Summary

Gleichzeitige Quantifizierung ausgewählter Kynurenine, analysiert durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Published: May 09, 2020
doi:

Summary

Beschrieben wird hier ein Protokoll zur Bestimmung von vier verschiedenen Tryptophan-Metaboliten, die im Kynurenin-Signalweg (Kynurenin, 3-Hydroxykynurenin, Xanthurensäure, 3-Hydroxyanthranilsäure) in dem Medium erzeugt werden, das aus Krebszellkulturen gesammelt wird, die durch flüssige Chromatographie in Verbindung mit einer einzigen Quadrupol-Massenspektrometrie analysiert werden.

Abstract

Der Kynurenin-Weg und die Tryptophan-Kataboliten genannt Kynurenine haben erhöhte Aufmerksamkeit für ihre Beteiligung an der Immunregulation und Krebsbiologie erhalten. Ein In-vitro-Zellkultur-Assay wird oft verwendet, um über den Beitrag verschiedener Tryptophan-Kataboliten in einem Krankheitsmechanismus zu lernen und therapeutische Strategien zu testen. Zellkulturmedium, das reich an sezernierten Metaboliten und Signalmolekülen ist, spiegelt den Status des Tryptophan-Stoffwechsels und anderer zellulärer Ereignisse wider. Neue Protokolle zur zuverlässigen Quantifizierung mehrerer Kynurenine im komplexen Zellkulturmedium sind erwünscht, um eine zuverlässige und schnelle Analyse mehrerer Proben zu ermöglichen. Dies kann mit flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie erreicht werden. Diese leistungsstarke Technik wird in vielen klinischen und Forschungslaboratorien für die Quantifizierung von Metaboliten eingesetzt und kann zur Messung von Kynureninen eingesetzt werden.

Hier wird die Verwendung der Flüssigchromatographie gekoppelt mit der Single-Quadrupol-Massenspektrometrie (LC-SQ) zur gleichzeitigen Bestimmung von vier Kynureninen, d.h. Kynurenin, 3-Hydroxykynurenin, 3-Hydroxyanthranilal und Xanthurensäure im Medium, das aus in vitro kultivierten Krebszellen gesammelt wird, vorgestellt. SQ-Detektor ist einfach zu bedienen und im Vergleich zu anderen Massenspektrometern kostengünstiger. In der SQ-MS-Analyse werden mehrere Ionen aus der Probe erzeugt und entsprechend ihrem spezifischen Massen-Zu-Lade-Verhältnis (m/z)getrennt, gefolgt von der Erkennung mit einem SIM-Modus (Single Ion Monitoring).

In diesem Papier wird auf die Vorteile der gemeldeten Methode hingewiesen und einige Schwachstellen aufgewiesen. Es konzentriert sich auf kritische Elemente der LC-SQ-Analyse einschließlich der Probenvorbereitung zusammen mit Chromatographie und Massenspektrometrie-Analyse. Auch die Qualitätskontrolle, Methodenkalibrierungsbedingungen und Matrixeffektfragen werden diskutiert. Wir beschrieben eine einfache Anwendung von 3-Nitrotyrosin als einen analogen Standard für alle Zielanalyten. Wie durch Experimente mit menschlichen Eierstock- und Brustkrebszellen bestätigt, liefert die vorgeschlagene LC-SQ-Methode zuverlässige Ergebnisse und kann weiter auf andere in vitro zelluläre Modelle angewendet werden.

