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Biochemistry

फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग का उपयोग करके एजिंग सी एलिगेंस में एमीलॉयड संरचनाओं का लक्षण वर्णन

Published: March 27, 2020 doi: 10.3791/61004
Automatic Translation
*1,2, *1, *1, 3, 1,4
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Molecular Neuroscience Group, Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 4Cell Biology, University of Bremen
* These authors contributed equally

Summary

फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग पर नज़र रखता है, मात्रा और रहने में प्रोटीन की एकत्रीकरण प्रवृत्तियों को अलग करता है, उंर बढ़ने, और सी elegans रोग मॉडल पर बल दिया ।

Abstract

एमिलॉयड फाइब्रिल्स हंटिंगटन, पार्किंसंस या अल्जाइमर रोग जैसे कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से जुड़े होते हैं। ये एमिलॉयड फाइब्रिल्स एंडोजेनस मेटास्टेबल प्रोटीन के साथ-साथ प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क (पीएन) के घटकों को अलग कर सकते हैं और इस तरह कोशिका में प्रोटीन गलत तह को बढ़ा सकते हैं। एक जानवर के भीतर एमिलॉयड प्रोटीन की एकत्रीकरण प्रक्रिया का आकलन करने के लिए सीमित संख्या में उपकरण उपलब्ध हैं। हम फ्लोरेसेंस लाइफटाइम माइक्रोस्कोपी (FLIM) के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो विशिष्ट कोशिकाओं में एमिलॉयड फाइब्रिलाइजेशन की निगरानी के साथ-साथ न्यूरॉन्स जैसी विशिष्ट कोशिकाओं में एमिलॉयड फाइब्रिलाइजेशन की मात्रा की अनुमति देता है, एक गैर-आक्रामक तरीके से और उम्र बढ़ने की प्रगति के साथ और क्षोभ पर पीएन। FLIM फ्लोरोफोर के अभिव्यक्ति के स्तर से स्वतंत्र है और किसी भी आगे धुंधला या ब्लीचिंग के बिना एकत्रीकरण प्रक्रिया का विश्लेषण सक्षम बनाता है । फ्लोरोफोरस को तब बुझाया जाता है जब वे एमिलॉयड संरचनाओं के करीब होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरेसेंस जीवनकाल में कमी आती है। शमन सीधे एमिलॉयड प्रोटीन के एकत्रीकरण के साथ संबंधित है। FLIM एक बहुमुखी तकनीक है जिसे गैर-आक्रामक तरीके से वीवो में विभिन्न एमिलॉयड प्रोटीन, पर्यावरण उत्तेजनाओं या आनुवंशिक पृष्ठभूमि की फाइब्रिलाइजेशन प्रक्रिया की तुलना करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

प्रोटीन एकत्रीकरण उम्र बढ़ने और बीमारी दोनों में होता है। बड़े एमिलॉयड या असंगत समावेशन के गठन और जमाव का कारण बनने वाले रास्ते का पालन करना मुश्किल है और उनके गतिज इसी तरह को सुलझाना चुनौतीपूर्ण हैं। प्रोटीन आनुवंशिक रोगों के मामले में, उनके कोडिंग दृश्यों के भीतर आंतरिक उत्परिवर्तन के कारण गलत गुना कर सकते हैं। प्रोटीन भी गलत गुना क्योंकि प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क (पीएन) जो उन्हें घुलनशील और ठीक से जोड़ता रहता है, बिगड़ा हुआ है, जैसा कि उम्र बढ़ने के दौरान होता है। पीएन में आणविक चपरासी और क्षरण मशीनें शामिल हैं और बायोजेनेसिस, तह, तस्करी और प्रोटीन1के क्षरण के लिए जिम्मेदार है।

सी एलिगेंस अपनी छोटी उम्र, आइसोजेनिक प्रकृति और आनुवंशिक हेरफेर में आसानी के कारण उम्र बढ़ने और बीमारी का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में उभरा है । कई सी एलिगेंस ट्रांसजेनिक उपभेदों कि कमजोर ऊतकों में मानव रोग के कारण प्रोटीन व्यक्त बनाया गया है । महत्वपूर्ण बात यह है कि एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन वाले कई उपभेद एमिलॉयड विकारों की पहचान, बड़े समावेशन के गठन को फिर से दोहराते हैं। सी एलिगेंस के पारदर्शी शरीर के लिए धन्यवाद, इन समुचुओं को वीवो, गैर-आक्रामक और गैर-विनाशकारी रूप से2में कल्पना की जा सकती है। फ्लोरोफोर के साथ संलयन में ब्याज (पीओआई) का कोई प्रोटीन उत्पन्न करना इसके स्थानों, तस्करी, इंटरैक्शन नेटवर्क और सामान्य भाग्य की जांच करने की अनुमति देता है।

हम फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) के माध्यम से रहने वाले और उम्र बढ़ने सी एलिगनएस में रोग पैदा करने वाले प्रोटीन के एकत्रीकरण की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। FLIM एक शक्तिशाली तकनीक है जो अपने उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के बजाय फ्लोरोफोर के जीवनकाल पर आधारित है। जीवन भर (ताऊ, α) औसत एक फोटॉन के लिए आवश्यक समय के रूप में परिभाषित किया गया है अपने उत्तेजित राज्य से अपनी जमीन राज्य को वापस क्षय । दिए गए अणु के जीवनकाल की गणना समय-सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती (टीसीएसपीसी) की समय-डोमेन तकनीक के साथ की जाती है। टीसीएसपीसी-एफआईआईएल में, फ्लोरोसेंट क्षय समारोह को फ्लोरोफोर को कम, उच्च आवृत्ति लेजर दालों के साथ रोमांचक करके प्राप्त किया जाता है और दालों के संबंध में एक डिटेक्टर के लिए उत्सर्जित फोटॉन के आगमन के समय को मापने के लिए प्राप्त किया जाता है। एक नमूने को स्कैन करते समय, प्रत्येक पिक्सेल के लिए एक त्रि-आयामी डेटा सरणी बनाई जाती है: सरणी में उनके एक्स, वाई स्थानिक निर्देशांक और उनके लौकिक क्षय वक्र में फोटॉनों के वितरण के बारे में जानकारी शामिल है। एक दिया नमूना इसलिए प्रोटीन की संरचना, बाध्यकारी, और पर्यावरण3,,4के बारे में जानकारी खुलासा जीवन काल का एक नक्शा बन जाता है । प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन में एक आंतरिक और ठीक परिभाषित जीवनकाल होता है, आमतौर पर कुछ नैनोसेकंड (एनएस) का होता है, जो इसके फिजियोकेमिकल गुणों पर निर्भर होता है। महत्वपूर्ण बात, फ्लोरोफोर का जीवनकाल इसकी एकाग्रता, फ्लोरोसेंट तीव्रता और इमेजिंग पद्धति से स्वतंत्र है। हालांकि, एक जैविक प्रणाली के भीतर, यह पीएच, तापमान, आयन सांद्रता, ऑक्सीजन संतृप्ति, और उसके बातचीत भागीदारों जैसे पर्यावरणीय कारकों से प्रभावित हो सकता है। जीवन काल भी आंतरिक संरचनात्मक परिवर्तन और अभिविन्यास के प्रति संवेदनशील हैं। पीओआई के लिए फ्लोरोफोर को फ्यूज करने के परिणामस्वरूप इसके जीवनकाल में बदलाव होता है और इसके परिणामस्वरूप फ्यूजकिए गए प्रोटीन के व्यवहार के बारे में जानकारी होती है। जब एक फ्लोरोफोर को कसकर बंधे वातावरण में घिरा या समझाया जाता है, जैसे कि एमिलॉयड संरचना की एंटीसमान बीटा शीट, यह ऊर्जा को गैर-रेडिएटिव रूप से खो देता है, एक प्रक्रिया जिसे शमन5के रूप में जाना जाता है। फ्लोरोफोर की शमन के परिणामस्वरूप इसके स्पष्ट जीवनकाल का एक छोटा होता है। जब घुलनशील, एक प्रोटीन के जीवनकाल अपने मूल, उच्च मूल्य के करीब रहना होगा । इसके विपरीत, जब एक प्रोटीन कुल शुरू होता है, तो उसका जीवनकाल अनिवार्य रूप से कम मूल्य6,,7में बदल जाएगा। इसलिए, जीवित सी एलिगेंसमें विभिन्न उम्र में किसी भी एमिलॉयड बनाने वाले प्रोटीन की एकत्रीकरण प्रवृत्ति की निगरानी करना संभव हो जाता है।

