Summary
Fluorescens levetid bildebehandlingsskjermer, kvantifiserer og skiller aggregering tendenser av proteiner i levende, aldring, og stresset C. elegans sykdom modeller.
Abstract
Amyloid fibriller er forbundet med en rekke nevrodegenerative sykdommer som Huntingtons, Parkinsons eller Alzheimers sykdom. Disse amyloid fibriller kan sequester endogene metastabile proteiner samt komponenter i proteostase nettverk (PN) og dermed forverre protein misfolding i cellen. Det finnes et begrenset antall verktøy tilgjengelig for å vurdere aggregeringsprosessen av amyloid proteiner i et dyr. Vi presenterer en protokoll for fluorescens livstidsmikroskopi (FLIM) som gjør det mulig å overvåke samt kvantifisering av amyloid fibrilization i bestemte celler, for eksempel nevroner, på en ikke-invasiv måte og med progresjon av aldring og ved perturbasjon av pn. FLIM er uavhengig av uttrykksnivåene til fluoroforen og muliggjør en analyse av aggregeringsprosessen uten ytterligere flekker eller bleking. Fluoroforer slukkes når de er i nærheten av amyloid strukturer, noe som resulterer i en reduksjon av fluorescens levetid. Slukkingen korrelerer direkte med aggregeringen av amyloidproteinet. FLIM er en allsidig teknikk som kan brukes til å sammenligne fibrilization prosessen med forskjellige amyloid proteiner, miljømessige stimuli, eller genetisk bakgrunn in vivo på en ikke-invasiv måte.
Introduction
Proteinaggregering forekommer både ved aldring og sykdom. Banene som fører til dannelse og avsetning av store amyloider eller amorfe inneslutninger er vanskelige å følge, og deres kinetikk er tilsvarende utfordrende å rakne. Proteiner kan misfold på grunn av iboende mutasjoner i deres koding sekvenser, som i tilfelle av genetiske sykdommer. Proteiner også misfold fordi proteostase nettverk (PN) som holder dem løselig og riktig foldet er svekket, som skjer under aldring. PN inkluderer molekylære chaperones og nedbrytning maskiner og er ansvarlig for biogenesis, folding, menneskehandel, og nedbrytning av proteiner1.
C. elegans har dukket opp som en modell for å studere aldring og sykdom på grunn av sin korte levetid, isogene natur, og enkel genetisk manipulasjon. Flere C. elegans transgene stammer som uttrykker menneskelig sykdomsfremkallende proteiner i sårbare vev har blitt opprettet. Viktigere, mange av stammene som inneholder aggregeringsutsatte proteiner rekapitulerer kjennetegnet på amyloid lidelser, dannelsen av store inneslutninger. Takket være C. elegans gjennomsiktige kropp, kan disse aggregatene visualiseres in vivo, ikke-invasivt og ikke-destruktivt2. Generering av ethvert protein av interesse (POI) i fusjon med en fluorophore gjør det mulig å undersøke sine steder, menneskehandel, interaksjonsnettverk og generell skjebne.
Vi presenterer en protokoll for å overvåke aggregering av sykdomsfremkallende proteiner i levende og aldrende C. elegans via fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM). FLIM er en kraftig teknikk basert på levetiden til en fluorophore, snarere enn utslippsspektra. Levetiden (tau, τ) er definert som den gjennomsnittlige tiden som kreves av et foton for å forfalle fra sin spente tilstand tilbake til sin bakketilstand. Levetiden til et gitt molekyl beregnes med tidsdomeneteknikken for tidskorrelert enkeltfotontelling (TCSPC). I TCSPC-FLIM oppnås fluorescerende forfallsfunksjon ved å spennende fluoroforforen med korte, høyfrekvente laserpulser og måle de emitterte fotonens ankomsttider til en detektor i forhold til pulsene. Når du skanner en prøve, opprettes en tredimensjonal datamatrise for hver piksel: matrisen inneholder informasjon om fordelingen av fotonene i x,y romlige koordinater og deres temporale forfallskurve. En gitt prøve blir derfor et kart over levetidsomhet som avslører informasjon om proteinets struktur, binding og miljø3,4. Hvert fluorescerende protein har en iboende og nøyaktig definert levetid, vanligvis av noen få nanosekunder (ns), avhengig av sine fysiokjemiske egenskaper. Viktigere, levetiden til en fluorophore er uavhengig av konsentrasjon, fluorescerende intensitet, og av bildemetoden. Men innenfor et biologisk system kan det påvirkes av miljøfaktorer som pH, temperatur, ionkonsentrasjoner, oksygenmetning og interaksjonspartnere. Levetider er også følsomme for interne strukturelle endringer og orientering. Å koble en fluorofor til et POI resulterer i en endring i levetiden og dermed informasjon om oppførselen til det smeltede proteinet. Når en fluoroforer er omgitt eller innkapslet i et tett bundet miljø, for eksempel de antiparallelle betaarkene i en amyloid struktur, mister den energi ikke-radiativt, en prosess kjent somslukkende 5. Slukking av fluoroforen resulterer i en forkortelse av sin tilsynelatende levetid. Når løselig, et protein levetid vil holde seg nærmere sin opprinnelige, høyere verdi. I motsetning, når et protein begynner å aggregere, vil levetiden uunngåelig skifte til en lavere verdi6,7. Derfor blir det mulig å overvåke aggregeringstilbøyeligheten til ethvert amyloiddannende protein i ulike aldre i levende C. elegans.
