera eventuell bakgrunds- eller bildskärmsbakgrundsbelysning innan du startar. Innan du påbörjar något experiment, upprätta fotostabiliteten hos den valda fluorofore. Om fluorofore bleker inom en kort tid inom nematodvävnaderna är den inte lämplig för FLIM-mätningar i C. elegans.
- Öppna FLIM förvärv programvara. FLIM-programvaran ger också kontroll över konfokalmikroskopet. Leta reda på fliken/knappen så att detektorns utgångar aktiveras och tryck på Aktivera utdata.
- Hämta instrumentresponsfunktionen (IRF), som beskriver tidsprecisionen för den instrumentala inställningen.
OBS: Detta steg bör utföras helst innan nematoderna monteras.- Ta bort magnetiserings-/utsläppsfiltren om sådana finns.
- Placera ett tomt täckslip ovanför målet och hitta dess yta. Registrera spridningssignalen som erhålls från täcket i minst 30 s.
OBS: För livslängder på flera nanoseconds kan förvärvsprogramvaran automatiskt uppskatta IRF-skiftet. Att förvärva en IRF rekommenderas alltid.
- Placera bilden med den monterade C. elegansen på scenen. Använda en 10x förstoringslins i transmissionsläge och lokalisera nematodernas position på bilden.
- Ta bort bilden, växla målet till en 63x förstoringslins och använd det erforderliga nedsänkningsmediet (t.ex. olja). Byt ut bilden på scenen och lokalisera nematoderna.
- Leta reda på Pinhole Manager på förvärvsprogramvaran och öppna den till max. Börja skanna provet, välj ett område av intresse (t.ex. huvud, överkropp) och fokusera på dess maximala projektionsplan.
- Övervaka laserpulsen och de tre andra värden som finns på programvarans gränssnitt: Konstant fraktionsdiskriminator (CFD), TIME-to-Amplitude (TAC) och analog-till-digital omvandlare (ADC).
OBS: Lasern bör ha en maximal grind på 1 x 108 enda foton räknas. Detta nummer representerar det maximala antalet fotoner som levereras av lasern. CFD ger information om mottagandet av den enda fotonpulsen med hänvisning till laserpulsen av detektorn. Det här värdet bör vara ungefär 1 x 105. TAC diskriminerar mellan den tidpunkt då en foton upptäcktes och nästa laserpuls. Slutligen omvandlar ADC TAC-spänningen till en lagringsbar minnessignal11. CFD, TAC och ADC bör alla ha liknande värden för att säkerställa att fotoner som avges av fluorofore inte går förlorade. Korrekt utvärdering av dessa parametrar säkerställer att tillräckligt med fotoner samlas in för att skapa en korrekt livstidskarta. - På gränssnittet för FLIM-programvaran förhandsgranskar du antalet fotoner som upptäckts: ADC-värdet ska vara mellan 1 x 104 och 1 x 105. Om det behövs, flytta fokus på ett annat plan eller öka laserkraften för att samla in fler fotoner.
OBS: I allmänhet bör antalet inspelade fotoner per sekund inte överstiga 1 % av laserns upprepningshastighet. - I menyraden väljer du fliken för att ställa in anskaffningsparametrarna. Välj skanningssynkronisering för att möjliggöra enstaka fotonidentifiering.
- Ställ in anskaffningen på en fast tid eller ett fast antal fotoner. Skaffa till exempel en livstids förfallkurva i 2 min eller tills en enskild pixel når ett fotonantal på 2 000 enskilda händelser. Tryck på Start för att påbörja förvärvet.
OBS: Olika fluorofores kommer att kräva olika excitering och utsläpp lasrar och filter. Enligt provets ljusstyrka kan lasereffekten också justeras, vilket inte stör livslängden. Dessa protokoll använder följande magnetiserings-/utsläppsinställningar: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. En pulsad två foton laser användes för CFP mätningar med ex800/em440 nm. Den tid och foton räkna krävs för förvärv av en FLIM karta måste empiriskt fastställas för varje setup och varje experimentellt syfte.
