Summary
Hier beschreven is een protocol voor de bepaling van vier verschillende tryptofaanmetabolieten gegenereerd in de kynurenine route (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic zuur, 3-hydroxyanthranilic zuur) in het medium verzameld uit kankercelculturen geanalyseerd door vloeibare chromatografie in combinatie met een enkele viervoudige massaspectrometrie.
Abstract
De kynurenine route en de tryptofaan katabolieten genaamd kynurenines hebben meer aandacht gekregen voor hun betrokkenheid bij immuunregulatie en kankerbiologie. Een in vitro celkweektest wordt vaak gebruikt om te leren over de bijdrage van verschillende tryptofaankabolieten in een ziektemechanisme en voor het testen van therapeutische strategieën. Celkweekmedium dat rijk is aan uitgescheiden metabolieten en signaalmoleculen weerspiegelt de status van het tryptofaanmetabolisme en andere cellulaire gebeurtenissen. Nieuwe protocollen voor de betrouwbare kwantificering van meerdere kynurenines in het complexe celkweekmedium zijn gewenst om een betrouwbare en snelle analyse van meerdere monsters mogelijk te maken. Dit kan worden bereikt met vloeibare chromatografie in combinatie met massaspectrometrie. Deze krachtige techniek wordt in veel klinische en onderzoekslaboratoria gebruikt voor de kwantificering van metabolieten en kan worden gebruikt voor het meten van kynurenines.
Hier wordt het gebruik van vloeibare chromatografie in combinatie met enkele viervoudige massaspectrometrie (LC-SQ) gepresenteerd voor de gelijktijdige bepaling van vier kynurenines, d.w.z. kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic en xanthurenic acid in het medium dat wordt verzameld uit in vitro gekweekte kankercellen. SQ-detector is eenvoudig te gebruiken en goedkoper in vergelijking met andere massaspectrometers. In de SQ-MS-analyse worden meerdere ionen uit het monster gegenereerd en gescheiden op basis van hun specifieke massa-tot-ladingsverhouding(m/z),gevolgd door de detectie met behulp van een Sim-modus (Single Ion Monitoring).
Dit document vestigt de aandacht op de voordelen van de gerapporteerde methode en geeft enkele zwakke punten aan. Het is gericht op kritieke elementen van LC-SQ-analyse, waaronder monstervoorbereiding, samen met chromatografie en massaspectrometrieanalyse. Ook de kwaliteitscontrole, methodekalibratieomstandigheden en matrixeffectproblemen komen aan bod. We beschreven een eenvoudige toepassing van 3-nitrotyrosine als één analoge standaard voor alle doelanalyten. Zoals bevestigd door experimenten met menselijke eierstok- en borstkankercellen, genereert de voorgestelde LC-SQ-methode betrouwbare resultaten en kan deze verder worden toegepast op andere in vitro cellulaire modellen.
Introduction
Kynurenine pathway (KP) is de belangrijkste route van tryptofaan (Trp) katabolisme in menselijke cellen. Indoolamine-2,3-dioxygenase (IDO-1) in extrahepatische cellen is het eerste en beperkende enzym van KP en zet Trp om in N-formylkynurenine1. Verdere stappen binnen KP genereren andere secundaire metabolieten, namelijk kynurenines die verschillende biologische eigenschappen vertonen. Kynurenine (Kyn) is de eerste stabiele Trp-katabole die toxische eigenschappen vertoont en cellulaire gebeurtenissen reguleert na binding aan de arylkoolwaterstofreceptor (AhR)2. Vervolgens wordt Kyn omgezet in verschillende moleculen, hetzij spontaan, hetzij in de enzymgemedieerde processen, waardoor dergelijke metabolieten zoals 3-hydroxykynurenine (3HKyn), anthranilic acid (AA), 3-hydroxyanthranilic acid (3-HAA), kynurenic acid (Kyna) en xanthurenic acid (XA) worden gegenereerd. Een andere downstream metaboliet, 2-amino-3-carboxymuconzuur-6-semialdehyde (ACMS), ondergaat niet-enzymatische cyclisatie naar chinolienzuur (QA) of picolininezuur (PA)1. Ten slotte wordt QA verder omgezet in nicotinamide-adenine dinucleotide (NAD+)3, de KP-eindpuntmetaboliet die een belangrijke enzymcofactor is. Sommige kynurenines hebben neuroprotectieve eigenschappen zoals Kyna en PA, terwijl de andere, d.w.z. 3HAA en 3HKyn, giftig zijn4. Xanthurenic zuur, dat wordt gevormd uit 3HKyn, presenteert antioxiderende en vasorelaxatie eigenschappen5. XA hoopt zich op in verouderende lenzen en leidt tot apoptose van epitheelcellen6. KP, beschreven in het midden van de 20e eeuw, kreeg meer aandacht toen zijn betrokkenheid bij verschillende aandoeningen werd aangetoond. Verhoogde activiteit van deze metabolische route en accumulatie van sommige kynurenines moduleren de immuunrespons en worden geassocieerd met verschillende pathologische aandoeningen zoals depressie, schizofrenie, encefalopathie, HIV, dementie, amyotrofische laterale sclerose, malaria, Alzheimer, de Ziekte van Huntington en kanker4,7. Sommige veranderingen in het Trp-metabolisme worden waargenomen in tumormicromilieus en kankercellen2,8. Bovendien worden kynurenines beschouwd als veelbelovende ziektemarkers9. In kankeronderzoek worden in vitro celkweekmodellen goed ingeburgerd en veel gebruikt voor preklinische evaluatie van reacties op geneesmiddelen tegen kanker10. Trp-metabolieten worden door cellen uitgescheiden in het kweekmedium en kunnen worden gemeten om de status van de kynurenineroute te beoordelen. Daarom is het nodig om geschikte methoden te ontwikkelen voor de gelijktijdige detectie van zoveel mogelijk KP-metabolieten in een verscheidenheid aan biologische specimens met een eenvoudig, flexibel en betrouwbaar protocol.