Introduction

Kynurenin-Weg (KP) ist die Hauptroute von Tryptophan (Trp) Katabolismus in menschlichen Zellen. Indollamin-2,3-Dioxygenase (IDO-1) in extrahepatischen Zellen ist das erste und begrenzende Enzym von KP und wandelt Trp in N-Formylkynurenin1um. Weitere Schritte innerhalb von KP erzeugen andere sekundäre Metaboliten, nämlich Kynurenine, die verschiedene biologische Eigenschaften aufweisen. Kynurenin (Kyn) ist der erste stabile Trp-Katabolit, der toxische Eigenschaften aufweist und zelluläre Ereignisse reguliert, nachdem es an den Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (AhR)2gebunden wurde. Anschließend wird Kyn entweder spontan oder in den enzymvermittelten Prozessen in mehrere Moleküle umgewandelt, die solche Metaboliten wie 3-Hydroxykynurenin (3HKyn), Anthranilic säure (AA), 3-Hydroxyanthranilic acid (3-HAA), Kynurensäure (Kyna) und Xanthurensäure (XA) erzeugen. Ein weiterer nachgeschalteter Metabolit, 2-Amino-3-Carboxymuconinsäure-6-Semialdehyd (ACMS), wird nicht-enzymatischer Zyklisierung zu Chinolinsäure (QA) oder Picolinsäure (PA)1unterzogen. Schließlich wird die QUALITÄTS-Qa weiter in Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+)3umgewandelt, den KP-Endpunktmetaboliten, der ein wichtiger Enzymkofaktor ist. Einige Kynurenine haben neuroprotektive Eigenschaften wie Kyna und PA, während die anderen, d.h. 3HAA und 3HKyn, giftig sind4. Xanthurensäure, die aus 3HKyn gebildet wird, präsentiert antioxidative und vasorelaxation Eigenschaften5. XA sammelt sich in alternden Linsen an und führt zu Apoptose der Epithelzellen6. KP, das Mitte des20. Jahrhunderts beschrieben wurde, erlangte mehr Aufmerksamkeit, als seine Beteiligung an verschiedenen Störungen nachgewiesen wurde. Erhöhte Aktivität dieser Stoffwechselroute und Akkumulation einiger Kynurenine modulieren die Immunantwort und sind mit verschiedenen pathologischen Erkrankungen wie Depression, Schizophrenie, Enzephalopathie, HIV, Demenz, amyotrophe Lateralsklerose, Malaria, Alzheimer, Huntington und Krebsassoziiert 4,7. Einige Veränderungen im Trp-Stoffwechsel werden in Tumormikroumgebungen und Krebszellen2,8beobachtet. Darüber hinaus gelten Kynurenine als vielversprechende Krankheitsmarker9. In der Krebsforschung sind In-vitro-Zellkulturmodelle etabliert und weit verbreitet für die präklinische Bewertung von Reaktionen auf Krebsmedikamente10. Trp-Metaboliten werden von Zellen in das Kulturmedium abgesondert und können gemessen werden, um den Status des Kynurenin-Signalwegs zu bewerten. Daher ist es notwendig, geeignete Methoden für den gleichzeitigen Nachweis möglichst vieler KP-Metaboliten in einer Vielzahl biologischer Proben mit einem einfachen, flexiblen und zuverlässigen Protokoll zu entwickeln.

In diesem Beitrag beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Bestimmung von vier Kynurenin-Signalweg-Metaboliten: Kyn, 3HKyn, 3HAA und XA von LC-SQ in einem post-culture Medium, das aus Krebszellen gesammelt wird. In einem modernen analytischen Ansatz wird die Flüssigchromatographie13,14,15,16 für die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung der einzelnen Tryptophan-Kataboliten bevorzugt, im Gegensatz zu biochemischen unspezifischen Assays unter Verwendung des Ehrlich-Reagenz11,12. Derzeit gibt es viele Methoden zur Bestimmung von Kynureninen in menschlichen Proben, hauptsächlich auf der Grundlage einer Flüssigchromatographie mit Ultraviolett- oder Fluoreszenzdetektoren13,17,18,19. Die Flüssigchromatographie in Verbindung mit einem Massenspektrometriedetektor (LC-MS) scheint aufgrund ihrer höheren Empfindlichkeit (untere Nachweisgrenzen), Selektivität und Wiederholbarkeit für diese Art der Analyse besser geeignet zu sein.