6. Analys av FLIM-data med hjälp av FLIMfit-programvara
OBS: Utför dataanalys med hjälp av FLIMfit-programvaruverktyget som utvecklats vid Imperial College London12 (se figur 1).
- Öppna programvaran och importera FLIM datafiler via Arkiv | Läs in FLIM-data. Ladda alla prover från ett villkor, även om de erhålls i olika sessioner och från olika biologiska repetitioner.
- Vid behov, segmentera en enda nematod från valfri FLIM-bild via segmentering | Segmenteringshanteraren. Dra beskärningsverktyget runt det område av intresse tills det markeras. När du är klar trycker du på OK.
Segmentering måste göras för alla bilder. - Välj en liten region där den intensitetsbaserade bilden av en C. elegans visas (bild 1, Pilar 1). Sönderfallskurvan i det området visas i det stora sönderfallsfönstret till höger om gränssnittet (bild 1, pil 2).
OBS: Förfallet kan visas linjärt eller logaritmetiskt. - Ställ in rätt parametrar för att extrapolera livslängden via programvarans algoritm enligt beskrivningen i steg 6.5-6.8.
- På fliken Data (bild 1, Pil 3):
- Ange ett godtyckligt integrerat minimivärde för att utesluta pixlar som är för svaga för att ge en bra passform. Beroende på C. elegans-provet varierar värdet från 40-300. Mata in olika värden tills en tillfredsställande förhandsgranskning har uppnåtts.
- Välj ett Tidsmini och ett tidsmaximal för att begränsa FLIM-signalen till dessa värden. Alla händelser som visas före och efter det här tröskelvärdet kommer att uteslutas.
OBS: Till exempel, för analys av mRFP, händelserna före 800 ps och efter 4.000 ps uteslöts. Dessa värden beror på fluorofores livslängd och måste bestämmas av slutanvändaren. - Ändra inte de förinställda antalen/fotonen på 1.
- Mata in repetitionshastigheten, i MHz, för den laser som användes vid förvärvet.
OBS: För det aktuella protokollet användes olika lasrar med olika repetitionshastigheter. De två foton laser som används för förvärv av CFP livstider har en upprepning på 80 MHz, för YFP lasern upprepas vid 40 MHz, och för mRFP värdet är 78,01 MHz. Dessa värden matades in i FLIMfit enligt det analyserade provet. - Mata in ett Gate Max-värde för att utesluta alla mättade pixlar.
OBS: För livstidsmätningar i C. elegansär detta värde inställt på ett stort antal (t.ex. 1 x 108).
- På fliken Livstid väljer du en global passning som ska användas (t.ex. en pixelvis passning). Se bild 1, pil 4.
OBS: En Pixel-wise montering kommer att producera ett förfall monteras på varje enskild pixel. En bild-vis montering kommer att producera en global montering av varje enskild bild och visa ett enda livstidsvärde per bild. En global-vis montering kommer att producera en enda montering över hela datauppsättningen. Ett enda livstidsvärde tillhandahålls för alla bilder. - Ändra inte någon annan parameter förutom nr-et. Exp urval om det är känt att den valda fluorescens sönderfall är multiexponential och uppvisar mer än en enda livstid.
OBS: I detta protokoll användes denna funktion för att beräkna livslängden för biexponential CFP fluorofore. - Ladda upp IRF via IRF-menyn: IRF | Ladda IRF. Om du vill uppskatta IRF-skiftet väljer du IRF | Uppskatta IRF Shift. En uppsättning värden visas automatiskt på fliken IRF. När detta har fastställts ska du inte ändra några andra parametrar på den här fliken.
- När alla parametrar har ställts in trycker du på Anpassa datauppsättning (bild 1, pil 5). Algoritmen kommer att producera en passform för förfallkurvan och fastställa ett livstidsvärde för varje bild.
