Summary
המתואר כאן הוא פרוטוקול לקביעת ארבעה מטבוליטים שונים טריפטופן שנוצר במסלול קינורנין (קינורנין, 3-hydroxykynurenine, חומצה xanthurenic, 3-hydroxyanthranilic חומצה) במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים נותחו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית יחד עם ספקטרומטריית מסה מרובעת אחת.
Abstract
מסלול הקינורנין וקטבוליטים טריפטופן בשם kynurenines קיבלו תשומת לב מוגברת למעורבותם בוויסות המערכת החיסונית וביולוגיה של סרטן. מבחני תרבות תאים במבחנה משמש לעתים קרובות כדי ללמוד על תרומתם של קטבוליטים טריפטופן שונים במנגנון המחלה לבדיקת אסטרטגיות טיפוליות. מדיום תרבות התא עשיר מטבוליטים מופרשים ומולקולות איתות משקף את המצב של חילוף החומרים טריפטופן ואירועים תאיים אחרים. פרוטוקולים חדשים לכימות אמין של קינורנינים מרובים במדיום תרבות התא המורכב רצויים לאפשר ניתוח אמין ומהיר של דגימות מרובות. זה יכול להתבצע עם כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה. טכניקה רבת עוצמה זו משמשת במעבדות קליניות ומחקריות רבות לכימות מטבוליטים וניתן להשתמש בה למדידת קינורנינים.
מוצג כאן הוא השימוש כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה quadrupole יחיד (LC-SQ) לקביעה בו זמנית של ארבעה קינורנינים, כלומר, קינורנין, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, וחומצה xanthurenic במדיום שנאסף תאים סרטניים בתרבית ויטרו. גלאי SQ הוא פשוט לשימוש ופחות יקר בהשוואה לספקטרומטרים מסה אחרים. בניתוח SQ-MS, יונים מרובים מהמדגם נוצרים ומופרדים בהתאם ליחס המסה לטעינה הספציפי שלהם (m/z), ואחריו הזיהוי באמצעות מצב ניטור יונים יחיד (SIM).
מאמר זה מושך את תשומת הלב על היתרונות של השיטה המדווחת ומציין כמה נקודות תורפה. הוא מתמקד באלמנטים קריטיים של ניתוח LC-SQ כולל הכנת מדגם יחד עם כרומטוגרפיה וניתוח ספקטרומטריית מסה. בקרת האיכות, תנאי כיול השיטה ובעיות אפקט המטריצה נדונים גם הם. תיארנו יישום פשוט של 3-nitrotyrosine כסטנדרט אנלוגי אחד עבור כל analytes היעד. כפי שאושר על ידי ניסויים עם השחלות האנושיות ותאי סרטן השד, שיטת LC-SQ המוצעת מייצרת תוצאות אמינות וניתן ליישם אותה עוד יותר על מודלים תאיים במבחנה אחרים.
Introduction
מסלול קינורנין (KP) הוא המסלול העיקרי של קטבוליזם טריפטופן (Trp) בתאים אנושיים. אינדולאמין-2,3-דיוקסיגנאז (IDO-1) בתאים אקסטרה-הפטיים הוא האנזים הראשון והמגביל של KP וממיר את Trp ל- N-formylkynurenine1. צעדים נוספים בתוך KP ליצור מטבוליטים משניים אחרים, כלומר kynurenines המציגים תכונות ביולוגיות שונות. קינורנין (Kyn) הוא קטבוליט Trp היציב הראשון המציג תכונות רעילות ומווסת אירועים תאיים לאחר קשירה לקולטן פחמימנים aryl (AhR)2. לאחר מכן, Kyn הופך למספר מולקולות באופן ספונטני או בתהליכים בתיווך אנזימים, ויוצר מטבוליטים כאלה כמו 3-hydroxykynurenine (3HKyn), חומצה אנתרנילית (AA), חומצה 3-הידרוקסיאנתרנית (3-HAA), חומצה קינורינית (Kyna) וחומצה קסנתרנית (XA). מטבוליט נוסף במורד הזרם, 2-אמינו-3-קרבוקסיקוניק חומצה-6-semialdehyde (ACMS), עובר מחזוריות לא אנזימטית לחומצה קינולינית (QA) או חומצה פיקולינית (PA)1. לבסוף, QA הופך עוד יותר nicotinamide-אדנין דינוקלאוטיד (NAD+)3, המטבוליט נקודת קצה KP כי הוא קופקטור אנזים חשוב. כמה kynurenines יש תכונות neuroprotective כגון Kyna ו- PA, בעוד האחרים, כלומר, 3HAA ו 3HKyn, הם רעילים4. חומצה Xanthurenic, אשר נוצר 3HKyn, מציג תכונות נוגדות חמצון vasorelaxation5. XA מצטבר בעדשות הזדקנות ומוביל אפופטוזיס של תאי אפיתל6. KP, המתואר באמצע המאה ה-20, זכה לתשומת לב רבה יותר כאשר מעורבותו בהפרעות שונות הודגם. פעילות מוגברת של מסלול מטבולי זה הצטברות של כמה kynurenines לווסת את התגובה החיסונית קשורים עם תנאים פתולוגיים שונים כגון דיכאון, סכיזופרניה, אנצפלופתיה, HIV, דמנציה, טרשת לרוחב amyotrophic, מלריה, אלצהיימר, מחלת הנטינגטון, וסרטן4,7. כמה שינויים בחילוף החומרים של Trp נצפו microenvironments הגידול ותאי סרטן2,8. יתר על כן, kynurenines נחשבים סמני מחלה מבטיחים9. במחקר סרטן, אין ויטרו מודלים תרבות התא מבוססים היטב בשימוש נרחב להערכה פרה-קלינית של תגובות תרופות נגד סרטן10. מטבוליטים Trp מופרשים על ידי תאים לתוך מדיום התרבות ניתן למדוד כדי להעריך את המצב של מסלול kynurenine. לכן, יש צורך לפתח שיטות מתאימות לגילוי בו זמנית של מטבוליטים KP רבים ככל האפשר במגוון של דגימות ביולוגיות עם פרוטוקול קל, גמיש ואמין.
במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לקביעה בו זמנית של ארבעה מטבוליטים מסלול קינורנין: Kyn, 3HKyn, 3HAA, ו XA על ידי LC-SQ במדיום שלאחר התרבות שנאסף מתאי סרטן. בגישה אנליטית מודרנית, כרומטוגרפיה נוזלית13,14,15,16 עדיפה על גילוי וכימות בו זמנית של קטבוליטים טריפטופן בודדים, בניגוד מבחנים ביוכימיים לא ספציפיים ניצול Ehrlich ריאגנט11,12. כיום, ישנן שיטות רבות הזמינות לקביעת קינורנינים בדגימות אנושיות, המבוססות בעיקר על כרומטוגרפיה נוזלית עם גלאי אולטרה סגול או פלואורסצנטי13,17,18,19. כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם גלאי ספקטרומטריית מסה (LC-MS) נראה מתאים יותר עבור סוג זה של ניתוח, בשל הרגישות הגבוהה שלהם (גבולות נמוכים יותר של גילוי), סלקטיביות וחזרתיות.