यहां हम एक संलयन प्रोटीन के एकत्रीकरण का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें विभिन्न पॉलीग्लूटामाइन (सीएजी, क्यू) फैला (Q40, Q44 और Q85) शामिल हैं। हम वर्णन करते हैं कि तकनीक को विभिन्न फ्लोरोफोरस पर समान रूप से कैसे लागू किया जा सकता है, जैसे सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी), येलो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) और मोनोमेरिक रेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एमआरएफपी); और सी एलिगन्सके सभी ऊतकों में, न्यूरॉन्स, मांसपेशियों और आंत सहित। इसके अलावा, प्रोटेओस्टेसिस के संदर्भ में, FLIM आणविक चपरासी की कमी पर परिवर्तन ों का निरीक्षण करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है। आरएनए हस्तक्षेप के माध्यम से प्रमुख आणविक चपरासियों में से एक, हीट शॉक प्रोटीन 1(एचएसपी-1)को दस्तक देना प्रोटीन के समय से पहले गलत गुना पैदा करता है। उम्र बढ़ने, बीमारी, या कमी वाले चैपरोन के परिणामस्वरूप एकत्रीकरण भार में वृद्धि को फ्लोअरसेंस जीवनकाल में कमी के रूप में मापा जाता है।

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Protocol

1. सी एलिगेंस का सिंक्रोनाइजेशन

  1. सिंक्रोनाइज सी एलिगेंस या तो क्षारीय हाइपोक्लोराइट समाधान उपचार के माध्यम से या 20 डिग्री सेल्सियस8पर 4 घंटे के लिए सरल अंडे बिछाने के माध्यम से।
  2. मानक प्रक्रियाओं9के अनुसार OP50 ई. कोलाई के साथ वरीयता प्राप्त नेमाटोड विकास माध्यम (एनजीएम) प्लेटों पर 20 डिग्री सेल्सियस पर नेमाटोड विकसित करें और बनाए रखें। वांछित विकास के चरण या दिन तक सूत्रकृमि की आयु।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, युवा वयस्कों 4 दिन पर छवि है और पुराने सूत्रकृमि जीवन के 8 दिन पर छवि रहे हैं ।

2. आरएनएआई-मध्यस्थता करने वाली चैपरोन मशीनरी का नॉकडाउन खिलाने के माध्यम से

नोट: नेमाटोड10को इसी आरएनएआई वेक्टर को खिलाकर हीट शॉक प्रोटीन 1(एचएसपी-1)चैपरोन का नॉकडाउन करें । एचएसपी-1 आरएनएआई प्लाज्मिड अहरिंगर लाइब्रेरी (क्लोन आईडी: F26D10.3) से प्राप्त किया गया था।

  1. 50 μg/mL ampicillin युक्त लुरिया बर्टानी (एलबी) माध्यम में 6 घंटे से रातोंरात के लिए एचएसपी-1 आरएनएआई प्लाज्मिड व्यक्त करते हुए HT115 (DE3) ई. कोलाई बढ़ाएं।
  2. आइसोप्रोपिल युक्त ताजा एनजीएम एगर प्लेटें तैयार करें-डी-1-थिओगलकटोपिरानोसाइड (आईपीटीजी; 1 एमएम) और एमपिसिलिन (25 μg/mL) और एचएसपी-1 आरएनएआई बैक्टीरिया के साथ बीज । प्लेटों को सूखने के लिए छोड़ दें और 1-3 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर प्रेरित करें।
  3. सिआरएनए प्लेट पर सिंक्रोनाइज्ड अंडे रखें और हैच करने के लिए छोड़ दें, या ग्रेविड निमाटोड रखें और हटाने से पहले 20 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए अंडे डालने की अनुमति दें। वांछित उम्र या चरण तक नेमाटोड बढ़ाएं।
    नोट: सूत्रकृमि की दूसरी पीढ़ी नॉकडाउन का एक मजबूत फेनोटाइप पेश कर सकती है। यहां वर्णित सिआरएनए प्रोटोकॉल और स्थितियां सामान्य हैं और एचएसएसपी1के अनुकूल हैं । एक विशिष्ट क्लोन/जीन के siRNA के माध्यम से आरएनए हस्तक्षेप की स्थापना की जरूरत है और अंतिम उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सभी सिरना में एक ही दक्षता नहीं है, और इसलिए क्वांटिटेटिव रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) या वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा क्वांटिफिकेशन द्वारा नॉकडाउन की प्रभावकारिता का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है।

3. माइक्रोस्कोपी स्लाइड की तैयारी

  1. इमेजिंग के दिन इमेजिंग स्लाइड तैयार करके शुरुआत करें। 3% (w/v) की एकाग्रता पर ddH2O में अगारोज पिघलऔर थोड़ा ठंडा करते हैं ।
  2. एक 1 एमएल पिपेट टिप की नोक काटें और पिघला हुआ अगारोज के लगभग 200 माइक्रोन लें। एक साफ ग्लास स्लाइड पर अगारोज पिपेट और तुरंत शीर्ष पर एक दूसरे को रखें, किसी भी बुलबुले के गठन से बचें। सूखने के लिए छोड़ दें और धीरे-धीरे शीर्ष ग्लास स्लाइड को हटा दें। परिणाम एक भी अगारोज सतह के साथ एक ग्लास स्लाइड है जहां सूत्रकृमि तैनात किया जाएगा।
    नोट: प्रत्येक स्लाइड 5-10 सूत्रकृमि के बीच छवि के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । स्लाइड तैयार किया जा सकता है और एक humified बॉक्स में कुछ घंटों के लिए संग्रहीत करने के लिए बाहर सुखाने से agarose को रोकने के लिए ।

4. माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर बढ़ते सूत्रकृमि

नोट: FLIM निमाटोड स्थिर होने की आवश्यकता है । इमेजिंग सेटअप (जैसे, माइक्रोस्कोप, लेजर, डिटेक्टर) का उपयोग करने के लिए तैयार है एक बार इस कदम को अंजाम दें।

  1. एक प्लेटिनम तार लेने का उपयोग करना, एक ताजा गैर वरीयता प्राप्त थाली पर वांछित उम्र के सूत्रकृमि जगह है और उन्हें अपने शरीर से अतिरिक्त OP50 बैक्टीरिया को हटाने के लिए क्रॉल करते हैं।
  2. नेमाटोड को स्थिर करने के लिए एनेस्थेटिक यौगिक (सोडियम अजाइड या लेविसोल) तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 500 mM NaN3 स्टॉक रखें और 250 mM की अंतिम एकाग्रता के लिए ताजा डीडीएच2ओ में पतला करें। यदि लेविसोल का उपयोग कर रहे हैं, तो डीडीएच2ओ में 2 एमएम कार्य समाधान के लिए 20 एमएम स्टॉक को पतला करें।
    सावधानी: सोडियम एजाइड (NaN3)अत्यधिक विषाक्त है। दस्ताने और सुरक्षात्मक आईवियर का उपयोग करें और एक हवादार हुड के तहत काम करते हैं।
  3. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत काम करना, एग्रोज पैड पर एनेस्थेटिक यौगिक की 10 माइक्रोन ड्रॉप रखें और धीरे-धीरे इसमें 5-10 सूत्रकृमि स्थानांतरित करें। सूत्रकृमि को अलग करने के लिए बरौनी टिप का प्रयोग करें। उन्हें एक साथ बंद रखें, लेकिन छवि अधिग्रहण के दौरान सूत्रकृमि के आसान स्थानीयकरण के लिए अनुमति देने के लिए छू नहीं है ।
  4. सावधानी से एक कवरस्लिप के साथ सूत्रकृमि को ओवरले करें। बढ़ते के बाद 1 घंटे के भीतर माप लें।
    नोट: दोनों एनेस्थेटिक्स अंततः सी एलिगेंसको मार डालेंगे । इमेजिंग के दौरान सूत्रकृमि पूरी तरह से स्थिर होना चाहिए, क्योंकि जीवन भर का नक्शा प्रत्येक पिक्सेल से दर्ज किया जाता है। एक्स, वाई पैरामीटरका कोई भी आंदोलन एक ही उत्साहित पिक्सेल में जीवन भर के पढ़ने को रोकता है।

5. FLIM डेटा का अधिग्रहण

नोट: इस प्रोटोकॉल में, फ्लोरोफोर का जीवनकाल समय-डोमेन टीसीएसपीसी विधि के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। FLIM प्रकाश की एक नब्ज एक सेट और लगातार पुनरावृत्ति दर पर लेजर द्वारा उत्पन्न करने की आवश्यकता है । पुनरावृत्ति दर लेजर प्रकार के अनुसार भिन्न होती है और उपयोगकर्ता द्वारा ज्ञात होने की आवश्यकता होती है। आजीवन माप एक पारंपरिक माइक्रोस्कोप के साथ स्थापित डिटेक्टरों और इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों द्वारा प्राप्त कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल में, माप क्रमशः एमआरएफपी, सीएफपी और वाईएफपी लाइफटाइम के अधिग्रहण के लिए दो अलग-अलग कंपनियों(टेबल ऑफ मैटेरियल)द्वारा प्रदान किए गए डिटेक्टरों और सॉफ्टवेयर के साथ तीन अलग-अलग लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर किए जाते हैं। जांच लें कि उत्सर्जन/उत्तेजना के सही फिल्टर जगह में हैं और किसी भी पृष्ठभूमि को कम करने या शुरू करने से पहले बैकलाइट की निगरानी । किसी भी प्रयोग को शुरू करने से पहले, चुने हुए फ्लोरोफोर की फोटोस्थिरता स्थापित करें। यदि फ्लोरोफोर ने निमाटोड ऊतकों के भीतर थोड़े समय के भीतर ब्लीच किया जाता है, तो यह सी एलिगन्समें FLIM माप के लिए उपयुक्त नहीं है।

  1. FLIM अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें। FLIM सॉफ्टवेयर भी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के नियंत्रण की अनुमति देता है। डिटेक्टर के आउटपुट को सक्षम बनाने और सक्षम आउटपुटदबाने की अनुमति देने के लिए टैब/बटन का पता लगाएं।
  2. इंस्ट्रूमेंट रिस्पांस फंक्शन (आईआरएफ) प्राप्त करें, जो वाद्य सेटअप के समय की सटीकता का वर्णन करता है।
    नोट: यह कदम अधिमानतः सूत्रकृमि बढ़ते से पहले किया जाना चाहिए ।
    1. यदि उपलब्ध हो, तो उत्तेजना/उत्सर्जन फिल्टर हटा दें।
    2. उद्देश्य के ऊपर एक खाली कवरस्लिप रखें और इसकी सतह ढूंढें। कवरस्लिप से प्राप्त स्कैटर सिग्नल को न्यूनतम 30 एस के लिए रिकॉर्ड करें।
      नोट: कई नैनोसेकंड के जीवनकाल के लिए, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से आईआरएफ बदलाव का अनुमान लगा सकता है। आईआरएफ प्राप्त करने की हमेशा सिफारिश की जाती है।
  3. स्टेज पर घुड़सवार सी एलिगेंस के साथ स्लाइड रखें। ट्रांसमिशन मोड में 10x आवर्धन लेंस का उपयोग करना और स्लाइड पर निमाटोड की स्थिति का स्थानीयकरण करना।
  4. स्लाइड निकालें, उद्देश्य को 63x आवर्धन लेंस पर स्विच करें, और आवश्यक विसर्जन माध्यम (जैसे, तेल) लागू करें। स्लाइड को स्टेज पर बदलें और नेमाटोड को स्थानीयकृत करें।
  5. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर पिनहोल प्रबंधक का पता लगाएं और इसे अधिकतमकरने के लिए खोलें। नमूने को स्कैन करना शुरू करें, ब्याज के क्षेत्र (जैसे, सिर, ऊपरी शरीर) का चयन करें, और इसके अधिकतम प्रक्षेपण विमान पर ध्यान केंद्रित करें।
  6. लेजर पल्स दर और सॉफ्टवेयर के इंटरफेस पर मौजूद तीन अन्य मूल्यों की निगरानी करें: निरंतर अंश विवेचक (सीएफडी), टाइम-टू-एम्फेट (टीएसी), और एनालॉग-टू-डिजिटल कनवर्टर (एडीसी)।
    नोट: लेजर में 1 x 108 सिंगल फोटॉन मायने रखता है का अधिकतम गेट होना चाहिए। यह संख्या लेजर द्वारा आपूर्ति किए गए फोटॉनों की अधिकतम संख्या का प्रतिनिधित्व करती है। सीएफडी डिटेक्टर द्वारा लेजर पल्स के संदर्भ में एकल फोटॉन पल्स की प्राप्ति के बारे में जानकारी प्रदान करता है। यह मूल्य लगभग 1 x 105होना चाहिए। टीएसी समय एक फोटॉन का पता चला और अगले लेजर पल्स के बीच भेदभाव करता है । अंत में, एडीसी टीएसी वोल्टेज को एक स्ट्रेंबल मेमोरी सिग्नल11में परिवर्तित कर देता है । सीएफडी, टीएसी और एडीसी सभी के पास समान मूल्य होने चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि फ्लोरोफोर द्वारा उत्सर्जित फोटॉन खो न जाएं । इन मापदंडों का सही मूल्यांकन यह सुनिश्चित करता है कि एक सटीक आजीवन नक्शा बनाने के लिए पर्याप्त फोटॉन एकत्र किए जा रहे हैं।
  7. FLIM सॉफ्टवेयर के इंटरफेस पर, पता चला फोटॉनों की संख्या का पूर्वावलोकन: एडीसी मूल्य 1 x 104 और 1 x 105के बीच होना चाहिए । यदि आवश्यक हो, तो ध्यान को एक अलग विमान पर स्थानांतरित करें या अधिक फोटॉन एकत्र करने के लिए लेजर पावर बढ़ाएं।
    नोट: सामान्य तौर पर, प्रति सेकंड दर्ज फोटॉनों की संख्या लेजर की पुनरावृत्ति दर के 1% से अधिक नहीं होनी चाहिए।
  8. मेनू बार में, अधिग्रहण मापदंडों को सेट करने के लिए टैब का चयन करें। एकल फोटॉन का पता लगाने की अनुमति देने के लिए स्कैन सिंक का चयन करें।
  9. अधिग्रहण को निर्धारित समय या फोटॉनकी की एक निश्चित संख्या में सेट करें। उदाहरण के लिए, 2 मिन के लिए या जब तक एक भी पिक्सेल 2,000 एकल घटनाओं की फोटॉन गिनती तक पहुंचता है तब तक आजीवन क्षय वक्र प्राप्त करें। प्रेस अधिग्रहण शुरू करने के लिए शुरू करते हैं ।
    नोट: विभिन्न फ्लोरोफोरस को विभिन्न उत्तेजना और उत्सर्जन लेजर और फिल्टर की आवश्यकता होगी। नमूने की चमक के अनुसार लेजर पावर को भी एडजस्ट किया जा सकता है, जिससे जीवनभर इसमें दखल नहीं मिलेगा। ये प्रोटोकॉल निम्नलिखित उत्तेजना/उत्सर्जन सेटिंग्स का उपयोग करते हैं: YFP ex500/em520-50 एनएम, mRFP ex561/em580-620 एनएम । एक स्पंदित दो फोटॉन लेजर ex800/em440 एनएम का उपयोग कर CFP माप के लिए नियोजित किया गया था । FLIM मानचित्र के अधिग्रहण के लिए आवश्यक समय और फोटॉन गिनती की राशि प्रत्येक सेटअप और प्रत्येक प्रायोगिक उद्देश्य के लिए अनुभवजन्य रूप से स्थापित करने की आवश्यकता होगी।

