Summary
Burada, tek bir dörtlüktolü kütle spektrometresi ile birlikte sıvı kromatografisi ile analiz edilen kanser hücre kültürlerinden toplanan ortamda kynurenine pathway'de (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, ksantürenik asit, 3-hidroksiranilik asit) üretilen dört farklı triptofan metabolitinin belirlenmesi için bir protokol açıklanmıştır.
Abstract
Kynurenine yolu ve kynurenines adı verilen triptofan katabolitleri, bağışıklık düzenlemesi ve kanser biyolojisinde rol almaları nedeniyle daha fazla ilgi gördü. Bir in vitro hücre kültürü testi genellikle farklı triptofan katabolitlerinin bir hastalık mekanizmasına katkısı hakkında bilgi edinmek ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılır. Salgılanan metabolitler ve sinyal molekülleri bakımından zengin olan hücre kültürü ortamı triptofan metabolizmasının ve diğer hücresel olayların durumunu yansıtır. Karmaşık hücre kültürü ortamında birden fazla kynureninin güvenilir bir şekilde ölçülmesi için yeni protokoller, birden fazla numunenin güvenilir ve hızlı bir şekilde analiz edilmesine izin vermek için arzu edilir. Bu, kütle spektrometresi ile birleştiğinde sıvı kromatografisi ile gerçekleştirilebilir. Bu güçlü teknik metabolitlerin nicelleştirilmesi için birçok klinik ve araştırma laboratuvarında kullanılır ve kynurenines ölçümü için kullanılabilir.
Burada sunulan, in vitro kültürlü kanser hücrelerinden toplanan ortamda dört kynureninin, yani kynurenine, 3-hidroksisinurenin, 3-hidroksiranilik ve ksantrinik asidin eşzamanlı belirlenmesi için tek dörtlü kütle spektrometresi (LC-SQ) ile birleştirilmiş sıvı kromatografinin kullanımıdır. SQ dedektörünün kullanımı kolaydır ve diğer kütle spektrometrelerine kıyasla daha ucuzdur. SQ-MS analizinde, numuneden birden fazla iyon oluşturulur ve belirli kütle-şarj oranlarına(m/z)göre ayrılır ve ardından Tek İyon İzleme (SIM) modu kullanılarak tespit edilir.
Bu makale, bildirilen yöntemin avantajlarına dikkat çeker ve bazı zayıf noktaları gösterir. Kromatografi ve kütle spektrometresi analizi ile birlikte numune hazırlama dahil olmak üzere LC-SQ analizinin kritik unsurlarına odaklanmıştır. Kalite kontrol, yöntem kalibrasyon koşulları ve matris etkisi konuları da tartışılmaktadır. 3-nitrotirozinin basit bir uygulamasını tüm hedef analitler için bir analog standart olarak tanımladık. İnsan yumurtalık ve meme kanseri hücreleri ile yapılan deneylerle doğrulanan LC-SQ yöntemi güvenilir sonuçlar üretir ve diğer in vitro hücresel modellere daha fazla uygulanabilir.
Introduction
Kynurenine pathway (KP), insan hücrelerinde triptofan (Trp) katabolizmanın ana yoludur. Ekstrahepatik hücrelerde indoleamin-2,3-dioksijenaz (IDO-1) KP'nin ilk ve sınırlayıcı enzimidir ve Trp'yi N-formilkynurenine1'edönüştürür. KP içindeki diğer adımlar, diğer ikincil metabolitleri, yani çeşitli biyolojik özellikler gösteren kynureninleri oluşturur. Kynurenine (Kyn), aryl hidrokarbon reseptörüne (AhR) bağlandıktan sonra toksik özellikleri gösteren ve hücresel olayları düzenleyen ilk kararlı Trp katabolitidir2. Daha sonra, Kyn kendiliğinden veya enzim aracılı süreçlerde çeşitli moleküllere dönüştürülür ve 3-hidroksiynurenine (3HKyn), antranilik asit (AA), 3-hidroksiranilik asit (3-HAA), kynurenic asit (Kyna) ve ksantürenik asit (XA) gibi metabolitler üretir. Başka bir downstream metabolit, 2-amino-3-karboksimonik asit-6-semialdehit (ACMS), kinolinik asit (QA) veya pikolinik asit (PA)1için enzimatik olmayan siklizyon geçirir. Son olarak, QA ayrıca nikotinamid-adenin dinükleotid (NAD+)3, önemli bir enzim kofaktörü olan KP uç nokta metabolitine dönüştürülür. Bazı kynureninler Kyna ve PA gibi nöroprotektif özelliklere sahipken, diğerleri, yani 3HAA ve 3HKyn,toksiktir 4. 3HKyn'den oluşan ksanturenik asit antioksidan ve vasorelaksasyon özellikleri sunar5. XA yaşlanma lenslerinde birikir ve epitel hücrelerinin apoptozlanmasına yol açar6. 20. yüzyılın ortalarında tanımlanan KP, çeşitli bozukluklara katılımı gösterildiğinde daha fazla ilgi gördü. Bu metabolik rotanın artan aktivitesi ve bazı kynureninlerin birikmesi immün yanıtı modüle eder ve depresyon, şizofreni, ensefalopati, HIV, demans, amyotrofik lateral skleroz, sıtma, Alzheimer, Huntington hastalığı ve kanser4,7gibi farklı patolojik durumlarla ilişkilidir. Trp metabolizmasında bazı değişiklikler tümör mikroçevronmentlerinde ve kanser hücrelerinde gözlenir2,8. Ayrıca, kynurenines umut verici hastalık belirteçleri olarak kabul edilir9. Kanser araştırmalarında, in vitro hücre kültürü modelleri iyi kurulmuş ve antikanser ilaçlara verilen yanıtların klinik öncesi değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır10. Trp metabolitleri hücreler tarafından kültür ortamına salgılanır ve kynurenine yolunun durumunu değerlendirmek için ölçülebilir. Bu nedenle, kolay, esnek ve güvenilir bir protokole sahip çeşitli biyolojik örneklerde mümkün olduğunca çok sayıda KP metabolitinin aynı anda tespiti için uygun yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır.
Bu yazıda, kanser hücrelerinden toplanan kültür sonrası bir ortamda LC-SQ tarafından Kyn, 3HKyn, 3HAA ve XA olmak üzere dört kynurenine yolu metabolitinin aynı anda belirlenmesi için bir protokol açıklıyoruz. Modern biranalitik yaklaşımda, Ehrlich reaktifi11,12kullanan biyokimyasal spesifik olmayan testlerin aksine, bireysel triptofan katabolitlerinin eşzamanlı tespiti ve niceliği için sıvı kromatografisi 13 , 14 , 15,16tercih edilir. Şu anda, insan örneklerinde kynurenines tayini için birçok yöntem mevcuttur, esas olarak ultraviyole veya floresan dedektörleri ile sıvı kromatografisine dayanmaktadır13,17,18,19. Sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi dedektörü (LC-MS) ile birleştiğinde, daha yüksek hassasiyetleri (daha düşük algılama sınırları), seçicilikleri ve tekrarlanabilirlikleri nedeniyle bu tür analizler için daha uygun görünmektedir.