מטבוליטים Trp כבר נקבעו בסרום אנושי, פלזמה ושתן13,20,21,22,23, עם זאת, השיטות עבור דגימות ביולוגיות אחרות, כמו מדיום תרבות התא רצויים גם. בעבר, LC-MS שימש תרכובות נגזרות Trp במדיום שנאסף לאחר culturing של תאי גליומה אנושיים, מונוציטים, תאים דנדריטיים או אסטרוציטים שטופלו גמא אינטרפרון (IFN-γ)24,25,26. נכון לעכשיו, יש צורך בפרוטוקולים מאומתים חדשים שיכולים לאפשר הערכה של מספר מטבוליטים במדיות תרבות שונות, תאים וטיפולים המשמשים במודלים של סרטן.
מטרת השיטה המפותחת היא לכמת (בתוך ריצה אנליטית אחת) ארבעה קינורנינים עיקריים שיכולים להצביע על חריגות ב- KP. מוצגים להלן צעדים קריטיים של הפרוטוקול שפורסם לאחרונה שלנו לניתוח כמותי LC-SQ של קינורנינים משמעותיים נבחרים באמצעות תקן פנימי אחד (3-nitrotyrosine, 3NT) במדיום שנאסף מתאי סרטן אנושיים בתרבית במבחנה 27. למיטב ידיעתנו, זהו פרוטוקול LC-SQ הראשון לכימות בו זמנית של 3HKyn, 3HAA, Kyn ו- XA במדיום תרבות המתקבל מהתאים הגדלים במבחנה. על כמה שינויים, השיטה עשויה להיות מיושמת עוד יותר כדי ללמוד את השינויים בחילוף החומרים Trp במגוון רחב יותר של מודלים של תרבות התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת פתרונות מלאי סטנדרטיים 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA סטנדרטיים
- שוקלים את ריאגנטים בבקבוקון עם הדיוק הגבוה ביותר (0.3 מ"ג כל אחד). לדיוק טוב יותר, הדרג את ריאגנטים, התאמת נפח הממס על פי שלב 1.2.
- להמיס את ריאגנטים ב 300 μL של הממס כדי לקבל פתרון מלאי של 1 g / L. להמיס 3NT ב 1% (v / v) חומצה פורמית (FA) במים; Kyn, 3HAA ו-XA בדימוסטיל סולפוקסיד (DMSO); 3HKyn במים חומצי pH 2.5 עם חומצה הידרוכלורית (HCl).
התראה: 3HAA מגרה את העיניים, האף, הגרון והריאות. זה מזיק כאשר בשאיפה, במגע עם העור, ואם בלע. ללבוש הגנה מתאימה כלומר, כפפות ומסכה. - סגור בחוזקה את הבקבוקון והנח אותו באמבטיה קולית במשך דקה כדי להאיץ את הפירוק.
הערה: אחסן את פתרונות המלאי ב-20°C ומזער את ההקפאה/הפשרה (3 מחזורים לכל היותר) בשל חוסר היציבות של פתרונות המלאי.
2. הכנת מדיום תרבות המטופל בפחם
- בצינור, שוקלים 280 מ"ג פחם פעיל ומוסיפים 5 מ"ל של המדיום הנוזלי המוכן לצביעת תאי העניין.
- לנער את הצינור עם בינוני ופחם על נדנדה לראות לראות במשך 2 שעות, בטמפרטורת החדר (להגדיר מהירות ל 50 תנודות / דקה). לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות ב 6000 x g במשך 15 דקות.
- הסר את הצינור מן הצנטריפוגה בזהירות לאסוף את supernatant מבלי להפריע משקעים. חזור על צנטריפוגה במידת הצורך, כדי להסיר את כל שאריות הפחם.
- סנן את supernatant באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר.
- ודא כי מדיום תרבות pretreated פחם נשלל עקבות kynurenines על ידי הפעלת מדגם פיילוט על LC-MS כמתואר בשלב 6.3.2. אחרת, חזור על שלבים 2.1-2.4.
הערה: אם מדיום התרבות המלא בתחילה אינו מכיל קינורנינים, ייתכן שצעד הטיהור באמצעות פחם יושמט. במקרה זה, להכין תקני כיול ודגימות בקרת איכות באמצעות המדיום המלא בדרך כלל מוכן culturing התא. - לאחסן את המדיום מוכן ב 4 מעלות צלזיוס עד ניתוח.
3. ביצוע פתרונות הכיול ועקומות הכיול
- תקצץ את מדיום התרבות של פחם עם 0.75 μL של פתרון 0.1 g/L 3NT והוסף ארבעה תקנים (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) לפחות שישה ריכוזים שונים לכיסוי טווחי כיול. שמור את הנפח הסופי של כל מדגם ב 150 μL. וורטקס היטב. השתמש 1.5 צינורות צנטריפוגה מ"ל להכנת מדגם.
הערה: נקודות כיול מוצעות עבור 3HKyn: 0.018, 0.045, 0.22, 1.12, 2.23, 4.46 מיקרומול /L; עבור Kyn: 0.0096, 0.048, 0.24, 1.20, 2.40, 3.84 מיקרומול /L; עבור 3HAA: 0.033, 0.16, 0.65, 3.27, 6.53, 13.06 מיקרומול / ליטר; עבור XA: 0.019, 0.13, 0.49, 1.22, 3.65, 4.87 מיקרומול /L. - הוסף 150 μL של מתנול קר (נשמר ב -20 מעלות צלזיוס) המכיל 1% (v / v) חומצה פורמית לתוך כל צינור עבור deproteinization מדגם. סגור היטב את הצינורות ואת המערבולת היטב.
- דגירה את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות.
- צנטריפוגה הדגימות ב 14,000 x g במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הצינורות מהצנטריפוגה. לאסוף supernatants לתוך הצינורות החדשים. אל תפריעו למשקעים.
- העבר 270 μL של supernatant לתוך בקבוקון הזכוכית באמצעות פיפטה אוטומטית. מכניסים את הבקבוקונים לאייד ומתאדים בעדינות עד לייבוש. השתמש בתוכנית המתאימה עבור שברי מים / מתנול כדי לאדות רכיבים נדיפים. אין למרוח טמפרטורה גבוהה מ-40 מעלות צלזיוס ולהימנע מייבוש יתר.