6. FLIMfit सॉफ्टवेयर का उपयोग कर FLIM डेटा का विश्लेषण

नोट: इंपीरियल कॉलेज लंदन12 में विकसित FLIMfit सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग कर डेटा विश्लेषण करें (चित्रा 1देखें) ।

  1. सॉफ्टवेयर खोलें और फ़ाइल के माध्यम से FLIM डेटा फ़ाइलों का आयात करें । लोड फ्लिम डेटा। सभी नमूनों को एक शर्त से लोड करें, भले ही विभिन्न सत्रों में और विभिन्न जैविक दोहराता से प्राप्त किया गया हो।
  2. यदि आवश्यक हो, तो सेगमेंटेशन के माध्यम से किसी भी FLIM चित्र से एक भी सूत्रकृमि खंड । विभाजन प्रबंधक। जब तक इसे हाइलाइट न किया जाए तब तक ब्याज के क्षेत्र के चारों ओर फसल उपकरण खींचें। एक बार पूरा हो जाने के बाद, ठीकप्रेस।
    नोट: सभी छवियों के लिए विभाजन किया जाना चाहिए।
  3. एक छोटे से क्षेत्र का चयन करें जहां सी एलिगेंस की तीव्रता आधारित छवि दिखाई देती है(चित्र 1,तीर 1)। उस क्षेत्र का क्षय वक्र इंटरफ़ेस के दाईं ओर बड़ी क्षय खिड़की में दिखाई देगा(चित्र ा 1,तीर 2)।
    नोट: क्षय को liलक या logarithmically प्रदर्शित किया जा सकता है।
  4. 6.5-6.8 चरणों में वर्णित सॉफ्टवेयर के एल्गोरिदम के माध्यम से जीवनकाल को एक्सट्रपलेशन करने के लिए सही पैरामीटर सेट करें।
  5. डेटा टैब पर(चित्रा 1,तीर 3):
    1. किसी भी पिक्सेल को बाहर करने के लिए एक मनमाना एकीकृत न्यूनतम मूल्य निर्धारित करें जो एक अच्छा फिट उत्पादन करने के लिए बहुत मंद हैं। सी एलिगेंस नमूना के आधार पर यह मूल्य 40-300 से भिन्न होता है। इनपुट विभिन्न मूल्यों जब तक एक संतोषजनक पूर्वावलोकन प्राप्त किया है।
    2. इन मूल्यों के लिए FLIM संकेत को सीमित करने के लिए एक समय न्यूनतम और एक समय अधिकतम संख्या का चयन करें । इस दहलीज से पहले और बाद में दिखाई देने वाली सभी घटनाओं को बाहर रखा जाएगा।
      नोट: उदाहरण के लिए, MRFP के विश्लेषण के लिए, 800 पीएस से पहले की घटनाओं और 4,000 पीएस के बाद बाहर रखा गया था। ये मूल्य फ्लोरोफोर के जीवनकाल पर निर्भर करते हैं और अंतिम उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किए जाने की आवश्यकता होती है।
    3. 1 के प्रीसेट काउंट/फोटॉन को न बदलें ।
    4. अधिग्रहण के दौरान उपयोग किए गए लेजर की मेगाहर्ट्ज में पुनरावृत्ति दरइनपुट करें।
      नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए, विभिन्न पुनरावृत्ति दरों के साथ विभिन्न लेजर का उपयोग किया गया था। सीएफपी लाइफटाइम के अधिग्रहण के लिए उपयोग किए जाने वाले दो फोटॉन लेजर में 80 मेगाहर्ट्ज की पुनरावृत्ति दर है, वाईएफपी के लिए लेजर 40 मेगाहर्ट्ज पर दोहराता है, और MRFP के लिए मूल्य 78.01 मेगाहर्ट्ज है। इन मूल्यों का विश्लेषण नमूना के अनुसार FLIMfit में डाला गया ।
    5. सभी संतृप्त पिक्सेल को बाहर करने के लिए गेट मैक्स मूल्य इनपुट करें।
      नोट: सी एलिगेंसमें आजीवन माप न के लिए, यह मूल्य किसी भी बड़ी संख्या (जैसे, 1 x 108)के लिए निर्धारित है।
  6. लाइफटाइम टैब पर, उपयोग किए जाने वाले वैश्विक फिटिंग का चयन करें (उदाहरण के लिए, एक पिक्सेल-वार फिटिंग)। देखें चित्रा 1,तीर 4।
    नोट: एक पिक्सेल के लिहाज से फिटिंग प्रत्येक व्यक्ति पिक्सेल के लिए फिट एक क्षय का उत्पादन होगा । एक छवि के लिहाज से फिटिंग प्रत्येक व्यक्ति की छवि की एक वैश्विक फिटिंग का उत्पादन और छवि प्रति एक जीवन भर मूल्य प्रदर्शित करेगा । एक वैश्विक वार फिटिंग पूरे डेटासेट में एक ही फिटिंग का उत्पादन होगा । सभी छवियों के लिए एक एकल आजीवन मूल्य प्रदान किया जाता है।
  7. नहीं के अलावा किसी भी अन्य पैरामीटर में परिवर्तन न करें। चयन को उत्तेजित करें यदि यह ज्ञात है कि चुना हुआ फ्लोरेसेंस क्षय बहुघातीय है और एक ही जीवनकाल से अधिक प्रदर्शित करता है।
    नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में, इस समारोह का उपयोग द्विघाती सीएफपी फ्लोरोफोर के जीवनकाल की गणना करने के लिए किया गया था।
  8. आईआरएफ मेनू के माध्यम से आईआरएफ अपलोड करें: आईआरएफ । लोड आईआरएफ। आईआरएफ बदलाव का अनुमान लगाने के लिए आईआरएफ का चयन करें । आईआरएफ शिफ्ट का अनुमानलगाएं । मूल्यों का एक सेट स्वचालित रूप से आईआरएफ टैब पर दिखाई देगा। एक बार यह स्थापित हो जाने के बाद, इस टैब के किसी अन्य मापदंडों को न बदलें।
  9. एक बार सभी पैरामीटर सेट हो जाने के बाद, फिट डेटासेट (चित्रा 1,तीर 5) दबाएं। एल्गोरिदम क्षय वक्र के लिए एक फिट का उत्पादन और प्रत्येक छवि के लिए एक जीवन भर मूल्य स्थापित करेगा ।
    नोट: जिसके परिणामस्वरूप फिट, एक नीली रेखा में प्रकाश डाला, सभी घटनाओं के साथ ओवरलैप करना चाहिए । एक अच्छा फिट प्राप्त किया जाता है जब सभी घटनाओं फिट के साथ गठबंधन कर रहे हैं ।
  10. सॉफ्टवेयर के इंटरफ़ेस के शीर्ष सही मेनू के भीतर स्थित पैरामीटर टैब(चित्रा 1,एरो 6) पर क्लिक करें, और सांख्यिकीका चयन करें: w_mean (भारित मतलब) और जांच ें कि chi2 मूल्य जितना संभव हो सके 1 के करीब है।
    नोट: एक के करीब एक chi2 फिट की सटीकता सुनिश्चित करता है । इस प्रकार चयनित छवि का आजीवन मूल्य tau_1के रूप में प्रकट होता है ।
  11. ब्याज की किसी भी जानकारी का निर्यात करें: फाइल । निर्यात तीव्रता छवियां/फिट रिजल्ट टेबल/इमेजेज/हिस्टोग्राम। जीवन भर की गणना करने के लिए उपयोग की जाने वाली डेटा सेटिंग्स को सहेजें: फ़ाइल । डेटा सेटिंग सहेजें।
    नोट: चयनित नमूनों के भविष्य के विश्लेषण के लिए नियोजित मापदंडों को बचाया जाएगा।

