Summary
Beschrieben wird hier ein Protokoll zur Bestimmung von vier verschiedenen Tryptophan-Metaboliten, die im Kynurenin-Signalweg (Kynurenin, 3-Hydroxykynurenin, Xanthurensäure, 3-Hydroxyanthranilsäure) in dem Medium erzeugt werden, das aus Krebszellkulturen gesammelt wird, die durch flüssige Chromatographie in Verbindung mit einer einzigen Quadrupol-Massenspektrometrie analysiert werden.
Abstract
Der Kynurenin-Weg und die Tryptophan-Kataboliten genannt Kynurenine haben erhöhte Aufmerksamkeit für ihre Beteiligung an der Immunregulation und Krebsbiologie erhalten. Ein In-vitro-Zellkultur-Assay wird oft verwendet, um über den Beitrag verschiedener Tryptophan-Kataboliten in einem Krankheitsmechanismus zu lernen und therapeutische Strategien zu testen. Zellkulturmedium, das reich an sezernierten Metaboliten und Signalmolekülen ist, spiegelt den Status des Tryptophan-Stoffwechsels und anderer zellulärer Ereignisse wider. Neue Protokolle zur zuverlässigen Quantifizierung mehrerer Kynurenine im komplexen Zellkulturmedium sind erwünscht, um eine zuverlässige und schnelle Analyse mehrerer Proben zu ermöglichen. Dies kann mit flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie erreicht werden. Diese leistungsstarke Technik wird in vielen klinischen und Forschungslaboratorien für die Quantifizierung von Metaboliten eingesetzt und kann zur Messung von Kynureninen eingesetzt werden.
Hier wird die Verwendung der Flüssigchromatographie gekoppelt mit der Single-Quadrupol-Massenspektrometrie (LC-SQ) zur gleichzeitigen Bestimmung von vier Kynureninen, d.h. Kynurenin, 3-Hydroxykynurenin, 3-Hydroxyanthranilal und Xanthurensäure im Medium, das aus in vitro kultivierten Krebszellen gesammelt wird, vorgestellt. SQ-Detektor ist einfach zu bedienen und im Vergleich zu anderen Massenspektrometern kostengünstiger. In der SQ-MS-Analyse werden mehrere Ionen aus der Probe erzeugt und entsprechend ihrem spezifischen Massen-Zu-Lade-Verhältnis (m/z)getrennt, gefolgt von der Erkennung mit einem SIM-Modus (Single Ion Monitoring).
In diesem Papier wird auf die Vorteile der gemeldeten Methode hingewiesen und einige Schwachstellen aufgewiesen. Es konzentriert sich auf kritische Elemente der LC-SQ-Analyse einschließlich der Probenvorbereitung zusammen mit Chromatographie und Massenspektrometrie-Analyse. Auch die Qualitätskontrolle, Methodenkalibrierungsbedingungen und Matrixeffektfragen werden diskutiert. Wir beschrieben eine einfache Anwendung von 3-Nitrotyrosin als einen analogen Standard für alle Zielanalyten. Wie durch Experimente mit menschlichen Eierstock- und Brustkrebszellen bestätigt, liefert die vorgeschlagene LC-SQ-Methode zuverlässige Ergebnisse und kann weiter auf andere in vitro zelluläre Modelle angewendet werden.
