Summary
Fluorescens levetid imaging overvåger, kvantificerer og skelner aggregering tendenser af proteiner i levende, aldring, og understregede C. elegans sygdom modeller.
Abstract
Amyloid fibriller er forbundet med en række neurodegenerative sygdomme som Huntingtons, Parkinsons eller Alzheimers sygdom. Disse amyloid fibriller kan sequester endogene metastabile proteiner samt komponenter i proteostasis netværk (PN) og dermed forværre protein misfolding i cellen. Der er et begrænset antal værktøjer til rådighed til at vurdere aggregering af amyloid proteiner i et dyr. Vi præsenterer en protokol for fluorescens levetid mikroskopi (FLIM), der tillader overvågning samt kvantificering af amyloid fibrilization i specifikke celler, såsom neuroner, i en noninvasive måde og med progression af aldring og ved forstyrrelser af pn'en. FLIM er uafhængig af fluorophores udtryksniveauer og muliggør en analyse af aggregeringsprocessen uden yderligere farvning eller blegning. Fluorophorer slukkes, når de er i nærheden af amyloid strukturer, hvilket resulterer i et fald i fluorescens levetid. Dæmpningen korrelerer direkte med sammenlægningen af amyloidproteinet. FLIM er en alsidig teknik, der kan anvendes til at sammenligne fibrilization processen med forskellige amyloid proteiner, miljømæssige stimuli, eller genetiske baggrunde in vivo i en ikke-invasiv måde.
Introduction
Protein aggregering forekommer både i aldring og sygdom. De veje, der fører til dannelse og aflejring af store amyloider eller amorfe indeslutninger er vanskelige at følge, og deres kinetik er ligeledes udfordrende at optrævle. Proteiner kan foldes forkert på grund af iboende mutationer inden for deres kodningsekvenser, som det er tilfældet med genetiske sygdomme. Proteiner også misfold fordi proteostasis netværk (PN), der holder dem opløselige og korrekt foldet er svækket, som det sker under aldring. PN omfatter molekylære chaperoner og nedbrydningsmaskiner og er ansvarlig for biogenese, foldning, handel og nedbrydning af proteiner1.
C. elegans har vist sig som en model til at studere aldring og sygdom på grund af sin korte levetid, isogene karakter, og nem genetisk manipulation. Flere C. elegans transgene stammer, der udtrykker humane sygdomsfremkaldende proteiner i sårbare væv er blevet skabt. Vigtigere er det, mange af de stammer, der indeholder aggregering-tilbøjelige proteiner opsummere kendetegnende for amyloid lidelser, dannelsen af store indeslutninger. Takket være C. elegans 'gennemsigtige krop, kan disse aggregater visualiseres in vivo, noninvasively og nondestructively2. Generering af protein af interesse (POI) i fusion med en fluorophore gør det muligt at undersøge dens placeringer, menneskehandel, interaktion netværk, og generelle skæbne.
Vi præsenterer en protokol til at overvåge aggregering af sygdomsfremkaldende proteiner i levende og aldrende C. elegans via fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM). FLIM er en kraftfuld teknik baseret på levetiden for en fluorophore, snarere end dens emissionsspektre. Levetiden (tau, τ) er defineret som den gennemsnitlige tid, der kræves af en foton til henfald fra sin ophidset tilstand tilbage til sin jorden tilstand. Et givet molekyles levetid beregnes med tidsdomæneteknikken for tidskorreleret enkelt fotontælling (TCSPC). I TCSPC-FLIM opnås fluorescerende henfaldsfunktion ved at spændende fluorophore med korte, højfrekvente laserimpulser og måle den udsendte fotons ankomsttider til en detektor med hensyn til impulserne. Når du scanner et eksempel, oprettes der en tredimensionel datamatrix for hver pixel: Arrayet indeholder oplysninger om fotonernes fordeling i deres x,y rumlige koordinater og deres tidsmæssige henfaldskurve. En given prøve bliver derfor et kort over levetider, der afslører oplysninger om proteinets struktur, binding og miljø3,4. Hvert fluorescerende protein har en iboende og præcist defineret levetid, normalt af et par nanosekunder (ns), afhængig af dens fysiokemiske egenskaber. Det er vigtigt, at en fluorophores levetid er uafhængig af dens koncentration, fluorescerende intensitet og billedbehandlingsmetoden. Men inden for et biologisk system, det kan påvirkes af miljømæssige faktorer såsom pH, temperatur, ion koncentrationer, iltmætning, og dens interaktion partnere. Levetider er også følsomme over for interne strukturelle ændringer og orientering. Sammensmeltning af en fluorophore til et POI resulterer i en ændring i dens levetid og dermed oplysninger om opførsel af det smeltede protein. Når en fluorophore er omgivet eller indkapslet i et tæt bundet miljø, såsom antiparallel beta ark af en amyloid struktur, det mister energi ikke-radiativt, en proces kendt som dæmpning5. Dæmpning af fluorophore resulterer i en forkortelse af dens tilsyneladende levetid. Når opløselige, et protein levetid vil forblive tættere på sin oprindelige, højere værdi. I modsætning hertil, når et protein begynder at samle, vil dets levetid uundgåeligt skifte til en lavere værdi6,7. Derfor bliver det muligt at overvåge sammenlægningtilbøjeligheden af amyloiddannende protein i forskellige aldre i levende C. elegans.