7. FLIM डेटा के चित्रमय अभ्यावेदन

नोट: विभिन्न नमूनों से एकत्र जीवन काल को विभिन्न तरीकों से नेत्रहीन रूप से दर्शाया जा सकता है। नैनोसेकंड या पिकोसेकंड में जीवन भर के मूल्यों को निरूपित करने के लिए चुनें।

  1. FLIMfit से सीधे क्षय वक्र निर्यात करके फिट की गुणवत्ता और वक्र की सटीकता दिखाओ।
  2. एक हिस्टोग्राम में आजीवन मूल्य बनाम फोटॉन गिनती की आवृत्ति की साजिश रचने के द्वारा फोटॉन के वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं।
  3. अंत में, सांख्यिकीय तुलना के लिए, यदि दो या अधिक नमूनों की तुलना करते हैं, तो एक तितर-बितर प्लॉट बार ग्राफ में मतलब के आजीवन मूल्यों के साथ-साथ मानक विचलन रखें। किसी भी वांछित सांख्यिकीय विश्लेषण करें।

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Representative Results

प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे सही सी elegansमें एकत्रित प्रजातियों के गठन की निगरानी के लिए, दोनों अपनी प्राकृतिक उंर बढ़ने के दौरान और जब तनाव के अधीन । हमने ट्रांसजेनिक नेमाटोड के चार अलग-अलग उपभेदों का चयन किया, जो 40Q, 44Q या 85Q दोहराता है के पॉलीग्लूटामाइन प्रोटीन को व्यक्त करते हैं। ये प्रोटीन विभिन्न ऊतकों में संश्लेषित होते हैं और विभिन्न फ्लोरोफोरस से जुड़े होते थे। सी elegans उपभेदों या तो शरीर की दीवार की मांसपेशियों में Q40-mRFP व्यक्त (mQ40-RFP), तंत्रिका तंत्र में Q40-CFP (nQ40-CFP), और या तो Q44-YFP या Q85-YFP आंत में (iQ44-YFP और iQ85-YFP)13। यह समझाने के लिए कि उम्र बढ़ने एकत्रीकरण को कैसे बढ़ावा देता है, हमने जीवन के 4 दिन में, और पुराने सूत्रकृमि, 8 दिन में युवा सूत्रकृमि में इन पॉलीक्यू उपभेदों के जीवनकाल को एकत्र किया। पीएन में कमी के प्रभाव को दिखाने के लिए, हमने एमक्यू40-आरएफपी और एनक्यू40 उपभेदों में एचएसपी-1 का नॉकडाउन किया।

एक बार जब लाइफटाइम मूल्यों को FLIMfit सॉफ़्टवेयर के माध्यम से एक्सपेरिगेट किया जाता था, तो प्राप्त डेटा में ग्लूटामाइन लोड, उम्र बढ़ने या तनाव के कारण एकत्रित होने पर पॉलीक्यू निर्माण में से किसी के जीवनकाल में स्पष्ट कमी दिखाई गई। FLIM घुलनशील प्रोटीन अंश और एकत्रित प्रजातियों के बीच प्रतिष्ठित है, और उनके संक्रमण, उनके जीवन काल में एक बदलाव रिकॉर्डिंग द्वारा ।