Trp metabolitleri insan serumu, plazma ve idrar13,20,21,22,23'te zaten belirlenmiştir, ancak hücre kültürü ortamı gibi diğer biyolojik örnekler için yöntemler de istenmemektedir. Daha önce, LC-MS, interferon gama (IFN-γ) 24 ,25,26ile tedavi edilen insan glioma hücrelerinin, monositlerin, dendritik hücrelerin veya astrositlerin kültleştirilmesinden sonra toplanan bir ortamda Trp türevi bileşikler için kullanılmıştır. Şu anda, farklı kültür ortamlarında, hücrelerde ve kanser modellerinde kullanılan tedavilerde çeşitli metabolitlerin değerlendirilmesine izin verebilen yeni onaylanmış protokollere ihtiyaç vardır.
Geliştirilen yöntemin amacı, KP'deki anormallikleri gösterebilen dört ana kynurenines'i (bir analitik çalışma içinde) ölçmektir. Burada sunulan, in vitro kültürlü insan kanser hücrelerinden toplanan ortamda bir iç standart (3-nitrotirozin, 3NT) kullanılarak seçilen anlamlı kynureninlerin nicel LC-SQ analizi için yakın zamanda yayınlanan protokolümüzün kritik adımları27. En iyi bilgimize göre, in vitro yetiştirilen hücrelerden elde edilen bir kültür ortamında 3HKyn, 3HAA, Kyn ve XA'nın eşzamanlı olarak ölçülmesi için ilk LC-SQ protokolüdür. Bazı değişikliklerde, yöntem trp metabolizmasındaki değişiklikleri daha geniş bir hücre kültürü model yelpazesinde incelemek için daha fazla uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Standart 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standart stok çözümlerinin hazırlanması
- Reaktifleri bir şişede en yüksek doğrulukta (her biri 0,3 mg) tartın. Daha iyi doğruluk için, çözücünün hacmini adım 1.2'ye göre ayarlayarak reaktifleri ölçeklendirin.
- 1 g/L stok çözeltisi elde etmek için çözücünün 300 μL'sinde reaktifleri çözün. Dimetil sülfitte (DMSO) Kyn, 3HAA ve XA; Hidroklorik asit (HCl) ile pH 2.5'e asitlenmiş suda 3HKyn.
DİkKAT: 3HAA gözleri, burnu, boğazı ve akciğerleri tahriş eder. Solunduğunda, ciltle temas ettiğinde ve yutulduğunda zararlıdır. Eldiven ve maske gibi uygun korumayı takın. - Şişeyi sıkıca kapatın ve çözünmeyi hızlandırmak için 1 dakika boyunca ultrasonik bir banyoya yerleştirin.
NOT: Stok çözeltilerini -20 °C'de saklayın ve stok çözeltilerinin kararsızlığı nedeniyle donma/çözülmeyi (maksimum 3 döngü) en aza indirin.
2. Kömürle işlenmiş kültür ortamının hazırlanması
- Bir tüpte, 280 mg aktif kömür ağırlığında ve ilgi çekici hücreleri kültleme için hazırlanan sıvı ortamın 5 mL'sini ekleyin.
- Oda sıcaklığında (hızı 50 salınım / dk'ya ayarlayın) 2 saat boyunca bir testere sallayıcı üzerinde orta ve kömür ile tüpü sallayın. Ardından, tüpleri 15 dakika boyunca 6000 x g'da santrifüj edin.
- Tüpü santrifüjden çıkarın ve tortuyu bozmadan süpernatantı dikkatlice toplayın. Tüm kömür kalıntılarını gidermek için gerekirse santrifüjü tekrarlamayı tekrarlayın.
- Süpernatantı 0,45 μm şırınna filtresi kullanarak filtreleyin.
- Adım 6.3.2'de açıklandığı gibi LC-MS'te bir pilot örnek çalıştırarak kömür önceden işlenmiş kültür ortamının kynurenines izlerinden yoksun olduğundan emin olun. Aksi takdirde, 2.1-2.4 adımlarını yineleyin.
NOT: Tam kültür ortamı başlangıçta kynurenines içermiyorsa, kömür kullanarak arınma adımı atlanabilir. Bu durumda, genellikle hücre kültleme için hazırlanan komple ortamı kullanarak kalibrasyon standartlarını ve kalite kontrol örneklerini hazırlayın. - Hazırlanan ortamı analize kadar 4 °C'de saklayın.
3. Kalibrasyon çözümlerinin ve kalibrasyon eğrilerinin yapılması
- Kömür ön işlemli kültür ortamını 0,75 μL 0,1 g/L 3NT çözelti ile yükseltin ve kalibrasyon aralıklarını kapsayacak şekilde en az altı farklı konsantrasyonda dört standart (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) ekleyin. Her numunenin son hacmini 150 μL'de tutun. Numune hazırlama için 1,5 mL santrifüj tüpleri kullanın.
NOT: 3HKyn için önerilen kalibrasyon noktaları: 0.018, 0.045, 0.22, 1.12, 2.23, 4.46 μmol/L; Kyn için: 0.0096, 0.048, 0.24, 1.20, 2.40, 3.84 μmol / L; 3HAA için: 0.033, 0.16, 0.65, 3.27, 6.53, 13.06 μmol / L; XA için: 0.019, 0.13, 0.49, 1.22, 3.65, 4.87 μmol / L. - Numune deproteinizasyonu için her tüpe %1 (v/v) formik asit içeren 150 μL soğuk metanol (-20 °C'de tutulur) ekleyin. Tüpleri ve girdabı sıkıca kapatın.
- Numuneleri 40 dakika boyunca -20 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Numuneleri 14.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüj edin. Tüpleri santrifüjden çıkarın. Yeni tüplere süpernatants toplayın. Tortuyu bozmayın.
- Otomatik pipet kullanarak 270 μL'lik süpernatant'ı cam şişeye aktarın. Şişeleri evaporatöre koyun ve kuruyana kadar hafifçe buharlaşın. Uçucu bileşenleri buharlaşmak için su/metanol fraksiyonları için uygun programı kullanın. 40 °C'den yüksek sıcaklık uygulamayın ve aşırı kurumaya karşı kaçının.