הערה: בקבוקוני זכוכית שטוחים תחתון, כלומר, בקבוקונים כרומטוגרפיים להקל על אידוי מהיר יותר ושחזורים גבוהים יותר בהשוואה צינורות חרוט פלסטיק. - לאחר 30 דקות, בדוק את מצב האידוי. במידת הצורך, להמשיך אידוי (למשל, להוסיף 10 דקות נוספות). הימנע ייבוש יתר.
- הסר את הבקבוקונים מהמאדה. לשקם כל דגימה ב 60 μL של 0.1% (v / v) חומצה פורמית במים. מוסיפים את הממס לבקבוקון המכיל את שאריות החומר. סגור היטב את הבקבוקונים ואת המערבולת - ובכן.
- מעבירים את הדגימה לצינור של 1.5 מ"ל ומסתובבים במהירות של 14,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להפריד את החלבון המשקע.
- מבלי להפריע גלולת החלבון, להעביר את supernatants לתוך בקבוקונים כרומטוגרפיים עם מוסיף זכוכית חרוטית עם פיפטה אוטומטית. סגור היטב את הבקבוקונים.
- בדוק אם יש נוכחות של בועות אוויר בבקבוקון הכנס ולהסיר אותם במידת הצורך (למשל, על ידי מערבולת).
- העבר את הבקבוקונים הכרומטוגרפיים המכילים דגימות לתוך דגימה אוטומטית LC. רשום את מיקום הדגימות הממוקמות במגש דגימה אוטומטית.
4. הכנת דגימות בקרת איכות (QC)
- ספייק את מדיום התרבות pretreated פחם (מוכן בצינור צנטריפוגלי 1.5 מ"ל) עם 0.75 μL של 0.1 g / L 3NT פתרון ותקנים של ארבעה kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) בריכוז אחד שנבחר מתוך הטווח הליניארי של עקומות הכיול. שמור את הנפח הסופי של המדגם ב 150 μL.
הערה: אם רלוונטי, להכין כמה דגימות QC בריכוזים שונים נופלים תחת הטווח הליניארי של עקומת הכיול. - בצע את הפרוטוקול המתואר בסעיף 3 (שלבים 3.2-3.11).
5. הגדרת מערכת LC-MS
- הכינו את ממיסי הפאזה הניידים: ממס A: 20 mmol / L אמוניום אסיר במים אולטרה סגולים (pH 4.3 מותאם עם חומצה פורמית); ממס B: 100% אצטוניטריל.
הערה: יש להשתמש בבקבוקי זכוכית בורוסיליקט בלבד. יש לשטוף בקבוקים במים אולטרה-דקים לפני מילוים מחדש. אין להשתמש בבקבוקים שנוקו עם חומרי ניקוי.
התראה: אצטוניטריל גורם להשפעות בריאותיות חמורות או למוות. הוא מוצת בקלות על ידי חום. נוזל אצטוניטריל ואדים יכול לגרות את העיניים, האף, הגרון והריאות.- הכן 5 mol / L פתרון מלאי של אמוניום formate על ידי המסת מגיב גבישי (15.77 גרם) ב 50 מ"ל של מים אולטרה סגולים בבקבוק זכוכית. מערבבים עד שכל השיוריות מתמוססות. סנן דרך קרום 0.45 מיקרומטר כדי להסיר כל פסולת שיורית (למשל, באמצעות מסנן מזרק ניילון). אחסן את פתרון המלאי ב- 4 °C (69 °F).
- הכן ממס A על ידי הוספת 4 מ"ל של 5 מול / L אמוניום formate במים ל 980 מ"ל של מים אולטרה סגולים בבקבוק זכוכית ענבר ומערבבים היטב. לטבול בר ערבוב ולשים את הבקבוק עם הממס על stirrer מגנטי. לטבול אלקטרודה pH לתוך הפתרון ולשלוט על ה- pH תחת ערבוב. הוסף פתרון מלאי חומצה פורמית (98%-100%) dropwise באמצעות פיפטה אוטומטית עם קצה 0.2 מ"ל כדי להשיג pH 4.3, להתאים את עוצמת הקול עד 1 L עם מים אולטרה דקים ומערבבים היטב.
הערה: הכינו את הממסים לפחות פעם בשבוע כדי למנוע צמיחה מיקרוביאלית.
התראה: חומצה פורמית (FA) רעילה בשאיפה, גורמת לכוויות בעור ולנזק לעיניים. לעבוד מתחת למכסה המנוע אדים; ללבוש כפפות מגן ומעיל. - לסנן את כל הפתרונות דרך קרום 0.22 מיקרומטר (למשל, מסנן מזרק ניילון) כדי להסיר את כל שאריות פסולת. לחלופין, השתמש במסנני כניסת ממס ייעודיים למאגרי ממס LC כדי להגן על המערכת מפני חלקיקים נכנסים.
- הפעל את תוכנת הבקרה ורכישת הנתונים LC-MS.
- לטהר את מערכת LC עם השלב הנייד כדי להסיר בועות, כדי prime כל ערוצי ממס.
- אנסמבל עמודת מגן כדי להגן על העמודה האנליטית מפני סתימה.
- רוקן את השומר ואת העמודה האנליטית (C18, 2.1 x 100 מ"מ, 1.8 מיקרומטר) עם 100% אצטוניטריל במשך כ 30 דקות, ולאחר מכן עם 100% ממס A עד לחץ יציב בעמודה נצפתה. שלוט בביצועי המערכת באמצעות תוכנת הבקרה.
- הגדר את פרמטרי ה- LC המתאימים בתוכנת רכישת הנתונים.
- הגדר את תוכנית השיפוע: 0-8 דקות ממס B 0%; 8-17 דקות ממס B 0-2%; 17-20 דקות ממס B 2%; 20-32 דקות ממס B 10-30%; 32-45 דקות ממס B 0%.
- הגדר את קצב זרימת הפאזה הנייד ב- 0.15 מ"ל/דקה, זמן ריצה כולל של ניתוח למשך 45 דקות, טמפרטורת עמודה ב- +40 °C (70 °F) ונפח הזרקה ב- 10 μL.
- הגדר את פרמטרי הרכישה של גלאי ספקטרומטריית המסה.
- החל פרמטרי יינון: ניטור יון יחיד (SIM), יינון חיובי, לחץ nebulizer של 50 psi, +350 מעלות צלזיוס ייבוש טמפרטורת הגז, ייבוש זרימת גז של 12 L / min, ו 5500 V מתח נימי.
