Summary
Palmitoylation geri dönüşümlü bir şekilde hedef proteinlerin sistein artıkları için 16 karbon palmitate moiety dahil gerektirir. Burada, fare beyin lysates ilgi herhangi bir protein palmitoylation durumunu araştırmak için, bir biyokimyasal yaklaşım, asil-PEGyl değişim jel vardiya (APEGS) tsay açıklar.
Abstract
Postsinaptik yoğunluk (PSD) içindeki sinaptik AMPA reseptörlerinin (AMPA) düzeylerindeki aktiviteye bağlı değişikliklerin öğrenme ve hafıza için hücresel bir mekanizmayı temsil olduğu düşünülmektedir. Palmitoylation ampa-Rs, yardımcı faktörler ve sinaptik iskeleler gibi birçok sinaptik proteinin lokalizasyonunu ve işlevini aktiviteye bağlı bir şekilde düzenler. AMPA'larla ilişki içinde olan ve sinaps gücünü düzenleyen, beyne özgü transmembran proteinlerini kodlayan dört genden oluşan sinaps farklılaşma (SynDIG) ailesini (SynDIG1-4) belirledik. SynDIG1, aktiviteye bağlı eksitatory sinaps gelişimi için önemli olan yan yana-transmembran bölgesinde 191 ve 192 pozisyonlarında bulunan iki sistein kalıntısında palmitoylatedtir. Burada, yenilikçi bir biyokimyasal yaklaşım tanımlamak, asil-PEGyl değişim jel shift (APEGS) tsay, ilgi herhangi bir protein palmitoylation durumunu araştırmak ve fare beyin lysates proteinlerin SynDIG ailesi ile yarar göstermek için.
Introduction
S-palmitoylation kararlı membran ilişkisi, protein ticareti ve protein-proteinetkileşimleridüzenleyen hedef proteinlerin geri dönüşümlü post-çevirisel modifikasyon 1. Palmitoyl acyltransferaz (PAT) enzimleri tarafından katalize edilen tiyoester bağlantısı ile sistein kalıntılarına 16 karbonlu palmitat moiety eklenmesini içerir. Beyindeki birçok sinaptik proteinler palmitoylated, AMPA-Rs ve PSD-95 dahil, bir aktiviteye bağlı bir şekilde istikrar düzenlemek için, lokalizasyon, ve fonksiyon2,3,4. PSD-95 gibi sinaptik silikatüritlik ile yardımcı faktörlerin etkileşimi yoluyla PSD sinaptik AMPAR düzeylerinde değişiklikler sinaptik plastisite altında; böylece sinaptik proteinlerin palmitoylation durumunu belirleme yöntemleri sinaptik plastisite mekanizmalarına önemli bir bakış açısı sağlar.
Daha önce,ampaper5 ile ilişkilendirmek beyin özgü transmembran proteinleri kodlama dört gen (SynDIG1-4) SynDIG aile tespit . Aşırı ekspresyon veya parçalanmış sıçan hipokampal nöronlar SynDIG1 knock-down artar veya azalır, sırasıyla, AMPA-R sinaps boyutu ve sayısı ~ 50% olarak immünositokimya ve elektrofizyoloji kullanılarak tespit5. Biz syndig1 iki korunmuş yan yana transmembran Cys kalıntılar (tüm SynDIG proteinlerde bulunan) bir aktiviteye bağlı bir şekilde istikrar, lokalizasyon ve fonksiyon6düzenlemek için palmitoylated olduğunu göstermek için acyl-biotin değişimi (ABE) tsay kullanılmıştır. ABE tsay modifikasyon ve sonraki yakınlık saflaştırma7tarafından korunan sistein biotin değişimi dayanır. Burada, yenilikçi bir biyokimyasal yaklaşım tanımlamak, acyl-PEGyl döviz jel vardiya (APEGS) tsay8,9,10,11,12,hangi yakınlık arınma gerektirmez ve bunun yerine ilgi bir protein için modifikasyon sayısını belirlemek için jel hareketlilik değişiklikleri kullanır. Protokol, fare beyninden gelen ve uygun antikorların bulunduğu endojen membran proteinlerinin araştırılması için tanımlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından belirlenen yönergeleri takip ve California Üniversitesi, Davis Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Fare beyin zarlarının hazırlanması
- Bir giyotin aparatı kullanarak fareyi decapitate ve hızlı bir şekilde beyin dışarı diseksiyon (in <1 dk, mümkünse, diseksiyon işlemi sırasında oluşabilir palmitoylation değişiklikleri en aza indirmek için). 10 mL'lik homojenizasyon tamponu(Tablo 1)içinde bir cam homogenizer (~12 vuruş) buz üzerinde hemen homojenleştirin.