Introduction
Kynurenin-Weg (KP) ist die Hauptroute von Tryptophan (Trp) Katabolismus in menschlichen Zellen. Indollamin-2,3-Dioxygenase (IDO-1) in extrahepatischen Zellen ist das erste und begrenzende Enzym von KP und wandelt Trp in N-Formylkynurenin1um. Weitere Schritte innerhalb von KP erzeugen andere sekundäre Metaboliten, nämlich Kynurenine, die verschiedene biologische Eigenschaften aufweisen. Kynurenin (Kyn) ist der erste stabile Trp-Katabolit, der toxische Eigenschaften aufweist und zelluläre Ereignisse reguliert, nachdem es an den Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (AhR)2gebunden wurde. Anschließend wird Kyn entweder spontan oder in den enzymvermittelten Prozessen in mehrere Moleküle umgewandelt, die solche Metaboliten wie 3-Hydroxykynurenin (3HKyn), Anthranilic säure (AA), 3-Hydroxyanthranilic acid (3-HAA), Kynurensäure (Kyna) und Xanthurensäure (XA) erzeugen. Ein weiterer nachgeschalteter Metabolit, 2-Amino-3-Carboxymuconinsäure-6-Semialdehyd (ACMS), wird nicht-enzymatischer Zyklisierung zu Chinolinsäure (QA) oder Picolinsäure (PA)1unterzogen. Schließlich wird die QUALITÄTS-Qa weiter in Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+)3umgewandelt, den KP-Endpunktmetaboliten, der ein wichtiger Enzymkofaktor ist. Einige Kynurenine haben neuroprotektive Eigenschaften wie Kyna und PA, während die anderen, d.h. 3HAA und 3HKyn, giftig sind4. Xanthurensäure, die aus 3HKyn gebildet wird, präsentiert antioxidative und vasorelaxation Eigenschaften5. XA sammelt sich in alternden Linsen an und führt zu Apoptose der Epithelzellen6. KP, das Mitte des20. Jahrhunderts beschrieben wurde, erlangte mehr Aufmerksamkeit, als seine Beteiligung an verschiedenen Störungen nachgewiesen wurde. Erhöhte Aktivität dieser Stoffwechselroute und Akkumulation einiger Kynurenine modulieren die Immunantwort und sind mit verschiedenen pathologischen Erkrankungen wie Depression, Schizophrenie, Enzephalopathie, HIV, Demenz, amyotrophe Lateralsklerose, Malaria, Alzheimer, Huntington und Krebsassoziiert 4,7. Einige Veränderungen im Trp-Stoffwechsel werden in Tumormikroumgebungen und Krebszellen2,8beobachtet. Darüber hinaus gelten Kynurenine als vielversprechende Krankheitsmarker9. In der Krebsforschung sind In-vitro-Zellkulturmodelle etabliert und weit verbreitet für die präklinische Bewertung von Reaktionen auf Krebsmedikamente10. Trp-Metaboliten werden von Zellen in das Kulturmedium abgesondert und können gemessen werden, um den Status des Kynurenin-Signalwegs zu bewerten. Daher ist es notwendig, geeignete Methoden für den gleichzeitigen Nachweis möglichst vieler KP-Metaboliten in einer Vielzahl biologischer Proben mit einem einfachen, flexiblen und zuverlässigen Protokoll zu entwickeln.
In diesem Beitrag beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Bestimmung von vier Kynurenin-Signalweg-Metaboliten: Kyn, 3HKyn, 3HAA und XA von LC-SQ in einem post-culture Medium, das aus Krebszellen gesammelt wird. In einem modernen analytischen Ansatz wird die Flüssigchromatographie13,14,15,16 für die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung der einzelnen Tryptophan-Kataboliten bevorzugt, im Gegensatz zu biochemischen unspezifischen Assays unter Verwendung des Ehrlich-Reagenz11,12. Derzeit gibt es viele Methoden zur Bestimmung von Kynureninen in menschlichen Proben, hauptsächlich auf der Grundlage einer Flüssigchromatographie mit Ultraviolett- oder Fluoreszenzdetektoren13,17,18,19. Die Flüssigchromatographie in Verbindung mit einem Massenspektrometriedetektor (LC-MS) scheint aufgrund ihrer höheren Empfindlichkeit (untere Nachweisgrenzen), Selektivität und Wiederholbarkeit für diese Art der Analyse besser geeignet zu sein.
Trp-Metaboliten wurden bereits im menschlichen Serum, Plasma und Urin13,20,21,22,23bestimmt, aber auch die Methoden für andere biologische Proben, wie Zellkulturmedium, sind erwünscht. Zuvor wurde LC-MS für Trp-abgeleitete Verbindungen in einem Medium verwendet, das nach der Kultivierung menschlicher Gliomzellen, Monozyten, dendritischer Zellen oder Mit Interferon-Gamma (IFN-γ)behandelterbehandeltwurde. Derzeit sind neue validierte Protokolle erforderlich, die eine Bewertung mehrerer Metaboliten in verschiedenen Kulturmedien, Zellen und Behandlungen ermöglichen können, die in Krebsmodellen verwendet werden.