- בחר את יוני ניטור האנלייט: עבור 3HKyn m/z 225.0 (תקופת סריקה: 2-6 דקות, מתח מקוטע: 100 V); עבור Kyn m/z 209.0 (תקופת סריקה: 6-12 דקות, מתח מפצל: 80 V); עבור 3HAA m/z 154.0 (תקופת סריקה: 12-18 דקות, מתח מפצל: 80 V); עבור 3NT m/z 227.0 (תקופת סריקה: 18-23 דקות, מתח מפצל: 100 V); עבור XA m/z 206.0 (תקופת סריקה: 23-45 דקות, מתח מפצל: 100 V).
- בנה רשימת עבודה והפעל דוגמאות במערכת LC.
- בהתחלה, לפני הניתוח של דגימות הניסוי, להפעיל מדגם ריק (ממס A) לפחות משולשים, ואחריו מדגם QC אחד.
- פתח את תוכנת ניתוח הנתונים וטען את התוצאות שהתקבלו עבור מדגם QC.
- בדוק את המיקום של פסגות אנלייט על הכרומטוגרמה. כאשר אותות זזים מעבר למיקום הצפוי, התאם את שערי הזמן לאיסוף אותות ניתוח מתאים. עיין במדריך התוכנה לקבלת הוראות אודות שילוב אותות.
6. בניית עקומת הכיול
- בתוכנת רכישת הנתונים, הוסף תקני כיול לרשימת העבודה והפעל את הסטנדרטים בטריפלים.
- שלב ומדוד את אזור השיא המתאים ל- 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT ו- XA בזמן השמירה של כ- 4.4 דקות, 10 דקות, 16 דקות, 21 דקות ו- 30 דקות, בהתאמה.
- בנה עקומות כיול בודדות עבור כל מטבוליט באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני.
- כדי ליצור את תרשים הכיול, התווה את הערך עבור יחס של אזור שיא ניתוח מעל אזור השיא של 3NT לעומת ריכוז האנליסט.
- נתח את המדגם הריק (מדיום תרבות pretreated פחם זינק רק עם 3NT) כדי להבטיח שאין עקבות של האנליסטים שנחקרו במדיום. אחרת, הפחת את הערך המתקבל מכל נקודת כיול.
- בדוק את הליניאריות של כל עקומת כיול.
- בנפרד, עבור כל ניתוח, צור משוואה ליניארית ליירוט שיפוע (y = גרזן +b), כאשר y מתאים ליחס של אזור השיא של האנלייט לעומת אזור השיא של 3NT, a הוא השיפוע, x הוא ריכוז האנלייט (μmol/L) ו- b מתייחס ליירוט העקומה. התוויית הגרף 'y' לעומת 'x' תיצור את עקומת הכיול.
- הוסף קו מגמה ליניארי לתרשים, הצג את משוואת עקומת הכיול ואת מקדם הרגרסיה בתרשים. ודא שמקדם הרגרסיה הוא > 0.990. במקרה של תקני כיול לא תואמים, הכינו ו/או ניתחו אותם שוב. לחלופין, שנה את טווח הריכוז של עקומת הכיול.
- נתח את דגימות ה- QC כדי לבדוק את ביצועי המערכת לפני ניתוח הדגימות הניסיוניות. במקרה של אי-תאימות (סטייה של ± 20% מערך הייחוס), הכינו את עקומות הכיול החדשות.
7. תרבות תאי במבחנה ואיסוף מדגם לניתוח
- צלחת התאים הסרטניים שנחקרו (MDA-MB-231 או SK-OV-3) ב DMEM (מדיום הנשר שונה של Dulbecco) המכיל 4.5 גרם / ליטר של ᴅ גלוקוז, 10% (v / v) סרום שור עוברי (FBS), 2 mmol / L ʟ גלוטמין ו 1 U פניצילין / סטרפטומיצין ותרבות ב 37 °C (69 °F) באווירה לחה של 5% CO2 כדי להרחיב אותם לניסוי. מעבר התאים ב 80% של המפגש.
- נתק תאים מתבנית התרבות באמצעות טריפסין, זרע לניסוי על צלחות 12 באר בצפיפות של 0.3 × 106 תאים לבאר ומניחים באינקובטור בן לילה.
- למחרת, לשאוף את מדיום התרבות ולהוסיף DMEM טרי עם או בלי תוספת של תרכובות למד, בהתאם לעיצוב הניסיוני.
- לאחר 48 שעות, לאסוף את המדיום מעל התאים (כ 500 μL) לתוך צינור 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 14, 000 x g במשך 5 דקות כדי להסיר את כל פסולת התא. לאסוף את supernatant ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד הניתוח.
- שמור את גלולה הסלולר משלב 7.4 להערכת חלבון. להקפיא את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס.
הערה: יש לנרמל את התוצאות המתקבלות עבור מדיום מבארות שונות לתכולת החלבון הכוללת כדי להסביר את השונות במספר התאים בבארות בודדות. ניתן להעריך את ריכוז החלבון כמתואר בשלב 9.
8. הכנת דגימות לניתוח LC-MS
- מפשירים את הדגימה הקפואה בטמפרטורת החדר ומערבבים היטב. העבר 149.25 μL של מדיום התרבות לתוך צינור צנטריפוגה (1.5 מ"ל).
- הוסף 0.75 μL של 0.1 g/L של פתרון 3NT (תקן פנימי). סגור היטב את הצינורות והמערבולת.
- הוסף 150 μL של מצונן ב -20 °C מתנול המכיל 1% (v / v) FA עבור deproteinization מדגם. סגור היטב את הצינורות והמערבולת.
- המשך בהכנה לדוגמה כמתואר בסעיף 3 (שלבים 3.3-3.11).
הערה: תאים סרטניים מסוימים כמו SK-OV-3 מפרישים כמויות גדולות של Kyn למדיום תרבות. כדי להתאים את הנתונים לטווח ליניארי של עקומת הכיול, יש צורך בדילול של המדגם בערך פי 100. במקרה זה, לדלל חלק של המדגם עם 0.1% (v / v) FA במים ולנתח בנוסף מדגם לא מדולל. דגימות הייחוס של תקנים עבור עקומת הכיול צריך להיות מוכן ב 100 פעמים מדולל מדיום תרבות מלאה. לחלופין, להוסיף נקודות נוספות בעקומת הכיול (אם מסיסות נכונה ליניאריות מושגים) כדי להתאים אותו לרמת הריכוז של Kyn במדגם הניסיוני. - נתח את הדגימות על-ידי LC-MS כמתואר בסעיף 5. בנה רשימת עבודה והפעל כל דגימה בטריפל.
- לאחר השלמת רשימת העבודה, למדוד את אזור השיא של ניתוח.
- צור גיליון אלקטרוני באמצעות התוכנה הזמינה והשגת נתונים מספריים.
- בעמודת גיליון אלקטרוני אחת לחשב את היחס של אזור השיא של ניתוח מעל אזור השיא 3NT.
- השתמש במשוואת כיול ליניארית בודדת המוקדשת לכל ניתוח (משלב 6.3.) כדי לחשב ריכוזים של ניתוחים הקיימים בדגימות הניסוי.