NOT: Düz alt cam şişeler, yani kromatografik şişeler, plastik konik tüplere kıyasla daha hızlı buharlaşmayı ve daha yüksek geri kazanımları kolaylaştırır. - 30 dakika sonra buharlaşma durumunu kontrol edin. Gerekirse buharlaşmaya devam edin (örneğin, ekstra 10 dakika ekleyin). Aşırı kurumaktan kaçının.
- Şişeleri evaporatörden çıkarın. Her numuneyi sudaki %0,1 (v/v) formik asitin 60 μL'sinde yeniden inşa edin. Çözücüyü artık malzemeyi içeren şişeye ekleyin. Şişeleri ve girdabı sıkıca kapatın.
- Numuneyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve çökemiş proteini ayırmak için 4 °C'de 15 dakika boyunca 14.000 x g'da döndürün.
- Protein peletini bozmadan, süpernatantları otomatik pipetli konik cam uçlu kromatografik şişelere aktarın. Şişeleri sıkıca kapatın.
- Kesici uç şişesinde hava kabarcıklarının olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse çıkarın (örneğin, girdapla).
- Örnekleri içeren kromatografik şişeleri LC otomatik örnekleyiciye aktarın. Otomatik örnekleme tepsisine yerleştirilen örneklerin konumunu kaydedin.
4. Kalite kontrol (QC) örneklerinin hazırlanması
- Kömür ön işlemli kültür ortamını (1,5 ml santrifüj tüpte hazırlanmış) 0,75 μL 0,1 g/L 3NT çözeltisi ve dört kynurenin (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) standartları ile kalibrasyon eğrilerinin doğrusal aralığından seçilen bir konsantrasyonda başaklandırın. Numunenin son hacmini 150 μL'de tutun.
NOT: Varsa, kalibrasyon eğrisinin doğrusal aralığının altına düşen farklı konsantrasyonlarda birkaç QC numunesi hazırlayın. - Bölüm 3'te açıklanan protokolü izleyin (adım 3.2-3.11).
5. LC-MS sisteminin kurulması
- Mobil faz çözücüleri hazırlayın: Solvent A: Ultra saf suda 20 mmol / L amonyum formatında (formik asitle ayarlanmış pH 4.3); Solvent B: %100 asetonitril.
NOT: Sadece borosilikat cam şişeler kullanın. Şişeleri doldurmadan önce ultra saf suyla durulayın. Deterjanlarla temizlenmiş şişeler kullanmayın.
DİkKAT: Asetonitril ciddi sağlık etkilerine veya ölüme neden olur. Isı ile kolayca tutuşur. Asetonitril sıvı ve buhar gözleri, burnu, boğazı ve akciğerleri tahriş edebilir.- Bir cam şişede 50 mL ultra saf suda kristal reaktifi (15,77 g) eriterek 5 mol/L stok amonyum formatlı çözelti hazırlayın. Tüm artıklar çözülene kadar karıştırın. Kalan kalıntıları gidermek için 0,45 μm membran boyunca filtreleyin (örneğin, naylon şırıng filtresi kullanarak). Stok çözeltisini 4 °C'de saklayın.
- Bir kehribar cam şişede 980 mL ultra saf suya suya 4 mL 5 mol/L amonyum format ekleyerek Solvent A'yı hazırlayın ve iyice karıştırın. Bir karıştırma çubuğunu batırın ve çözücü ile şişeyi manyetik bir karıştırıcıya koyun. Çözeltiye bir pH elektrot batırın ve karıştırma altında pH'ı kontrol edin. Formik asit stok çözeltisi ekleyin (%98-%100) pH 4.3 elde etmek için 0.2 mL uçlu otomatik pipet kullanarak damla yönünde, ultra saf su ile sesi 1 L'ye kadar ayarlayın ve iyice karıştırın.
NOT: Herhangi bir mikrobiyal büyümeyi önlemek için çözücüleri haftada en az bir kez hazırlayın.
DİkKAT: Formik asit (FA) solunduğunda toksiktir, cilt yanıklara ve göz hasarına neden olur. Duman kaputunun altında çalışın; koruyucu eldiven ve ceket giyin. - Kalan kalıntıları gidermek için tüm çözeltileri 0,22 μm membrandan (örneğin naylon şırınna filtresi) filtreleyin. İsteğe bağlı olarak, sistemi gelen parçacıklardan korumak için LC çözücü rezervuarları için ayrılmış çözücü giriş filtrelerini kullanın.
- LC-MS kontrol ve veri toplama yazılımını başlatın.
- Kabarcıkları gidermek ve tüm solvent kanallarını astarlamak için LC sistemini mobil fazla temizle.
- Analitik sütunun tıkanmasını korumak için bir koruma sütunu topluluk haline getirmek.
- Koruma ve analitik sütunu (C18, 2.1 x 100 mm, 1.8 μm) yaklaşık 30 dakika boyunca% 100 asetonitril ile yıkayın ve ardından sütunda kararlı bir basınç gözlenene kadar% 100 çözücü A ile yıkayın. Kontrol yazılımını kullanarak sistem performansını kontrol edin.
- Veri toplama yazılımında uygun LC parametrelerini ayarlayın.
- Degrade programını kurun: 0-8 dk çözücü B% 0; 8-17 dk çözücü B 0-2%; 17-20 dk çözücü B% 2; 20-32 dk çözücü B 10-30%; 32-45 dk çözücü B% 0.
- Mobil faz akış hızını 0,15 mL/dak, toplam analiz çalışma süresini 45 dk, kolon sıcaklığını +40 °C ve enjeksiyon hacmini 10 μL olarak ayarlayın.
- Kütle spektrometresi dedektörünün alım parametrelerini ayarlayın.
- İyonizasyon parametrelerini uygulayın: tek iyon izleme (SIM), pozitif iyonlaşma, 50 psi'lik nebülizör basıncı, +350 °C kurutma gazı sıcaklığı, 12 L/dk kurutma gazı akışı ve 5500 V kılcal gerilim.
- Analit izleme iyonlarını seçin: 3HKyn m/z 225.0 için (tarama süresi: 2-6 dk, parçalayıcı voltajı: 100 V); Kyn m/z 209.0 için (tarama süresi: 6-12 dk, parçalayıcı voltaj: 80 V); 3HAA m/z 154.0 için (tarama süresi: 12-18 dk, parçalayıcı voltaj: 80 V); 3NT m/z 227.0 için (tarama süresi: 18-23 dk, parçalayıcı voltaj: 100 V); XA m/z 206.0 için (tarama süresi: 23-45 dk, parçalayıcı voltaj: 100 V).
- Bir çalışma listesi oluşturun ve örnekleri LC sisteminde çalıştırın.