DEN resulterande passformen, markerad i en blå linje, bör överlappa alla händelser. En bra passform erhålls när alla händelser är i linje längs passformen. - Klicka på fliken Parametrar (Bild 1, Pil 6), som finns i de övre högra menyerna i programvarans gränssnitt, och välj Statistik: w_mean (viktat medelvärde) och kontrollera att chi2-värdet är så nära som möjligt till 1.
OBS: En chi2 nära en säkerställer noggrannheten i passformen. Livstidsvärdet för den valda bilden visas således som tau_1. - Exportera alla uppgifter av intresse: Arkiv | Exportera intensitetsbilder/anpassa resultattabell/bilder/histogram. Spara de datainställningar som används för att beräkna livslängden: Arkiv | Spara datainställningar.
OBS: De parametrar som används kommer att sparas för framtida analys av de valda proverna.
7. Grafiska representationer av FLIM-uppgifter
Obs: De livslängder som samlas in från olika prover kan representeras visuellt på olika sätt. Markera det här alternativet om du vill ange livstidsvärden antingen i nanoseconds eller picoseconds.
- Visa kvaliteten på passformen och noggrannheten i kurvan genom att exportera förfallkurvan direkt från FLIMfit.
- Representera fördelningen av fotonerna genom att rita frekvensen av fotonantalet jämfört med livstidsvärdet i ett histogram.
- Slutligen, för statistisk jämförelse, om du jämför två eller flera prover, placera livstidsvärden plus standardavvikelse för medelvärdet i ett punktdiagram. Utför önskad statistisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet visar hur man noggrant kan övervaka bildandet av aggregerade arter i levande C. elegans, både under sitt naturliga åldrande och när de utsätts för stress. Vi valde ut fyra olika stammar av transgena nematoder som uttrycker polyglutaminproteiner på antingen 40Q, 44Q eller 85Q repetitioner. Dessa proteiner syntetiseras i olika vävnader och smältes till olika fluorofores. C. elegans stammar antingen uttryckt Q40-mRFP i kroppen väggmusklerna (mQ40-RFP), Q40-CFP i nervsystemet (nQ40-CFP), och antingen Q44-YFP eller Q85-YFP i tarmen (iQ44-YFP och iQ85-YFP)13. För att illustrera hur åldrande främjar aggregering, samlade vi livstiden för dessa polyQ stammar i unga nematoder, på dag 4 i livet, och gamla nematoder, på dag 8. För att visa effekterna av en brist i PN, utförde vi en knockdown av hsp-1 i mQ40-RFP och nQ40 stammar.
När livstidsvärdena extrapolerades via FLIMfit-programvaran visade de erhållna uppgifterna en tydlig minskning av livslängden för någon av polyQ-konstruktionerna när de aggregerades på grund av antingen glutaminbelastning, åldrande eller stress. FLIM skiljer mellan den lösliga proteinfraktionen och de aggregerade arterna och deras övergång genom att registrera en förändring i deras livstid.
Dag 4 visade mQ40-RFP en genomsnittlig fluorescenslivstid på 1,69 ns (figur 2). Vid åldrande uppstod mer aggregerade arter, som visas som låg livstid högborgar i livet bilder och flytta histogrammet till minskad livslängd (Figur 2A). Genom att rita den genomsnittliga fluorescenslivstiden för varje förvärvad bild över nematodernas ålder blev en signifikant minskning av fluorescensens livstid, och därmed ackumulering av aggregerade arter, synlig (figur 2B). PN:s proteinvikningsförmåga minskade efter dag 4 i livet i C. elegans14 och aggregeringsbenägna proteiner som ytterligare misskötts till kluster till amyloid och amorfa aggregat. Bortsett från PN, den inneboende aggregering benägenhet ett visst protein spelat en viktig roll i utvecklingen av aggregerad bildning. Detta analyserades genom att jämföra beteendet hos iQ44-YFP och iQ85-YFP. Den längre Q-sträckan av iQ85 var mer benägna att aggregering och uppvisade en fluorescens livstid skift i histogrammet redan på dag 4 i livet (Figur 3A). I själva verket, på dag 4, högborgarbildning observerades för iQ85, medan fortfarande frånvarande i iQ44. Vid åldrande, men iQ44 uppvisade också foci bildas och därmed en minskad fluorescens livstid. Eftersom iQ85 redan uppvisade aggregat i tidig vuxen ålder var utvecklingen av aggregering vid åldrande mindre uttalad, men signifikant (figur 3B). Slutligen upptäckte vi inte focibildning eller minskad fluorescenslivstid i nQ40-CFP-stammen (figur 4A). För denna stam, Det fanns endast subtila, obetydliga förändringar av den genomsnittliga fluorescens livstid vid åldrande (Figur 4B), potentiellt på grund av nervceller är mindre mottagliga för ännu okända skäl.