9. הערכת תכולת החלבון ונורמליזציה של נתונים
- Resuspend גלולה הסלולר משלב 7.5 עם 100 μL של מלוחים אגירה פוספט (PBS) בצינור 1.5 מ"ל.
הערה: להכין פתרון PBS על ידי המסת 8 גרם של נתרן כלורי, 0.2 גרם של אשלגן כלורי, 1.44 גרם של נתרן פוספט dibasic, אשלגן דיהידרוגן פוספט ב 950 מ"ל של מים אולטרה סגולים. מערבבים היטב. כוונן את ה- pH ל- 7.4 עם חומצה הידרוכלורית (dropwise). כוונן את הנפח עד 1 L עם מים אולטרה-דקים. מערבבים היטב עד הומוגני.
התראה: חומצה הידרוכלורית היא מאכלת מאוד ויש לטפל בה באמצעי זהירות מתאימים. מגע עם עור האדם יכול לגרום לאאדמומיות, כאב, כוויות בעור. לעבוד מתחת למכסה המנוע אדים; ללבוש כפפות מגן ומעיל. - להקפיא את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להפשיר על קרח. חזור על שלב זה 3x.
- צנטריפוגה הדגימות ב 14, 000 x g במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatants לתוך הצינורות החדשים. אל תפריעו לכדור.
- לדלל את supernatants 10x עם PBS.
- לבנות עקומת כיול מ 0 עד 2 מיקרוגרם של החלבון לכל טווח טוב.
- הכן פתרון סטנדרטי של אלבומין סרום שור (BSA) לכיול. להמיס 1.23 מיקרוגרם של BSA ב 1 מ"ל של מים אולטרה סגולים ומערבולת היטב.
- על צלחת 96-באר, לטעון כמויות שונות של פתרון סטנדרטי BSA (1.23 מיקרוגרם / מ"ל): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
- למלא את הבאר עם PBS לנפח הסופי של 50 μL.
- טען 10 - 15 תאי μL lysate משלב 9.4 על אותה צלחת 96 באר. מלא את הבארות עם PBS כדי להגיע לנפח הסופי של 50 μL.
הערה: במידת הצורך, כוונן את עוצמת הקול של aliquot lysate התא בכל באר כדי להתאים בטווח הליניארי של עקומת הכיול. שמור את הנפח הסופי ל 50 μL של המדגם לכל באר. - הוסף 200 μL של ריאגנט ברדפורד (מדולל 5 פעמים עם מים אולטרה סגולים) לכל באר.
- דגירה פטה 96-באר לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר. הכנס את הלוח לקורא מיקרופלאט. מדידת ספיגה ב λ = 595 ננומטר.
- בנה עקומת כיול באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני. התווה את כמות BSA (μg) לעומת ספיגה. הוסף קו מגמה ליניארי, הצג את משוואת עקומת הכיול ואת מקדם הרגרסיה בתרשים.
- השתמש במשוואה הליניארית (y = ax +b, כאשר y מתאים לספיגה ב- μ = 595 ננומטר, a הוא השיפוע, x הוא תכולת חלבון (מיקרוגרם), ו- b מתייחס ליירוט העקומה) כדי לחשב את כמות החלבון במדגם.
הערה: שקול גורם דילול לדוגמה בחישובים. - השתמש בתכולת החלבון המשוערת כדי לנרמל את כמות הקיאנורנין במדגם לכל 1 מ"ג חלבון. כדי לעשות זאת, לחלק את הריכוז של kynurenines נקבע בשלב 8.9 עם תכולת החלבון הכוללת משלב 9.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LC-MS מציג יתרונות שאין עליה עוררין בכימות של מולקולות פעילות ביולוגית, למרות שרכיבים מסוימים של דגימות מורכבות גורמים למה שמכונה אפקטים מטריצתיים ויינון פשרה של אנליטים. זה מוביל דיכוי יון או שיפור יון, מאוד להקטין את הדיוק ומשפיע על מגבלה של זיהוי / כימות של LC-MS, אשר נחשב כנקודה "חלשה" של השיטה. בפרוטוקול שלנו, היונים נוצרים על ידי יינון electrospray (ESI) במצב חיובי, אשר הועסק גם במחקרים אחרים על קביעת מטבוליטים Trp13. ESI, לעומת זאת, נוטה יותר אפקטים מטריצה מאשר לחץ אטמוספרי יינון כימי (APCI)28. לכן, לכימות מדויק של מטבוליטים Trp במדיום תרבות התא, השתמשנו בתקן פנימי וכיול מותאם מטריצה כדי לפצות את ההשפעות תלויות המטריצה על אות האנליסט ולתקן את אובדן תרכובות היעד במהלך שלב הכנת מדגם. יישמנו את אותו תקן פנימי (3NT) עבור כל האנליסטים הנחקרים (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA). 3NT לא נמצא במדיום המקורי, טרי המשמש culturing התא ומראה התנהגות דומה כמו תרכובות היעד בתנאים אנליטיים להחיל. זה הופך את 3NT לתקן הפנימי המתאים27. בנוסף, כדי לפשט את הפרוטוקול, על מנת להפוך אותו לנגיש יותר לקבוצה רחבה של משתמשים, אנו מציעים רק שלב אחד של הכנת מדגם הכרוך בהסרת חלבון על ידי טיפול במתנול המכיל 1% (v /v) FA.
בתוך הפרוטוקול המוצג, מומלץ להכין את עקומות הכיול באמצעות המדיום המלא המשמש לתרבות התאים. עם זאת, מדיום התרבות עשוי להכיל Kyn אנדוגני שמפריע הערכה נכונה של אזור שיא אנליט, במיוחד בפתרונות כיול בריכוזים נמוכים. איור 1A מדגים תוצאות LC-SQ שהושגו במהלך הניתוח של DMEM המכיל 4.5 גרם / L D-גלוקוז (DMEM-HG) ו 10% (v / v) FBS בשימוש על ידי הקבוצה שלנו לתרבות תאים סרטנית. גילינו שמדיום התרבות השלם הטרי מכיל בתחילה כמה קן שניתן להסיר על ידי טיהור עם פחם פעיל(איור 1B). בעת ניתוח הדגימות הניסיוניות, המדיום המלא של תרבות DMEM-HG נותח גם הוא כמדגם בקרה, ואזור השיא של Kyn הופרד מאזור השיא שנרשם עבור Kyn בכל מדגם שנבדק.