Her beskriver vi en protokol til analyse af sammenlægningen af et fusionsprotein bestående af forskellige polyglutaminstrækninger (CAG, Q) (Q40, Q44 og Q85). Vi illustrerer, hvordan teknikken kan anvendes på samme måde på forskellige fluorophorer, såsom cyanfluorescerende protein (CFP), gult fluorescerende protein (YFP) og monomerisk rødt fluorescerende protein (mRFP); og i alle væv af C. elegans, herunder neuroner, muskler, og tarmen. Desuden, i forbindelse med proteostase, FLIM er et meget nyttigt redskab til at observere ændringer ved udtømning af molekylære chaperoner. At vælte en af de vigtigste molekylære chaperoner, varmechokprotein 1 (hsp-1) via RNA-interferens producerer for tidlig misfoldning af proteiner. Stigningen i aggregering belastning som følge af aldring, sygdom, eller mangelfuld chaperones, måles derefter som et fald i fluorescens levetid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synkronisering af C. elegans
- Synkroniser C. elegans enten via behandling af alkalisk hypochloritopløsning eller via simpel æglægning i 4 timer ved 20 °C8.
- Vokse og vedligeholde nematoder ved 20 °C på nematode vækstmedium (NGM) plader seedet med OP50 E. coli i henhold til standardprocedurer9. Æld sletterne indtil det ønskede udviklingsstadie eller den ønskede dag.
BEMÆRK: I denne protokol, unge voksne er afbildet på dag 4 og gamle nematoder er afbildet på dag 8 i livet.
2. RNAi-medieret knockdown af chaperone maskiner via fodring
BEMÆRK: Udfør knockdown af varmechokprotein 1 (hsp-1) chaperone ved at fodre den tilsvarende RNAi vektor til nematoderne10. Den hsp-1 RNAi plasmid blev opnået fra Ahringer biblioteket (klon ID: F26D10.3).
- Dyrk HT115 (DE3) E. coli, der udtrykker hsp-1 RNAi plasmid i 6 timer til natten i Luria Bertani (LB) medium, der indeholder 50 μg/ml ampicillin.
- Der fremstilles friske NGM agarplader indeholdende isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) og ampicillin (25 μg/ml) og frø med hsp-1 RNAi-bakterierne. Lad pladerne tørre og fremkalde ved stuetemperatur i 1-3 dage.
- Anbring synkroniserede æg på en siRNA-plade og lad det klækkes, eller anbring gravidnematoder, og lad æglægge i 4 timer ved 20 °C, før de fjernes. Dyrk nematoderne indtil den ønskede alder eller fase.
BEMÆRK: Den anden generation af nematoder kan præsentere en stærkere fænotype af knockdown. SiRNA-protokollen og de betingelser, der er beskrevet her, er generelle og tilpasset hsp1. RNA-interferens via siRNA af en specifik klon/gen skal etableres og optimeres af slutbrugeren. Det er vigtigt at bemærke, at ikke alle siRNA har samme effektivitet, og det anbefales derfor at teste effekten af knockdown ved kvantificering ved enten kvantitativ omvendt transskription polymerase kædereaktion (RT-qPCR) eller Western blot.
3. Fremstilling af mikroskopidias
- På billedbehandlingsdagen skal du starte med at forberede billeddiasene. Smelt agarose i ddH2O ved en koncentration på 3% (w/v) og lad afkølelidt.
- Skær spidsen af en 1 ml pipettespids og tag ca. 200 μL smeltet agarose. Pipette agarose på en ren glas slide og straks placere en anden på toppen, undgå dannelsen af eventuelle bobler. Lad det tørre og forsigtigt fjerne det øverste glas dias. Resultatet er en glasrutsjebane med en jævn agaroseoverflade, hvor nematoderne vil blive placeret.
BEMÆRK: Hvert dias vil blive brugt til at afbilde mellem 5-10 nematoder. Slides kan tilberedes og opbevares i et par timer i en humified boks for at forhindre agarose fra udtørring.