Der Zweck der entwickelten Methode ist es, (innerhalb eines analytischen Laufs) vier große Kynurenine zu quantifizieren, die auf Anomalien in KP hinweisen können. Hier werden kritische Schritte unseres kürzlich veröffentlichten Protokolls zur quantitativen LC-SQ-Analyse ausgewählter aussagekräftiger Kynurenine mit einem internen Standard (3-Nitrotyrosin, 3NT) im Medium aus in vitro kultivierten menschlichen Krebszellen27vorgestellt. Nach bestem Wissen und Gewissen ist es das erste LC-SQ-Protokoll zur gleichzeitigen Quantifizierung von 3HKyn, 3HAA, Kyn und XA in einem Kulturmedium, das aus den in vitro gewachsenen Zellen gewonnen wird. Bei einigen Modifikationen könnte die Methode weiter angewendet werden, um die Veränderungen des Trp-Stoffwechsels in einer breiteren Palette von Zellkulturmodellen zu untersuchen.
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Protocol
1. Herstellung von Standard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA Standard-Lagerlösungen
- Wiegen Sie die Reagenzien in einer Durchstechflasche mit der höchsten Genauigkeit (jeweils 0,3 mg). Skalieren Sie die Reagenzien für eine bessere Genauigkeit, indem Sie das Volumen des Lösungsmittels gemäß Schritt 1.2 anpassen.
- Lösen Sie die Reagenzien in 300 l des Lösungsmittels auf, um eine Stammlösung von 1 g/L zu erhalten. Lösen Sie 3NT in 1% (v/v) Ameisensäure (FA) in Wasser; Kyn, 3HAA und XA in Dimethylsulfoxid (DMSO); 3HKyn in Wasser auf pH 2,5 mit Salzsäure (HCl) säuert.
VORSICHT: 3HAA reizt Augen, Nase, Hals und Lunge. Es ist schädlich beim Einatmen, bei Kontakt mit der Haut und bei Verschlucken. Tragen Sie einen angemessenen Schutz, z. B. Handschuhe und Maske. - Schließen Sie die Durchstechflasche fest und legen Sie sie 1 min in ein Ultraschallbad, um die Auflösung zu beschleunigen.
HINWEIS: Bewahren Sie die Lagerlösungen bei -20 °C auf und minimieren Sie das Einfrieren/Auftauen (max. 3 Zyklen) aufgrund der Instabilität der Lagerlösungen.
2. Zubereitung von holzkohlebehandeltem Kulturmedium
- In einem Rohr 280 mg Aktivkohle wiegen und 5 ml des flüssigen Mediums hinzufügen, das für die Kultivierung der zellen von Interesse vorbereitet ist.
- Schütteln Sie das Rohr mit dem Medium und Holzkohle auf einem Sägewipbe für 2 h, bei Raumtemperatur (eingestellte Geschwindigkeit auf 50 Schwingungen/min). Als nächstes zentrifugieren Sie die Rohre bei 6000 x g für 15 min.
- Entfernen Sie das Rohr aus der Zentrifuge und sammeln Sie den Überstand sorgfältig, ohne das Sediment zu stören. Bei Bedarf zentrifugieren, um alle Holzkohlerückstände zu entfernen.
- Filtern Sie den Überstand mit einem Spritzenfilter von 0,45 m.
- Stellen Sie sicher, dass dem vorbehandelten Kulturmedium der Kynurenine-Spuren vorenthalten wird, indem Sie eine Pilotprobe auf LC-MS ausführen, wie in Schritt 6.3.2 beschrieben. Andernfalls wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.4.
HINWEIS: Wenn das gesamte Kulturmedium zunächst keine Kynurenine enthält, kann der Reinigungsschritt mit Holzkohle weggelassen werden. In diesem Fall bereiten Sie Kalibrierstandards und Qualitätskontrollproben mit dem gesamten Medium vor, das normalerweise für die Zellkultivierung vorbereitet wird. - Bewahren Sie das vorbereitete Medium bis zur Analyse bei 4 °C auf.
3. Herstellung der Kalibrierlösungen und Kalibrierkurven
- Spike die Holzkohle vorbehandelt Kulturmedium mit 0,75 l von 0,1 g/ L 3NT Lösung und fügen Sie vier Standards (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) mindestens sechs verschiedene Konzentrationen, um Kalibrierbereiche zu decken. Halten Sie das endige Volumen jeder Probe bei 150 L. Vortex gut. Verwenden Sie 1,5 ml Zentrifugenrohre für die Probenvorbereitung.