4 दिन में, mQ40-RFP १.६९ ns(चित्रा 2)के एक औसत फ्लोरेसेंस जीवनकाल प्रदर्शित किया । उम्र बढ़ने पर, अधिक एकत्रित प्रजातियां पैदा हुईं, जो आजीवन छवियों में कम जीवनकाल फोसी के रूप में दिखाई देती हैं और हिस्टोग्राम को कम जीवनकाल में स्थानांतरित करती हैं(चित्र 2ए)। सूत्रकृमि की उम्र में हर अधिग्रहीत छवि के मतलब फ्लोरेसेंस जीवनकाल की साजिश रचकर, और इसलिए एकत्रित प्रजातियों का संचय, दिखाई देने वाला(चित्र ा 2बी)। पीएन की प्रोटीन तह क्षमता सी elegans14 और एकत्रीकरण प्रवण प्रोटीन में जीवन के 4 दिन के बाद गिरावट आई और आगे एमिलॉयड और असंगत समुच्य में क्लस्टर के लिए गलत मुड़ा । पीएन के अलावा, एक निश्चित प्रोटीन की आंतरिक एकत्रीकरण प्रवृत्ति ने समग्र गठन की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई। iQ44-YFP और iQ85-YFP के व्यवहार की तुलना करके इसका विश्लेषण किया गया था। iQ85 के अब क्यू-स्ट्रेच एकत्रीकरण के लिए अधिक प्रवण था और जीवन के 4 दिन में पहले से ही हिस्टोग्राम में एक फ्लोरेसेंस लाइफटाइम शिफ्ट का प्रदर्शन किया(चित्रा 3ए)। वास्तव में, 4 दिन में, iQ85 के लिए फोसी गठन मनाया गया था, जबकि अभी भी iQ44 में अनुपस्थित है। उम्र बढ़ने पर, हालांकि, iQ44 ने फोसी गठन का भी प्रदर्शन किया और इस प्रकार एक कम फ्लोरेसेंस जीवनकाल। क्योंकि iQ85 पहले से ही प्रारंभिक वयस्कता में समुचित प्रदर्शित उम्र बढ़ने पर एकत्रीकरण की प्रगति कम स्पष्ट थी, फिर भी महत्वपूर्ण(चित्रा 3बी)। अंत में, हमने एफओआई गठन का पता नहीं लगाया और न ही nQ40-CFP तनाव(चित्रा 4ए)में फ्लोरेसेंस जीवनकाल में कमी आई। इस तनाव के लिए, उम्र बढ़ने पर मतलब फ्लोरेसेंस जीवनकाल में केवल सूक्ष्म, तुच्छ परिवर्तन थे(चित्र4बी),संभावित रूप से न्यूरॉन्स के कारण अभी तक अज्ञात कारणों से कम संवेदनशील थे।

नीचे दस्तक hsp-1 mQ40 और nQ40 नेमाटोड व्यक्त के पीएन के लिए एक चुनौती बन गया है । एचएसपी-1 की RNAI-मध्यस्थता की कमी के कारण एकत्रीकरण(चित्रा 5 और चित्रा 6)में उल्लेखनीय वृद्धि हुई । शरीर की दीवार की मांसपेशियों में व्यक्त Q40 गैर-एकत्रित सामग्री से घिरे बड़े फोसी की एक छोटी संख्या बनाने के लिए खड़ा था। इसके परिणामस्वरूप हिस्टोग्राम में दो विशिष्ट चोटियां (लगभग 1.7 एनएस और 1.4 एनएस, देखें चित्रा 5ए)। वृद्ध और आरएनएआई नेनिटोड का इलाज कम जीवनकाल शिखर में एक मजबूत वृद्धि अंततः औसत फ्लोरेसेंस जीवनकाल(चित्रा 5बी)कम दिखाया । मांसपेशियों में Q40 के इस बिफसिक व्यवहार की तुलना में, न्यूरोनल Q40 ने अधिक विविध एकत्रीकरण व्यवहार प्रदर्शित किया। हम मांसपेशियों की अभिव्यक्ति तनाव(चित्र6ए)के रूप में एकत्रीकरण के साथ फोसी गठन को सीधे सहसंबंधित नहीं कर सके। क्योंकि FLIM एकत्रीकरण की डिग्री का आकलन करने का अवसर प्रदान करता है, हिस्टोग्राम से पता चला है कि वहां कोई अलग चोटी लेकिन फ्लोरेसेंस जीवन काल का एक व्यापक वितरण था, विभिंन oligomers और उच्च आदेश समुच्चय की एक जटिल संरचना की ओर इशारा करते । फिर भी, एकत्रीकरण की समग्र डिग्री मतलब फ्लोरेसेंस लाइफटाइम(चित्रा 6बी)की साजिश रचने से मूल्यांकन किया जा सकता है, यह दिखारहा है कि एचएसपी-1 नॉकआउट के कारण एकत्रीकरण में वृद्धि हुई।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि फ्लोरोफोरस का जीवनकाल, एक संलयन साथी से मुक्त और जैविक प्रणाली के बाहर, अधिक था। क्योंकि जीवन भर मुख्य रूप से अपने पर्यावरण से प्रभावित है, YFP और RFP के जीवनकाल की एक मामूली कमी पहले से ही सी elegans ऊतकों के भीतर ध्यान देने योग्य था । इसलिए एक उपयुक्त नियंत्रण के रूप में सूत्रकृमि के भीतर घुलनशील पीओआई के जीवनकाल को प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। एक उच्च जीवनकाल और एक कम जीवन काल के साथ एकत्रित अंश के साथ घुलनशील अंश के बीच एक तुलना तो किया जा सकता है । यहां, मांसपेशियों और आंतों की कोशिकाओं के भीतर दिखाई फोसी के गठन के साथ जीवनकाल में कमी सहसंबद्ध है। फिर भी, फोसी का एक अंश फ्लोरेसेंस जीवनकाल की कोई कमी नहीं प्रदर्शित करता है (चित्रा 2 और चित्रा 3,सफेद तीर देखें)। इस सुविधा पर प्रकाश डाला गया है कि कैसे संलयन निर्माण का केवल एक हिस्सा एक विशेष स्थानिक बिंदु पर एकत्र किया जा सकता है, और उपस्थिति और अनबाउंड प्रोटीन की उपलब्धता । न्यूरोनल Q40-CFP तनाव की जांच से एक और जटिल परिदृश्य पैदा हुआ । सीएफपी आंतरिक रूप से दो अलग फ्लोरेसेंस जीवन काल के पास है। जबकि सीएफपी वाईएफपी के साथ मिलकर फॉर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी)15 मापन के लिए एक आदर्श फ्लोरोफोर है, सी एलिगेंसमें समुचित गठन की निगरानी करने के लिए इसे नियोजित करना उचित नहीं है।