Slå ner HSP-1 utgör en utmaning för PN av mQ40 och nQ40 uttrycker nematoder. RNAi-medierad utarmning av hsp-1 ledde till en betydande ökning av aggregering (figur 5 och figur 6). Q40 uttryckt i kroppen väggmuskler tenderade att bilda ett litet antal stora högborgar omgiven av icke aggregerat material. Detta resulterade i två urskiljbara toppar i histogrammen (cirka 1,7 ns och 1,4 ns, se figur 5A). De äldre och RNAi-behandlade nematoderna visade en kraftig ökning av den låga livstidstoppen som i slutändan minskade den genomsnittliga fluorescenslivstiden (figur 5B). Jämfört med detta bifasiska beteende av Q40 i muskler, neuronal Q40 visas en mer varierad aggregering beteende. Vi kunde inte direkt korrelera foci bildning med aggregering som i muskeluttryck stam (Figur 6A). Eftersom FLIM erbjuder en möjlighet att bedöma graden av aggregering, visade histogrammen att det inte fanns någon distinkt topp men en utbredd fördelning av fluorescenslivider, pekar på en komplex sammansättning av olika oligomerer och högre ordning aggregat. Ändå kan den totala graden av aggregering utvärderas genom att rita den genomsnittliga fluorescenslivstiden (figur 6B), som visar att hsp-1 knockdown ledde till ett uppsving i aggregering.
Det är viktigt att notera att fluoroforeernas livslängd, fri från en fusionspartner och utanför ett biologiskt system, var högre. Eftersom livslängden påverkas främst av dess miljö, var en liten minskning av livslängden för YFP och RFP redan märkbar inom C. elegans vävnader. Det är därför viktigt att erhålla livslängden för den lösliga poi inom nematoden som en lämplig kontroll. En jämförelse mellan den lösliga fraktionen med en högre livslängd och aggregerad fraktion med en lägre livslängd kan sedan göras. Här korrelerade minskningen av livslängden med bildandet av synliga foci i muskel- och tarmcellerna. Ändå uppvisade en bråkdel av foci ingen minskning av fluorescensens livslängd (se figur 2 och figur 3, vita pilar). Den här funktionen belyser hur endast en del av fusionskonstruktionen kan aggregeras vid en viss spatiotemporal punkt, och förekomsten och tillgängligheten av obundet protein. Ett mer komplext scenario uppstod från undersökningen av neuronal Q40-CFP stam. Den gemensamma fiskeripolitiken har i sig två distinkta fluorescenslivstid. Medan CFP är en idealisk fluorofore för Förster resonans energiöverföring (FRET)15 mätningar, tillsammans med YFP, är det inte lämpligt att använda den för att övervaka bildandet av aggregat i C. elegans.