HINWEIS: Vorgeschlagene Kalibrierpunkte für 3HKyn: 0,018, 0,045, 0,22, 1,12, 2,23, 4,46 ,mol/L; für Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 ,mol/L; für 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 ,mol/L; für XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 ,Mol/L. - Zur Probendeproteinisierung 150 l kaltes Methanol (bei -20 °C gehalten) mit 1% (v/v) Ameisensäure in jedes Rohr geben. Dicht die Rohre dicht schließen und gut wirbeln.
- Inkubieren Sie die Proben bei -20 °C für 40 min.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 x g für 15 min bei 4 °C. Entfernen Sie die Rohre aus der Zentrifuge. Sammeln Sie Überstand in die neuen Röhren. Stören Sie das Sediment nicht.
- Übertragen Sie 270 L des Überstandes mit einer automatischen Pipette in die Glasdurchstechflasche. Die Fläschchen in den Verdampfer legen und vorsichtig verdampfen, bis sie trocken sind. Verwenden Sie das entsprechende Programm für Wasser/Methanol-Fraktionen, um flüchtige Komponenten zu verdampfen. Temperatur höher als 40 °C nicht auftragen und Übertrocknung vermeiden.
HINWEIS: Flache Glasfläschchen im Boden, d. h. chromatographische Durchstechflaschen, ermöglichen eine schnellere Verdunstung und höhere Rückgewinnungen im Vergleich zu kunststoffkonischen Rohren. - Überprüfen Sie nach 30 min den Verdunstungsstatus. Setzen Sie ggf. die Verdunstung fort (z. B. zusätzlich 10 min hinzufügen). Vermeiden Sie Übertrocknung.
- Entfernen Sie die Durchstechflaschen aus dem Verdampfer. Rekonstituieren Sie jede Probe in 60 l 0,1% (v/v) Ameisensäure in Wasser. Fügen Sie das Lösungsmittel in die Durchstechflasche, die das Restmaterial enthält. Schließen Sie die Fläschchen und Dentex-Gut dicht.
- Die Probe in ein 1,5 ml-Rohr geben und bei 14.000 x g 15 min bei 4 °C drehen, um das gefällte Protein zu trennen.
- Ohne das Proteinpellet zu stören, übertragen Sie die Überwälststoffe in chromatographische Fläschchen mit konischen Glaseinsätzen mit einer automatischen Pipette. Schließen Sie die Fläschchen dicht.
- Prüfen Sie, ob Luftblasen in der Einlegedurchstecher vorliegen, und entfernen Sie sie bei Bedarf (z.B. durch Wirbel).
- Übertragen Sie die chromatographischen Durchstechflaschen mit Proben in den LC-Autosampler. Zeichnen Sie die Position der Proben auf, die in einem Autosampler-Fach platziert werden.
4. Erstellung von Qualitätskontrollproben (QC)
- Spike das holzkohlevorbehandelte Kulturmedium (in einem 1,5 ml Zentrifugalrohr) mit 0,75 l von 0,1 g/L 3NT Lösung und Standards von vier Kynureninen (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) in einer Konzentration aus dem linearen Bereich der Kalibrierkurven ausgewählt. Halten Sie das Endvolumen der Probe bei 150 l.
HINWEIS: Bereiten Sie gegebenenfalls mehrere QC-Proben in unterschiedlichen Konzentrationen vor, die unter den linearen Bereich der Kalibrierkurve fallen. - Befolgen Sie das in Abschnitt 3 beschriebene Protokoll (Schritte 3.2-3.11).
5. Einrichten des LC-MS-Systems
- Bereiten Sie die mobilen Phasenlösungsmittel vor: Lösungsmittel A: 20 mmol/L Ammoniumformat in Reinstwasser (pH 4.3 mit Ameisensäure eingestellt); Lösungsmittel B: 100% Acetonitril.
HINWEIS: Verwenden Sie nur Borosilikatglasflaschen. Spülen Sie Flaschen mit Reinstwasser, bevor Sie es nachfüllen. Verwenden Sie keine mit Reinigungsmitteln gereinigten Flaschen.
VORSICHT: Acetonitril verursacht schwere gesundheitliche Auswirkungen oder Tod. Es wird leicht durch Hitze entzündet. Acetonietrile Flüssigkeit und Dampf können Augen, Nase, Hals und Lunge reizen.- Bereiten Sie 5 mol/L Lagerlösung von Ammoniumformat vor, indem Sie ein kristallines Reagenz (15,77 g) in 50 ml Reinstwasser in einer Glasflasche auflösen. Rühren, bis sich alle Residuen auflösen. Filtern Sie durch die 0,45 m Membran, um Restreste zu entfernen (z. B. mit einem Nylonspritzenfilter). Lagern Sie die Lagerlösung bei 4 °C.