In dit artikel beschrijven we een protocol voor de gelijktijdige bepaling van vier kynurenine pathway metabolieten: Kyn, 3HKyn, 3HAA en XA door LC-SQ in een post-culture medium verzameld uit kankercellen. In een moderne analytische benadering heeft vloeibare chromatografie13,14,15,16 de voorkeur voor de gelijktijdige detectie en kwantificering van de individuele tryptofaankabolieten, in tegenstelling tot biochemische niet-specifieke tests met behulp van Ehrlich-reagens11,12. Op dit moment zijn er veel methoden beschikbaar voor kynurenines bepaling in menselijke specimens, voornamelijk gebaseerd op vloeibare chromatografie met ultraviolette of fluorescentiedetectoren13,17,18,19. Vloeibare chromatografie in combinatie met een massaspectrometriedetector (LC-MS) lijkt meer geschikt voor dit type analyse, vanwege hun hogere gevoeligheid (lagere detectiegrenzen), selectiviteit en herhaalbaarheid.
Trp-metabolieten zijn al bepaald in menselijk serum, plasma en urine13,20,21,22,23, maar de methoden voor andere biologische specimens, zoals celkweekmedium, zijn ook gewenst. Voorheen werd LC-MS gebruikt voor Trp-afgeleide verbindingen in een medium dat werd verzameld na cultivering van menselijke glioomcellen, monocyten, dendritische cellen of astrocyten behandeld met interferon gamma (IFN-γ)24,25,26. Momenteel is er behoefte aan nieuwe gevalideerde protocollen die een beoordeling van verschillende metabolieten in verschillende kweekmedia, cellen en behandelingen die in kankermodellen worden gebruikt, mogelijk kunnen maken.
Het doel van de ontwikkelde methode is om (binnen één analytische run) vier belangrijke kynurenines te kwantificeren die kunnen wijzen op afwijkingen in KP. Hier worden kritieke stappen gepresenteerd van ons onlangs gepubliceerde protocol voor kwantitatieve LC-SQ-analyse van geselecteerde betekenisvolle kynurenines met behulp van één interne standaard (3-nitrotyrosine, 3NT) in het medium verzameld uit in vitro gekweekte menselijke kankercellen27. Voor zover wij weten, is het het eerste LC-SQ-protocol voor gelijktijdige kwantificering van 3HKyn, 3HAA, Kyn en XA in een kweekmedium verkregen uit de in vitro gekweekte cellen. Bij sommige wijzigingen kan de methode verder worden toegepast om de veranderingen in het Trp-metabolisme in een breder scala aan celkweekmodellen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van standaard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standaard voorraadoplossingen
- Weeg de reagentia in een flacon met de hoogste nauwkeurigheid (0,3 mg per stuk). Voor een betere nauwkeurigheid schaalt u de reagentia op en past u het volume van het oplosmiddel aan volgens stap 1.2.
- Los de reagentia op in 300 μL van het oplosmiddel om een voorraadoplossing van 1 g/L te verkrijgen. Los 3NT op in 1% (v/v) mierenzuur (FA) in water; Kyn, 3HAA en XA in dimethylsulfoxide (DMSO); 3HKyn in water verzuurd tot pH 2,5 met zoutzuur (HCl).
LET OP: 3HAA irriteert ogen, neus, keel en longen. Het is schadelijk bij inademing, in contact met de huid en bij inslikken. Draag de juiste bescherming, d.w.z. handschoenen en masker. - Sluit de flacon goed en plaats deze gedurende 1 minuut in een ultrasoon bad om de ontbinding te versnellen.
OPMERKING: Bewaar de voorraadoplossingen bij -20 °C en minimaliseer bevriezing/ontdooien (maximaal 3 cycli) vanwege de instabiliteit van de voorraadoplossingen.
2. Bereiding van houtskoolbehandeld kweekmedium
- Weeg in een buis 280 mg actieve kool en voeg 5 ml van het vloeibare medium toe dat is bereid om de cellen van belang te cultiveren.
- Schud de buis met het medium en houtskool op een see saw rocker gedurende 2 uur, bij kamertemperatuur (stel snelheid in op 50 oscillaties/min). Centrifugeer vervolgens de buizen gedurende 15 minuten op 6000 x g.
- Verwijder de buis van de centrifuge en verzamel voorzichtig het supernatant zonder het sediment te verstoren. Herhaal indien nodig centrifugatie om alle houtskoolresten te verwijderen.
- Filter het supernatant met een spuitfilter van 0,45 μm.
- Zorg ervoor dat het voorbehandelde kweekmedium van houtskool geen kynureninessporen heeft door een proefmonster uit te voeren op LC-MS zoals beschreven in stap 6.3.2. Herhaal anders stap 2.1-2.4.
OPMERKING: Als het volledige kweekmedium in eerste instantie geen kynurenines bevat, kan zuiveringsstap met houtskool worden weggelaten. Bereid in dit geval kalibratienormen en kwaliteitscontrolemonsters voor met behulp van het volledige medium dat gewoonlijk is voorbereid voor celculuring. - Bewaar het bereide medium op 4 °C tot de analyse.
3. Het maken van de kalibratieoplossingen en kalibratiecurven
- Spike het houtskool voorbehandelde kweekmedium met 0,75 μL van 0,1 g/L 3NT-oplossing en voeg vier normen (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) toe aan ten minste zes verschillende concentraties om kalibratiebereiken te dekken. Houd het uiteindelijke volume van elk monster op 150 μL. Vortex goed. Gebruik 1,5 ml centrifugebuizen voor monstervoorbereiding.
OPMERKING: Voorgestelde kalibratiepunten voor 3HKyn: 0,018, 0,045, 0,22, 1,12, 2,23, 4,46 μmol/L; voor Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/L; voor 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/L; voor XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/L. - Voeg 150 μL koude methanol (bewaard bij -20 °C) met 1% (v/v) mierenzuur toe aan elke buis voor monsterdeproteïnisatie. Sluit de buizen en vortex goed.
- Incubeer de monsters bij -20 °C gedurende 40 minuten.
- Centrifugeer de monsters bij 14.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Verwijder de buizen van de centrifuge. Verzamel supernatanten in de nieuwe buizen. Verstoort het sediment niet.
- Breng 270 μL van het supernatant over in de glazen flacon met behulp van een automatische pipet. Doe de flacons in de verdamper en verdamp zachtjes tot ze droog zijn. Gebruik het juiste programma voor water/methanolfracties om vluchtige componenten te verdampen. Breng geen temperatuur aan hoger dan 40 °C en vermijd overdrogen.