Trp-Metaboliten wurden bereits im menschlichen Serum, Plasma und Urin13,20,21,22,23bestimmt, aber auch die Methoden für andere biologische Proben, wie Zellkulturmedium, sind erwünscht. Zuvor wurde LC-MS für Trp-abgeleitete Verbindungen in einem Medium verwendet, das nach der Kultivierung menschlicher Gliomzellen, Monozyten, dendritischer Zellen oder Mit Interferon-Gamma (IFN-γ)behandelterbehandeltwurde. Derzeit sind neue validierte Protokolle erforderlich, die eine Bewertung mehrerer Metaboliten in verschiedenen Kulturmedien, Zellen und Behandlungen ermöglichen können, die in Krebsmodellen verwendet werden.

Der Zweck der entwickelten Methode ist es, (innerhalb eines analytischen Laufs) vier große Kynurenine zu quantifizieren, die auf Anomalien in KP hinweisen können. Hier werden kritische Schritte unseres kürzlich veröffentlichten Protokolls zur quantitativen LC-SQ-Analyse ausgewählter aussagekräftiger Kynurenine mit einem internen Standard (3-Nitrotyrosin, 3NT) im Medium aus in vitro kultivierten menschlichen Krebszellen27vorgestellt. Nach bestem Wissen und Gewissen ist es das erste LC-SQ-Protokoll zur gleichzeitigen Quantifizierung von 3HKyn, 3HAA, Kyn und XA in einem Kulturmedium, das aus den in vitro gewachsenen Zellen gewonnen wird. Bei einigen Modifikationen könnte die Methode weiter angewendet werden, um die Veränderungen des Trp-Stoffwechsels in einer breiteren Palette von Zellkulturmodellen zu untersuchen.

Protocol

1. Herstellung von Standard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA Standard-Lagerlösungen Wiegen Sie die Reagenzien in einer Durchstechflasche mit der höchsten Genauigkeit (jeweils 0,3 mg). Skalieren Sie die Reagenzien für eine bessere Genauigkeit, indem Sie das Volumen des Lösungsmittels gemäß Schritt 1.2 anpassen. Lösen Sie die Reagenzien in 300 l des Lösungsmittels auf, um eine Stammlösung von 1 g/L zu erhalten. Lösen Sie 3NT in 1% (v/v) Ameisensäure (FA) in Wasser; Kyn, 3HAA und XA in Dimethylsulfox…

Representative Results

LC-MS bietet unbestreitbare Vorteile bei der Quantifizierung biologisch aktiver Moleküle, auch wenn einige Komponenten komplexer Proben sogenannte Matrixeffekte verursachen und die Ionisierung von Analyten beeinträchtigen. Es führt zu Ionenunterdrückung oder Ionenverstärkung, stark abnehmende Genauigkeit und Auswirkungen auf eine Grenze der Erkennung / Quantifizierung von LC-MS, die als “schwacher” Punkt der Methode betrachtet wird. In unserem Protokoll werden die Ionen durch Elektrospray-Ionisation (ESI) im positiv…

Discussion

Dieses Papier stellt ein detailliertes LC-SQ-Protokoll zur gleichzeitigen Quantifizierung von vier großen Trp-Metaboliten (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) vor, die in einem Medium aus in vitro kultivierten menschlichen Krebszellen gemessen werden. Besondere Aufmerksamkeit wird der Probenvorbereitung, dem chromatographischen/Massenspektrometrieverfahren und der Dateninterpretation, den wichtigsten Punkten der Analyse, gewidmet.

Im Allgemeinen erfordert die LC-MS-Analyse aufgrund der hohen Empfi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Europäischen Union aus dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung im Rahmen des Operationellen Programms Entwicklung Ostpolens 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00) von der Fakultät für Biotechnologie und Umweltwissenschaften der Katholischen Universität Lublin (Young Scientists Grant for Ilona Sadok), Polish National Science Centre, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 für Magdalena Staniszewska, Principle Investigator).  Die Autoren danken Prof. Agnieszka ‘cibior vom Laboratory of Oxidative Stress, Centre for Interdisciplinary Research, JPII CUL für die gemeinsame Nutzung der Ausrüstung für zellulierung und Proteinquantifizierung.