איור 1: תוצאות נציגות של LC-SQ של מדיום תרבות DMEM-HG מלא (A) לפני ו-(B) לאחר טיפול מקדים בפחם פעיל. דגימות של מדיום תרבות היו זינקו עם אותה כמות של התקן הפנימי (3NT). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
בשלב הבא נקבע זמן שמירה עבור כל ניתוח יעד (ראו כרומטוגרמה באיור 2A). הנוהג הטוב בניתוח LC-MS הוא להפעיל דגימת QC לפני הדגימות בפועל כדי לאשר את זמני השמירה המתאימים של הניתוחים. מדי פעם, שינוי באותות LC ניתן לראות, ואי התאמות נוטים לקרות. איור 2B מציג שינוי קל בזמני השמירה של האנליסטים, אשר, עם זאת, אינו מפריע למדידות הנכונות. מנגד, איור 2C מציג שינוי משמעותי במיקום של פסגות היעד. כפי שניתן לראות, אות 3NT הועבר באופן משמעותי לכיוון זמן שמירה קצר יותר ויצא משער הזמן שנקבע. במקרה זה, ניתוח כמותי מתאים היה בלתי אפשרי מכיוון שלא ניתן למדוד כראוי את האות הסטנדרטי הפנימי. זה יכול להיות בגלל מספר גורמים, כלומר שיווי משקל טור לא מספיק, ערבוב שגוי של הממסים במשאבה, שימוש בדגימה לא הולמת או זיהום של השלב הנייח בעמודה. איור 2D, לעומת זאת, מייצג מצב, כאשר הפסגות הרשומות סובלות מעוצמות נמוכות מאוד. זה יכול להיות תוצאה של כשל בהזרקה, דליפה במערכת או נזק לטרשת נפוצה. יתר על כן, רכיבי המטריצה המשותפת יכולים ליצור יונים כאשר m/z נבחר עבור ניתוחי היעד, כמו באיור 3A, שם מוצגת התוצאה מהניתוח של מדיום תרבות התאים MDA-MB-231. בזמן השמירה של כ 25 דקות, אות חזק נגזר רכיב מטריצה לא ידוע (תרכובת X) נצפתה. השיא מופיע בתקופת הסריקה, כאשר היון של m/z 206 (נבחר עבור XA) היה במעקב. עם זאת, אות זה אינו תואם את האנלייט עקב חוסר תאימות של זמן השמירה. כדי למנוע טעויות במהלך אינטגרציה שיא, השוואה של זמן השמירה עם זה נרשם עבור דגימות QC מומלץ גם.
איור 2. דוגמאות לתוצאות נכונות ושגויות. הכרומטוגרמות הנכונות של ניתוח מדגם QC ב -( A) בינוני ו -( B) רמות ריכוז נמוכות נרשמו בימים שונים. דוגמה לכרומטוגרמה השגויה הנובעת משינוי משמעותי בזמני השמירה של האנליטים (C) ועוצמות לא משביעות רצון של פסגות (D). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. תוצאות מייצגות של מדיום תרבות שנאספו מקווי תאים סרטניים שונים. מדיום תרבות מ- (A) MDA-MB-231 (סרטן השד האנושי) ו -( B) SK-OV-3 (סרטן השחלות האנושי) נותחו באמצעות LC-SQ. המתחם X מציין את האות של תרכובת לא ידועה הנמצאת במדיום התרבות המשותף עם האנלייט ומיונן כדי ליצור יון עם m /z שנבחר לניתוח. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
מדיום התרבות המשמש לתאי סרטן (DMEM) מכיל כמויות משמעותיות של Trp. האיזוטופ שלה(13C-Trp) חולק את אותו יון כמו XA(m/z 206) ועלול להפריע לקביעת XA. עם זאת, בתנאים כרומטוגרפיים להחיל, האות מ Trp מופרד היטב מן האות XA. לכן, הגענו למסקנה כי Trp נוכח DMEM אינו משפיע על כימות XA ודיוק של השיטה (איור 4).
איור 4. מיקום אותות טריפטופן (Trp) וחומצה קסנטורינית (XA) על כרומטוגרמה של MS. פתרונות סטנדרטיים של Trp (49.0 μmol / L) ו XA (48.8 μmol / L) הוכנו ממס A (20 mmol / L אמוניום formate במים, pH 4.3) בתנאי LC-SQ אופטימיזציה. היונים של m/z 205 (המתאימים ל- [Trp+H]+) ו- m/z 206 (המתאימים ל- [XA+H]+) היו מנוטרים עבור Trp ו- XA, בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
השיטה האנליטית שהוצגה עברה בהצלחה את מבחן האימות במונחים של ליניאריות, דיוק (מקדמי וריאציה ≤15%), דיוק (96-104%), התאוששות (96-119%) ואפקטי מטריצה עבור כל הניתוחים, כפי שתואר בפירוט במאמר הקודם שלנו 27.
לבסוף, אישרנו יישום של הגישה האנליטית המתוארת למדיום שנאסף מתאי הסרטן האנושיים בתרבית במבחנה. הנתונים שלנו אישרו שרמת הקינורנינים יכולה להשתנות באופן משמעותי במדיום תרבות שנאסף מסוגי תאים שונים (איור 3). ניתחנו את מדיום התרבות משני סוגים של קווי סרטן כלומר MDA-MB-231 ו SK-OV-3 תאים נגזר סרטן השד והשחלות, בהתאמה. הקווים שנבחרו משמשים לעתים קרובות כמודלים לחקר אירועים מולקולריים ולבדיקות תרופתיות נגד סרטן. כפי שראינו, התאים בתרבית במדיום תקן שליטה שחררו כמויות שונות של מטבוליטים טריפטופן, כלומר, תאי MDA-MB-231 שיחררו כמות ניתנת לכימות של Kyn ו-XA בריכוז נמוך של נמול/L(איור 3A),בעוד שתאי SK-OV-3 הראו באופן משמעותי יותר Kyn, הפרשה נמוכה מאוד של XA, ואין הפרשה של קינורנינים אחרים שנחקרו כפי שצוין על ידי עוצמת הפסגות המתאימות (איור 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקול LC-SQ מפורט לכימות בו זמנית של ארבעה מטבוליטים עיקריים של Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) הנמדדים במדיום מתאי סרטן אנושיים בתרבית במבחנה. תשומת לב מיוחדת מקדישה להכנת המדגם, הליך ספקטרומטריה כרומטוגרפית / מסה, ופרשנות נתונים, הנקודות החשובות ביותר בתוך הניתוח.