- İlk başta, deneysel örneklerin analizinden önce, en azından üç taraflı olarak boş bir örnek (Solvent A) ve ardından bir QC örneği çalıştırın.
- Veri analizi yazılımını açın ve QC örneği için elde edilen sonuçları yükleyin.
- Analit tepelerinin kromatogramdaki konumunu kontrol edin. Sinyaller beklenen konumun ötesine geçtiğinde, uygun analit sinyallerinin toplanması için zaman kapılarını ayarlayın. Sinyal entegrasyonu hakkında talimat için yazılım kılavuzuna bakın.
6. Kalibrasyon eğrisinin inşası
- Veri toplama yazılımında, kalibrasyon standartlarını çalışma listesine ekleyin ve standartları üç taraflı olarak çalıştırın.
- Sırasıyla yaklaşık 4,4 dk, 10 dk, 16 dk, 21 dk ve 30 dk tutma süresinde 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT ve XA'ya karşılık gelen tepe alanını entegre edin ve ölçün.
- Bir elektronik tablo programı kullanarak her metabolit için ayrı kalibrasyon eğrileri oluşturun.
- Kalibrasyon grafiğini oluşturmak için, analit tepe alanının 3NT tepe alanı üzerindeki bir oranının değerini analit konsantrasyonuna göre çizin.
- Orta alanda çalışılan analizlerin iz kalmadığından emin olmak için boş numuneyi (kömür önceden işlem görmüş kültür ortamı sadece 3NT ile çivilenmiş) analiz edin. Aksi takdirde, elde edilen değeri her kalibrasyon noktasından çıkarın.
- Her kalibrasyon eğrisinin doğrusallığını kontrol edin.
- Ayrı ayrı, her analit için, bir eğim kesişim doğrusal denklemi (y = ax +b) oluşturun, burada y, analit tepe alanının 3NT tepe alanına karşı oranına karşılık gelir, a eğimdir, x analit konsantrasyonudur (μmol / L) ve b eğri kesişimini ifade eder. 'y' grafiğinin 'x'e karşı çizilmeleri kalibrasyon eğrisini oluşturur.
- Grafiğe doğrusal bir eğilim çizgisi ekleyin, kalibrasyon eğrisi denklemini ve regresyon katsayısını grafikte görüntüleyin. Regresyon katsayısının > 0,990 olduğundan emin olun. Eşleşmeyen kalibrasyon standartları durumunda bunları bir kez daha hazırlayın ve/veya analiz edin. İsteğe bağlı olarak, kalibrasyon eğrisinin konsantrasyon aralığını değiştirin.
- Deneysel örnekleri analiz etmeden önce sistem performansını kontrol etmek için QC örneklerini analiz edin. Uyumsuzluk durumunda (referans değerden %20 sapma ±), yeni kalibrasyon eğrilerini hazırlayın.
7. In vitro hücre kültürü ve analiz için örnek toplama
- Çalışılan kanser hücrelerini (MDA-MB-231 veya SK-OV-3) DMEM'de (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası) 4,5 g/L ᴅ-glikoz içeren plaka, %10 (v/v) fetal sığır serumu (FBS), 2 mmol/L ʟ glutamin ve 1 U penisilin/streptomisinin ve kültürünün 37 °C'de nemlendirilmiş bir atmosferde %5 CO2 deney için genişletilmesi. Hücreleri konfluenslerin %80'inden geç.
- Hücreleri tripin kullanarak kültür çanaktan ayırın, kuyu başına 0,3 × 106 hücre yoğunluğunda 12 kuyu plakası üzerinde deney için tohum ve bir gecede bir inkübatöre yerleştirin.
- Ertesi gün, kültür ortamını aspire edin ve deneysel tasarıma bağlı olarak, çalışılan bileşiklerin eklenmesiyle veya eklenmeden taze DMEM ekleyin.
- 48 saat sonra, ortamı hücrelerin üstünden (yaklaşık 500 μL) 1,5 mL'lik bir tüpe toplayın. Herhangi bir hücre kalıntılarını gidermek için 5 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj. Süpernatant toplayın ve analize kadar -80 °C'de saklayın.
- Hücresel peletin protein tahmini için adım 7.4'ten sakla. Numuneleri -20 °C'de dondurun.
NOT: Farklı kuyulardan bir ortam için elde edilen sonuçlar, bireysel kuyulardaki hücre sayısındaki değişkenliği hesaba katmak için toplam protein içeriğine normalleştirilmelidir. Protein konsantrasyonu 9.
8. LC-MS analizi için numuneler hazırlayın
- Donmuş numuneyi oda sıcaklığında çözün ve iyice karıştırın. Kültür ortamının 149,25 μL'lik kısmını santrifüj tüpüne (1,5 mL) aktarın.
- 0,75 μL 0,1 g/L 3NT çözelti (dahili standart) ekleyin. Tüpleri ve girdabı iyi kapatın.
- Numune deproteinizasyonu için %1 (v/v) FA içeren -20 °C metanolde 150 μL soğutulmuş ekleyin. Tüpleri ve girdabı iyi kapatın.
- Bölüm 3'te açıklandığı gibi örnek hazırlamaya devam edin (adım 3.3-3.11).
NOT: SK-OV-3 gibi bazı kanser hücreleri büyük miktarlarda Kyn'i bir kültür ortamına salgılar. Verileri kalibrasyon eğrisinin doğrusal bir aralığına sığdırmak için numunenin yaklaşık 100 kat seyreltilmesi gerekir. Bu durumda, numunenin bir kısmını suda% 0,1 (v/v) FA ile seyreltin ve seyreltilmemiş numuneye ek olarak analiz edin. Kalibrasyon eğrisi için standartların referans örnekleri 100 kat seyreltilmiş tam kültür ortamında hazırlanmalıdır. Alternatif olarak, deneysel numunedeki Kyn konsantrasyon seviyesine ayarlamak için kalibrasyon eğrisine daha fazla nokta ekleyin (uygun çözünürlük ve doğrusallık elde edilirse). - Örnekleri bölüm 5'te açıklandığı gibi LC-MS ile analiz edin. Bir çalışma listesi oluşturun ve her örneği üç taraflı olarak çalıştırın.
- Çalışma listesi tamamlandıktan sonra, analit tepe alanını ölçün.
- Kullanılabilir yazılımı ve elde edilen sayısal verileri kullanarak bir elektronik tablo oluşturun.
- Bir elektronik tablo sütununda, analit tepe alanının 3NT tepe alanı üzerindeki oranını hesaplayın.
- Deneysel örneklerde bulunan analiz konsantrasyonlarını hesaplamak için her bir analit için ayrılmış ayrı bir doğrusal kalibrasyon denklemi kullanın (adım 6.3.'den itibaren).