4. Montering af nematoder på mikroskopidias
BEMÆRK: FLIM kræver, at nematoderne immobiliseres. Udfør dette trin, når billedbehandlingsopsætningen (f.eks. mikroskoper, lasere, detektorer) er klar til brug.
- Ved hjælp af en platin wire pick, placere nematoder af den ønskede alder på en frisk unseeded plade og lad dem kravle for at fjerne de overskydende OP50 bakterier fra deres kroppe.
- Anæstesiforbindelsen (natriumazid eller levamisole) klargør det til at immobilisere nematoden. Opbevar en 500 mM NaN3-bestand i mørke ved 4 °C og fortyndes i frisk ddH2O til en endelig koncentration på 250 mM. Hvis levamisole meds, fortyndes en 20 mM bestand til 2 mM arbejdsopløsning i ddH2O.
FORSIGTIG: Natriumazid (NaN3)er meget giftigt. Brug handsker og beskyttelsesbriller og arbejd under en ventileret hætte. - Arbejde under et stereomikroskop, placere en 10 μL dråbe bedøvelsesmiddel sammensatte på en agarose pad og forsigtigt overføre 5-10 nematoder ind i det. Brug en øjenvippespids til at adskille nematoderne. Hold dem tæt sammen, men ikke røre for at give mulighed for lettere lokalisering af nematoder under billederhvervelse.
- Overlejr forsigtigt nematoderne med en dæksel. Mål inden for 1 time efter montering.
BEMÆRK: Begge bedøvelsesmiddel vil i sidste ende dræbe C. elegans. Nematoderne skal være helt immobile under billedbehandling, fordi kortet over levetiden registreres fra hver pixel. Enhver bevægelse af x,y parametre forhindrer læsning af levetiden i samme ophidset pixel.
5. Erhvervelse af FLIM-data
BEMÆRK: I denne protokol erhverves fluorophors levetid via tCSPC-metoden med tidsdomænet. FLIM kræver en puls af lys, der genereres af laseren på et sæt og konstant gentagelsesats. Gentagelseshastigheden varierer afhængigt af lasertypen og skal være kendt af brugeren. Levetidsmålinger opnås ved detektorer og elektronisk udstyr, der installeres sammen med et konventionelt mikroskop. I denne protokol udføres målinger på tre forskellige laserscanningskonfokale mikroskoper med detektorer og software fra to forskellige virksomheder (Table of Materials) til erhvervelse af henholdsvis mRFP, CFP og YFP-levetider. Kontroller, at de korrekte emissionsfiltre/excitation er på plads, og minimer baggrunds- eller skærmbaggrundslyset, før du starter. Før du starter et eksperiment, etablere fotostabilitet af den valgte fluorophore. Hvis fluorophore blegner inden for kort tid inden for nematodevævet, er det ikke egnet til FLIM-målinger i C. elegans.
- Åbn FLIM-anskaffelsessoftwaren. FLIM-softwaren giver også mulighed for kontrol af det konfokale mikroskop. Find fanen/knappen for at gøre det muligt at aktivere detektorens udgange, og tryk på Aktivér udgange.
- Anskaf instrumentresponsfunktionen (IRF), som beskriver timingpræcisionen af den instrumentale opsætning.
BEMÆRK: Dette trin skal helst udføres, før nematoderne monteres.- Hvis det er muligt, skal du fjerne excitations-/emissionsfiltrene.
- Placer en tom dæksel over målet og finde dens overflade. Det punktsignal, der er hentet fra dækstrækket, registreres i mindst 30 s.
BEMÆRK: I en levetid på flere nanosekunder kan anskaffelsessoftwaren automatisk estimere IRF-skiftet. Det anbefales altid at anskaffe en IRF.
- Placer slæden med de monterede C. elegans på scenen. Brug af et 10x forstørrelsesobjektiv i transmissionstilstand og lokalisere placeringen af nematoderne på diaset.
- Fjern sliden, skift målet til et 63x forstørrelsesobjektiv, og påfør det nødvendige nedsænkningsmedium (f.eks. olie). Udskift slidsen på scenen, og oversat nematoderne.
- Find Pinhole Manager på anskaffelsessoftwaren, og åbn den til maksimum . Begynd at scanne prøven, vælg et interesseområde (f.eks. hoved, overkrop), og fokuser på dens maksimale projektionsplan.
- Overvåg laserpulsen og de tre andre værdier, der findes på softwarens grænseflade: CFD (Constant Fraction Discriminator), Time-to-Amplitude (TAC) og Analog-to-Digital Converter (ADC).