Her beskriver vi en protokoll for å analysere aggregeringen av et fusjonsprotein som består av forskjellige polyglutamin (CAG, Q) strekninger (Q40, Q44 og Q85). Vi illustrerer hvordan teknikken kan brukes likt på forskjellige fluoroforer, som cyanfluorescerende protein (CFP), gult fluorescerende protein (YFP) og monomeriske røde fluorescerende protein (mRFP); og i alle vev av C. elegans, inkludert nevroner, muskler, og tarmen. Videre, i sammenheng med proteostase, er FLIM et svært nyttig verktøy for å observere endringer ved uttømming av molekylære chaperons. Slå ned en av de viktigste molekylære chaperones, varme sjokk protein 1 (hsp-1), via RNA interferens produserer for tidlig feilfolding av proteiner. Økningen i aggregeringsbelastning som følge av aldring, sykdom eller mangelfulle chaperones, måles deretter som en reduksjon i fluorescens levetid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synkronisering av C. elegans
- Synkroniser C. elegans enten via alkalisk hypoklorittløsningsbehandling eller via enkel egglegging i 4 timer ved 20 °C8.
- Vokse og vedlikeholdne ved 20 °C på nematodevekstmedium (NGM) plater sådd med OP50 E. coli i henhold til standardprosedyrer9. Alder nematodene til ønsket utviklingsstadium eller dag.
MERK: I denne protokollen blir unge voksne avbildet på dag 4 og gamle nematoder er avbildet på dag 8 av livet.
2. RNAi-mediert knockdown av chaperone maskiner via fôring
MERK: Utfør knockdown av varmesjokkprotein 1 (hsp-1) chaperone ved å mate den tilsvarende RNAi-vektoren til nematodene10. Hsp-1 RNAi plasmid ble hentet fra Ahringer-biblioteket (klone-ID: F26D10.3).
- Øk HT115 (DE3) E. coli som uttrykker hsp-1 RNAi plasmid for 6 h til over natten i Luria Bertani (LB) medium som inneholder 50 μg/ml amicillin.
- Forbered ferske NGM agarplater som inneholder isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) og ampicillin (25 μg/ml) og frø med hsp-1 RNAi-bakteriene. La platene tørke og indusere ved romtemperatur i 1-3 dager.
- Plasser synkroniserte egg på en siRNA-plate og la det klekkes, eller plasser gravid nematoder og la det legge egg i 4 timer ved 20 °C før du fjerner. Dyrk nematodene til ønsket alder eller stadium.
MERK: Den andre generasjonen nematoder kan presentere en sterkere fenotype av knockdown. SiRNA-protokollen og betingelsene som er beskrevet her er generelle og tilpasses hsp1. RNA-interferens via siRNA av en bestemt klone/gen må etableres og optimaliseres av sluttbrukeren. Det er viktig å merke seg at ikke alle siRNA har samme effektivitet, og det anbefales derfor å teste effekten av knockdown ved kvantifisering ved enten kvantitativ omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-qPCR) eller vestlig blot.
3. Utarbeidelse av mikroskopilysbilder
- Start med å forberede bildelysbildene på bildedagen. Smelt agarose i ddH2O ved en konsentrasjon på 3 % (w/v) og la avkjøles litt.
- Klipp spissen av en 1 ml pipettespiss og ta omtrent 200 μL smeltet agarose. Pipette agarose på en ren glasssklie og umiddelbart plassere en andre på toppen, unngå dannelse av noen bobler. La det tørke og fjern det øverste glasslysbildet forsiktig. Resultatet er et glasslysbilde med en jevn agaroseoverflate hvor nematodene vil bli plassert.