9. Protein içeriğinin ve veri normalleşmesini değerlendirme
- Hücresel peleti 1,5 mL tüpte 100 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 7,5 adımından yeniden tanımlayın.
NOT: 950 mL ultra saf suda 8 g sodyum klorür, 0,2 g potasyum klorür, 1,44 g sodyum fosfat dibasik, potasyum dihidrojen fosfat eriterek PBS çözeltisi hazırlayın. İyice karıştırın. Hidroklorik asit (damla yönünde) ile pH'ı 7,4'e ayarlayın. Ultra saf su ile hacmi 1 L'ye kadar ayarlayın. Homojen olana kadar iyice karıştırın.
DİkKAT: Hidroklorik asit oldukça aşındırıcıdır ve uygun güvenlik önlemleri ile ele alınmalıdır. İnsan derisi ile temas kızarıklığa, ağrıya, cilt yanıklığına neden olabilir. Duman kaputunun altında çalışın; koruyucu eldiven ve ceket giyin. - Numuneleri -20 °C'de dondurun ve buz üzerinde çözün. Bu adımı 3x tekrarlayın.
- Numuneleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj edin. Süpernatantları yeni tüplere toplayın. Peletin rahatsız etmeyin.
- Pbs ile süpernatantları 10x seyreltin.
- Kuyu aralığı başına proteinin 0 ila 2 μg arasında bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
- Kalibrasyon için sığır serum albümini (BSA) standart soluyu hazırlayın. 1,23 μg BSA'yı 1 mL ultra saf su ve girdap kuyusunda çözün.
- 96 kuyulu bir plakada, farklı miktarlarda BSA standart çözeltisi (1,23 μg/mL) yükleyin: 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
- Kuyuyu PBS ile 50 μL'lik son hacme kadar doldurun.
- Aynı 96 kuyu plakasına 9.4 adımından 10 - 15 μL hücre likatı yükleyin. 50 μL'lik son hacme ulaşmak için kuyuları PBS ile doldurun.
NOT: Gerekirse, kalibrasyon eğrisinin doğrusal aralığına uyacak şekilde her kuyudaki hücre likır aliquotunun hacmini ayarlayın. Son hacmi kuyu başına numunenin 50 μL'sine kadar tutun. - Her kuyuya 200 μL Bradford reaktifi (ultra saf su ile 5 kez seyreltilmiş) ekleyin.
- 96 kuyulu pate'yi oda sıcaklığında en az 5 dakika kuluçkaya yatırın. Plakayı bir mikro plaka okuyucusuna yerleştirin. Absorbansı φ = 595 nm'de ölçün.
- Elektronik tablo programı kullanarak kalibrasyon eğrisi oluşturun. Emiciliğe karşı BSA miktarını (μg) çizin. Doğrusal bir eğilim çizgisi ekleyin, kalibrasyon eğrisi denklemini ve regresyon katsayısını grafikte görüntüleyin.
- Örnekteki protein miktarını hesaplamak için doğrusal denklemi (y = balta +b, burada y φ = 595 nm'deki absorbansa karşılık gelir, a eğimdir, x bir protein içeriğidir (μg) ve b eğri kesişimini ifade eder) kullanın.
NOT: Hesaplamalarda örnek bir seyreltme faktörü düşünün. - Numunedeki kynurenine miktarını 1 mg protein başına normalleştirmek için tahmini protein içeriğini kullanın. Bunu yapmak için, adım 8.9'da belirlenen kynurenin konsantrasyonu ile toplam protein içeriğini adım 9.10'dan bölün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LC-MS, karmaşık örneklerin bazı bileşenleri matris etkilerine neden olsa ve analitlerin iyonlaşmasını tehlikeye atsa da, biyolojik olarak aktif moleküllerin ölçülmesinde tartışılmaz avantajlar sunar. İyon bastırmaya veya iyon geliştirmesine yol açar, doğruluğu güçlü bir şekilde azaltır ve yöntemin ''zayıf' bir noktası olarak kabul edilen LC-MS'in tespit / nicelifikasyon sınırını etkiler. Protokolümüzde, iyonlar, Trp metabolitleri belirleme13ile ilgili diğer çalışmalarda da kullanılan pozitif modda elektrospray iyonizasyon (ESI) tarafından üretilir. Bununla birlikte, ESI, atmosferik basınç kimyasal iyonizasyonuna (APCI) göre matris etkilerine daha yatkındır28. Bu nedenle, bir hücre kültürü ortamında Trp metabolitlerinin doğru nicelemesi için, analit sinyali üzerindeki matrise bağımlı etkileri telafi etmek ve örnek bir hazırlık adımı sırasında hedef bileşiklerin kaybını düzeltmek için dahili standart ve matrisle eşleşen bir kalibrasyon kullandık. Çalışılan tüm analitler (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) için aynı iç standardı (3NT) uyguladık. 3NT, hücre kültleme için kullanılan orijinal, taze ortamda bulunamadı ve uygulanan analitik koşullar altında hedef bileşikler gibi benzer bir davranış gösteriyor. Bu, 3NT'i uygun dahili standart27yapar. Buna ek olarak, protokolü basitleştirmek için, geniş bir kullanıcı grubu için daha erişilebilir hale getirmek için, % 1 (v / v) FA içeren metanol ile tedavi ile protein çıkarılmasını içeren sadece bir örnek hazırlama adımı öneriyoruz.
Sunulan protokolde, hücre kültürü için kullanılan tam ortamı kullanarak kalibrasyon eğrilerinin hazırlanması önerilir. Bununla birlikte, kültür ortamı, özellikle düşük konsantrasyonlardaki kalibrasyon çözeltilerinde, analit tepe alanının uygun tahminini bozan endojen Kyn içerebilir. Şekil 1A, grubumuz tarafından kanser hücre kültürü için kullanılan 4,5 g/L D-glikoz (DMEM-HG) ve %10 (v/v) FBS içeren DMEM analizi sırasında elde edilen LC-SQ sonuçlarını göstermektedir. Taze tam kültür ortamının başlangıçta aktif kömür ile saflaştırma ile çıkarılabilen bazı Kyn içerdiğini bulduk (Şekil 1B). Deneysel örnekler analiz edilirken, DMEM-HG kültür ortamının tamamı da kontrol örneği olarak analiz edildi ve Kyn tepe alanı, test edilen her örnekte Kyn için kaydedilen tepe alanından çıkarılır.