BEMÆRK: Laseren skal have en maksimal port på 1 x 108 enkelt foton tællinger. Dette tal repræsenterer det maksimale antal fotoner, der leveres af laseren. CFD giver oplysninger om detektorens modtagelse af enkeltfotonpulsen i forhold til laserpulsen. Denne værdi skal være ca. 1 x 105. TAC diskriminerer mellem det tidspunkt, hvor en foton blev opdaget, og den næste laserpuls. Endelig konverterer ADC TAC-spændingen til et lagerbart hukommelsessignal11. CFD, TAC og ADC bør alle have samme værdier for at sikre, at fotoner, der udsendes af fluorophore, ikke går tabt. Korrekt evaluering af disse parametre sikrer, at der indsamles nok fotoner til at skabe et nøjagtigt levetidskort. - På grænsefladen af FLIM software, preview antallet af fotoner opdaget: ADC værdien skal være mellem 1 x 104 og 1 x 105. Hvis det er nødvendigt, flytte fokus på et andet plan eller øge laser magt til at indsamle flere fotoner.
BEMÆRK: Generelt bør antallet af optagede fotoner pr. sekund ikke overstige 1 % af laserens gentagelseshastighed. - Vælg fanen på menulinjen for at angive anskaffelsesparametrene. Vælg scanningssynkronisering for at give mulighed for registrering af en enkelt foton.
- Indstil anskaffelsen til et fast tidsrum eller et fast antal fotoner. For eksempel, erhverve en levetid henfald kurve i 2 min eller indtil en enkelt pixel når en foton tælle på 2.000 enkelt begivenheder. Tryk på Start for at begynde at købe.
BEMÆRK: Forskellige fluorophores vil kræve forskellige excitation og emission lasere og filtre. Ifølge prøvens lysstyrke kan lasereffekten også justeres, hvilket ikke vil forstyrre levetiden. Disse protokoller bruger følgende excitations-/emissionsindstillinger: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. En pulserende to foton laser blev ansat til CFP målinger ved hjælp af ex800/em440 nm. Den tid og fotontælling, der kræves til erhvervelse af et FLIM-kort, skal etableres empirisk for hver opsætning og hvert eksperimentelt formål.
6. Analyse af FLIM-data ved hjælp af FLIMfit-software
BEMÆRK: Udfør dataanalyse ved hjælp af FLIMfit-softwareværktøjet udviklet på Imperial College London12 (se figur 1).
- Åbn softwaren og importere FLIM datafiler via Fil | Indlæs FLIM-data. Alle prøver indlades fra én betingelse, også hvis de er udtaget i forskellige sessioner og fra forskellige biologiske gentagelser.
- Hvis det er nødvendigt, segmentere en enkelt nematode fra et FLIM-billede via Segmentering | Segmenteringschef. Træk beskæringsværktøjet rundt i det område, hvor der er interesse, indtil det fremhæves. Tryk på OK, når du er færdig .
BEMÆRK: Segmentering skal ske for alle billeder. - Vælg et lille område, hvor det intensitetsbaserede billede af en C. elegans vises(Figur 1, Pile 1). Henfaldskurven for det pågældende område vises i det store forfaldsvindue i højre side af grænsefladen(Figur 1, Pil 2).
BEMÆRK: Henfaldet kan vises lineært eller logarithmisk. - Indstil de korrekte parametre til at ekstrapolere levetiden via softwarens algoritme som beskrevet i trin 6.5-6.8.
- Under fanen Data (Figur 1, Pil 3):
- Angiv en vilkårlig integreret minimumværdi for at udelade pixel, der er for nedtonede til at give en god tilpasning. Afhængigt af C. elegans prøve denne værdi varierer fra 40-300. Indtast forskellige værdier, indtil der er opnået en tilfredsstillende forhåndsvisning.
- Vælg et Time Min- og timemax-nummer for at begrænse FLIM-signalet til disse værdier. Alle hændelser, der vises før og efter denne grænse, vil blive udelukket.
BEMÆRK: For eksempel, for analysen af mRFP, begivenhederne før 800 ps og efter 4.000 ps blev udelukket. Disse værdier afhænger af fluorophores levetid og skal bestemmes af slutbrugeren. - Du må ikke ændre de forudindstillede optællinger/foton på 1.
- Indtast Gentagelseshastighedeni MHz af den laser, der blev udnyttet under erhvervelsen.