MERK: Hvert lysbilde vil bli brukt til å bilde mellom 5-10 nematoder. Lysbilder kan tilberedes og lagres i noen timer i en humifisert boks for å hindre at agarose tørker ut.
4. Montering av nematoder på mikroskopilysbilder
MERK: FLIM krever at nematodene immobiliseres. Utfør dette trinnet når bildeoppsettet (f.eks. mikroskoper, lasere, detektorer) er klare til bruk.
- Bruk en platinatrådplukking til å plassere nematoder av ønsket alder på en frisk usett plate og la dem krype for å fjerne de overskytende OP50-bakteriene fra kroppen.
- Forbered den bedøvelsesforbindelsen (natriumazid eller levamisole) for å immobilisere nematoden. Oppbevar et 500 mM NaN3-lager i mørket ved 4 °C og fortynn i frisk ddH2O til en endelig konsentrasjon på 250 mM. Ved bruk av levamisole, fortynn en 20 mM-lager til 2 mM arbeidsløsning i ddH2O.
FORSIKTIG: Natriumazid (NaN3) er svært giftig. Bruk hansker og vernebriller og arbeid under en ventilert hette. - Arbeider under et stereomikroskop, plasser en 10 μL dråpe bedøvelse sammensatte på en agarose pad og forsiktig overføre 5-10 nematoder inn i den. Bruk en øyenvippespiss for å skille nematodene. Hold dem tett sammen, men ikke berøre for å tillate enklere lokalisering av nematodene under bildeoppkjøp.
- Overlegg nematodene forsiktig med en dekkslip. Ta målinger innen 1 t etter montering.
MERK: Begge bedøvelsesmiddelvil til slutt drepe C. elegans. Nematodene må være helt immobile under bildebehandling, fordi bildets kart registreres fra hver piksel. Enhver bevegelse av x,y-parametrene forhindrer lesing av levetiden i samme opphissede piksel.
5. Innhenting av FLIM-data
MERK: I denne protokollen er levetiden til fluoroforen anskaffet via tcspc-metoden for tidsdomene. FLIM krever en puls av lys som skal genereres av laseren med et sett og konstant repetisjonshastighet. Repetisjonshastigheten varierer i henhold til lasertypen og må være kjent av brukeren. Livstidsmålinger oppnås ved at detektorer og elektronisk utstyr installeres sammen med et konvensjonelt mikroskop. I denne protokollen utføres målinger på tre forskjellige laserskanningskonfokale mikroskoper med detektorer og programvare levert av to forskjellige selskaper (Table of Materials) for oppkjøp av henholdsvis mRFP, CFP og YFP-levetid. Kontroller at de riktige filtrene for utslipp/eksitasjon er på plass og minimere ri bakgrunns- eller skjermbakgrunnsbelysningfør start. Før du starter et eksperiment, etablere fotostabiliteten til den valgte fluorophore. Hvis fluoroforen bleker innen kort tid innenfor nematodevevet, er det ikke egnet for FLIM-målinger i C. elegans.
- Åpne FLIM-oppkjøpsprogramvaren. FLIM-programvaren tillater også kontroll av konfokalmikroskopet. Finn kategorien/knappen for å tillate at detektorens utganger aktiveres, og trykk på Aktiver utganger.
- Erverve instrumentresponsfunksjonen (IRF), som beskriver timingpresisjonen til instrumentoppsettet.
MERK: Dette trinnet bør utføres fortrinnsvis før du monterer nematodene.- Hvis tilgjengelig, fjerner du eksitasjons-/utslippsfiltrene.
- Plasser en tom dekselslip over målet og finn overflaten. Ta opp scattersignalet som er hentet fra dekkseddelen i minst 30 s.
MERK: For levetidpå flere nanosekunder kan oppkjøpsprogramvaren automatisk estimere IRF-skiftet. Det anbefales alltid å anskaffe en IRF.
- Plasser lysbildet med de monterte C. elegans på scenen. Bruk en 10x forstørrelseslinse i overføringsmodus og lokalisere posisjonen til nematodene på lysbildet.
- Fjern lysbildet, sett målet til et 63x forstørrelsesobjektiv, og bruk ønsket nedsenkingmedium (f.eks. olje). Skift ut lysbildet på scenen og lokaliser nematodene.
- Finn Pinhole Manager på oppkjøpsprogramvaren og åpne den til Maksimum. Begynn å skanne prøven, velg en interesseregion (f.eks. hode, overkropp), og fokuser på det maksimale projeksjonsplanet.