Şekil 1: Aktif kömür üzerinde ön işlemden önce (A) ve (B) tam DMEM-HG kültür ortamının temsili LC-SQ sonuçları. Kültür ortamı örnekleri, aynı miktarda iç standart (3NT) ile arttırıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Aşağıdaki adımda, her hedef analit için bir tutma süresi oluşturulmuştur (Şekil 2A'dabir kromatograma bakın). LC-MS analizinde iyi uygulama, analitlerin uygun saklama sürelerini doğrulamak için gerçek örneklerden önce bir QC örneği çalıştırmaktır. Bazen, LC sinyallerinde bir kayma gözlenebilir ve uyuşmazlıklar olma eğilimindedir. Şekil 2B, analitlerin tutma sürelerinde küçük bir değişiklik olduğunu göstermektedir, ancak bu da doğru ölçümleri bozmaz. Öte yandan, Şekil 2C hedef zirvelerin bir pozisyonunda önemli bir değişiklik sunar. Görüldüğü gibi, 3NT sinyali önemli ölçüde daha kısa bir tutma süresine doğru kaydırıldı ve ayarlanan zaman kapısından çıktı. Bu durumda, iç standart sinyal doğru ölçülemediği için uygun bir nicel analiz imkansızdı. Bunun nedeni çeşitli faktörler olabilir, yani yetersiz kolon dengelenme, pompadaki çözücülerin yanlış karıştırılması, uygun olmayan numune seyreltici kullanımı veya kolon sabit fazının kirlenmesi. Şekil 2D, ancak, kayıtlı zirveler ciddi derecede düşük yoğunluklardan muzdarip olduğunda bir durumu temsil eder. Bu, bir enjeksiyon arızası, sistemdeki bir sızıntı veya MS hasarının bir sonucu olabilir. Ayrıca, co-eluting matris bileşenleri, şekil 3A'da olduğu gibi hedef analitler için seçilen m/z ile iyonlar oluşturabilir , burada MDA-MB-231 hücre kültür ortamının analizinden elde edilen sonuç gösterilir. Yaklaşık 25 dakikalık tutma süresinde, bilinmeyen bir matris bileşeninden (bileşik X) elde edilen güçlü bir sinyal gözlendi. Tepe, m/z 206'nın iyonunun (XA için seçilen) izlendiği tarama döneminde görünür. Ancak, bu sinyal tutma süresinin uyumsuzluğu nedeniyle analitle uyuşmaz. Pik tümleştirme sırasında hataları önlemek için, saklama süresinin QC örnekleri için kaydedilenle karşılaştırılması da önerilir.
Şekil 2. Doğru ve yanlış sonuçlara örnekler. Farklı günlerde kaydedilen(A) orta ve (B) düşük konsantrasyon seviyelerinde QC örnek analizinin doğru kromatogramları. Analitlerin (C) tutma sürelerinde önemli bir değişiklikten ve tepelerin tatmin edici olmayan yoğunluklarından(D)kaynaklanan yanlış kromatogram örneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Farklı kanser hücre hatlarından toplanan kültür ortamının temsili sonuçları. (A) MDA-MB-231 (insan meme kanseri) ve (B) SK-OV-3 (insan yumurtalık kanseri) hücrelerinden kültür ortamı LC-SQ kullanılarak analiz edildi. X bileşiği, analit için seçilen m/z ile bir iyon oluşturmak için analit ve iyonize ile birlikte ortaya çıkan kültür ortamında bulunan bilinmeyen bir bileşiğin sinyalini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Kanser hücreleri (DMEM) için kullanılan kültür ortamı önemli miktarda Trp içerir. İzotop(13C-Trp) XA(m/z 206) ile aynı iyonu paylaşır ve XA kararlılığını engelleyebilir. Bununla birlikte, uygulanan kromatografik koşullar altında, Trp'den gelen sinyal XA sinyalinden iyi ayrılır. Bu nedenle, DMEM'de bulunan Trp'nin XA niceliğini ve yöntemin doğruluğunu etkilemediği sonucuna vardık (Şekil 4).
Şekil 4. MS kromatogramında triptofan (Trp) ve ksantürenik asit (XA) sinyallerinin konumu. Solvent A'da (suda 20 mmol/L amonyum formatında, pH 4.3) trp (49.0 μmol/L) ve XA (48.8 μmol/L) standart çözümleri optimize edilmiş LC-SQ koşullarında hazırlanmıştır. Sırasıyla m/z 205 ([Trp+H]+'ya karşılık gelen) ve m/z 206 ([XA+H]+'ya karşılık gelen) iyonları Trp ve XA için izlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Sunulan analitik yöntem, doğrusallık, hassasiyet (değişim katsayıları ≤15%), doğruluk (%96-104), geri kazanım (%96-119) ve matris etkileri açısından doğrulama testini başarıyla geçti, önceki makalemizde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi 27.
Son olarak, in vitro kültürlü insan kanser hücrelerinden toplanan bir ortama tarif edilen analitik yaklaşımın bir uygulamasını doğruladık. Verilerimiz, farklı hücre türlerinden toplanan bir kültür ortamında bir kynurenines seviyesinin önemli ölçüde değişebileceğini doğruladı (Şekil 3). Sırasıyla meme ve yumurtalık kanserinden elde edilen 2 tip kanser hattından yani MDA-MB-231 ve SK-OV-3 hücrelerinden kültür ortamını analiz ettik. Seçilen çizgiler genellikle moleküler olayları incelemek ve anti-kanser ilaç testleri için model olarak kullanılır. Gözlemlediğimiz gibi, bir kontrol standart ortamında kültürlenen hücreler farklı miktarlarda triptofan metabolitleri serbest bıraktı, yani, MDA-MB-231 hücreleri düşük nmol / L konsantrasyonda ölçülebilir miktarda Kyn ve XA salgılarken (Şekil 3A), SK-OV-3 hücreleri önemli ölçüde daha fazla Kyn, çok düşük XA salgısı ve ilgili zirvelerin yoğunluğu ile belirtildiği gibi çalışılan diğer kynureninlerin salgılanması göstermedi (Şekil 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale, in vitro kültürlü insan kanser hücrelerinden bir ortamda ölçülen dört ana Trp metabolitinin (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) eşzamanlı nicelemesi için ayrıntılı bir LC-SQ protokolü sunun. Analizdeki en önemli noktalar olan numune hazırlama, kromatografik/kütle spektrometresi prosedürü ve veri yorumlamaya özel önem verilir.
Genel olarak, LC-MS analizi, yüksek hassasiyet nedeniyle, kullanılan malzemelerin protokol katılığı ve saflığının en yüksek standartlarını gerektirir. Standart prosedür boyunca düzgünce temizlenmiş ve düzgün yıkanmış cam eşyaların yanı sıra yüksek dereceli kimyasalların uygulanmasını ifade eder. Bu hassas yaklaşımda analizi büyük ölçüde etkileyebilecek mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için mobil fazın tatlı su bazlı çözücülerinin kullanılması çok önemlidir. Bir LC sistemine enjekte etmeden önce, analiz edilen örneklerin çözünmeyen parçacıkların varlığı için dikkatlice incelenmesi gerekir. Örnek analizinden önce sütunun yeterince dengelenmiş olması gerektiğini unutmayın. Bu kurallara uyulmaması, numunelerin, LC sisteminin ve analitik sütunun kirlenmesine veya MS kaynağında yetersiz numune iyonlaşmasına neden olabilir ve sonunda sinyallerin kaymasına neden olabilir.