- Bereiten Sie Solvent A vor, indem Sie 4 ml 5 mol/L Ammoniumformat in Wasser zu 980 ml reinem Wasser in einer Bernsteinglasflasche hinzufügen und gut umrühren. Einen Rührstab eintauchen und die Flasche mit dem Lösungsmittel auf einen Magnetrührer legen. Tauchen Sie eine pH-Elektrode in die Lösung ein und steuern Sie den pH-Wert unter Rühren. Ameisensäure-Stammlösung hinzufügen (98%-100%) Mit einer automatischen Pipette mit 0,2 ml Spitze pH 4,3 zu erhalten, die Lautstärke bis zu 1 L mit Reinstwasser einzustellen und gut umrühren.
HINWEIS: Bereiten Sie die Lösungsmittel mindestens einmal pro Woche vor, um ein mikrobielles Wachstum zu verhindern.
VORSICHT: Ameisensäure (FA) ist beim Einatmen giftig, verursacht Hautverbrennungen und Augenschäden. Arbeiten unter der Dunstabzugshaube; Schutzhandschuhe und Mantel tragen. - Filtern Sie alle Lösungen durch die 0,22 m Membran (z. B. Nylonspritzenfilter), um Restmüll zu entfernen. Verwenden Sie optional die Lösungsmitteleinlassfilter für LC-Lösungsmittelbehälter, um das System vor eingehenden Partikeln zu schützen.
- Starten Sie die Steuerungs- und Datenerfassungssoftware LC-MS.
- Reinigen Sie das LC-System mit der mobilen Phase, um Blasen zu entfernen und alle Lösungsmittelkanäle zu grundieren.
- Ensemble eine Wachsäule, um die analytische Säule vor Verstopfung zu schützen.
- Spülen Sie den Schutz und die analytische Säule (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 m) mit 100% Acetonitril für ca. 30 min und dann mit 100% Lösungsmittel A, bis ein stabiler Druck in der Säule beobachtet wird. Steuern Sie die Systemleistung mit der Steuerungssoftware.
- Legen Sie die entsprechenden LC-Parameter in der Datenerfassungssoftware fest.
- Einrichten des Gradientenprogramms: 0-8 min Lösungsmittel B 0%; 8-17 min Lösungsmittel B 0-2%; 17-20 min Lösungsmittel B 2%; 20-32 min Lösungsmittel B 10-30%; 32-45 min Lösungsmittel B 0%.
- Stellen Sie den mobilen Phasendurchfluss auf 0,15 ml/min, die Gesamtanalyselaufzeit für 45 min, die Säulentemperatur auf +40 °C und das Einspritzvolumen auf 10 l fest.
- Stellen Sie die Erfassungsparameter des Massenspektrometriedetektors ein.
- Anwenden von Ionisierungsparametern: Einzelionenüberwachung (SIM), positive Ionisation, Verneblerdruck von 50 psi, +350 °C Trocknungsgastemperatur, Trocknungsgasdurchfluss von 12 L/min und 5500 V Kapillarspannung.
- Wählen Sie die Analyt-Überwachungsionen: für 3HKyn m/z 225.0 (Scanzeitraum: 2-6 min, Fragmentorspannung: 100 V); für Kyn m/z 209.0 (Scanzeitraum: 6-12 min, Bruchspannung: 80 V); für 3HAA m/z 154.0 (Scanzeitraum: 12-18 min, Bruchspannung: 80 V); für 3NT m/z 227.0 (Scanzeitraum: 18-23 min, Bruchspannung: 100 V); für XA m/z 206.0 (Scanzeitraum: 23-45 min, Bruchspannung: 100 V).
- Erstellen Sie einen Arbeitsvorrat, und führen Sie Beispiele auf dem LC-System aus.
- Führen Sie zunächst vor der Analyse der Versuchsproben eine leere Probe (Solvent A) zumindest in Triplicaten durch, gefolgt von einer QC-Probe.
- Öffnen Sie die Datenanalysesoftware, und laden Sie die für die QC-Stichprobe erhaltenen Ergebnisse.