- Overvåk laserpulsen og de tre andre verdiene som finnes på grensesnittet til programvaren: Konstant fraksjonsdiskriminator (CFD), Tid-til-amplitude (TAC) og analog-til-digital omformer (ADC).
MERK: Laseren skal ha en maksimal port på 1 x 108 enkelt fotonteller. Dette nummeret representerer maksimalt antall fotoner levert av laseren. CFD gir informasjon om mottak av enkelt fotonpuls i referanse til laserpulsen av detektoren. Denne verdien bør være omtrent 1 x 105. TAC diskriminerer mellom den tiden en foton ble oppdaget og neste laserpuls. Til slutt konverterer ADC TAC-spenningen til et lagringssikkert minnesignal11. CFD, TAC og ADC bør alle ha lignende verdier for å sikre at fotoner som slippes ut av fluoroforforen ikke går tapt. Riktig evaluering av disse parametrene sikrer at det samles inn nok fotoner for å lage et nøyaktig livstidskart. - På grensesnittet til FLIM-programvaren, forhåndsvis antall fotoner oppdaget: ADC-verdien skal være mellom 1 x 104 og 1 x 105. Om nødvendig, skift fokus på et annet plan eller øke laserkraften for å samle flere fotoner.
MERK: Generelt bør antall innspilte fotoner per sekund ikke overstige 1% av laserens repetisjonshastighet. - Velg kategorien på menylinjen for å angi anskaffelsesparameterne. Velg skannesynkronisering for å tillate enkelt fotongjenkjenning.
- Sett anskaffelsen til en fast tidsperiode eller et fast antall fotoner. For eksempel, få en levetid forfall kurve for 2 min eller til en enkelt piksel når en foton antall 2000 enkelt hendelser. Trykk på Start for å starte oppkjøpet.
MERK: Ulike fluoroforer vil kreve forskjellige eksitasjons- og utslippslasere og filtre. I henhold til lysstyrken på prøven kan lasereffekten også justeres, noe som ikke forstyrrer levetiden. Disse protokollene bruker følgende eksitasjons-/utslippsinnstillinger: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. En pulserende to fotonlaser ble brukt for CFP-målinger ved hjelp av ex800/em440 nm. Mengden tid og fotontelling som kreves for oppkjøp av et FLIM-kart, må etableres empirisk for hvert oppsett og hvert eksperimentelt formål.
6. Analyse av FLIM-data ved hjelp av FLIMfit-programvare
MERK: Utfør dataanalyse ved hjelp av FLIMfit-programvareverktøyet utviklet ved Imperial College London12 (se figur 1).
- Åpne programvaren og importer FLIM datafiler via File | Last inn FLIM-data. Last alle prøver fra én betingelse, selv om de oppnås i forskjellige økter og fra forskjellige biologiske repetisjoner.
- Om nødvendig må du segmentere en enkelt nematode fra et flimbilde via segmentering | Segmenteringsbehandling. Dra beskjæringsverktøyet rundt interesseområdet til det er uthevet. Når du er ferdig, trykker du på OK.
MERK: Segmentering må gjøres for alle bilder. - Velg et lite område der det intensitetsbaserte bildet av en C. elegans vises (Figur 1, Piler 1). Forfallkurven i denne regionen vises i det store forfallsvinduet på høyre side av grensesnittet (Figur 1, Pil 2).
MERK: Forfallet kan vises lineært eller logarittisk. - Angi de riktige parametrene for å ekstrapolere levetiden via programvarens algoritme som beskrevet i trinn 6.5-6.8.
- I kategorien Data (Figur 1, Pil 3):
- Angi en vilkårlig integrert minimumsverdi for å utelate eventuelle piksler som er for svake til å gi en god passform. Avhengig av C. elegans prøven varierer denne verdien fra 40-300. Skriv inn forskjellige verdier til en tilfredsstillende forhåndsvisning er oppnådd.
- Velg et Time Min- og Time Max-nummer for å begrense FLIM-signalet til disse verdiene. Alle hendelser som vises før og etter denne terskelen, vil bli ekskludert.
MERK: For eksempel, for analyse av mRFP, ble hendelsene før 800 ps og etter 4000 ps ekskludert. Disse verdiene avhenger av levetiden til fluoroforen og må bestemmes av sluttbrukeren. - Ikke endre de forhåndsinnstilte antallene/fotoonene på 1.
- Skriv inn repetisjonsfrekvensen, i MHz, av laseren som brukes under oppkjøpet.