En iyi sonuçları elde etmek için protokol içinde üzerinde durulması gereken 2 temel nokta vardır. Sunulan protokoldeki en kritik kısım örnek hazırlama adımıdır. Yetersiz bir prosedür kullanmak hedef bileşiklerin kaybına ve dolayısıyla yanlış nicelemeye neden olur. Yaklaşımımızda, yöntem geliştirme sırasında, numune hazırlama adımı, proteinin çıkarılması için çözücü seçimi ile birlikte dikkatlice optimize edilmiştir. Belirlediğimiz gibi, %1 (v/v) formik asit içeren metanol ile örnek tedavi, çalışılan tüm kynureninler için en iyi geri kazanımları sağladı. Mobil faz bileşiminin analit iyonlaşmasının kapsamı üzerindeki etkisi de değerlendirildi. Formik veya asetik asit ile ayarlanmış farklı pH'da 0-20 mmol/L amonyum format veya amonyum asetat içeren mobil fazları kontrol ettik. Su (pH 4.3, solvent A) ve asetonitril (solvent B) içinde 20 mmol / L amonyum formatı içeren mobil faz, Kyn, 3HKyn, 3HAA ve XA27'nineşzamanlı nicelemesi için mümkün olan en iyi koşulları sağladı. LC-MS analizinde bir diğer önemli adım da pik entegrasyondur. Bazı kynureninler çok düşük konsantrasyon seviyelerinde bir örnekte görülür. Bu durumda, birlikte geçen bileşiklerin sinyalleri hedef analit sinyaliyle çakışabilir veya benzer bir tutma zamanında bir tepe oluşturabilir. Bu yöntemin deneyimsiz bir kullanıcısı, Şekil 2C'deörneklenerek doğru bir tepe tümleştirmesinde bazı zorluklar bulabilir. Bu nedenle, analitler için saklama süresini kontrol etmek ve bir QC örneği ile karşılaştırmak gerekir ve şiddetle tavsiye edilir.
İyi analitik uygulama, nicel analiz için uygun bir iç standart seçmeyi içerir. Burada, dört kynurenine analogu olarak sadece bir iç standart (3NT) kullanarak basit ve uygun maliyetli bir yaklaşım öneriyoruz. Sonuçlar, 3NT'nin hedef bileşikler gibi benzer kromatografik davranış sunduğunu doğruladı ve sonuç olarak yöntemin iyi bir hassasiyet ve doğruluğuna ulaşmanıza izin veriyor27. Uygulanan LC koşullarında, 3NT pik diğer analitlerin sinyallerinden iyi ayrılır ve ölçülmek kolaydır. Bu tür analizlerde kullanılan izotopik etiketli iç standartların (ILIS)14,15 matris etkilerinin daha iyi telafisini ve yanlış sonuçlara yol açabilecek tüm değişkenlerin daha iyi kontrol etmesini sağlayacağının farkındayız. Öte yandan, tüm hedef analitler için ILIS'ler, yüksek maliyeti bir şekilde her zaman kolayca mevcut değildir. Ayrıca, ILIS'ler bu makalede kullandığımız Tek İyon İzleme (SIM) moduna sahip LC-SQ yerine LC-MS/MS için ayrılmıştır.
3NT'nin iç standart olarak kullanılması, proteinler üzerinde 3-nitrotirozin oluşumu olasılığı nedeniyle yöntemin bir sınırlaması olarak düşünülebilir29. Bununla birlikte, bir kültür ortamı durumunda, herhangi bir serbest endojen 3-nitrotirozin gözlemlemedik. 3NT'i uygun bir iç standart olarak tanımamızı sağlar. Bununla birlikte, özellikle bu raporda test edilenden daha fazla diğer hücre tiplerini incelerken, ilk endojen 3NT seviyesinin önceden değerlendirilmesini öneririz.
Özetle, herhangi bir analitenin bir analogunun seçilmesinde, örneğin bir örnek matrisinde kimyasal benzerlik ve ilk yokluk gibi birçok özelliği göz önünde bulundurmak gerekir. Ayrıca, bir örnek matriste analog iç standardın stabilitesi, matris bileşenlerinin varlığında geri kazanımı ve iyonlaşma verimliliği hedef bileşiklerden farklı olabilir. Bu nedenle, yöntem geliştirme sırasında tüm bu özellikler göz önünde bulundurulmalı ve dikkatlice araştırılmalıdır.
Bir MS dedektöründen oluşan sunulan yöntemdeki analitik sistem, düşük algılama sınırlarına ulaşmamızı sağladı (0.0033 – 0.0108 μmol/ L)27. Bu şekilde eşzamanlı 3HKyn ölçümleri, Kyn, 3HAA, XA konsantrasyon aralıklarında 0.018 - 4.46 μmol/L, 0.0096 - 3.84 μmol/L, 0.033 - 13.06 μmol/L ve sırasıyla 0.019 – 4.87 μmol/L elde edildi. Herhangi bir LC-SQ analizinin ana sınırlaması, bir LC sütunundaki örnek bileşenlerin uygun bir şekilde ayrılmasıyla ilişkilidir. Zayıf ayırma, ürün iyonları ve Çoklu Reaksiyon İzleme (MRM) modundan yararlanan tandem dörtlü kütle spektrometresi ile algılamaya kıyasla daha düşük seçiciliğe katkıda bulunur. Bir hedef molekülle aynı veya benzer iyonları paylaşan diğer matris bileşenlerinin parazitlerini önlemek için, LC ayırma koşulları dikkatlice optimize edilmelidir. Örnek olarak, 13C Trp izotop (izleme miktarlarında bulunur), XA izleme için seçilen m/z 206'nın aynı iyonunu oluşturur. Burada kromatografik koşullar optimize ederek ve Sütundan elde edilen Trp ve XA'nın tatmin edici ayrımı yapılarak yanlış yorumlama önlenmiştir (Şekil 4).