OPMERKING: Glazen flacons met platte bodem, d.w.z. chromatografische flacons vergemakkelijken een snellere verdamping en hogere terugwinning in vergelijking met plastic conische buizen. - Controleer na 30 minuten de verdampingsstatus. Ga indien nodig verder met verdampen (voeg bijvoorbeeld 10 minuten extra toe). Vermijd overdrogen.
- Verwijder de flacons van de verdamper. Reconstitueren elk monster in 60 μL van 0,1% (v/v) mierenzuur in water. Voeg het oplosmiddel toe aan de flacon die het restmateriaal bevat. Sluit de flacons en vortex-put goed.
- Breng het monster over in een tube van 1,5 ml en draai gedurende 15 minuten bij 4 °C op 14.000 x g om het neergeslagen eiwit te scheiden.
- Zonder de eiwitkorrel te storen, breng de supernatanten over in chromatografische flacons met conische glazen inzetstukken met een automatische pipet. Sluit de flacons goed af.
- Controleer op de aanwezigheid van luchtbellen in de injectieflacon en verwijder ze indien nodig (bijv. door vortexing).
- Breng de chromatografische flacons met monsters over in LC autosampler. Noteer de positie van monsters die in een autosamplerlade zijn geplaatst.
4. Voorbereiding van kwaliteitscontrole (QC) monsters
- Spike het voorbehandelde kweekmedium van houtskool (bereid in een centrifugaalbuis van 1,5 ml) met 0,75 μL van 0,1 g/L 3NT-oplossing en normen van vier kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) in één concentratie geselecteerd uit het lineaire bereik van de kalibratiecurven. Houd het uiteindelijke volume van het monster op 150 μL.
OPMERKING: Bereid indien van toepassing verschillende QC-monsters voor in verschillende concentraties die onder het lineaire bereik van de kalibratiecurve vallen. - Volg het protocol beschreven in sectie 3 (stappen 3.2-3.11).
5. Instellen van het LC-MS systeem
- Bereid de mobiele fase-oplosmiddelen voor: Oplosmiddel A: 20 mmol/L ammoniumformaat in ultrapaanwater (pH 4.3 aangepast met mierenzuur); Oplosmiddel B: 100% acetonitril.
OPMERKING: Gebruik alleen borosilicaatglasflessen. Spoel flessen af met ultrapure water voordat u het bijvult. Gebruik geen flessen die met reinigingsmiddelen zijn gereinigd.
LET OP: Acetonitrile veroorzaakt ernstige gezondheidseffecten of overlijden. Het wordt gemakkelijk aangestoken door hitte. Acetonitril vloeistof en damp kunnen ogen, neus, keel en longen irriteren.- Bereid 5 mol/L bouillonoplossing van ammoniumformaat door een kristallijn reagens (15,77 g) in 50 ml ultrapure water in een glazen fles op te lossen. Roer tot alle resten oplossen. Filtreer door het membraan van 0,45 μm om restafval te verwijderen (bijv. met behulp van een nylon spuitfilter). Bewaar de voorraadoplossing op 4 °C.
- Bereid oplosmiddel A door 4 ml van 5 mol/L ammoniumformaat in water toe te voegen aan 980 ml ultrapure water in een amberkleurige glazen fles en roer goed. Dompel een roerstaaf onder en leg de fles met het oplosmiddel op een magneetroerder. Dompel een pH-elektrode onder in de oplossing en controleer de pH onder roeren. Voeg mierenzuurvoorraadoplossing toe (98%-100%) dropwise met behulp van een automatische pipet met 0,2 ml tip om pH 4.3 te verkrijgen, stel het volume in tot 1 L met ultrapure water en roer goed.
OPMERKING: Bereid de oplosmiddelen minstens één keer per week voor om microbiële groei te voorkomen.
LET OP: Mierenzuur (FA) is giftig bij inademing en veroorzaakt brandwonden aan de huid en oogbeschadiging. Werk onder de afzuigkap; draag beschermende handschoenen en jas. - Filter alle oplossingen door het membraan van 0,22 μm (bijv. nylon spuitfilter) om eventuele restafval te verwijderen. Gebruik optioneel de oplosmiddelinlaatfilters voor LC-oplosmiddelreservoirs om het systeem te beschermen tegen binnenkomende deeltjes.
- Start LC-MS-besturings- en gegevensverwervingssoftware.
- Zuiver het LC-systeem met de mobiele fase om bellen te verwijderen en alle oplosmiddelkanalen te primen.
- Ensemble een beschermkolom om de analytische kolom te beschermen tegen verstopping.
- Spoel de beschermkap en analytische kolom (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) gedurende ongeveer 30 minuten door met 100% acetonitril en vervolgens met 100% oplosmiddel A totdat een stabiele druk in de kolom wordt waargenomen. Bedien de systeemprestaties met behulp van de besturingssoftware.
- Stel de juiste LC-parameters in de software voor gegevensverwerving in.
- Stel het gradiëntprogramma in: 0-8 min oplosmiddel B 0%; 8-17 min oplosmiddel B 0-2%; 17-20 min oplosmiddel B 2%; 20-32 min oplosmiddel B 10-30%; 32-45 min oplosmiddel B 0%.
- Stel het mobiele fasedebiet in op 0,15 ml/min, totale analyseduur gedurende 45 min, kolomtemperatuur op +40 °C en injectievolume op 10 μL.
- Stel de aanschafparameters van de massaspectrometriedetector in.
- Ionisatieparameters toepassen: enkelvoudige ionenbewaking (SIM), positieve ionisatie, verneveldruk van 50 psi, +350 °C drooggastemperatuur, drooggasstroom van 12 L/min en 5500 V capillaire spanning.
- Selecteer de analytbewakingsionen: voor 3HKyn m/z 225.0 (scanperiode: 2-6 min, fragmentorspanning: 100 V); voor Kyn m/z 209.0 (scanperiode: 6-12 min, fragmentorspanning: 80 V); voor 3HAA m/z 154,0 (scanperiode: 12-18 min, fragmentorspanning: 80 V); voor 3NT m/z 227,0 (scanperiode: 18-23 min, fragmentorspanning: 100 V); voor XA m/z 206.0 (scanperiode: 23-45 min, fragmentorspanning: 100 V).
- Maak een werklijst en voer voorbeelden uit op het LC-systeem.
- Voer eerst, vóór de analyse van de experimentele monsters, een blanco monster (oplosmiddel A) uit, ten minste in drievoud, gevolgd door één QC-monster.