באופן כללי, ניתוח LC-MS, בשל רגישות גבוהה, דורש את הסטנדרטים הגבוהים ביותר של הקפדה פרוטוקול וטוהר של חומרים משומשים. זה מתייחס ליישום של כלי זכוכית שנוקו בצורה מסודרת ושטף כראוי, כמו גם כימיקלים ברמה גבוהה לאורך כל ההליך הרגיל. חשוב מאוד להשתמש בממסים מבוססי מים מתוקים של שלב נייד כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי כי בגישה רגישה זו עלולה להשפיע באופן דרסטי על הניתוח. לפני הזרקת לתוך מערכת LC, הדגימות מנותחות צריך להיבדק בקפידה לנוכחות של כל חלקיקים בלתי מסיסים. חשוב לציין כי יש להשוות את העמודה במידה מספקת לפני ניתוח הדגימה. אי עמידה בכללים אלה עלולה לגרום לזיהום הדגימות, למערכת ה- LC ולעמודה האנליטית או ליינון מדגם לא מספיק במקור MS, ולבסוף לגרום לשינוי של אותות.
ישנן 2 נקודות מפתח בתוך הפרוטוקול שיש להדגיש על מנת לקבל תוצאות אופטימליות. החלק הקריטי ביותר בפרוטוקול המוצג הוא שלב ההכנה לדוגמה. שימוש בהליך לקוי גורם לאובדן תרכובות מטרה וכתוצאה מכך לכימות לא מדויק. בגישה שלנו, במהלך פיתוח השיטה, שלב הכנת מדגם היה אופטימיזציה בקפידה יחד עם הבחירה של הממס להסרת חלבון. כפי שקבענו, טיפול מדגמי עם מתנול המכיל 1% (v / v) חומצה פורמית הניב את המחלימים הטובים ביותר עבור כל kynurenines למד. ההשפעה של הרכב שלב נייד על היקף יינון ניתוח הוערך גם. בדקנו שלבים ניידים המורכבים 0-20 mmol / L אמוניום אסיר או אמוניום אצטט ב- pH שונים מותאם עם חומצה פורמית או אצטית. השלב הנייד המכיל 20 mmol / L אמוניום אסיר במים (pH 4.3, ממס A) ו acetonitrile (ממס B) סיפק את התנאים הטובים ביותר האפשריים לכימות בו זמנית של Kyn, 3HKyn, 3HAA ו XA27. צעד חשוב נוסף בניתוח LC-MS הוא אינטגרציית שיא. כמה קינורנינים להתרחש במדגם ברמות ריכוז נמוכות מאוד. במקרה זה, האותות של תרכובות שיתוף eluting עשוי לחפוף עם אות ניתוח היעד או ליצור שיא בזמן שמירה דומה. משתמש לא מנוסה בשיטה זו עלול למצוא קשיים מסוימים באינטגרציית שיא נכונה, כפי שבא לידי ביטוי באיור 2C. לכן, בדיקת זמן השמירה עבור analytes והשוואה עם מדגם QC נדרש ומומלץ מאוד.
תרגול אנליטי טוב כולל בחירת תקן פנימי מתאים לניתוח כמותי. בזאת, אנו מציעים גישה פשוטה וחסכונית באמצעות תקן פנימי אחד בלבד (3NT) כאנלוגי של ארבעה קינורנינים. התוצאות אישרו כי 3NT מציג התנהגות כרומטוגרפית דומה כמו תרכובות היעד וכתוצאה מכך הוא מאפשר להשיג דיוק ודיוק טובים של השיטה27. בתנאי LC החלים, שיא 3NT מופרד היטב מאותות האנליסטים האחרים וקל למדידה. אנו מבינים כי איסוטופיקטית שכותרתו סטנדרטים פנימיים (ILIS) המשמשים בניתוחים כאלה14,15 יספק פיצוי טוב יותר של אפקטים מטריקס ושליטה טובה יותר של כל המשתנים שיכולים להוביל לתוצאות כוזבות. מצד שני, ILISS עבור כל analytes היעד אינם תמיד זמינים בקלות, שלא לדבר על העלות הגבוהה שלהם. כמו כן, ILISS מוקדשים ולא עבור LC-MS/MS מאשר LC-SQ עם מצב ניטור יון יחיד (SIM) שבו השתמשנו בנייר זה.
שימוש 3NT כסטנדרט פנימי עשוי להיחשב כאן כמגבלה של השיטה בשל אפשרות של היווצרות 3-nitrotyrosine על חלבונים29. עם זאת, במקרה של מדיום תרבות, לא ראינו שום אנדוגני חינם 3-nitrotyrosine. זה מאפשר לנו לזהות 3NT כסטנדרט פנימי מתאים. עם זאת, אנו ממליצים על הערכה קודמת של רמת 3NT אנדוגנית ראשונית, במיוחד כאשר לומדים סוגי תאים אחרים מאשר נבדק בדוח זה.
לסיכום, בעת בחירת אנלוגי של כל ניתוח, יש לקחת בחשבון תכונות רבות, למשל, דמיון כימי והיעדרות ראשונית במטריצת מדגם. יתר על כן, יציבות של התקן הפנימי האנלוגי במטריצת מדגם, יעילות ההתאוששות והיוניזציה שלו בנוכחות רכיבי מטריצה עשויה להיות שונה מתרכובות היעד. לכן, כל התכונות הללו צריך להיחשב נחקר בקפידה במהלך פיתוח השיטה.
המערכת האנליטית בשיטה המוצגת הכוללת גלאי MS אפשרה לנו להשיג גבולות נמוכים של גילוי (0.0033 – 0.0108 μmol / L)27. בדרך זו מדידות בו זמנית של 3HKyn, Kyn, 3HAA, XA בטווחי הריכוז של 0.018 - 4.46 מיקרומול / L, 0.0096 - 3.84 מיקרומול / L, 0.033 - 13.06 מיקרומול / L, ו 0.019 - 4.87 μmol / L, בהתאמה, הושג. המגבלה העיקרית של כל ניתוח LC-SQ משויכת להפרדה נאותה של רכיבים לדוגמה בעמודת LC. הפרדה לקויה תורמת לסלקטיביות נמוכה יותר בהשוואה לגילוי עם ספקטרומטריית מסה מרובעת דו-מושבית המשתמשת ביונים של מוצרים ובמצב ניטור תגובות מרובות (MRM). על מנת למנוע הפרעות מרכיבי מטריצה אחרים החולקים יונים זהים או דומים עם מולקולת יעד, תנאי ההפרדה LC חייב להיות אופטימיזציה בקפידה. לדוגמה, איזוטופ 13C Trp (קיים בכמויות זעירות) יוצר את אותו יון של m/z 206 כפי שנבחר עבור ניטור XA. פרשנות שגויה נמנעה כאן על ידי אופטימיזציה של התנאים הכרומטוגרפיים והפרדה משביעת רצון של Trp ו- XA eluted מהעמודה (איור 4).