MERK: For gjeldende protokoll ble forskjellige lasere benyttet med ulike repetisjonshastigheter. De to fotonlaseren som brukes til oppkjøp av CFP-levetider har en repetisjonshastighet på 80 MHz, for YFP laseren gjentar på 40 MHz, og for mRFP er verdien 78,01 MHz. Disse verdiene ble puttet inn i FLIMfit i henhold til prøven analysert. - Skriv inn en Gate Max-verdi for å utelate alle mettede piksler.
MERK: For livstidsmålinger i C. eleganser denne verdien satt til et hvilket som helst stort tall (f.eks. 1 x 108).
- I kategorien Levetid velger du en global tilpasning som skal brukes (f.eks. en pikselmessig tilpasning). Se figur 1, pil 4.
MERK: En pixel-klok tilpasning vil gi et forfall montert på hver enkelt piksel. En bildemessig tilpasning vil gi en global tilpasning av hvert enkelt bilde og vise en enkelt livstidsverdi per bilde. En global-klok tilpasning vil produsere en enkelt tilpasning over hele datasettet. En enkelt levetidsverdi er gitt for alle bilder. - Ikke endre noen annen parameter, bortsett fra nr. Exp utvalg hvis det er kjent at den valgte fluorescens forfall er multieksponentiell og viser mer enn en enkelt levetid.
MERK: I den nåværende protokollen ble denne funksjonen benyttet til å beregne levetiden til biexponential CFP fluorophore. - Last opp IRF via IRF-menyen: IRF | Last iRF. Hvis du vil anslå IRF-skiftet, velger du IRF | Estimat IRF Shift. Et sett med verdier vises automatisk i kategorien IRF. Når dette er opprettet, må du ikke endre andre parametere i denne kategorien.
- Når alle parametrene er angitt, trykker du på Tilpass datasett (Figur 1, Pil 5). Algoritmen vil gi en passform for forfallkurven og etablere en livstidsverdi for hvert bilde.
MERK: Den resulterende passformen, uthevet i en blå linje, bør overlappe med alle hendelsene. En god passform oppnås når alle arrangementer er justert langs passformen. - Klikk kategorien Parametere (Figur 1, Pil 6), som ligger i menyene øverst til høyre i programvarens grensesnitt, og velg Statistikk: w_mean (vektet gjennomsnitt) og kontroller at chi2-verdien er så nær som mulig til 1.
MERK: En chi2 nær en sikrer nøyaktigheten av passformen. Levetidsverdien for det valgte bildet blir dermed avslørt som tau_1. - Eksportere all informasjon av interesse: Fil | Eksporter intensitetsbilder/fit resultattabell/bilder/histogrammer. Lagre datainnstillingene som brukes til å beregne levetiden: Fil | Lagre datainnstillinger.
MERK: De ansatte parameterne lagres for fremtidig analyse av de valgte prøvene.
7. Grafiske fremstillinger av FLIM-data
MERK: Levetidene som samles inn fra ulike prøver, kan representeres visuelt på ulike måter. Velg for å angi livstidsverdiene enten i nanosekunder eller picosekunder.
- Vis kvaliteten på passformen og nøyaktigheten av kurven ved å eksportere forfallskurvekurven direkte fra FLIMfit.
- Representer fordelingen av fotonene ved å plotte frekvensen av fotontellingen kontra livstidsverdien i et histogrammet.
- Til slutt, for statistisk sammenligning, hvis du sammenligner to eller flere prøver, plasser livstidsverdier pluss standardavvik av gjennomsnittet i en scatter plot bar graf. Utfør ønsket statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen viser hvordan man nøyaktig overvåker dannelsen av aggregerte arter i levende C. elegans, både under sin naturlige aldring og når de utsettes for stress. Vi valgte fire forskjellige stammer av transgene nematoder som uttrykker polyglutaminproteiner på enten 40Q, 44Q eller 85Q repetisjoner. Disse proteinene syntetiseres i forskjellige vev og ble smeltet sammen til forskjellige fluoroforer. C. elegans stammer enten uttrykt Q40-mRFP i kroppen veggen muskler (mQ40-RFP), Q40-CFP i nervesystemet (nQ40-CFP), og enten Q44-YFP eller Q85-YFP i tarmen (iQ44-YFP og iQ85-YFP)13. For å illustrere hvordan aldring fremmer aggregering, samlet vi levetiden til disse polyQ-stammene i unge nematoder, på dag 4 av livet, og gamle nematoder, på dag 8. For å vise effekten av en mangel i PN, utførte vi en knockdown av hsp-1 i mQ40-RFP og nQ40-stammene.