Bild 1: Skärmdump av FLIMFit-programvarugränssnittet. Skärmbild av programvaran som används för att beräkna fluorescenslivstiden. Fönstret visar gränssnittet efter att inställningarna definierats som beskrivs i texten och beräkning av livstider utfördes. Numrerade pilar refererar till specifika steg i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Fluorescenslivstiden för muskulös Q40-RFP minskade med åldern. (A)Representativa kartor över C. elegans som uttrycker muskulös Q40-RFP dag 4 eller dag 8 av livet som genereras av FLIMfit. Fluorescenslivstid, fluorescensintensitet och en sammanslagen bild av båda tillhandahålls. Skalstaplar = 25 μm. Histogram visar en fördelning av uppmätta livslängder för alla analyserade nematoder indelade i 100 kategorier. B)Stapelområden som visar de viktade genomsnittliga fluorescenslivslängderna för alla analyserade djur dag 4 respektive dag 8 i livet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Fluorescenslivstiden för tarmen Q44-YFP och tarmen Q85-YFP minskade med åldern. (A)Representativa kartor över C. elegans som uttrycker tarmen Q44-YFP eller tarm Q85-YFP dag 4 eller dag 8 i livet som genereras av FLIMfit. Fluorescenslivstid, fluorescensintensitet och en sammanslagen bild av båda tillhandahålls. Skalstaplar = 25 μm. Histogram visar en fördelning av uppmätta livslängder för alla analyserade nematoder indelade i 100 kategorier. B)Stapelområden som visar de viktade genomsnittliga fluorescenslivslängderna för alla analyserade djur dag 4 respektive dag 8 i livet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Fluorescenslivstiden för neuronal Q40-CFP förändrades inte med åldern. (A)Representativa kartor över C. elegans som uttrycker neuronal Q40-CFP dag 4 eller dag 8 av livet som genereras av FLIMfit. Fluorescenslivslängder, fluorescensintensitet och en sammanslagen bild av båda tillhandahålls (den andra livslängden, τ2, anges i alla prover). Skalstaplar = 25 μm. Histogram visar en fördelning av uppmätta livslängder för alla analyserade nematoder indelade i 100 kategorier. B)Stapelområden som visar de viktade genomsnittliga fluorescenslivslängderna för alla analyserade djur dag 4 respektive dag 8 i livet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Fluorescenslivstiden för muskulös Q40-RFP minskade vid knockdown av hsp-1. (A)Representativa kartor över C. elegans som uttrycker muskulös Q40-RFP dag 4 eller dag 8 av livet som genereras av FLIMfit. En sammanslagning av fluorescensens livslängd och intensitetskarta visas. För båda tidpunkterna visas nematoder som växte på bakterier som uttrycker en tom vektor (kontroll) eller bakterier som uttrycker hsp-1 RNAi-konstruktionen. Skalstaplar = 25 μm. Histogram visar en fördelning av uppmätta livslängder för alla analyserade nematoder indelade i 100 kategorier. B)Stapelområden som visar de viktade genomsnittliga fluorescenslivslängderna för alla analyserade djur dag 4 eller dag 8 i livet, med kontroll respektive hsp-1 RNAi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Fluorescens livstid neuronal Q40-CFP minskade vid knockdown av HSP-1. (A)Representativa kartor över C. elegans som uttrycker neuronal Q40-CFP på dag 4 av livet som genereras av FLIMfit. En sammanslagning av fluorescensens livslängd och intensitetskarta visas. Nematoder som visades odlades på bakterier som uttrycker en tom vektor (kontroll) eller bakterier som uttrycker hsp-1 RNAi konstruktion. Skalstaplar = 25 μm. Histogram visar en fördelning av uppmätta livslängder för alla analyserade nematoder indelade i 100 kategorier. B)Stapelområden som visar de viktade genomsnittliga fluorescenslivslängderna för alla analyserade djur dag 4, med kontroll RNAi eller hsp-1 RNAi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som presenteras här beskriver en mikroskopibaserad teknik för att identifiera aggregerade arter i C. elegans modellsystemet. FLIM kan exakt karakterisera förekomsten av både aggregerade och lösliga arter som smälts till en fluorofore genom mätning av deras fluorescenslivstidsförfall. När ett fusionsprotein börjar aggregera sin registrerade genomsnittliga livslängd kommer att skifta från en högre till ett lägre värde16. Aggregeringens benägenhet kan sedan härledas av minskningen under livet: ju lägre livslängd, desto högre är förekomsten av aggregerade proteinarter i systemet. Därmed blir det möjligt att följa effekterna av åldrande, sjukdom, eller försämring av PN på aggregering benägenhet av något protein.