Gelecekteki uygulamalarda, protokolde bazı değişiklikler uygulanabilir. Potansiyel bir kullanıcı, incelenen kynureninlerin seviyelerinin burada sunulan konsantrasyonlara düşmesi beklendiğinde iç standardın (3NT) konsantrasyonunun değiştirilmesini sağlayabilir. Daha da önemlisi, 3NT konsantrasyonu hem kalibrasyon standartlarında hem de deneysel numunelerde aynı olmalıdır. SK-OV-3 hücrelerinde gözlenen Kyn gibi son derece yüksek bir analiz seviyesi durumunda, daha yüksek bir 3NT konsantrasyonu ile çalışmanızı öneririz. Örnek seyreltme gerekiyorsa, LC sütununa numune enjeksiyonundan önce protokolün son adımında yapılır.
Literatürde, farklı hücrelerden bir kültür ortamında kynurenines'in LC-MS/MS nicel analizi için önerilen bazı protokoller vardır. Bir protokol, Kyn, 3HKyn ve 3HAA gibi 3 metabolitin eşzamanlı bir şekilde belirlenmesini sağlar, ancakyöntemimizinaksine daha az hassastır (daha yüksek seviyelerde nicelik sınırı (LOQ). Başka bir rapor, Benzer LOQs25ile Kyn, 3HKyn, 3HAA ve XA dahil olmak üzere 4 kynurenines nicelleştirilmesine izin veren bir yöntem sundu. Ancak hiçbiri in vitro kültürlü kanser hücrelerinin ürettiği kynureninlerin tespiti için optimize edildi. Örnek matrisin bileşenleri, güvenilir olmayan sonuçların nedeni olan sinyali azaltarak veya artırarak MS kaynağındaki analit iyonlaşmasını etkiler. Daha doğru veriler elde etmek için, matrise bağımlı efektlerin daha iyi telafisi için matrisle eşleşen bir kalibrasyon ile birlikte analog bir iç standart (3NT) kullanmayı önerdik.
Sunulan metodolojiyi kullanarak, Kyn'in analiz edilen kanser hücre türlerinden toplanan bir kültür ortamında en bol Trp metaboliti olduğunu gözlemleyebilirken, kontrol altındaki diğer metabolitler kültür koşulları tespit edilemedi (Iz ama tespit edilebilir miktarlarda bulunan XA hariç). Bununla birlikte, hücreler güçlü bir immün aktivatör - bakteriyel lipopolisakkarit ile uyarıldığında, Kyn'e ek olarak daha büyük miktarda XA salgılandı. Öte yandan, KP içinde XA'nın yukarı akışında oluşan tespit edilen 3HKyn ve 3HAA hala LOQ27altındaydı. Bu, bir kültür ortamında küçük miktarlarda bulunan bazı KP metabolitlerinin önerilen LC-SQ yaklaşımını kullanarak ölçülebileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, sunulan protokol, biriken anahtar Trp metabolitlerinin ölçülmesiyle KP'deki değişiklikleri tanımlamak için yararlıdır. Bu metodolojinin in vitro hücre kültürü sistemine dahil olmak için gelecekteki çalışmalarda istihdam edilmesi, bağışıklıkla ilgili hastalıkların ve kanserin yeni biyobelirteçlerini sunacaktır. Yaklaşımımız, aşağı akış KP metabolitlerinin düşük konsantrasyonları nedeniyle zorlu olan hücresel modeller için ilgili hassasiyete sahip doğrulanmış ve güvenilir bir test getiriyor. Sağlanan talimatlar, farklı alanlardan araştırmacıların kanser ve diğer hastalıklarla ilgili majör kynureninlerin ölçülmesi için bu yaklaşımı kullanmalarına izin verecektir. Verilerimiz (yayınlanmamış) farklı glikasyon ürünlerine maruz kalan hücrelerde KP modülasyonunu incelemek için yararlı olduğunu göstermektedir, ancak aynı zamanda diğer araştırma alanlarında ve bağışıklık bileşeni olan hastalıklarda, yani endometrium biyolojisinde ve üremesinde bir uygulama bulmalıdır30.
Sunulan protokol, farklı deneysel koşullar sırasında bir kültür ortamında birikebilecek ek analizleri belirlemek için daha da genişletilebilir. Nicel analizler için kullanılmadan önce yöntem doğrulaması için doğruluk, hassasiyet, doğrusallık, geri kazanım veya seçicilik açısından uygun referans standartları kullanılmalıdır. Ayrıca, araştırma amacına bağlı olarak, protokol bireysel kynureninler (3HKyn, Kyn, 3HAA veya XA) için kullanılabilir. Bu durumda, analiz için dikkate alınmayan bileşiklere karşılık gelen iyonlar MS ayarlarından kaldırılabilir. LC degrade programındaki uygun değişiklikler analiz süresinin kesilmesine yardımcı olacaktır.
KP'yi incelerken, İDO enziminin aktivitesini değerlendirmek önemlidir. Bu sadece Trp tüketimini ve Kyn salınımı bir kültür ortamına ölçülerek veya kynurenine-triptofan konsantrasyon oranı ([Kyn]/[Trp])31hesaplanarak tahmin edilebilir. Yaklaşımımızda, bir Trp konsantrasyonu ölçmedik, ancak protokol bu hedefi LC-SQ analizine ekleyerek genişletilebilir. Biyokimyasal olarak daha uygun bir yaklaşım olarak, İDO enzimatik aktivitesini, başka bir yerde sunulduğu gibi dakikada miligram protein başına hücreler tarafından üretilen bir Kyn miktarı olarak ifade etmenizi öneririz32. Kanser hücreleri (hazırlık aşamasında el yazması) üzerine yaptığımız diğer çalışmalarda bu yaklaşımı kullanmada bir avantaj fark ettik ve in vitro hücre kültürü modelini kullanırken bu yöntemi öneriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Doğu Polonya Operasyonel Programı Geliştirme 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-09-00) kapsamında Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu'ndan Avrupa Birliği tarafından, Lublin John Paul II Katolik Üniversitesi Biyoteknoloji ve Çevre Bilimleri Fakültesi (Ilona Sadok için Genç Bilim adamları hibesi), Polonya Ulusal Bilim Merkezi tarafından desteklendi. OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 Magdalena Staniszewska, İlke Araştırmacısı). Yazarlar, hücre kültleme ve protein nicelleştirme ekipmanlarını paylaştığı için Oksidatif Stres Laboratuvarı, Disiplinlerarası Araştırma Merkezi, JPII CUL'dan Prof. Agnieszka Ścibior'a teşekkür ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
| Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
| Analytical balance | Ohaus | ||
| Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
| Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
| Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
| Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
| Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
| Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
| Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
| Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
| Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
| Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
| Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
| Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
| Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
| See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
| Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
| Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
| Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
| Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
| Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
| Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
| Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
References
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
- Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
- Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
- Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
- Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
- Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).
- Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
- Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
- Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
- Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M.
- Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
- Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
- Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
- Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
- Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
- Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
- Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).
- Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
- Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
- Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
- Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
- Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
- Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
- Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
- Annesley, T. M.
- Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
- Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
- Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416 (2009).
- Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).