Når levetidsverdiene ble ekstrapolert via FLIMfit-programvaren, viste de innsamlede dataene en klar reduksjon i levetiden til noen av polyQ-konstruksjonene når de aggregeres på grunn av enten glutaminbelastning, aldring eller stress. FLIM skilte mellom den oppløselige proteinfraksjonen og aggregerte arten, og deres overgang, ved å registrere et skifte i livet.
På dag 4 viste mQ40-RFP en gjennomsnittlig fluorescenslevetid på 1,69 ns (figur 2). Ved aldring oppsto mer aggregerte arter, som vises som lav levetid foci i levetidsbildene og skiftet histogrammet til redusert levetid (figur 2A). Ved å plotte gjennomsnittlig fluorescens levetid for hvert ervervet bilde over nematodenes alder, ble en betydelig reduksjon av fluorescens levetid, og derfor akkumulering av aggregerte arter, synlig (Figur 2B). Proteinfoldekapasiteten til PN falt etter dag 4 av livet i C. elegans14 og aggregeringsutsatte proteiner ytterligere feilbrettet for å klynge seg inn i amyloid og amorfe aggregater. Bortsett fra PN spilte den indre aggregasjonstilbøyeligheten til et bestemt protein en viktig rolle i utviklingen av aggregering. Dette ble analysert ved å sammenligne virkemåten til iQ44-YFP og iQ85-YFP. Den lengre Q-strekningen av iQ85 var mer utsatt for aggregering og viste en fluorescens levetid skift i histogrammet allerede på dag 4 av livet (Figur 3A). Faktisk, på dag 4, foci formasjon ble observert for iQ85, mens fortsatt fraværende i iQ44. Ved aldring viste imidlertid iQ44 også foci-dannelse og dermed redusert fluorescenslevetid. Fordi iQ85 allerede utstilt aggregater i tidlig voksen alder, var utviklingen av aggregering ved aldring mindre uttalt, men signifikant (figur 3B). Til slutt oppdaget vi ikke foci-dannelse eller redusert fluorescenslevetid i nQ40-CFP-stammen (figur 4A). For denne belastningen var det bare subtile, ubetydelige endringer i gjennomsnittlig fluorescens levetid ved aldring (Figur 4B), potensielt på grunn av at nevronene var mindre utsatt for ennå ukjente grunner.
Å slå ned hsp-1 utgjør en utfordring for PN av mQ40 og nQ40 som uttrykker nematoder. RNAi-mediert uttømming av hsp-1 førte til en betydelig økning i aggregering (figur 5 og figur 6). Q40 uttrykt i kroppen vegg muskler tendens til å danne et lite antall store foci omgitt av ikke-aggregert materiale. Dette resulterte i to fremstående topper i histogrammene (rundt 1,7 ns og 1,4 ns, se figur 5A). De eldre og RNAi-behandlede nematodene viste en sterk økning i lavlevetidstoppen som til slutt reduserte gjennomsnittlig fluorescenslevetid (figur 5B). Sammenlignet med denne bifasiske oppførselen til Q40 i muskler, viste den nevronale Q40 en mer variert aggregeringsatferd. Vi kunne ikke direkte korrelere foci dannelse med aggregering som i muskeluttrykk belastning (Figur 6A). Fordi FLIM gir en mulighet til å vurdere graden av aggregering, avslørte histogrammene at det ikke var noen distinkt topp, men en utbredt fordeling av fluorescenslevetid, og peker på en kompleks sammensetning av forskjellige oligomere og høyere ordreaggregater. Likevel kan den totale graden av aggregering evalueres ved å plotte gjennomsnittlig fluorescenslevetid (figur 6B), som viser at hsp-1 knockdown førte til et løft i aggregering.
Det er viktig å merke seg at levetiden til fluoroforene, fri for en fusjonspartner og utenfor et biologisk system, var høyere. Fordi levetiden hovedsakelig påvirkes av miljøet, var en liten reduksjon av levetiden til YFP og RFP allerede merkbar i C. elegans vev. Det er derfor viktig å oppnå levetiden til det oppløselige INTERESSEPUNKTET i nematoden som en egnet kontroll. En sammenligning mellom den oppløselige fraksjonen med høyere levetid og aggregert brøkdel med lavere levetid kan deretter gjøres. Her korrelerte nedgangen i levetid med dannelsen av synlige foci i muskel- og tarmcellene. Likevel viste en brøkdel av foci ingen reduksjon av fluorescens levetid (se figur 2 og figur 3,hvite piler). Denne funksjonen fremhever hvordan bare en del av fusjonskonstruksjonen kan aggregeres på et bestemt spatiotemporal punkt, og tilstedeværelsen og tilgjengeligheten av ubundet protein. Et mer komplekst scenario oppsto fra undersøkelse av den nevronale Q40-CFP-stammen. CFP har i seg selv to forskjellige fluorescenslevetider. Mens CFP er en ideell fluorophore for Förster resonans energioverføring (FRET)15 målinger, i forbindelse med YFP, er det ikke tilrådelig å bruke den til å overvåke dannelsen av aggregater i C. elegans.