BEMÆRK: For den nuværende protokol, forskellige lasere blev udnyttet med forskellige gentagelse satser. De to foton laser, der anvendes til erhvervelse af CFP levetid er i besiddelse af en gentagelse sats på 80 MHz, for YFP laseren gentager på 40 MHz, og for mRFP værdien er 78,01 MHz. Disse værdier blev indtastet i FLIMfit i henhold til den analyserede prøve. - Indtast en Gate Max-værdi for at udelade alle mættede pixel.
BEMÆRK: Ved livstidsmålinger i C. elegans indstillesdenne værdi til et stort tal (f.eks. 1 x 108).
- Vælg en global tilpasning, der skal bruges (f.eks. en pixelklog tilpasning), under fanen Levetid. Se figur 1, pil 4.
BEMÆRK: En Pixel-wise montering vil producere et henfald monteret på hver enkelt pixel. En billed-klog montering vil producere en global montering af hvert enkelt billede og vise en enkelt levetid værdi pr billede. En Global-wise montering vil producere en enkelt montering på tværs af hele datasættet. Der er en enkelt levetidsværdi for alle billeder. - Du må ikke ændre andre parametre bortset fra feltet Nummer. Exp udvælgelse, hvis det er kendt, at den valgte fluorescens henfald er multieksponentiel og udviser mere end en enkelt levetid.
BEMÆRK: I denne protokol blev denne funktion udnyttet til at beregne levetiden for den bieksponentielle cfp fluorophore. - Overfør IRF via IRF-menuen: IRF | Indlæs IRF. Hvis du vil estimere IRF-skiftet, skal du vælge IRF | Anslå IRF Skift. Et sæt værdier vises automatisk under fanen IRF. Når dette er oprettet, skal du ikke ændre andre parametre for denne fane.
- Når alle parametre er indstillet, skal du trykke på Tilpas datasæt (Figur 1, Pil 5). Algoritmen vil producere en pasform til henfaldskurven og etablere en levetidsværdi for hvert billede.
BEMÆRK: Den resulterende pasform, der er fremhævet i en blå linje, skal overlappe alle hændelserne. En god pasform opnås, når alle begivenheder er justeret langs pasformen. - Klik på fanen Parametre (Figur 1, Pil 6), der er placeret i øverste højre menuer i softwarens grænseflade, og vælg Statistik: w_mean (vægtet gennemsnit), og kontroller, at chi2-værdien er så tæt som muligt på 1.
BEMÆRK: En chi2 tæt på en sikrer nøjagtigheden af pasformen. Levetidsværdien for det valgte billede afsløres således som tau_1. - Eksportér alle oplysninger af interesse: Fil | Eksportintensitetsbilleder/Tilpas resultattabel/billeder/histogrammer. Gem de dataindstillinger, der bruges til at beregne levetiden: Fil | Gem dataindstillinger.
BEMÆRK: De anvendte parametre vil blive gemt til fremtidig analyse af de udvalgte prøver.
7. Grafiske fremstillinger af FLIM-data
BEMÆRK: Levetiden indsamlet fra forskellige prøver kan visuelt repræsenteres på forskellige måder. Vælg denne værdi for at betegne levetidsværdierne enten i nanosekunder eller picosekunder.
- Vis kurvens kvalitet og nøjagtighed ved at eksportere henfaldskurven direkte fra FLIMfit.
- Repræsentere fordelingen af fotonerne ved at plotte hyppigheden af fotontallet i forhold til levetidsværdien i et histogram.
- Endelig skal der ved statistisk sammenligning, hvis man sammenligner to eller flere prøver, placere levetidsværdier plus middelværdiens standardafvigelse i en punktpunktssøjlegraf. Udfør enhver ønsket statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen viser, hvordan man præcist overvåge dannelsen af aggregerede arter i levende C. elegans, både i løbet af sin naturlige aldring, og når de udsættes for stress. Vi udvalgte fire forskellige stammer af transgene nematoder, der udtrykker polyglutaminproteiner af enten 40Q, 44Q eller 85Q-gentagelser. Disse proteiner er syntetiseret i forskellige væv og blev smeltet til forskellige fluorophorer. C. elegans stammer enten udtrykt Q40-mRFP i kroppen væg muskler (mQ40-RFP), Q40-CFP i nervesystemet (nQ40-CFP), og enten Q44-YFP eller Q85-YFP i tarmen (iQ44-YFP og iQ85-YFP)13. For at illustrere, hvordan aldring fremmer aggregering, vi indsamlet levetiden af disse polyQ stammer i unge nematoder, på dag 4 i livet, og gamle nematoder, på dag 8. For at vise virkningerne af en mangel i PN, udførte vi en knockdown af hsp-1 i mQ40-RFP og nQ40 stammerne.