- Open de data-analysesoftware en laad de verkregen resultaten voor het QC-monster.
- Controleer de positie van analytpieken op het chromatogram. Wanneer signalen verder gaan dan de verwachte positie, pas dan de tijdpoorten aan voor de juiste analytsignalenverzameling. Zie de softwarehandleiding voor instructies over signaalintegratie.
6. De kalibratiecurve construeren
- Voeg in de software voor gegevensverwerving kalibratiestandaarden toe aan de werklijst en voer de standaarden in drievoud uit.
- Integreer en meet het piekgebied dat overeenkomt met 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT en XA bij de retentietijd van respectievelijk ongeveer 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min en 30 min.
- Maak afzonderlijke kalibratiecurven voor elke metaboliet met behulp van een spreadsheetprogramma.
- Als u het kalibratiegrafiek wilt maken, plot u de waarde voor een verhouding van het analytenpiekgebied over het 3NT-piekgebied versus de concentratie van de analyt.
- Analyseer het blanco monster (houtskoolvoorbehandeld kweekmedium alleen met 3NT) om er zeker van te zijn dat er geen spoor is van de bestudeerde analyten in het medium. Trek anders de verkregen waarde af van elk kalibratiepunt.
- Controleer de lineariteit van elke kalibratiecurve.
- Afzonderlijk, voor elke analyt, maak een helling-onderschepping lineaire vergelijking (y = ax +b), waarbij y overeenkomt met de verhouding van het analyt piekgebied versus 3NT piekgebied, a is de helling, x is de analytenconcentratie (μmol/L), en b verwijst naar de curve onderschepping. Het plotten van de grafiek 'y' versus 'x' genereert de kalibratiecurve.
- Voeg een lineaire trendlijn toe aan de grafiek, geef de kalibratiecurvevergelijking en regressiecoëfficiënt weer in de grafiek. Zorg ervoor dat de regressiecoëfficiënt > 0,990 is. In geval van niet-overeenkomende kalibratienormen, bereid deze opnieuw voor en/of analyseer deze opnieuw. Wijzig optioneel het concentratiebereik van de kalibratiecurve.
- Analyseer de QC-monsters om de systeemprestaties te controleren voordat u de experimentele monsters analyseert. In geval van onverenigbaarheden (± 20% afwijking van de referentiewaarde) de nieuwe kalibratiecurven voorbereiden.
7. In vitro celkweek en monsterverzameling voor analyse
- Plaat de bestudeerde kankercellen (MDA-MB-231 of SK-OV-3) in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) met 4,5 g/L ᴅ-glucose, 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS), 2 mmol/L ʟ-glutamine en 1 U penicilline/streptomycine en kweek bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 om ze voor het experiment uit te breiden. Passage de cellen bij 80% van de samenvloeiing.
- Maak cellen los van de kweekschaal met trypsine, zaad voor het experiment op 12-putplaten met een dichtheid van 0,3 × 106 cellen per put en plaats 's nachts in een incubator.
- Aspireer de volgende dag het kweekmedium en voeg verse DMEM toe met of zonder toevoeging van de bestudeerde verbindingen, afhankelijk van het experimentele ontwerp.
- Verzamel na 48 uur het medium van boven de cellen (ongeveer 500 μL) in een buis van 1,5 ml. Centrifugeer op 14.000 x g gedurende 5 minuten om eventuele celresten te verwijderen. Verzamel het supernatant en bewaar bij -80 °C tot de analyse.
- Bewaar de cellulaire pellet van stap 7.4 voor eiwitschatting. Vries de monsters in bij -20 °C.
OPMERKING: De resultaten die voor een medium uit verschillende putten worden verkregen, moeten worden genormaliseerd tot het totale eiwitgehalte om rekening te houden met de variabiliteit in celnummer in afzonderlijke putten. De eiwitconcentratie kan worden beoordeeld zoals beschreven in stap 9.
8. Bereid monsters voor op LC-MS-analyse
- Ontdooi het bevroren monster op kamertemperatuur en meng goed. Breng 149,25 μL van het kweekmedium over in een centrifugatiebuis (1,5 ml).
- Voeg 0,75 μL 0,1 g/L 3NT-oplossing (interne standaard) toe. Sluit de buizen en vortex goed.
- Voeg 150 μL gekoeld bij -20 °C methanol met 1% (v/v) FA toe voor monsterdeproteïnisatie. Sluit de buizen en vortex goed.
- Ga verder met de monstervoorbereiding zoals beschreven in rubriek 3 (stappen 3.3-3.11).
OPMERKING: Sommige kankercellen zoals SK-OV-3 scheiden grote hoeveelheden Kyn af in een kweekmedium. Om de gegevens in een lineair bereik van de kalibratiecurve te plaatsen, is een ongeveer 100-voudige verdunning van het monster noodzakelijk. Verdun in dit geval een deel van het monster met 0,1% (v/v) FA in water en analyseer naast het onverdunde monster. De referentiemonsters van normen voor de kalibratiecurve moeten worden bereid in 100 keer verdund volledig kweekmedium. U ook meer punten in de kalibratiecurve toevoegen (als de juiste oplosbaarheid en lineariteit worden bereikt) om deze aan te passen aan het concentratieniveau van Kyn in het experimentele monster. - Analyseer de monsters door LC-MS zoals beschreven in sectie 5. Maak een werklijst en voer elk voorbeeld in drievoud uit.
- Nadat de werklijst is voltooid, meet u het piekgebied van analyt.
- Genereer een spreadsheet met behulp van de beschikbare software en de verkregen numerieke gegevens.
- Bereken in één spreadsheetkolom de verhouding van het analytpiekgebied over het 3NT-piekgebied.
- Gebruik een individuele lineaire kalibratievergelijking die is toegewezen voor elke analyt (vanaf stap 6.3.) om concentraties van analyten in de experimentele monsters te berekenen.
9. Beoordeling van eiwitgehalte en datanormalisatie
- Resuspendeer de cellulaire pellet uit stap 7.5 met 100 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in 1,5 ml buis.
OPMERKING: Bereid PBS-oplossing door 8 g natriumchloride, 0,2 g kaliumchloride, 1,44 g natriumfosfaat dibasic, kaliumdihydrogenfosfaat op te lossen in 950 ml ultrapure water. Goed roeren. Stel de pH in op 7,4 met zoutzuur (druppelsgewijs). Stel het volume in tot 1 L met ultrapaan water. Roer goed tot het homogeen is.