ביישומים העתידיים, ניתן ליישם שינויים מסוימים בפרוטוקול. משתמש פוטנציאלי יכול לשנות ריכוז של התקן הפנימי (3NT) כאשר רמות kynurenines למד צפויים ליפול beyound הריכוזים המוצגים כאן. חשוב לציין, ריכוז 3NT צריך להיות זהה הן בתקני הכיול והן בדגימות הניסוי. במקרה של רמת ניתוח גבוהה מאוד, כגון Kyn שנצפה בתאי SK-OV-3, אנו ממליצים לעבוד עם ריכוז גבוה יותר של 3NT. אם נדרש דילול מדגם, זה צריך להיעשות בשלב הסופי של הפרוטוקול, לפני הזרקת מדגם על העמודה LC.
בספרות, ישנם כמה פרוטוקולים המוצעים עבור ניתוח כמותי LC-MS/ MS של קינורנינים במדיום תרבות מתאים שונים. פרוטוקול אחד מספק קביעה בו זמנית של 3 מטבוליטים, כלומר, Kyn, 3HKyn ו 3HAA אבל זה פחות רגיש (גבול של כימותים (LOQ) ברמות גבוהות יותר), בניגוד לשיטה שלנו21. דו"ח אחר הציג שיטה המאפשרת כימות של 4 קינורנינים, כולל Kyn, 3HKyn, 3HAA ו- XA עם LOQsדומה 25. אף אחד מהם, עם זאת, היה אופטימיזציה לגילוי של kynurenines שנוצר על ידי תאים סרטניים בתרבית במבחנה. הרכיבים של מטריצת מדגם משפיעים על יינון הניתוח במקור טרשת נפוצה על ידי הקטנה או הגדלה של האות, שהוא גורם לתוצאות לא אמינות. כדי להשיג נתונים מדויקים יותר, הצענו להשתמש בתקן פנימי אנלוגי (3NT) בשילוב עם כיול תואם מטריצה לפיצוי טוב יותר של אפקטים תלויי מטריצה.
באמצעות המתודולוגיה המוצגת, יכולנו להבחין כי Kyn היה מטבוליט Trp הנפוץ ביותר במדיום תרבות שנאסף מן סוגי תאים סרטניים נותחו, בעוד מטבוליטים אחרים שנחקרו תחת תנאי תרבות שליטה לא זוהו (למעט XA נוכח עקבות אבל כמויות לגילוי). עם זאת, כאשר התאים היו מגורה עם מפעיל חיסוני חזק – lipopolysaccharide חיידקי, כמות גדולה יותר של XA בנוסף Kyn הופרש. מצד שני, זוהו 3HKyn ו 3HAA שנוצרים במעלה הזרם של XA בתוך KP היו עדיין תחת LOQ27. זה מרמז כי כמה מטבוליטים KP נוכח בכמויות קטנות במדיום תרבות עשוי להיות קשה למדוד באמצעות הגישה המוצעת LC-SQ. עם זאת, הפרוטוקול המוצג שימושי כדי לזהות שינויים KP על ידי כימות של המצטבר מפתח Trp מטבוליטים. שימוש במתודולוגיה זו במחקרים עתידיים כדי לעסוק במערכת תרבית תאים במבחנה יספק סמנים ביולוגיים חדשניים של מחלות הקשורות למערכת החיסון וסרטן. הגישה שלנו מביאה לבדיקה מאומתת ואמינה עם רגישות רלוונטית לדגמים סלולריים מאתגרים בשל ריכוזים נמוכים של מטבוליטים KP במורד הזרם. ההוראות שסופקו יאפשרו לחוקרים מתחומים שונים לנצל גישה זו לכימות של קינורנינים גדולים הקשורים לסרטן ומחלות אחרות. הנתונים שלנו (שלא פורסמו) מראים כי זה שימושי לחקר אפנון KP בתאים חשופים למוצרי glycation שונים, אבל זה גם צריך למצוא יישום בתחומים מחקר אחרים ומחלות עם מרכיב החיסון, כלומר, בביולוגיה אנדומטריום ורבייה30.
ניתן להרחיב עוד יותר את הפרוטוקול המוצג כדי לקבוע ניתוחים נוספים שעשויים להצטבר במדיום תרבותי בתנאי ניסוי שונים. יש להשתמש בתקני הייחוס המתאימים של אנליטים לצורך אימות שיטה במונחים של דיוק, דיוק, ליניאריות, שחזור או סלקטיביות לפני השימוש לניתוחים כמותיים. פית'מור, בהתאם למטרת המחקר, הפרוטוקול עשוי לשמש לקינורנינים בודדים (3HKyn, Kyn, 3HAA או XA). במקרה זה, היונים המתאימים לתרכובות שאינן נחשבות לניתוח, עשויים להיות מוסרים מהגדרות MS. השינויים המתאימים בתוכנית ההדרגתית LC יסייעו בחיתוך זמן הניתוח.
כאשר לומדים KP, זה רלוונטי כדי להעריך את הפעילות של אנזים IDO. זה יכול להיות מוערך פשוט על ידי מדידת צריכת Trp ושחרור Kyn לתוך מדיום תרבות או על ידי חישוב יחס ריכוז kynurenine-כדי טריפטופן ([Kyn]/[Trp])31. בגישה שלנו, לא מדדנו ריכוז Trp, עם זאת, הפרוטוקול עשוי להיות מורחב על ידי הוספת יעד זה בניתוח LC-SQ. כגישה מתאימה יותר מבחינה ביוכימית, אנו ממליצים להביע פעילות אנזימטית של IDO ככמות של Kyn המיוצר על ידי תאים למיליגרם חלבון לדקה כפי שהוצג במקום אחר32. שמנו לב ליתרון בשימוש בגישה זו במחקרים האחרים שלנו על תאים סרטניים (כתב יד כהכנה) וממליצים על שיטה זו בעת שימוש במודל תרבות תאי במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי מהקרן האירופית לפיתוח אזורי במסגרת פיתוח התוכנית התפעולית של מזרח פולין 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), על ידי הפקולטה לביוטכנולוגיה ומדעי הסביבה של האוניברסיטה הקתולית של ג'ון פול השני לובלין (מענק מדענים צעירים עבור אילונה סאדוק), המרכז הלאומי למדע פולני, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 עבור מגדלנה סטניזווסקה, חוקרת עקרונות). המחברים מודים לפרופ' אגניישקה שצ'יביור מהמעבדה ללחץ חמצוני, המרכז למחקר בינתחומי, JPII CUL על שיתוף הציוד לפולחן תאים וכימות חלבונים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
| Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
| Analytical balance | Ohaus | ||
| Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
| Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
| Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
| Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
| Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
| Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
| Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
| Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
| Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
| Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
| Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
| Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
| Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
| See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
| Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
| Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
| Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
| Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
| Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
| Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
| Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
References
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
- Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
- Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
- Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
- Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
- Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).
- Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
- Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
- Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
- Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M.
- Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
- Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
- Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
- Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
- Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
- Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
- Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).
- Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
- Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
- Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
- Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
- Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
- Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
- Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
- Annesley, T. M.
- Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
- Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
- Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416 (2009).
- Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).
