כימות בו זמני של קינורנינים נבחרים שנותחו על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים
Summary
המתואר כאן הוא פרוטוקול לקביעת ארבעה מטבוליטים שונים טריפטופן שנוצר במסלול קינורנין (קינורנין, 3-hydroxykynurenine, חומצה xanthurenic, 3-hydroxyanthranilic חומצה) במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים נותחו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית יחד עם ספקטרומטריית מסה מרובעת אחת.
Abstract
מסלול הקינורנין וקטבוליטים טריפטופן בשם kynurenines קיבלו תשומת לב מוגברת למעורבותם בוויסות המערכת החיסונית וביולוגיה של סרטן. מבחני תרבות תאים במבחנה משמש לעתים קרובות כדי ללמוד על תרומתם של קטבוליטים טריפטופן שונים במנגנון המחלה לבדיקת אסטרטגיות טיפוליות. מדיום תרבות התא עשיר מטבוליטים מופרשים ומולקולות איתות משקף את המצב של חילוף החומרים טריפטופן ואירועים תאיים אחרים. פרוטוקולים חדשים לכימות אמין של קינורנינים מרובים במדיום תרבות התא המורכב רצויים לאפשר ניתוח אמין ומהיר של דגימות מרובות. זה יכול להתבצע עם כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה. טכניקה רבת עוצמה זו משמשת במעבדות קליניות ומחקריות רבות לכימות מטבוליטים וניתן להשתמש בה למדידת קינורנינים.
מוצג כאן הוא השימוש כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה quadrupole יחיד (LC-SQ) לקביעה בו זמנית של ארבעה קינורנינים, כלומר, קינורנין, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, וחומצה xanthurenic במדיום שנאסף תאים סרטניים בתרבית ויטרו. גלאי SQ הוא פשוט לשימוש ופחות יקר בהשוואה לספקטרומטרים מסה אחרים. בניתוח SQ-MS, יונים מרובים מהמדגם נוצרים ומופרדים בהתאם ליחס המסה לטעינה הספציפי שלהם (m/z), ואחריו הזיהוי באמצעות מצב ניטור יונים יחיד (SIM).
מאמר זה מושך את תשומת הלב על היתרונות של השיטה המדווחת ומציין כמה נקודות תורפה. הוא מתמקד באלמנטים קריטיים של ניתוח LC-SQ כולל הכנת מדגם יחד עם כרומטוגרפיה וניתוח ספקטרומטריית מסה. בקרת האיכות, תנאי כיול השיטה ובעיות אפקט המטריצה נדונים גם הם. תיארנו יישום פשוט של 3-nitrotyrosine כסטנדרט אנלוגי אחד עבור כל analytes היעד. כפי שאושר על ידי ניסויים עם השחלות האנושיות ותאי סרטן השד, שיטת LC-SQ המוצעת מייצרת תוצאות אמינות וניתן ליישם אותה עוד יותר על מודלים תאיים במבחנה אחרים.
Introduction
מסלול קינורנין (KP) הוא המסלול העיקרי של קטבוליזם טריפטופן (Trp) בתאים אנושיים. אינדולאמין-2,3-דיוקסיגנאז (IDO-1) בתאים אקסטרה-הפטיים הוא האנזים הראשון והמגביל של KP וממיר את Trp ל- N-formylkynurenine1. צעדים נוספים בתוך KP ליצור מטבוליטים משניים אחרים, כלומר kynurenines המציגים תכונות ביולוגיות שונות. קינורנין (Kyn) הוא קטבוליט Trp היציב הראשון המציג תכונות רעילות ומווסת אירועים תאיים לאחר קשירה לקולטן פחמימנים aryl (AhR)2. לאחר מכן, Kyn הופך למספר מולקולות באופן ספונטני או בתהליכים בתיווך אנזימים, ויוצר מטבוליטים כאלה כמו 3-hydroxykynurenine (3HKyn), חומצה אנתרנילית (AA), חומצה 3-הידרוקסיאנתרנית (3-HAA), חומצה קינורינית (Kyna) וחומצה קסנתרנית (XA). מטבוליט נוסף במורד הזרם, 2-אמינו-3-קרבוקסיקוניק חומצה-6-semialdehyde (ACMS), עובר מחזוריות לא אנזימטית לחומצה קינולינית (QA) או חומצה פיקולינית (PA)1. לבסוף, QA הופך עוד יותר nicotinamide-אדנין דינוקלאוטיד (NAD+)3, המטבוליט נקודת קצה KP כי הוא קופקטור אנזים חשוב. כמה kynurenines יש תכונות neuroprotective כגון Kyna ו- PA, בעוד האחרים, כלומר, 3HAA ו 3HKyn, הם רעילים4. חומצה Xanthurenic, אשר נוצר 3HKyn, מציג תכונות נוגדות חמצון vasorelaxation5. XA מצטבר בעדשות הזדקנות ומוביל אפופטוזיס של תאי אפיתל6. KP, המתואר באמצע המאה ה-20, זכה לתשומת לב רבה יותר כאשר מעורבותו בהפרעות שונות הודגם. פעילות מוגברת של מסלול מטבולי זה הצטברות של כמה kynurenines לווסת את התגובה החיסונית קשורים עם תנאים פתולוגיים שונים כגון דיכאון, סכיזופרניה, אנצפלופתיה, HIV, דמנציה, טרשת לרוחב amyotrophic, מלריה, אלצהיימר, מחלת הנטינגטון, וסרטן4,7. כמה שינויים בחילוף החומרים של Trp נצפו microenvironments הגידול ותאי סרטן2,8. יתר על כן, kynurenines נחשבים סמני מחלה מבטיחים9. במחקר סרטן, אין ויטרו מודלים תרבות התא מבוססים היטב בשימוש נרחב להערכה פרה-קלינית של תגובות תרופות נגד סרטן10. מטבוליטים Trp מופרשים על ידי תאים לתוך מדיום התרבות ניתן למדוד כדי להעריך את המצב של מסלול kynurenine. לכן, יש צורך לפתח שיטות מתאימות לגילוי בו זמנית של מטבוליטים KP רבים ככל האפשר במגוון של דגימות ביולוגיות עם פרוטוקול קל, גמיש ואמין.
במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לקביעה בו זמנית של ארבעה מטבוליטים מסלול קינורנין: Kyn, 3HKyn, 3HAA, ו XA על ידי LC-SQ במדיום שלאחר התרבות שנאסף מתאי סרטן. בגישה אנליטית מודרנית, כרומטוגרפיה נוזלית13,14,15,16 עדיפה על גילוי וכימות בו זמנית של קטבוליטים טריפטופן בודדים, בניגוד מבחנים ביוכימיים לא ספציפיים ניצול Ehrlich ריאגנט11,12. כיום, ישנן שיטות רבות הזמינות לקביעת קינורנינים בדגימות אנושיות, המבוססות בעיקר על כרומטוגרפיה נוזלית עם גלאי אולטרה סגול או פלואורסצנטי13,17,18,19. כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם גלאי ספקטרומטריית מסה (LC-MS) נראה מתאים יותר עבור סוג זה של ניתוח, בשל הרגישות הגבוהה שלהם (גבולות נמוכים יותר של גילוי), סלקטיביות וחזרתיות.
מטבוליטים Trp כבר נקבעו בסרום אנושי, פלזמה ושתן13,20,21,22,23, עם זאת, השיטות עבור דגימות ביולוגיות אחרות, כמו מדיום תרבות התא רצויים גם. בעבר, LC-MS שימש תרכובות נגזרות Trp במדיום שנאסף לאחר culturing של תאי גליומה אנושיים, מונוציטים, תאים דנדריטיים או אסטרוציטים שטופלו גמא אינטרפרון (IFN-γ)24,25,26. נכון לעכשיו, יש צורך בפרוטוקולים מאומתים חדשים שיכולים לאפשר הערכה של מספר מטבוליטים במדיות תרבות שונות, תאים וטיפולים המשמשים במודלים של סרטן.
מטרת השיטה המפותחת היא לכמת (בתוך ריצה אנליטית אחת) ארבעה קינורנינים עיקריים שיכולים להצביע על חריגות ב- KP. מוצגים להלן צעדים קריטיים של הפרוטוקול שפורסם לאחרונה שלנו לניתוח כמותי LC-SQ של קינורנינים משמעותיים נבחרים באמצעות תקן פנימי אחד (3-nitrotyrosine, 3NT) במדיום שנאסף מתאי סרטן אנושיים בתרבית במבחנה 27. למיטב ידיעתנו, זהו פרוטוקול LC-SQ הראשון לכימות בו זמנית של 3HKyn, 3HAA, Kyn ו- XA במדיום תרבות המתקבל מהתאים הגדלים במבחנה. על כמה שינויים, השיטה עשויה להיות מיושמת עוד יותר כדי ללמוד את השינויים בחילוף החומרים Trp במגוון רחב יותר של מודלים של תרבות התא.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקול LC-SQ מפורט לכימות בו זמנית של ארבעה מטבוליטים עיקריים של Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) הנמדדים במדיום מתאי סרטן אנושיים בתרבית במבחנה. תשומת לב מיוחדת מקדישה להכנת המדגם, הליך ספקטרומטריה כרומטוגרפית / מסה, ופרשנות נתונים, הנקודות החשובות ביותר בתוך הניתוח.
באופן…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי מהקרן האירופית לפיתוח אזורי במסגרת פיתוח התוכנית התפעולית של מזרח פולין 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), על ידי הפקולטה לביוטכנולוגיה ומדעי הסביבה של האוניברסיטה הקתולית של ג’ון פול השני לובלין (מענק מדענים צעירים עבור אילונה סאדוק), המרכז הלאומי למדע פולני, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 עבור מגדלנה סטניזווסקה, חוקרת עקרונות). המחברים מודים לפרופ’ אגניישקה שצ’יביור מהמעבדה ללחץ חמצוני, המרכז למחקר בינתחומי, JPII CUL על שיתוף הציוד לפולחן תאים וכימות חלבונים.
Materials
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
| Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
| Analytical balance | Ohaus | ||
| Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
| Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
| Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
| Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
| Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
| Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
| Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
| Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
| Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
| Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
| Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
| Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
| Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
| See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
| Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
| Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
| Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
| Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
| Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
| Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
| Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
References
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
- Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
- Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
- Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
- Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
- Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).
- Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
- Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
- Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
- Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. Chromatographic analysis of tryptophan metabolites. Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).
- Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
- Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
- Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
- Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
- Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
- Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
- Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).
- Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
- Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
- Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
- Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
- Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
- Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
- Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
- Annesley, T. M. Ion suppression in mass spectrometry. Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).
- Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
- Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , (2019).
- Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416 (2009).
- Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).