LET OP: Zoutzuur is zeer corrosief en moet met passende veiligheidsmaatregelen worden behandeld. Contact met de menselijke huid kan roodheid, pijn, brandwonden van de huid veroorzaken. Werk onder de afzuigkap; draag beschermende handschoenen en jas. - Vries de monsters in bij -20 °C en ontdooi vervolgens op ijs. Herhaal deze stap 3x.
- Centrifugeer de monsters bij 14.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Verzamel de supernatanten in de nieuwe buizen. Stoor de pellet niet.
- Verdun de supernatanten 10x met PBS.
- Bouw een kalibratiecurve van 0 tot 2 μg eiwit per putbereik.
- Bereid de standaardoplossing voor runderserumalbumine (BSA) voor de kalibratie. Los 1,23 μg BSA op in 1 ml ultrapaanwater en vortexput.
- Laad op een plaat met 96 putten verschillende hoeveelheden BSA-standaardoplossing (1,23 μg/ml): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
- Vul de put met PBS tot het uiteindelijke volume van 50 μL.
- Laad 10 - 15 μL cel lysaat vanaf stap 9.4 op dezelfde 96-putplaat. Vul de putten met PBS om het uiteindelijke volume van 50 μL te bereiken.
OPMERKING: Pas indien nodig het volume van de cel lysaat aliquot in elke put aan om in het lineaire bereik van de kalibratiecurve te passen. Houd het uiteindelijke volume op 50 μL van het monster per put. - Voeg 200 μL van een Bradford-reagens (5 keer verdund met ultrapure water) toe aan elke put.
- Incubeer de 96-put paté gedurende ten minste 5 minuten op kamertemperatuur. Plaats de plaat in een microplaatlezer. Meet de absorptie bij λ = 595 nm.
- Maak een kalibratiecurve met behulp van een spreadsheetprogramma. Plot de BSA-hoeveelheid (μg) versus absorptie. Voeg een lineaire trendlijn toe, geef de kalibratiecurvevergelijking en regressiecoëfficiënt weer in de grafiek.
- Gebruik de lineaire vergelijking (y = bijl +b, waarbij y overeenkomt met de absorptie bij λ = 595 nm, a is de helling, x is een eiwitgehalte (μg) en b verwijst naar de curve-interceptie) om de eiwithoeveelheid in het monster te berekenen.
OPMERKING: Overweeg een monsterverdunningsfactor bij berekeningen. - Gebruik het geschatte eiwitgehalte om de kynureninehoeveelheid in het monster per 1 mg eiwit te normaliseren. Om dit te doen, verdeel de concentratie kynurenines bepaald in stap 8.9 met het totale eiwitgehalte van stap 9.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LC-MS biedt onbetwistbare voordelen bij de kwantificering van biologisch actieve moleculen, hoewel sommige componenten van complexe specimens zogenaamde matrixeffecten veroorzaken en de ionisatie van analyten in gevaar brengen. Het leidt tot ionenonderdrukking of ionenverbetering, sterk afnemende nauwkeurigheid en beïnvloedt een detectie-/kwantificeringsgrens van LC-MS, die wordt beschouwd als een "zwak" punt van de methode. In ons protocol worden de ionen gegenereerd door elektrospray-ionisatie (ESI) in de positieve modus, die ook werd gebruikt in andere studies naar Trp-metabolietenbepaling13. ESI is echter gevoeliger voor matrixeffecten dan atmosferische drukchemische ionisatie (APCI)28. Voor een nauwkeurige kwantificering van Trp-metabolieten in een celkweekmedium gebruikten we dus een interne standaard en matrixgematchte kalibratie om de matrixafhankelijke effecten op het analytsignaal te compenseren en het verlies van de doelverbindingen tijdens een monstervoorbereidingsstap te corrigeren. We pasten dezelfde interne standaard (3NT) toe voor alle bestudeerde analyten (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA). 3NT werd niet gevonden in het oorspronkelijke, verse medium dat werd gebruikt voor celcultiuring en vertoont een vergelijkbaar gedrag zoals doelverbindingen onder de toegepaste analytische omstandigheden. Dat maakt 3NT de juiste interne standaard27. Om het protocol te vereenvoudigen, om het toegankelijker te maken voor een brede groep gebruikers, stellen we bovendien slechts één stap van monsterpreparaat voor waarbij eiwitten worden verwijderd door behandeling met methanol die 1% (v/v) FA bevat.
Binnen het gepresenteerde protocol wordt aanbevolen om de kalibratiecurven voor te bereiden met behulp van het volledige medium dat wordt gebruikt voor celkweek. Het kweekmedium kan echter endogene Kyn bevatten die de juiste schatting van het analytpiekgebied verstoort, vooral in de kalibratieoplossingen bij lage concentraties. Figuur 1A illustreert de LC-SQ resultaten verkregen tijdens de analyse van DMEM met 4,5 g/L D-glucose (DMEM-HG) en 10% (v/v) FBS gebruikt door onze groep voor een kankercelkweek. We hebben ontdekt dat het verse complete kweekmedium in eerste instantie wat Kyn bevat dat kan worden verwijderd door zuivering met actieve kool (figuur 1B). Tijdens het analyseren van de experimentele monsters werd het volledige DMEM-HG-kweekmedium ook geanalyseerd als een controlemonster en werd het Kyn-piekgebied afgetrokken van het piekgebied dat voor Kyn in elk getest monster werd geregistreerd.