Når levetidsværdierne blev ekstrapoleret via FLIMfit-softwaren, viste de opnåede data en klar reduktion i levetiden for nogen af polyQ konstruktionerne, når de blev aggregeret på grund af enten glutaminbelastning, aldring eller stress. FLIM skelnes mellem den opløselige proteinfraktion og aggregerede arter og deres overgang ved at registrere et skift i deres levetid.
På dag 4 viste mQ40-RFP en gennemsnitlig fluorescenslevetid på 1,69 ns (Figur 2). Ved ældning opstod mere aggregerede arter, der optræder som lav levetid foci i levetiden billeder og flytte histogrammet til nedsat levetid (Figur 2A). Ved at plotte den gennemsnitlige fluorescenslevetid for hvert erhvervet billede over nematodernes alder blev en signifikant reduktion af fluorescenslevetiden og dermed akkumulering af aggregerede arter synlig (figur 2B). PN's proteinfoldeevne faldt efter dag 4 i livet i C. elegans14 og aggregering-tilbøjelige proteiner yderligere fejlfoldet til klynge i amyloid og amorfe aggregater. Bortset fra PN spillede et bestemt proteins iboende aggregeringstilbøjelighed en vigtig rolle i udviklingen af den samlede dannelse. Dette blev analyseret ved at sammenligne adfærden af iQ44-YFP og iQ85-YFP. Den længere Q-strækning af iQ85 var mere tilbøjelige til sammenlægning og udstillet en fluorescens levetid skift i histogrammet allerede på dag 4 i livet (Figur 3A). Faktisk blev der på dag 4 observeret foci-dannelse for iQ85, mens den stadig var fraværende i iQ44. Ved aldring, dog iQ44 også udstillet foci dannelse og dermed en reduceret fluorescens levetid. Fordi iQ85 allerede udstillet aggregater i den tidlige voksenalder progression af sammenlægning ved aldring var mindre udtalt, men betydelig (Figur 3B). Endelig har vi ikke opdaget foci dannelse eller nedsat fluorescens levetid i nQ40-CFP stamme (Figur 4A). For denne stamme, der var kun subtile, ikke-væsentlige ændringer i den gennemsnitlige fluorescens levetid ved ældning (Figur 4B), potentielt på grund af neuroner er mindre modtagelige for endnu ukendte årsager.
At vælte hsp-1 udgør en udfordring for PN på mQ40 og nQ40, der udtrykker nematoder. RNAi-medieret udtynding af hsp-1 førte til en betydelig stigning i aggregering (figur 5 og figur 6). Q40 udtrykt i kroppenvæg muskler tendens til at danne et lille antal store foci omgivet af ikke-aggregeret materiale. Dette resulterede i to tydelige toppe i histogrammer (ca. 1,7 ns og 1,4 ns, se figur 5A). De alders- og RNAi-behandlede nematoder viste en kraftig stigning i den lave levetidstop, hvilket i sidste ende reducerede den gennemsnitlige fluorescenslevetid (figur 5B). Sammenlignet med denne bifasiske adfærd Q40 i musklerne, den neuronale Q40 viste en mere forskelligartet sammenlægning adfærd. Vi kunne ikke direkte korrelere foci dannelse med aggregering som i den muskulære udtryk stamme (Figur 6A). Fordi FLIM giver mulighed for at vurdere graden af aggregering, viste histogrammer, at der ikke var nogen særskilt top, men en udbredt fordeling af fluorescens levetid, der peger på en kompleks sammensætning af forskellige oligomerer og højere orden aggregater. Alligevel kunne den samlede grad af aggregering evalueres ved at plotte den gennemsnitlige fluorescens levetid (Figur 6B), der viser, at hsp-1 knockdown førte til et løft i aggregering.
Det er vigtigt at bemærke, at lysstofophorernes levetid, fri for en fusionspartner og uden for et biologisk system, var højere. Da levetiden primært påvirkes af omgivelserne, var en mindre reduktion af YFP's og RFP's levetid allerede mærkbar i C. elegans væv. Det er derfor vigtigt at opnå levetiden for den opløselige POI i nematoden som en passende kontrol. En sammenligning mellem den opløselige fraktion med en højere levetid og aggregeret fraktion med en lavere levetid kan derefter foretages. Her korrelerer faldet i levetiden med dannelsen af synlige foci i muskel- og tarmcellerne. Alligevel udviste en brøkdel af foci ikke noget fald i fluorescenslevetiden (se figur 2 og figur 3, hvide pile). Denne funktion fremhæver, hvordan kun en del af fusionskonstruktionen kan aggregeres på et bestemt spatiotemporal punkt, og tilstedeværelsen og tilgængeligheden af ubundet protein. Et mere komplekst scenario opstod som følge af undersøgelsen af den neuronale Q40-CFP stamme. Den fælles fiskeripolitik har i sig selv to forskellige fluorescenslevetider. Mens CFP er en ideel fluorophore for Förster resonans energioverførsel (FRET)15 målinger, sammen med YFP, er det ikke tilrådeligt at anvende det til at overvåge dannelsen af aggregater i C. elegans.