Figur 1: Skjermbilde av FLIMFit programvaregrensesnitt. Skjermbilde av programvaren som brukes til å beregne fluorescenslevetiden. Vinduet viser grensesnittet etter at innstillingene ble definert som beskrevet i teksten, og beregning av levetidble utført. Nummererte piler refererer til bestemte trinn i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fluorescenslevetid en muskel Q40-RFP redusert med alderen. (A) Representative kart over C. elegans uttrykker muskuløs Q40-RFP på dag 4 eller dag 8 av livet generert av FLIMfit. Fluorescens levetid, fluorescensintensitet og et sammenslått bilde av begge er gitt. Skala barer = 25 μm. Histogrammer viser en fordeling av måltlevetid for alle analyserte nematoder delt inn i 100 kategorier. (B) Bar tomter som viser vektet gjennomsnittlig fluorescens levetid for alle analyserte dyr på dag 4 eller dag 8 av livet, henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fluorescenslevetid for intestinal Q44-YFP og intestinal Q85-YFP redusert med alderen. (A) Representative kart over C. elegans uttrykker intestinal Q44-YFP eller intestinal Q85-YFP på dag 4 eller dag 8 av livet generert av FLIMfit. Fluorescens levetid, fluorescensintensitet og et sammenslått bilde av begge er gitt. Skala barer = 25 μm. Histogrammer viser en fordeling av måltlevetid for alle analyserte nematoder delt inn i 100 kategorier. (B) Bar tomter som viser vektet gjennomsnittlig fluorescens levetid for alle analyserte dyr på dag 4 eller dag 8 av livet, henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fluorescenslevetid en nevronal Q40-CFP endret seg ikke med alderen. (A) Representative kart over C. elegans uttrykker nevronal Q40-CFP på dag 4 eller dag 8 av livet generert av FLIMfit. Fluorescens levetid, fluorescensintensitet og et sammenslått bilde av begge er gitt (den andre levetiden, τ2, er angitt i alle prøver). Skala barer = 25 μm. Histogrammer viser en fordeling av måltlevetid for alle analyserte nematoder delt inn i 100 kategorier. (B) Bar tomter som viser vektet gjennomsnittlig fluorescens levetid for alle analyserte dyr på dag 4 eller dag 8 av livet, henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fluorescenslevetid en muskel Q40-RFP redusert ved nedslåing av hsp-1. (A) Representative kart over C. elegans uttrykker muskuløs Q40-RFP på dag 4 eller dag 8 av livet generert av FLIMfit. En sammenslåing av fluorescenslevetiden og intensitetskartet vises. For begge tidspunktene vises nematoder som vokste på bakterier som uttrykker en tom vektor (kontroll) eller bakterier som uttrykker hsp-1 RNAi-konstruksjonen. Skala barer = 25 μm. Histogrammer viser en fordeling av måltlevetid for alle analyserte nematoder delt inn i 100 kategorier. (B) Bar tomter som viser vektet gjennomsnittlig fluorescens levetid for alle analyserte dyr på dag 4 eller dag 8 av livet, med kontroll eller hsp-1 RNAi, henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Fluorescens levetid en nevronal Q40-CFP redusert ved nedslåing av hsp-1. (A) Representative kart over C. elegans uttrykker nevronal Q40-CFP på dag 4 av livet generert av FLIMfit. En sammenslåing av fluorescenslevetiden og intensitetskartet vises. Nematoder vist ble dyrket på bakterier som uttrykker en tom vektor (kontroll) eller bakterier som uttrykker hsp-1 RNAi-konstruksjonen. Skala barer = 25 μm. Histogrammer viser en fordeling av måltlevetid for alle analyserte nematoder delt inn i 100 kategorier. (B) Bar tomter som viser vektet gjennomsnittlig fluorescens levetid for alle analyserte dyr på dag 4, med kontroll RNAi eller hsp-1 RNAi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som presenteres her beskriver en mikroskopibasert teknikk for å identifisere aggregerte arter i C. elegans modellsystem. FLIM kan nøyaktig karakterisere tilstedeværelsen av både aggregerte og oppløselige arter smeltet til en fluorophore via måling av deres fluorescens levetid forfall. Når et fusjonsprotein begynner å aggregere sin registrerte gjennomsnittlige levetid vil skifte fra en høyere til en lavere verdi16. Tilbøyeligheten til aggregering kan deretter utledes av fallet i levetiden: jo lavere levetid, jo høyere tilstedeværelse av aggregerte proteinarter i systemet. Dermed blir det mulig å følge effekten av aldring, sykdom eller svekkelse av PN på aggregasjonstilbøyeligheten til noe protein.