Figure 1
चित्रा 1: FLIMFit सॉफ्टवेयर इंटरफेस का स्क्रीनशॉट। फ्लोरेसेंस लाइफटाइम की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर का स्क्रीनशॉट। विंडो में सेटिंग्स को टेक्स्ट में वर्णित परिभाषित किए जाने के बाद इंटरफ़ेस को दर्शाया गया है, और जीवन काल की गणना की गई थी। गिने-चुने तीर प्रोटोकॉल के भीतर विशिष्ट चरणों को संदर्भित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पेशी Q40-RFP के फ्लोरेसेंस जीवन काल उम्र के साथ कम हो गए। (क)सी एलिगेंस के प्रतिनिधि नक्शे जो FLIMfit द्वारा उत्पन्न जीवन के 4 दिन या जीवन के 8 दिन मांसपेशियों Q40-RFP व्यक्त करते हैं । फ्लोरेसेंस लाइफटाइम, फ्लोरेसेंस तीव्रता, और दोनों की एक विलय छवि प्रदान की जाती है। स्केल बार = 25 माइक्रोन. हिस्टोग्राम 100 श्रेणियों में विभाजित सभी विश्लेषण निमाटोड के लिए मापा जीवन काल का वितरण दिखाते हैं। (ख)बार भूखंडों भारित मतलब फ्लोरेसेंस जीवन काल दिखा सभी के दिन 4 या जीवन के 8 दिन पर क्रमशः पशुओं का विश्लेषण किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आंतों Q44-YFP और आंतों Q85-YFP के फ्लोरेसेंस जीवन काल उम्र के साथ कम हो गए। (क)सी एलिगेंस के प्रतिनिधि नक्शे आंतों Q44-YFP या आंतों Q85-YFP दिन 4 या FLIMfit द्वारा उत्पन्न जीवन के 8 दिन पर व्यक्त करते हैं । फ्लोरेसेंस लाइफटाइम, फ्लोरेसेंस तीव्रता, और दोनों की एक विलय छवि प्रदान की जाती है। स्केल बार = 25 माइक्रोन. हिस्टोग्राम 100 श्रेणियों में विभाजित सभी विश्लेषण निमाटोड के लिए मापा जीवन काल का वितरण दिखाते हैं। (ख)बार भूखंडों भारित मतलब फ्लोरेसेंस जीवन काल दिखा सभी के दिन 4 या जीवन के 8 दिन पर क्रमशः पशुओं का विश्लेषण किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: न्यूरोनल Q40-CFP के फ्लोरेसेंस जीवन काल उम्र के साथ नहीं बदला । (क)सी एलिगेंस के प्रतिनिधि नक्शे जो फ्लेमफिट द्वारा उत्पन्न जीवन के 4 दिन या 8 दिन न्यूरोनल क्यू 40-सीएफपी व्यक्त करते हैं। फ्लोरेसेंस लाइफटाइम, फ्लोरेसेंस तीव्रता, और दोनों की एक विलय छवि प्रदान की जाती है (दूसरा जीवनकाल, α2, सभी नमूनों में इंगित किया जाता है)। स्केल बार = 25 माइक्रोन. हिस्टोग्राम 100 श्रेणियों में विभाजित सभी विश्लेषण निमाटोड के लिए मापा जीवन काल का वितरण दिखाते हैं। (ख)बार भूखंडों भारित मतलब फ्लोरेसेंस जीवन काल दिखा सभी के दिन 4 या जीवन के 8 दिन पर क्रमशः पशुओं का विश्लेषण किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: पेशी Q40-RFP के फ्लोरेसेंस जीवन काल hsp-1के नॉकडाउन पर कमी आई । (क)सी एलिगेंस के प्रतिनिधि नक्शे जो FLIMfit द्वारा उत्पन्न जीवन के 4 दिन या जीवन के 8 दिन मांसपेशियों Q40-RFP व्यक्त करते हैं । फ्लोरेसेंस लाइफटाइम और तीव्रता मानचित्र का एक विलय प्रदर्शित किया जाता है। दोनों समय बिंदुओं के लिए, सूत्रकृमि जो एक खाली वेक्टर (नियंत्रण) या एचएसपी-1 आरएनएआई निर्माण को व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया पर वृद्धि हुई हैं, दिखाए गए हैं। स्केल बार = 25 माइक्रोन. हिस्टोग्राम 100 श्रेणियों में विभाजित सभी विश्लेषण निमाटोड के लिए मापा जीवन काल का वितरण दिखाते हैं। (ख)बार भूखंडों में सभी विश्लेषण किए गए जानवरों के भारित साधन फ्लोरेसेंस जीवनकाल को क्रमशः नियंत्रण या एचएसपी-1 आरएनएआई के साथ जीवन के दिन 4 या 8 दिन दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: न्यूरोनल Q40-CFP के फ्लोरेसेंस जीवन काल hsp-1के नॉकडाउन पर कमी आई । (क)सी एलिगेंस के प्रतिनिधि नक्शे जो FLIMfit द्वारा उत्पन्न जीवन के चौथे दिन न्यूरोनल Q40-CFP व्यक्त करते हैं । फ्लोरेसेंस लाइफटाइम और तीव्रता मानचित्र का एक विलय प्रदर्शित किया जाता है। दिखाए गए नेमाटोड एक खाली वेक्टर (नियंत्रण) या एचएसपी-1 आरएनएआई निर्माण को व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया पर उगाए गए थे। स्केल बार = 25 माइक्रोन. हिस्टोग्राम 100 श्रेणियों में विभाजित सभी विश्लेषण निमाटोड के लिए मापा जीवन काल का वितरण दिखाते हैं। (ख)बार भूखंडों भारित मतलब फ्लोरेसेंस जीवन काल दिखा सभी 4 दिन पर जानवरों का विश्लेषण किया, नियंत्रण RNAI या एचएसपी-1 RNAi के साथ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सी एलिगेंस मॉडल सिस्टम में एकत्रित प्रजातियों की पहचान करने के लिए माइक्रोस्कोपी आधारित तकनीक का वर्णन करता है । FLIM सही दोनों एकत्रित और घुलनशील प्रजातियों की उपस्थिति की विशेषता को अपने फ्लोरेसेंस आजीवन क्षय के माप के माध्यम से एक फ्लोरोफोर के लिए जुड़े कर सकते हैं । जब एक संलयन प्रोटीन अपने दर्ज औसत जीवनकाल को एकत्र करना शुरू कर देता है तो वह उच्च से कम मूल्य16में बदल जाएगा । एकत्रीकरण की प्रवृत्ति तो जीवन भर में गिरावट से deduced किया जा सकता है: कम जीवन भर, उच्च प्रणाली में एकत्रित प्रोटीन प्रजातियों की उपस्थिति । इस प्रकार, किसी भी प्रोटीन की एकत्रीकरण प्रवृत्ति पर उम्र बढ़ने, रोग या पीएन की हानि के प्रभावों का पालन करना संभव हो जाता है।

तकनीक की बहुमुखी प्रतिभा को उजागर करने के लिए, हमारे परिणामों से स्पष्ट रूप से पता चला है कि FLIM ऊतक या फ्लोरोफोर की परवाह किए बिना विभिन्न पॉलीक्यू निर्माण की संरचना में परिवर्तन की पहचान कर सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि FLIM पहले से ही सी एलिगन्सके भीतर अन्य एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन के लक्षण वर्णन में सफलतापूर्वक लागू किया गया है, जैसे α-synuclein17। इसके अलावा, सी एलिगेंस के लिए किसी भी तनाव कारक को लागू करना और किसी भी पीओआई के खुलासा और एकत्रीकरण का पालन करना संभव हो जाता है। ओस्मोटिक, धातु आयन, रेडऑक्स, या रासायनिक तनाव सभी विषाक्त असंतुलन को बढ़ावा दे सकते हैं जिन्हें FLIM को नियोजित करने वाले सी एलिगेंस में सफलतापूर्वक निगरानी की जा सकती है। रिवर्स भी संभव हो सकता है: लाभकारी यौगिकों की उपस्थिति या पीएन को बढ़ाने के कारण एकत्रीकरण या यहां तक कि विघ्नवृद्धि में देरी, प्रोटीन के बचाव और परिणामस्वरूप आजीवन वृद्धि हो सकती है।