Materials

3-hydroksy-DL-kynurenina Sigma-Aldrich H1771
3-hydroxyanthranilic acid Sigma-Aldrich 148776 97%
3-nitro-L-tyrosine Sigma-Aldrich N7389
Acetonitrile Supelco 1.00029 hypergrade for LC-MS LiChrosolv
Activated charcoal Supelco 05105 powder
Analytical balance Ohaus
Analytical column Agilent Technologies 959764-902 Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm)
Ammonium formate Supelco 7022 eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0%
Bovine Serum Albumin Sigma 1001887398
Caps for chromatographic vials Agilent Technologies 5185-5820 blue screw caps,PTFE/red sil sepa
Cell culture dish Nest 704004 polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Cell culture plate Biologix 07-6012 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille
Cell incubator Thermo Fisher Scientific HERAcell 150i Cu
Centrifuge Eppendorf model 5415R
Centrifuge Eppendorf model 5428
Centrifuge tubes Bionovo B-2278 Eppendorf type, 1.5 mL
Centrifuge tubes Bionovo B-3693 Falcon type, 50 mL, PP
Chromatographic data acqusition and analysis software Agilent Technologies LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Chromatographic insert vials Agilent Technologies 9301-1387 100 µL
Chromatographic vials Agilent Technologies 5182-0714 2 mL, clear glass
Dimethyl sulfoxide Supelco 1.02950 Uvasol
Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) PAN Biotech P04-41450
Dual meter pH/conductivity Mettler Toledo SevenMulti
Evaporator Genevac model EZ-2.3 Elite
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F9665
Formic acid Supelco 5.33002 for LC-MS LiChropur
Glass bottle for reagents storage Bionovo S-2070 50 mL, clear glass
Guard column Agilent Technologies 959757-902 Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm)
Hydrochloric acid Merck 1.00317.1000
L-kynurenine Sigma-Aldrich K8625 ≥98% (HPLC)
Magnetic stirrer Wigo ES 21 H
Microbalance Mettler Toledo model XP6
Milli-Q system Millipore ZRQSVPO30 Direct-Q 3 UV with Pump
Quadrupole mass spectrometer Agilent Technologies G1948B model 6120
Penicillin-Streptomycin Sigma-Adrich 048M4874V
Plate reader Bio Tek Synergy 2 operated by Gen5
Potassium chloride Merck 1.04936.1000
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1.05108.0500
Protein Assay Dye Reagent Concentrate BioRad 500-0006
See-saw rocker Stuart SSL4
Serological pipette Nest 326001 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Merck 1.06346.1000
Solvent inlet filter Agilent Technologies 5041-2168 glass filter, 20 μm pore size
Solvent reservoir (for LC-MS) Agilent Technologies 9301-6524 1 L, clear glass
Solvent reservoir (for LC-MS) Agilent Technologies 9301-6526 1 L, amber glass
Spreadsheet program Microsoft Office Microsoft Office Excel
Stir bar Bionovo 6-2003 teflon coated
Syringe filters for culture medium filtration Bionovo 7-8803 regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm
Syringe filters for mobile phase components filtration Bionovo 6-0018 nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm
Tissue culture plates VWR 10062-900 96-wells, sterille
Trypsin-EDTA Solution Sigma-Aldrih T4049-100 mL
Ultra-High Performance Liquid Chromatography system Agilent Technologies G1367D, G1379B, G1312B, G1316C 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C)
Ultrasound bath Polsonic 104533 model 6D
Vortex Biosan model V-1 plus
Xanthurenic acid Sigma-Aldrich D120804 96%

References

  1. Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
  2. Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
  3. Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
  4. Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
  5. Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
  6. Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
  7. Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
  8. Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).
  9. Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
  10. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
  11. Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
  12. Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
  13. Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. Chromatographic analysis of tryptophan metabolites. Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).
  14. Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
  15. Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
  16. Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
  17. Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
  18. Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
  19. Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
  20. Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).
  21. Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
  22. Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
  23. Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
  24. Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
  25. Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
  26. Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
  27. Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
  28. Annesley, T. M. Ion suppression in mass spectrometry. Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).
  29. Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
  30. Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , (2019).
  31. Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416 (2009).
  32. Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).

Play Video

Cite This Article
Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures. J. Vis. Exp. (159), e61031, doi:10.3791/61031 (2020).

View Video