Figuur 1: Representatieve LC-SQ resultaten van het volledige DMEM-HG kweekmedium (A) voor en (B) na voorbehandeling op actieve kool. Monsters van kweekmedium werden gepiekt met dezelfde hoeveelheid van de interne standaard (3NT). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In de volgende stap werd een retentietijd voor elke doelanalyt vastgesteld (zie een chromatogram in figuur 2A). De goede praktijk in LC-MS-analyse is om een QC-monster vóór de werkelijke monsters uit te voeren om de juiste retentietijden van de analyten te bevestigen. Af en toe kan een verschuiving in LC-signalen worden waargenomen en komen er meestal mismatches voor. Figuur 2B toont een lichte verandering in de retentietijden van de analyten, die echter de juiste metingen niet verstoort. Aan de andere kant geeft figuur 2C een significante verandering in de positie van de doelpieken. Zoals te zien was, werd het 3NT-signaal aanzienlijk verschoven naar een kortere retentietijd en kwam het uit de ingestelde tijdpoort. In dit geval was een passende kwantitatieve analyse onmogelijk omdat het interne standaardsignaal niet correct kan worden gemeten. Dit kan te wijten zijn aan verschillende factoren, namelijk onvoldoende kolomevenwicht, onjuiste menging van de oplosmiddelen in de pomp, gebruik van ongepast monsterverdunningsmiddel of verontreiniging van de stationaire kolomfase. Figuur 2Dvertegenwoordigt echter een situatie waarin de geregistreerde pieken te kampen hebben met ernstig lage intensiteiten. Dit kan het gevolg zijn van een injectiefout, een lek in het systeem of MS-schade. Bovendien kunnen de co-eluting matrixcomponenten ionen genereren met m/z geselecteerd voor de doelanalyten, zoals in figuur 3A, waar het resultaat van de analyse van het MDA-MB-231 cellenkweekmedium wordt weergegeven. Bij de retentietijd van ongeveer 25 min werd een sterk signaal waargenomen dat afkomstig was van een onbekende matrixcomponent (verbinding X). De piek verschijnt in de scanperiode, toen het ion van m/z 206 (geselecteerd voor XA) werd gecontroleerd. Dit signaal komt echter niet overeen met de analyt als gevolg van incompatibiliteit van de retentietijd. Om fouten tijdens piekintegratie te voorkomen, wordt ook een vergelijking van de bewaartijd met die voor QC-monsters aanbevolen.
Figuur 2. Voorbeelden van correcte en onjuiste resultaten. De juiste chromatogrammen van QC-monsteranalyse bij (A) gemiddelde en (B) lage concentratieniveaus geregistreerd in verschillende dagen. Voorbeeld van het onjuiste chromatogram als gevolg van significante veranderingen in de retentietijden van de analyten (C) en onbevredigende intensiteiten van pieken (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Representatieve resultaten van kweekmedium verzameld uit verschillende kankercellijnen. Kweekmedium uit (A) MDA-MB-231 (menselijke borstkanker) en (B) SK-OV-3 (menselijke eierstokkanker) cellen werd geanalyseerd met behulp van LC-SQ. De verbinding X geeft het signaal aan van een onbekende verbinding aanwezig in het kweekmedium dat co-elutes met de analyt en ioniseert om een ion te vormen met m/z geselecteerd voor de analyt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het kweekmedium dat wordt gebruikt voor kankercellen (DMEM) bevat aanzienlijke hoeveelheden Trp. De isotoop (13C-Trp) heeft hetzelfde ion als XA (m/z 206) en kan de bepaling van XA verstoren. Onder de toegepaste chromatografische omstandigheden is het signaal van Trp echter goed gescheiden van het XA-signaal. Daarom concludeerden we dat Trp in DMEM geen invloed heeft op de XA-kwantificering en nauwkeurigheid van de methode (figuur 4).
Figuur 4. Positie van tryptofaan (Trp) en xanthurenic acid (XA) signalen op MS chromatogram. Standaardoplossingen van Trp (49,0 μmol/L) en XA (48,8 μmol/L) werden bereid in Solvent A (20 mmol/L ammoniumformaat in water, pH 4.3) onder geoptimaliseerde LC-SQ-omstandigheden. De ionen van m/z 205 (overeenkomend met [Trp+H]+) en m/z 206 (overeenkomend met [XA+H]+) werden gecontroleerd op respectievelijk Trp en XA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De gepresenteerde analysemethode slaagde met succes voor de validatietest in termen van lineariteit, precisie (variatiecoëfficiënten ≤15%), nauwkeurigheid (96-104%), herstel (96-119%) en matrixeffecten voor alle analyten, zoals het in detail werd beschreven in ons vorige artikel 27.
Ten slotte bevestigden we een toepassing van de beschreven analytische benadering op een medium dat is verzameld uit de in vitro gekweekte menselijke kankercellen. Onze gegevens bevestigden dat een niveau van kynurenines aanzienlijk kan variëren in een kweekmedium dat is verzameld uit verschillende celtypen (figuur 3). We analyseerden het kweekmedium van 2 soorten kankerlijnen, d.w.z. MDA-MB-231- en SK-OV-3-cellen afgeleid van respectievelijk borst- en eierstokkanker. De geselecteerde lijnen worden vaak gebruikt als modellen om moleculaire gebeurtenissen te bestuderen en voor het testen van geneesmiddelen tegen kanker. Zoals we zagen, gaven de cellen gekweekt in een controlestandaard medium verschillende hoeveelheden tryptofaanmetabolieten vrij, d.w.z. MDA-MB-231-cellen gaven een kwantificeerbare hoeveelheid Kyn en XA vrij bij een lage nmol/L-concentratie (figuur 3A), terwijl SK-OV-3-cellen significant meer Kyn vertoonden, een zeer lage afscheiding van XA, en geen afscheiding van andere bestudeerde kynurenines zoals aangegeven door de intensiteit van de overeenkomstige pieken (figuur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel presenteert een gedetailleerd LC-SQ-protocol voor de gelijktijdige kwantificering van vier belangrijke Trp-metabolieten (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) die worden gemeten in een medium uit in vitro gekweekte menselijke kankercellen. Speciale aandacht wordt besteed aan het monsterpreparaat, de chromatografische/massaspectrometrieprocedure en de gegevensinterpretatie, de belangrijkste punten binnen de analyse.
Over het algemeen vereist LC-MS-analyse, vanwege hoge gevoeligheid, de hoogste normen van een protocol striktheid en zuiverheid van gebruikte materialen. Het verwijst naar een toepassing van netjes gereinigd en goed gewassen glaswerk, evenals hoogwaardige chemicaliën tijdens de standaardprocedure. Het is erg belangrijk om oplosmiddelen op basis van zoet water uit een mobiele fase te gebruiken om microbiële verontreiniging te voorkomen die bij deze gevoelige aanpak de analyse drastisch kan beïnvloeden. Alvorens in een LC-systeem te injecteren, moeten de geanalyseerde monsters zorgvuldig worden onderzocht op de aanwezigheid van onoplosbare deeltjes. Het is belangrijk op te merken dat de kolom vóór de steekproefanalyse voldoende in evenwicht moet zijn. Het niet naleven van deze regels kan leiden tot verontreiniging van de monsters, het LC-systeem en de analytische kolom of tot onvoldoende monsterionisatie in MS-bron, wat uiteindelijk een verschuiving van signalen veroorzaakt.