- Santrifüj 15 dk 1.400 x g 4 °C'de. Supernatant'ı buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 710 x g'de eşit homojenizasyon tamponu ve santrifüj hacminde peleti (~6 vuruş) yeniden askıya alın.
- 4 °C'de 20 dakika boyunca 40.000 x g'de 1.2 adımve santrifüjdeki süpernatanları birleştirin.
- Supernatant atın (sitosolik fraksiyonu) ve homojenizasyon tampon peletli membran (P2) fraksiyonu resuspend.
NOT: Numuneler daha sonra kullanılmak üzere -80 °C'de dondurulabilir ve saklanabilir. - Protein düzeylerini quantitate için bir bicinchoninic asit (BCA) tsay gerçekleştirin. APEGS ttübünü 1,5 mL'lik bir tüpte 470 μL tampon A(Tablo 1)hacminde ~100−200 mg protein (maksimum 250 mg) ile başlayın. İzole ve santrifüj >13.000 x g 10 dk 25 °C'de çözünmez proteini çıkarmak için. Çözünen proteini yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
2. Acyl-PEGyl değişim jel-shift (APEGS) teşp
- Disülfür bağlarını bozun ve serbest sisteinları engelleyin.
- 25 mM tris (2-karboksitil)fosfin (TCEP; 25 μL, bir stok çözeltisinden eklenen) kuluçkaya yatarak disülfür bağlarını bozar; Tablo 1) 55 °C'de 60 dk.
- 50 mM N-etilmaleimid (NEM; 12.5 μL, bir stok çözeltisinden eklenen) bloksuz sisteinlar; Tablo 1) 3 saat oda sıcaklığında.
NOT: Reaksiyon bir gecede uzatılabilir.
- Kloroform metanol (CM) yağış gerçekleştirin.
- Protein çözeltisini 1,5 mL'lik tüpten, sallanan kova rotorunda mütevazı bir hızda santrifüj edilebilen polipropilen veya cam tüpe aktarın. 5 mL'lik bir tüp idealdir. Dört cilt (2 mL) metanol (MeOH) ve girdap kısaca ekleyin.
- Kloroform ve girdap kısa bir süre iki cilt (1 mL) ekleyin.
- Üç cilt (1,5 mL) dH2O ve girdap kısaca ekleyin.
- Numuneleri 3.000 x g'de 25 °C'de 30 dk'da sallanan bir kova rotoruile santrifüj edin.
- Üst fazı dikkatlice çıkarın ve atın.
- MeOH 3 cilt (1,5 mL) ekleyin ve opak protein gözleme parçalamak için dikkatli olmak, hafifçe ama iyice karıştırın.
- 3.000 x g'de 25 °C'de sallanan bir kova rotorunda 10 dakika boyunca santrifüj.
- Bir cam serolojik pipet kullanarak, protein gözleme rahatsız etmeden mümkün olduğunca üst faz ın çok çıkarın.
- Peleti 1 mL MeOH ile dikkatlice durula.
- Hava en az 10 dakika pelet kuru.
NOT: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir.
- Palmitoyl-tiyoester bağlantılarının hidroksilin (NH2OH, HAM) bölünmesini gerçekleştirin.
- Resuspend protein ankesür 125 μL tampon A ve sonicate kısaca. Çözünmez malzemeyi çıkarmak için 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj. Çözünen proteini yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
- 375 μL arabellek H (HAM+; Tablo 1) veya tampon T (HAM-; Tablo 1) ve 25 °C'de 60 dk kuluçka numuneleri.
- Adım 2.2'de açıklanan CM yağışını tekrarlayın.
NOT: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir. - Korumasız sisteinlara mPEG ekleyin.
- 10 mM TCEP içeren arabellek A 100 μL resuspend pelet. 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
NOT: CM yağış basamakları sırasında önemli miktarda protein kaybı nın meydana gelmiş olması normaldir. Sonraki tüm adımlar 1,5 mL'lik bir tüpte gerçekleştirilecektir ve protein hacmi maksimum ~120−130 μL'ye kadar kısıtlanacaktır. Bu son CM yağış sırasında protein kaybını azaltacaktır. - 20 mM mPEG-5k ekleyin (25 μL, bir stok çözeltisinden eklendi; Tablo 1) protein numunesi ve pipetleme ile karıştırın. 25 °C'de 60 dakika boyunca inkübün ve uç abitrotasyon.
- Dahil edilmemiş mPEG-5k'yi kaldırmak için, bu ayarlanmış hacimleri kullanarak adım 2.2'de açıklandığı gibi CM çökeltme gerçekleştirin: 4 birim MeOH (500 μL), 2 birim kloroform (250°L) ve 3 cilt dH2O (375°L). 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj.