FLIM व्यापक रूप से रसायन विज्ञान से कैंसर जीव विज्ञान18 चिकित्सा निदान के लिए विषयों की एक विस्तृत सरणी में किसी भी पदार्थ के जीवनकाल में परिवर्तन की निगरानी के लिए नियोजित किया गया है, लेकिन कुछ सीमाएं बनी हुई हैं । एक मुख्य समस्या फ्लोरोफोरस की फोटोस्थिरता है। क्योंकि FLIM फोटॉन की एक बड़ी संख्या की रिकॉर्डिंग की आवश्यकता है, फोटोब्लीचिंग एकत्र फोटॉनों की संख्या को कम कर देता है और जिसके परिणामस्वरूप क्षय वक्र बदल सकते हैं । इसके अलावा, विशेष रूप से सूत्रकृमि प्रणाली के भीतर, यदि फ्लोरोफोर की तीव्रता पर्याप्त फोटॉन एकत्र करने के लिए पर्याप्त रूप से अधिक नहीं है, तो एक उच्च उत्तेजना की आवश्यकता होती है, जिससे जल्दी फोटोब्लीचिंग और एक अविश्वसनीय क्षय वक्र होता है। अंत में, तकनीक पहले से मौजूद माइक्रोस्कोपी सिस्टम के लिए ऐड-ऑन के रूप में परिष्कृत और महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है, जिसमें एक महत्वपूर्ण तत्व डिटेक्टरों19की संवेदनशीलता है।

इसके विपरीत, फ्लोरोफोर और इसके फ्यूजन प्रोटीन के जीवनकाल की गणना करने के मुख्य फायदों में से एक यह है कि यह अपने पर्यावरण के भीतर बातचीत के विविध राज्यों में एक ही फ्लोरोफोर-प्रोटीन परिसर के विभिन्न अंशों के बारे में जानकारी प्रदान करता है, चाहे इसकी काफी हद तक अज्ञात एकाग्रता हो। FLIM का उपयोग किसी भी चरण में जीवनकाल को मापने के लिए भी किया जा सकता है, गैस, तरल, या ठोस और किसी भी मध्यम या जीव में जिसे सामान्य रूप से छवि बनाया जा सकता है, कोशिकाओं से जीवों तक, और ऑर्गेनेल्स को स्थिर, शुद्ध प्रोटीन20। माइक्रोस्कोपी तकनीक आमतौर पर फ्लोरोसेंटी टैग किए गए प्रोटीन की स्थिर-राज्य इमेजिंग पर भरोसा करती है। स्थिर राज्य तकनीकों के विपरीत, FLIM बाध्यकारी, संरचना और जैविक सब्सट्रेट की संरचना में परिवर्तन को हल कर सकता है। एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन की जांच के लिए, बड़े फ्लोरोसेंट समावेशन या फोसी की उपस्थिति को आसानी से चित्रित किया जा सकता है, लेकिन ये केवल एक स्थिर, तीव्रता आधारित स्नैपशॉट3का प्रतिनिधित्व करते हैं। एकत्रित प्रजातियों के मामले में, विज़ुअलाइज्ड फोसी भ्रामक भी हो सकता है, क्योंकि फ्लोरोफोर की उच्च एकाग्रता के परिणामस्वरूप मजबूत एमिलॉयड गठन नहीं होता है। FLIM के माध्यम से यह बजाय अघुलनशील सामग्री से घुलनशील भेद संभव है । अंत में, यह किसी भी जांच के लिए दोनों तीव्रता आधारित माप और समानांतर आजीवन माप प्राप्त करने के लिए फायदेमंद हो जाता है । इन माइक्रोस्कोपी तकनीकों की पूरकता के भीतर उनकी ताकत निहित है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

सीजीसी द्वारा प्रदान की जाने वाली मांसपेशी-Q40-mRFP तनाव, जिसे एनआईएच कार्यालय ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। न्यूरोनल-क्यू40-सीएफपी मोरिमोटो लैब का एक तरह का तोहफा था । हम डीएफजी (जेके को केआई-1988/5-1, न्यूरोक्योर पीएचडी फेलोशिप को एक्सीलेंस क्लस्टर ऑफ एक्सीलेंस द्वारा एमएलपी, एम्बो (एमएलपी को शॉर्ट टर्म फेलोशिप) और फंडिंग के लिए बायोलॉजिस्ट्स (सीजी और एमएलपी को यात्रा अनुदान) की कंपनी स्वीकार करते हैं । हम वाईएफपी निर्माण की छवि को सेटअप प्रदान करने के लिए मैक्स डेलब्रुक सेंटर फॉर मॉलिक्यूलर मेडिसिन, बर्लिन में उन्नत लाइट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सुविधा को भी स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar-Agar Kobe I Carl Roth GmbH + Co. KG 5210.2 NGM component
Ahringer Library hsp-1 siRNA Source BioScience UK Limited F26D10.3
Ampicillin Carl Roth GmbH + Co. KG K029.3 Antibiotic
B&H DCS-120 SPC-150 Becker & Hickl GmbH FLIM Aquisition software
B&H SPC830-SPC Image Becker & Hickl GmbH FLIM Aquisition software
BD Bacto Peptone BD-Bionsciences 211677 NGM component
C. elegans iQ44-YFP CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) OG412
C. elegans iQ85-YFP Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFP Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFP Kind gift from Morimoto Lab
Deckgläser-18x18mm Carl Roth GmbH + Co. KG 0657.2 Cover slips
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Carl Roth GmbH + Co. KG 2316.4
Leica M165 FC Leica Camera AG Mounting Stereomicroscope
Leica TCS SP5 Leica Camera AG Confocal Microscope
Levamisole Hydrochloride AppliChem GmbH A4341 Anesthetic
OP50 Escherichia coli CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) OP50
PicoQuant PicoHarp300 PicoQuant GmbH FLIM Aquisition software
Sodium Azide Carl Roth GmbH + Co. KG K305.1 Anesthetic
Sodium Chloride Carl Roth GmbH + Co. KG 3957.2 NGM component
Standard-Objektträger Carl Roth GmbH + Co. KG 0656.1 Glass slides
Universal Agarose Bio & Sell GmbH BS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1 Carl Zeiss AG Confocal Microscope
Zeiss LSM510-Meta NLO Carl Zeiss AG Confocal Microscope

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References

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बायोकेमिस्ट्री इश्यू 157 सी एलिगेंस,एग्रीगेशन एजिंग प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क सिराना नॉकडाउन फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) टाइम-सहसंबद्ध सिंगल फोटॉन काउंटिंग (टीसीएसपीसी) लाइफटाइम (ताऊ)
फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग का उपयोग करके एजिंग <em>सी एलिगेंस</em> में एमीलॉयड संरचनाओं का लक्षण वर्णन
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Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging. J. Vis. Exp. (157), e61004, doi:10.3791/61004 (2020).

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