Figur 1: Skærmbillede af FLIMFit-softwaregrænsefladen. Skærmbillede af den software, der bruges til at beregne fluorescenslevetiden. Vinduet viser grænsefladen, efter at indstillingerne er defineret som beskrevet i teksten, og der blev udført beregning af levetider. Nummererede pile refererer til bestemte trin i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fluorescenslevetiden for muskuløs Q40-RFP faldt med alderen. (A) Repræsentative kort over C. elegans, der udtrykker muskuløs Q40-RFP på dag 4 eller dag 8 i livet genereret af FLIMfit. Fluorescens levetid, fluorescens intensitet, og et fusioneret billede af begge er fastsat. Skalastænger = 25 μm. Histogrammer viser en fordeling af målte levetider for alle analyserede nematoder opdelt i 100 kategorier. (B) Barparceller, der viser den vægtede gennemsnitlige fluorescenslevetid for alle analyserede dyr på henholdsvis dag 4 eller dag 8 i livet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fluorescenslevetiden for intestinal Q44-YFP og tarmQ85-YFP faldt med alderen. (A) Repræsentative kort over C. elegans, der udtrykker intestinal Q44-YFP eller intestinal Q85-YFP på dag 4 eller dag 8 i livet genereret af FLIMfit. Fluorescens levetid, fluorescens intensitet, og et fusioneret billede af begge er fastsat. Skalastænger = 25 μm. Histogrammer viser en fordeling af målte levetider for alle analyserede nematoder opdelt i 100 kategorier. (B) Barparceller, der viser den vægtede gennemsnitlige fluorescenslevetid for alle analyserede dyr på henholdsvis dag 4 eller dag 8 i livet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fluorescenslevetiden for neuronal Q40-CFP ændrede sig ikke med alderen. (A)Repræsentative kort over C. elegans, der udtrykker neuronal Q40-CFP på dag 4 eller dag 8 i livet genereret af FLIMfit. Fluorescenslevetid, fluorescensintensitet og et flettet billede af begge er angivet (den anden levetid, τ2, er angivet i alle prøver). Skalastænger = 25 μm. Histogrammer viser en fordeling af målte levetider for alle analyserede nematoder opdelt i 100 kategorier. (B) Barparceller, der viser den vægtede gennemsnitlige fluorescenslevetid for alle analyserede dyr på henholdsvis dag 4 eller dag 8 i livet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Fluorescenslevetiden for muskuløs Q40-RFP faldt ved knockdown af hsp-1. (A) Repræsentative kort over C. elegans, der udtrykker muskuløs Q40-RFP på dag 4 eller dag 8 i livet genereret af FLIMfit. Der vises en sammenfletning af fluorescenslevetiden og intensitetskortet. For begge tidspunkter, nematoder, der voksede på bakterier, der udtrykker en tom vektor (kontrol) eller bakterier, der udtrykker hsp-1 RNAi konstruktion er vist. Skalastænger = 25 μm. Histogrammer viser en fordeling af målte levetider for alle analyserede nematoder opdelt i 100 kategorier. (B) Bar parceller, der viser den vægtede gennemsnitlige fluorescenslevetid for alle analyserede dyr på henholdsvis dag 4 eller dag 8 i livet, med kontrol eller hsp-1 RNAi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Fluorescens levetid en neuronal Q40-CFP faldt ved knockdown af hsp-1. (A)Repræsentative kort over C. elegans, der udtrykker neuronal Q40-CFP på dag 4 i livet genereret af FLIMfit. Der vises en sammenfletning af fluorescenslevetiden og intensitetskortet. Nematoder vist blev dyrket på bakterier, der udtrykker en tom vektor (kontrol) eller bakterier, der udtrykker hsp-1 RNAi konstruktion. Skalastænger = 25 μm. Histogrammer viser en fordeling af målte levetider for alle analyserede nematoder opdelt i 100 kategorier. (B) Bar parceller, der viser den vægtede gennemsnitlige fluorescenslevetid for alle analyserede dyr på dag 4, med kontrol RNAi eller hsp-1 RNAi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der præsenteres her, beskriver en mikroskopibaseret teknik til at identificere aggregerede arter i C. elegans modelsystem. FLIM kan præcist karakterisere tilstedeværelsen af både aggregerede og opløselige arter smeltet til en fluorophore via måling af deres fluorescens levetid henfald. Når et fusionsprotein begynder at samle sin registrerede gennemsnitlige levetid, vil det gå fra en højere til en lavere værdi16. Tilbøjeligheden til aggregering kan derefter udledes af faldet i levetid: jo lavere levetid, jo højere tilstedeværelsen af aggregerede proteinarter i systemet. Derved bliver det muligt at følge virkningerne af aldring, sygdom eller svækkelse af PN på aggregering tilbøjelighed af ethvert protein.