- Kalın, flocculent gözleme kaçınarak, daha önce olduğu gibi dikkatle üst faz kaldırın. MeOH 1 mL ekleyin ve yavaşça ama iyice karıştırın. 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj.
- Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve 1 mL MeOH ile peleti durula. 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj. Hava kuru pelet.
NOT: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir. - Kurutulmuş peleti 50 μL tampon A'da yeniden askıya alın (TCEP veya herhangi bir azaltma maddesi olmadan). BCA protein niceliği için 5 μL ayırın. Sayısallaştırmadan sonra, uygun miktarda 4x Laemmli numune tamponu ekleyin ve ilgi proteinine bağlı olarak numuneyi 10 dakika boyunca 70−100 °C'ye ısıtın.
NOT: Kaynama bazı membran proteinlerinin toplanmasına neden olabilir.
- 10 mM TCEP içeren arabellek A 100 μL resuspend pelet. 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
3. PEGylated proteinlerin Batı leke analizi
- Numuneyi sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezine (SDS-PAGE) yükleyin13.
NOT: Bu protokolde %10 poliakrilamid kullanılmıştır. - Batı lekeleme14için standart ayırma, aktarım ve algılama protokolleri kullanın.
- Pegylated ve nonPEGylated proteinlerin göreceli miktarlarını belirlemek için densitometri14 kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlgi proteinine karşı antikorlarla immünoblotlama, HAM'in dahil olmadığı örneklere kıyasla hareket kabiliyetine göre fare beynindeki palmitoylated durumunu (non, tek başına, iki kat, vb.) ortaya çıkarır. Daha önce, SynDIG1'in ABE tsay6kullanarak iki yerde palmitoylated olduğunu göstermiştik; Ancak her iki sitenin de beyin dokusunda modifiye edilip edilmediği belirlenemedi. Burada SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 ve Prrt2'nin fare beyninde palmitoylat olduğunu ve iki potansiyel palmitoylation bölgelerine sahip olduklarını gösteriyoruz(Şekil 1). İlginçtir, her protein fare beyninde olmayan için sinyaldayalı farklı bir palmitoylation durumu vardır, tek başına ve iki kat palmitoylated protein. Lekelerin densitometri analizi palmitoylated durum hakkında nicel bilgi sağlar.
Şekil 1: Fare zarı preparatlarında PEGylated protein türlerinin saptanması. Fare beyinleri hızla kesildi ve hemen homojenize edildi. P2 membran fraksiyonları bu protokolde açıklandığı gibi APEGs testine tabi tutulmuştur. Bu deneyde doğum sonrası gün 18 (P18) %10 SDS-PAGE jeli kullanılarak ayrılmış ve syndig1 (SD1), Prrt2 ve SynDIG4 (SD4) karşı antikorlarla incelenmiştir. Semboller palmitoylated olmayan proteini gösterir (•), palmitoylated tek il (*), ya da iki kat (**). HAM (-) koşullarında soluk bantların varlığı ya disülfür bağlarının eksik azaldığını ya da NEM tarafından serbest sisteinların eksik tıkandığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Arabellek | Bileşen | Çalışma eksi. | Yorum |
| Homojenizasyon | 0,32 M sakaroz, 1 mM Tris pH 7,2, 1 mM MgCl2 | Kullanmadan hemen önce PMSF ve proteaz inhibitörleri ekleyin. | |
| Arabellek A | PBS pH 7.2, 5 mM EDTA, %4 SDS (w/v) | Kullanmadan hemen önce PMSF ve proteaz inhibitörleri ekleyin. | |
| TCEP çözümü | ddH2O'da 500 mM TCEP (pH 7.2) | 25mm | pH'ı artırmak için 10 N NaOH ekleyin. |
| NEM çözümü | %100 etanolde 2.0 M NEM | 50 mM | Taze hazırlanın. |
| Tampon H (HAM+) | 1.33 M HAM, pH 7.0, 5 mM EDTA, %0.2 Triton X-100 (w/v) | 1.0 M | Taze hazırlanın. |
| Tampon T (HAM-) | 1.33 M Tris-HCl, pH 7.0, 5 mM EDTA, %0.2 Triton X-100 (w/v) | ||
| mPEG-5k | 100 mM mPEG-5k ddH2O | 20 mM | İyi bir şekilde karıştırın. Çok viskoz. |
Tablo 1: APEGS tarar için kullanılan çözümler. Homojenizasyon tamponu ve tampon A önceden hazırlanabilir; ancak, proteaz inhibitörleri ve fenilmetilsülfonil florür ekleyin (PMSF) hemen kullanmadan önce. Diğer tüm çözümler taze olarak hazırlanmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önceki çalışmamızda, SynDIG1'in stabiliteyi, lokalizasyonu ve fonksiyon6'yıdüzenlemek için aktiviteye bağımlı bir şekilde iki korunmuş yan yana transmembran Kis kalıntısı (tüm SynDIG proteinlerinde bulunan) palmitoylated olduğunu göstermek için ABE tsayını kullandık. Bir sınırlama ABE tahlil avidin moieties prosedürün son adım olarak konjuge agarose reçine ile yakınlık arınma gerektirir, kantitatif analiz karmaşık sinyal önemli kaybına neden. Ayrıca, ABE tsay bir protein palmitoylated bir kez veya birden fazla sitede olup olmadığını ayırt edemez.