For å fremheve allsidigheten til teknikken, viste våre resultater tydelig at FLIM kunne identifisere endringene i strukturen til de ulike polyQ-konstruksjonene, uavhengig av vev eller fluorofan. Viktigere, FLIM har allerede blitt brukt i karakterisering av andre aggregeringsutsatte proteiner innen C. elegans, for eksempel α-synuclein17. Videre blir det mulig å bruke noen stressfaktor til C. elegans og følge utfoldelse og aggregering av eventuelle POI. Osmotisk, metall-ion, redox, eller kjemisk stress kan alle fremme giftige ubalanser som kan overvåkes i C. elegans ansette FLIM. Det motsatte kan også være mulig: en forsinkelse i aggregering eller til og med disaggregering på grunn av tilstedeværelsen av gunstige forbindelser eller styrking av PN, kan resultere i en redning av proteinet og en påfølgende levetidøkning.
FLIM har vært mye ansatt for å overvåke endringer i levetiden til ethvert stoff i et bredt spekter av disipliner fra kjemi til kreftbiologi18 til medisinsk diagnostikk, men noen begrensninger gjenstår. Et hovedproblem er fotostabiliteten til fluoroforer. Fordi FLIM krever opptak av et stort antall fotoner, reduserer fotobleking antall fotoner som samles inn og kan endre den resulterende forfallkurven. Videre, spesielt innenfor nematodesystemet, hvis intensiteten av fluoroforen i seg selv ikke er tilstrekkelig høy for at nok fotoner skal samles inn, er det nødvendig med en høyere eksitasjon, noe som fører til raskere fotobleking og en upålitelig forfallskurve. Til slutt krever teknikken sofistikert og kostbart utstyr som tillegg til eksisterende mikroskopisystemer, med ett kritisk element som følsomheten til detektorene19.
Omvendt er en av de viktigste fordelene ved å beregne levetiden til en fluorophore og fusjonsproteinatet at det gir informasjon om forskjellige fraksjoner av samme fluorofor-proteinkompleks i ulike tilstander av interaksjoner i miljøet, uavhengig av den si stort sett ukjente konsentrasjonen. FLIM kan også brukes til å måle levetid i en hvilken som helst fase, gass, væske eller fast og i ethvilket som helst medium eller organisme som normalt kan avbildet, fra celler til organismer, og organeller til immobiliserte, rensede proteiner20. Mikroskopiteknikker er vanligvis avhengige av steady-state avbildning av et fluorescerende merket protein. I motsetning til stabile tilstandsteknikker kan FLIM løse endringer i binding, sammensetning og konformasjon av et biologisk substrat. For å undersøke aggregeringsutsatte proteiner kan tilstedeværelsen av store fluorescerende inneslutninger eller foci enkelt avbildes, men disse representerer bare et statisk, intensitetsbasert øyeblikksbilde3. I tilfelle av aggregerte arter kan det visualiserte foci også være misvisende, da en høy konsentrasjon av fluoroforfor ikke nødvendigvis resulterer i sterk amyloiddannelse. Via FLIM er det i stedet mulig å skille løselig fra uoppløselig materiale. Til slutt blir det gunstig for enhver undersøkelse å oppnå både intensitetsbaserte målinger og parallell livstidsmåling. Innenfor komplementariteten av disse mikroskopiteknikkene ligger deres styrke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Muskel-Q40-mRFP-stammen levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Den nevronale-Q40-CFP var en snill gave av Morimoto Lab. Vi anerkjenner DFG (KI-1988/5-1 til JK, NeuroCure PhD-fellesskap av NeuroCure Cluster of Excellence til MLP), EMBO (Kortsiktig fellesskap til MLP) og Biologselskapet (reisetilskudd til CG og MLP) for finansiering. Vi anerkjenner også Advanced Light Microscopy imaging anlegget ved Max Delbrück Centre for Molecular Medicine, Berlin, for å gi oppsettet for å bilde YFP-konstruksjonene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58 (2016).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer US. New York, NY. (2006).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
- Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
- Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
- Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687 (2013).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
- Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
- Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
- Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
- Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
- Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).