- Überprüfen Sie die Position der Analytspitzen auf dem Chromatogramm. Wenn sich Signale über die erwartete Position hinaus verschieben, passen Sie die Zeittore für eine angemessene Analytsignalerfassung an. Im Softwarehandbuch finden Sie Anweisungen zur Signalintegration.
6. Erstellen der Kalibrierkurve
- Fügen Sie in der Datenerfassungssoftware Kalibrierstandards in den Arbeitsvorrat ein und führen Sie die Standards in Triplicates aus.
- Integrieren und messen Sie die Spitzenfläche entsprechend 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT und XA bei der Retentionszeit von ca. 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min bzw. 30 min.
- Erstellen Sie individuelle Kalibrierkurven für jeden Metaboliten mit einem Tabellenkalkulationsprogramm.
- Um das Kalibrierdiagramm zu erstellen, zeichnen Sie den Wert für ein Verhältnis der Analyt-Spitzenfläche über die 3NT-Spitzenfläche im Vergleich zur Konzentration des Analyten.
- Analysieren Sie die leere Probe (Holzkohle-vorbehandeltes Kulturmedium, das nur mit 3NT gespickt ist), um sicherzustellen, dass es keine Spur der untersuchten Analyten im Medium gibt. Andernfalls subtrahieren Sie den erhaltenen Wert von jedem Kalibrierpunkt.
- Überprüfen Sie die Linearität jeder Kalibrierkurve.
- Individuell, für jeden Analyten, erstellen Sie eine Neigung-Intercept-lineare Gleichung (y = ax +b), wobei y dem Verhältnis des Analyten-Spitzenbereichs im Vergleich zum 3NT-Spitzenbereich entspricht, a die Steigung ist, x die Analytkonzentration (mol/L) und b bezieht sich auf den Kurvenabfang. Durch das Plotten des Diagramms 'y' im Vergleich zu 'x' wird die Kalibrierungskurve generiert.
- Fügen Sie dem Diagramm eine lineare Trendlinie hinzu, zeigen Sie die Kalibrierungskurvengleichung und den Regressionskoeffizienten im Diagramm an. Stellen Sie sicher, dass der Regressionskoeffizient > 0,990 beträgt. Bei nicht übereinstimmenden Kalibrierstandards diese noch einmal vorbereiten und/oder analysieren. Ändern Sie optional den Konzentrationsbereich der Kalibrierkurve.
- Analysieren Sie die QC-Beispiele, um die Systemleistung zu überprüfen, bevor Sie die experimentellen Proben analysieren. Bei Inkompatibilitäten (± 20% Abweichung vom Referenzwert) bereiten Sie die neuen Kalibrierkurven vor.
7. In-vitro-Zellkultur und Probenentnahme zur Analyse
- Die untersuchten Krebszellen (MDA-MB-231 oder SK-OV-3) in DMEM (Dulbecco es Modified Eagle es Medium) mit 4,5 g/L ᴅ-Glucose, 10% (v/v) fetales Rinderserum (FBS), 2 mmol/L-Glutamin und 1 U Penicillin/Streptomycin und Kultur bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2, um sie für das Experiment zu erweitern. Durchfahrt der Zellen bei 80% der Konfluenz.
- Lösen Sie Zellen von der Kulturschale mit Trypsin, Samen für das Experiment auf 12-Well-Platten mit einer Dichte von 0,3 × 106 Zellen pro Brunnen und legen Sie in einem Inkubator über Nacht.
- Am nächsten Tag, aspirieren Sie das Kulturmedium und fügen Sie frische DMEM mit oder ohne Zugabe der untersuchten Verbindungen, je nach experimentellem Design.
- Nach 48 h das Medium von oben in ein 1,5 ml-Rohr sammeln. Zentrifuge bei 14.000 x g für 5 min, um Zellablagerungen zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand und lagern Sie bei -80 °C bis zur Analyse.
- Speichern Sie das Zellpellet aus Schritt 7.4 für die Proteinschätzung. Einfrieren der Proben bei -20 °C.
HINWEIS: Die Ergebnisse, die für ein Medium aus verschiedenen Brunnen erzielt wurden, sollten auf den Gesamtproteingehalt normalisiert werden, um die Variabilität der Zellzahl in einzelnen Brunnen zu berücksichtigen. Die Proteinkonzentration kann wie in Schritt 9 beschrieben beurteilt werden.
8. Proben für die LC-MS-Analyse vorbereiten
- Die gefrorene Probe bei Raumtemperatur auftauen und gut vermischen. Übertragen Sie 149,25 l des Kulturmediums in ein Zentrifugationsrohr (1,5 ml).