Burada APEGS tsay8,9,10,11,12 AMPAR yardımcı transmembran proteinleri SynDIG1 ve ilgili proteinler SynDIG4 (prrt1 olarak da bilinir) ve Prrt2 fare beyin özleri palmitoylation durumunu belirlemek için kullanın;12 ancak, titretbatı lekeleme için uygun yüksek kaliteli ve spesifik antikor mevcut olan herhangi bir membran protein uygulanabilir. Biz SynDIG115 ve SynDIG416karşı antikorlar için göstermiştir gibi vahşi tip (WT) ve nakavt (KO) fareler beyin zarlarının kullanımı antikor özgüllüğü için ideal bir kontrol sağlar. APEGS titresinin WT ve KO farelerin beyin lysates ile gerçekleştirilmesi bu yöntemde antikor özgüllüğü için önemli bir kontrol sağlar. Bu yöntem, ilgi proteininin hücre altı lokalizasyonunu araştırmak için APEGS tpatının ardından diferansiyel santrifüj yoluyla elde edilen farklı membran fraksiyonlarına da uygulanabilir.
APEGS tetkisinin kritik adımlarından biri cm yağışlarıdır, amacı kimyasalları (NEM ve HAM) sonraki aşağı reaksiyonlara müdahale den kaldırmaktır. 1,5 mL'lik bir tüpte CM çökeltisi yapmak mümkün olsa da, daha büyük tüplerin ve hacimlerin kullanımı daha uygun sonuçlar verilmelidir. Aynı zamanda, kısmen birden fazla CM yağışnedeniyle, bir başından sonuna kadar protein önemli bir kayıp bekleyebilirsiniz. Bu eksi ve artı HAM koşullarında toplam protein düzeylerinde belirgin değişkenlik neden olabilir.
Şekil 1'degösterildiği gibi, mPEG-5k (5 kDa) eklenmesi mutlaka bir immünoblot üzerinde doğrusal bir kayma üretmek değildir. Bu birden fazla sitede palmitoylated proteinlerin çözümünde avantajları olabilir. Ayrıca, HAM negatif koşullarda hareketlilik kayması yerlerde bantların varlığı ya disülfür bağları eksik bir azalma ya da NEM tarafından serbest sistein eksik tıkanıklık gösterir. Alternatif olarak, HAM negatif durumunda belirgin kaymış bantlar belirli bir protein içinde serbest sistein blok zor olduğunu gösterebilir. Bu nedenle, toplam proteinin sadece küçük bir yüzdesi SynDIG1, SynDIG4 ve Prrt2'nin aksine proteinin çoğunluğunun tek ilolarak veya iki kat palmitoylated olduğu durumlarda, blokaj adımının ek optimizasyonu gerekebilir (Şekil 1).
Bu yöntem fare beyin lysates ile sınırlı değildir. Örneğin, bu yöntem psd-95 heterolog hücrelerde ifade edilen depalmitoylating enzimleri için tarama için kullanılmıştır9. Heterolog hücrelerde proteinlerin ekspresyonu da site yönelimli mutagenez yoluyla modifikasyon tam site belirlenmesi için izin verir. Bu yöntem aynı zamanda sinaptik sinatik siskele AKAP150 sinaptik plastisite17,,18, nöroloji geniş bir uygulama gösteren rolünü bilgilendirdi.
Bu apegs tsay 16-karbon palmitate moieties özel olmadığını belirtmek önemlidir, çünkü test mPEG tarafından dekolte ve değiştirme tabi diğer uzun zincirli yağ asil bağlantıları tespit edecek. Palmitat modifikasyonu kesin olarak kurmak için tritiated palmitate ile metabolik etiketleme gibi ek deney gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar tavsiye ve APEGS tayini üzerinde giriş için K. Woolfrey teşekkür ederim. Bu çalışmalar, Whitehall Vakfı ve NIH-NIMH'den (1R01MH119347) E.D.'ye yapılan araştırma hibeleri ile finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