Er zijn 2 belangrijke punten binnen het protocol die benadrukt moeten worden om optimale resultaten te behalen. Het meest kritieke onderdeel in het gepresenteerde protocol is de voorbeeldvoorbereidingsstap. Het gebruik van een ontoereikende procedure veroorzaakt een verlies van doelverbindingen en bijgevolg onnauwkeurige kwantificering. In onze aanpak, tijdens de methodeontwikkeling, werd de monstervoorbereidingsstap zorgvuldig geoptimaliseerd, samen met de selectie van het oplosmiddel voor eiwitverwijdering. Zoals we hebben vastgesteld, leverde een monsterbehandeling met methanol die 1% (v/v) mierenzuur bevat, de beste herstelte voor alle bestudeerde kynurenines. De impact van een mobiele fasesamenstelling op de mate van analytionisatie werd ook geëvalueerd. We hebben mobiele fasen gecontroleerd bestaande uit 0-20 mmol/L ammonium formate of ammoniumacetaat bij verschillende pH aangepast met mierenzuur of azijnzuur. De mobiele fase met 20 mmol/L ammoniumformaat in water (pH 4.3, oplosmiddel A) en acetonitril (oplosmiddel B) bood de best mogelijke voorwaarden voor de gelijktijdige kwantificering van Kyn, 3HKyn, 3HAA en XA27. Een andere belangrijke stap in de LC-MS-analyse is piekintegratie. Sommige kynurenines komen voor in een monster bij zeer lage concentratieniveaus. In dit geval kunnen de signalen van co-elutingverbindingen overlappen met het doelanalytsignaal of een piek genereren bij een vergelijkbare retentietijd. Een onervaren gebruiker van deze methode kan problemen ondervinden met een correcte piekintegratie, zoals geïllustreerd in figuur 2C. Het controleren van de bewaartijd voor de analyten en het vergelijken met een QC-monster is dus vereist en wordt ten zeerste aanbevolen.
Goede analytische praktijken omvatten het selecteren van een geschikte interne standaard voor een kwantitatieve analyse. Hierin stellen we een eenvoudige en kosteneffectieve aanpak voor met slechts één interne standaard (3NT) als analoog van vier kynurenines. De resultaten bevestigden dat 3NT vergelijkbaar chromatografisch gedrag vertoont zoals de doelverbindingen en dat het daardoor een goede precisie en nauwkeurigheid van de methode27mogelijk maakt. Onder de toegepaste LC-omstandigheden is de 3NT-piek goed gescheiden van de signalen van de andere analyten en gemakkelijk te meten. We realiseren ons dat isotopisch gelabelde interne normen (ILIS) die in dergelijke analyses worden gebruikt14,15 een betere compensatie van matrixeffecten en een betere controle van alle variabelen zullen bieden die tot valse resultaten kunnen leiden. Aan de andere kant zijn ILISs voor alle doelanalyten niet altijd gemakkelijk beschikbaar, laat staan hun hoge kosten. Ook zijn ILISs eerder bedoeld voor LC-MS/MS dan LC-SQ met Single Ion Monitoring (SIM) modus die we in dit artikel hebben gebruikt.
Het gebruik van 3NT als interne standaard kan hier worden beschouwd als een beperking van de methode vanwege een mogelijkheid van 3-nitrotyrosinevorming op eiwitten29. In het geval van een kweekmedium hebben we echter geen gratis endogene 3-nitrotyrosine gewaarlozen. Hiermee kunnen we 3NT herkennen als een geschikte interne standaard. We raden echter een voorafgaande beoordeling van een eerste endogene 3NT-niveau aan, vooral bij het bestuderen van andere celtypen dan getest in dit rapport.
Kortom, bij het selecteren van een analoog van een analyt moet men rekening houden met veel kenmerken, zoals chemische gelijkenis en initiële afwezigheid in een monstermatrix. Bovendien kan een stabiliteit van de analoge interne standaard in een monstermatrix, de terugwinning en ionisatie-efficiëntie ervan in aanwezigheid van matrixcomponenten verschillen van de doelverbindingen. Al deze kenmerken moeten dus worden overwogen en zorgvuldig worden onderzocht tijdens de ontwikkeling van methoden.
Het analysesysteem in de gepresenteerde methode bestaande uit een MS-detector stelde ons in staat om lage detectielimieten te bereiken (0,0033 – 0,0108 μmol/L)27. Op deze manier gelijktijdige metingen van 3HKyn, Kyn, 3HAA, XA binnen de concentratiebereiken van respectievelijk 0,018 - 4,46 μmol/L, 0,0096 - 3,84 μmol/L, 0,033 - 13,06 μmol/L en 0,019 – 4,87 μmol/L werd bereikt. De belangrijkste beperking van elke LC-SQ-analyse wordt geassocieerd met een goede scheiding van monstercomponenten op een LC-kolom. Slechte scheiding draagt bij aan een lagere selectiviteit in vergelijking met de detectie met een tandem viervoudige massaspectrometrie met behulp van productionen en MRM-modus (Multiple Reaction Monitoring). Om interferenties van andere matrixcomponenten die dezelfde of vergelijkbare ionen delen met een doelmolecuul te voorkomen, moeten de LC-scheidingsomstandigheden zorgvuldig worden geoptimaliseerd. Als voorbeeld genereert 13C Trp-isotoop (aanwezig in traceerhoeveelheden) hetzelfde ion van m/z 206 als geselecteerd voor XA-monitoring. De verkeerde interpretatie werd hier vermeden door de chromatografische omstandigheden te optimaliseren en Trp en XA voldoende te scheiden van de kolom (figuur 4).
In de toekomstige toepassingen kunnen enkele wijzigingen in het protocol worden geïmplementeerd. Een potentiële gebruiker kan een concentratie van de interne standaard (3NT) wijzigen wanneer de niveaus van bestudeerde kynurenines naar verwachting zullen dalen als gevolg van de hier gepresenteerde concentraties. Belangrijk is dat de 3NT-concentratie zowel in de kalibratienormen als in de experimentele monsters gelijk moet zijn. In het geval van een extreem hoog analytgehalte, zoals Kyn waargenomen in SK-OV-3 cellen, raden we aan om met een hogere concentratie 3NT te werken. Als monsterverdunning nodig is, gebeurt dit in de laatste stap van het protocol, voordat het monster op de LC-kolom wordt toegediend.