För att belysa mångsidigheten hos tekniken visade våra resultat tydligt att FLIM kunde identifiera förändringar i strukturen hos de olika polyQ konstruerar, oavsett vävnad eller fluorofore. Viktigt, FLIM har redan framgångsrikt tillämpats i karakterisering av andra aggregering-benägen proteiner inom C. elegans, såsom α-synuclein17. Dessutom blir det möjligt att tillämpa någon stressfaktor på C. elegans och följa utvecklingen och aggregering av någon SE. Osmotic, metal-ion, redox, eller kemisk stress kan alla främja giftiga obalanser som framgångsrikt kan övervakas i C. elegans anställa FLIM. Det omvända kan också vara möjligt: en fördröjning i aggregering eller till och med uppdelning på grund av förekomsten av nyttiga föreningar eller öka pn, kan resultera i en räddning av proteinet och en därav följande livstid ökning.
FLIM har varit allmänt anställd för att övervaka förändringar i livstid av något ämne i ett brett spektrum av discipliner från kemi till cancerbiologi18 till medicinsk diagnostik, men vissa begränsningar kvarstår. Ett stort problem är fotostabiliteten hos fluorofores. Eftersom FLIM kräver inspelning av ett stort antal fotoner minskar fotoblekning antalet fotoner som samlas in och kan ändra den resulterande förfallkurvan. Dessutom, särskilt inom nematodsystemet, om fluorofores intensitet inte är tillräckligt hög för att tillräckligt många fotoner ska samlas in, krävs en högre excitering, vilket leder till snabbare fotoblödning och en opålitlig sönderfallskurva. Slutligen kräver tekniken sofistikerad och kostsam utrustning som tillägg till befintliga mikroskopisystem, med en kritisk faktor är känsligheten hos detektorerna19.
Omvänt är en av de främsta fördelarna med att beräkna livslängden för en fluorofore och dess fusionsprotein att den ger information om olika fraktioner av samma fluoroforeproteinkomplex i olika interaktionstillstånd inom dess miljö, oavsett dess i stort sett okända koncentration. FLIM kan också användas för att mäta livslängd i alla faser, gas, vätska eller fasta och i något medium eller organism som normalt kan avbildas, från celler till organismer, och organeller till immobiliserade, renade proteiner20. Mikroskopi tekniker förlitar sig vanligtvis på steady-state imaging av ett fluorescerande taggade protein. Till skillnad från steady state-tekniker kan FLIM lösa förändringar i bindning, sammansättning och konformation av ett biologiskt substrat. För att undersöka aggregering-benägen proteiner, förekomsten av stora fluorescerande inneslutningar eller högborgar kan avbildas lätt, men dessa representerar endast en statisk, intensitet-baserad ögonblicksbild3. När det gäller aggregerade arter kan de visualiserade foci också vara vilseledande, eftersom en hög koncentration av fluorofore inte nödvändigtvis resulterar i stark amyloidbildning. Via FLIM är det istället möjligt att skilja lösligt från olösligt material. Slutligen blir det fördelaktigt för alla undersökningar att få både intensitetsbaserade mätningar och parallella livstidsmätningar. Inom komplementariteten av dessa mikroskopi tekniker ligger deras styrka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Muskel-Q40-mRFP stam som tillhandahålls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Den neuronala-Q40-CFP var en slags gåva av Morimoto Lab. Vi erkänner DFG (KI-1988/5-1 till JK, NeuroCure PhD stipendium av NeuroCure Cluster of Excellence till MLP), EMBO (Kortsiktiga gemenskap till MLP) och Company of Biologer (resebidrag till CG och MLP) för finansiering. Vi bekräftar också Advanced Light Microscopy imaging facility vid Max Delbrück Centre for Molecular Medicine, Berlin, för att tillhandahålla installationen för att avbilda YFP-konstruktionerna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58 (2016).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer US. New York, NY. (2006).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
- Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
- Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
- Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687 (2013).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
- Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
- Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
- Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
- Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
- Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).