For at fremhæve teknikkens alsidighed viste vores resultater tydeligt, at FLIM kunne identificere ændringer i strukturen af de forskellige polyQ konstruktioner, uanset væv eller fluorophore. Det er vigtigt, at FLIM allerede er blevet anvendt med succes i karakteriseringen af andre aggregeringsudsatte proteiner inden for C. elegans, såsom α-synuclein17. Desuden bliver det muligt at anvende enhver stressfaktor på C. elegans og følge udfoldelsen og sammenlægningen af ethvert INTERESSEOBJEKT. Osmotisk, metal-ion, redox, eller kemisk stress kan alle fremme giftige ubalancer, der med held kan overvåges i C. elegans beskæftiger FLIM. Det modsatte kunne også være muligt: en forsinkelse i aggregering eller endog disaggregering på grund af tilstedeværelsen af gavnlige forbindelser eller forøgelse af PN, kan resultere i en redning af proteinet og en deraf følgende levetid stigning.
FLIM har været almindeligt anvendt til at overvåge ændringer i levetiden for ethvert stof i en bred vifte af discipliner fra kemi til kræftbiologi18 til medicinsk diagnostik, men nogle begrænsninger er der stadig. Et hovedproblem er lysstabiliteten af fluorophorer. Da FLIM kræver registrering af et stort antal fotoner, reducerer fotoblegning antallet af indsamlede fotoner og kan ændre den resulterende henfaldskurve. Desuden, især inden for nematode systemet, hvis intensiteten af fluorophore selv ikke er tilstrækkelig høj til nok fotoner, der skal indsamles, en højere excitation er påkrævet, hvilket fører til hurtigere fotoblegning og en upålidelig henfald kurve. Endelig kræver teknikken sofistikeret og dyrt udstyr som tilføjelser til allerede eksisterende mikroskopisystemer, hvor et kritisk element er detektorernes følsomhed19.
Omvendt er en af de største fordele ved at beregne levetiden for et fluorophore og dets fusionsprotein, at det giver oplysninger om forskellige fraktioner af det samme fluorophore-proteinkompleks i forskellige tilstande af interaktioner inden for dets miljø, uanset dets stort set ukendte koncentration. FLIM kan også bruges til at måle levetiden i enhver fase, gas, væske eller fast og i ethvert medium eller organisme, der normalt kan afbildes, fra celler til organismer, og organeller til immobiliserede, rensede proteiner20. Mikroskopi teknikker normalt er afhængige af steady-state billeddannelse af en fluorescerende mærkede protein. I modsætning til steady state teknikker, kan FLIM løse ændringer i binding, sammensætning, og kropsbygning af et biologisk substrat. Til undersøgelse af aggregering-tilbøjelige proteiner, tilstedeværelsen af store fluorescerende indeslutninger eller foci kan afbildes nemt, men disse repræsenterer kun en statisk, intensitet-baserede snapshot3. For aggregerede arter kan den visualiserede foci også være vildledende, da en høj koncentration af fluorophor ikke nødvendigvis resulterer i stærk amyloiddannelse. Via FLIM er det i stedet muligt at skelne opløseligt fra uopløseligt materiale. Endelig bliver det gavnligt for enhver undersøgelse at opnå både intensitetsbaserede målinger og den parallelle levetidsmåling. Inden for komplementaritet af disse mikroskopi teknikker ligger deres styrke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Den muskel-Q40-mRFP stamme fra CGC, som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programmer (P40 OD010440). Den neuronal-Q40-CFP var en slags gave af Morimoto Lab. Vi anerkender DFG (KI-1988/5-1 til JK, NeuroCure PhD stipendium af NeuroCure Cluster of Excellence til MLP), EMBO (Kortsigtet stipendium til MLP) og Company of Biologs (rejse tilskud til CG og MLP) for finansiering. Vi anerkender også Advanced Light Microscopy imaging facilitet på Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin, for at give opsætningen til billedet YFP konstruktioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58 (2016).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer US. New York, NY. (2006).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
- Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
- Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
- Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687 (2013).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
- Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
- Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
- Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
- Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
- Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).