In de literatuur worden enkele protocollen voorgesteld voor LC-MS/MS kwantitatieve analyse van kynurenines in een kweekmedium uit verschillende cellen. Eén protocol biedt een gelijktijdige bepaling van 3 metabolieten, d.w.z. Kyn, 3HKyn en 3HAA, maar het is minder gevoelig (limiet van kwantificeringen (LOQ) op hogere niveaus), in tegenstelling tot onze methode21. Een ander rapport presenteerde een methode die kwantificering van 4 kynurenines mogelijk maakt, waaronder Kyn, 3HKyn, 3HAA en XA met vergelijkbare LOQ's25. Geen van hen werd echter geoptimaliseerd voor de detectie van kynurenines gegenereerd door in vitro gekweekte kankercellen. De componenten van een monstermatrix beïnvloeden de analytionisatie in ms-bron door het signaal te verminderen of te verhogen, wat een oorzaak is van onbetrouwbare resultaten. Om nauwkeurigere gegevens te verkrijgen, stelden we voor om een analoge interne standaard (3NT) te gebruiken in combinatie met een matrixgematchte kalibratie voor een betere compensatie van matrixafhankelijke effecten.
Met behulp van de gepresenteerde methodologie konden we vaststellen dat Kyn de meest voorkomende Trp-metaboliet was in een kweekmedium dat werd verzameld uit de geanalyseerde kankerceltypen, terwijl de andere bestudeerde metabolieten onder controle kweekomstandigheden niet werden gedetecteerd (exclusief XA aanwezig in sporen, maar detecteerbare hoeveelheden). Toen de cellen echter werden gestimuleerd met een krachtige immuunactivator - bacteriële lipopolysaccharide, werd een grotere hoeveelheid XA naast Kyn uitgescheiden. Aan de andere kant waren de gedetecteerde 3HKyn en 3HAA die vóór XA binnen KP worden gevormd, nog steeds onder LOQ27. Dit suggereert dat sommige KP-metabolieten die in kleine hoeveelheden in een kweekmedium aanwezig zijn, moeilijk te meten zijn met behulp van de voorgestelde LC-SQ-benadering. Niettemin is het gepresenteerde protocol nuttig om veranderingen in KP te identificeren door kwantificering van de accumulerende sleutel Trp-metabolieten. Het gebruik van deze methodologie in toekomstige studies om een in vitro celkweeksysteem te betrekken, zal nieuwe biomarkers van immuungerelateerde ziekten en kanker opleveren. Onze aanpak biedt een gevalideerde en betrouwbare test met relevante gevoeligheid voor cellulaire modellen die uitdagend zijn vanwege lage concentraties van de downstream KP-metabolieten. De verstrekte instructies zullen onderzoekers uit verschillende gebieden in staat stellen om deze aanpak te gebruiken voor het kwantificeren van belangrijke kynurenines gerelateerd aan kanker en andere ziekten. Onze gegevens (ongepubliceerd) tonen aan dat het nuttig is voor het bestuderen van KP-modulatie in cellen die zijn blootgesteld aan verschillende glycatieproducten, maar het moet ook een toepassing vinden op andere onderzoeksgebieden en ziekten met immuuncomponent, d.w.z. in endometriumbiologie en reproductie30.
Het gepresenteerde protocol kan verder worden uitgebreid om extra analyten te bepalen die zich tijdens verschillende experimentele omstandigheden in een kweekmedium kunnen ophopen. De passende referentienormen voor analyten moeten worden gebruikt voor de validering van methoden in termen van nauwkeurigheid, nauwkeurigheid, lineariteit, terugwinning of selectiviteit voordat zij voor kwantitatieve analyses worden gebruikt. Afhankelijk van het onderzoeksdoel kan het protocol worden gebruikt voor individuele kynurenines (3HKyn, Kyn, 3HAA of XA). In dit geval kunnen de ionen die overeenkomen met verbindingen die niet in aanmerking komen voor analyse, uit de MS-instellingen worden verwijderd. De geschikte wijzigingen in het LC-verloopprogramma helpen bij het verkorten van de analysetijd.
Bij het bestuderen van KP is het relevant om de activiteit van IDO-enzym te beoordelen. Dit kan eenvoudig worden geschat door het Trp-verbruik en de afgifte van Kyn in een kweekmedium te meten of door een concentratieverhouding tussen kynurenine en tryptofaan te berekenen ([Kyn]/[Trp])31. In onze aanpak hebben we geen Trp-concentratie gemeten, maar het protocol kan worden uitgebreid door dit doel toe te voegen aan de LC-SQ-analyse. Als een meer biochemisch geschikte aanpak, raden we aan om IDO enzymatische activiteit uit te drukken als een hoeveelheid Kyn geproduceerd door cellen per milligram eiwit per minuut zoals elders gepresenteerd32. We hebben een voordeel opgemerkt bij het gebruik van deze aanpak in onze andere studies naar kankercellen (manuscript in voorbereiding) en bevelen deze methode aan bij het gebruik van het in vitro celkweekmodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Europese Unie van het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling in het kader van het Operationeel Programma Ontwikkeling oost-Polen 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), door de Faculteit Biotechnologie en Milieuwetenschappen van de John Paul II Catholic University of Lublin (Young Scientists grant for Ilona Sadok), Polish National Science Centre, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 voor Magdalena Staniszewska, Principle Investigator). De auteurs danken Prof. Agnieszka Ścibior van het Laboratory of Oxidative Stress, Centre for Interdisciplinary Research, JPII CUL voor het delen van de apparatuur voor celcultiuring en eiwitkwantificering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
| Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
| Analytical balance | Ohaus | ||
| Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
| Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
| Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
| Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
| Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
| Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
| Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
| Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
| Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
| Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
| Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
| Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
| Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
| See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
| Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
| Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
| Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
| Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
| Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
| Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
| Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
References
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
- Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
- Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
- Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
- Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
- Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).
- Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
- Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
- Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
- Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M.
- Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
- Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
- Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
- Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
- Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
- Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
- Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).
- Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
- Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
- Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
- Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
- Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
- Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
- Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
- Annesley, T. M.
- Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
- Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
- Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416 (2009).
- Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).