- Fügen Sie 0,75 l von 0,1 g/L der 3NT-Lösung hinzu (interner Standard). Schließen Sie die Rohre und Wirbel gut.
- Zur Probendeproteinisierung 150 l gekühltes Methanol mit -20 °C methanol mit 1% (v/v) FA hinzufügen. Schließen Sie die Rohre und Wirbel gut.
- Fahren Sie mit der Probenvorbereitung fort, wie in Abschnitt 3 beschrieben (Schritte 3.3-3.11).
HINWEIS: Einige Krebszellen wie SK-OV-3 sezernieren große Mengen Kyn in ein Kulturmedium. Um die Daten in einen linearen Bereich der Kalibrierkurve einzupassen, ist eine etwa 100-fache Verdünnung der Probe erforderlich. In diesem Fall einen Teil der Probe mit 0,1% (v/v) FA in Wasser verdünnen und zusätzlich zur unverdünnten Probe analysieren. Die Referenzproben der Normen für die Kalibrierkurve sollten in einem 100-fach verdünnten kompletten Kulturmedium erstellt werden. Alternativ können Sie weitere Punkte in der Kalibrierkurve hinzufügen (wenn die richtige Löslichkeit und Linearität erreicht wird), um sie an den Konzentrationsgrad von Kyn in der Versuchsprobe anzupassen. - Analysieren Sie die Proben von LC-MS, wie in Abschnitt 5 beschrieben. Erstellen Sie einen Arbeitsvorrat, und führen Sie jedes Beispiel in dreifacher Ausführung aus.
- Messen Sie nach Abschluss des Arbeitsvorplatzes die Spitzenfläche des Analyten.
- Generieren Sie eine Kalkulationstabelle mit der verfügbaren Software und erhalten Sie numerische Daten.
- Berechnen Sie in einer Tabellenspalte das Verhältnis der Analyt-Spitzenfläche zum 3NT-Spitzenbereich.
- Verwenden Sie eine individuelle lineare Kalibrierungsgleichung, die für jeden Analyten (ab Schritt 6.3.) vorgesehen ist, um die Konzentrationen von Analyten in den experimentellen Proben zu berechnen.
9. Bewertung des Proteingehalts und der Datennormalisierung
- Setzen Sie das Zellpellet aus Schritt 7,5 mit 100 l Phosphat-gepufferter Saline (PBS) in 1,5 ml Röhre wieder aus.
HINWEIS: Bereiten Sie die PBS-Lösung vor, indem Sie 8 g Natriumchlorid, 0,2 g Kaliumchlorid, 1,44 g Natriumphosphatdibasis, Kaliumdihydrogenphosphat in 950 ml Reinstwasser auflösen. Gut umrühren. Stellen Sie den pH-Wert mit Salzsäure (tropfenweise) auf 7,4 ein. Volumen bis 1 L mit Reinstwasser einstellen. Gut umrühren, bis es homogen ist.
VORSICHT: Salzsäure ist stark korrosiv und muss mit geeigneten Sicherheitsvorkehrungen behandelt werden. Der Kontakt mit der menschlichen Haut kann Rötungen, Schmerzen, Hautverbrennungen verursachen. Arbeiten unter der Dunstabzugshaube; Schutzhandschuhe und Mantel tragen. - Die Proben bei -20 °C einfrieren und dann auf Eis auftauen. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 x g für 15 min bei 4 °C. Sammeln Sie die Überräube in die neuen Röhren. Stören Sie das Pellet nicht.
- Verdünnen Sie die Überräube 10x mit PBS.
- Konstruieren Sie eine Kalibrierkurve von 0 bis 2 g des Proteins pro Bohrbereich.
- Bereiten Sie die BSA-Standardlösung (Bovine Serum Albumin) für die Kalibrierung vor. Lösen Sie 1,23 g BSA in 1 ml Reinstwasser und Wirbel gut auf.
- Auf einer 96-Well-Platte verschiedene Mengen an BSA-Standardlösung (1,23 g/ml) laden: 0 l, 2 l, 4 l, 5 l, 7 l, 10 l, 15 , L, 20 l.
- Füllen Sie den Brunnen mit PBS bis zum Endvolumen von 50 l.
- Laden Sie 10 - 15 L Zelllysat ab Schritt 9.4 auf die gleiche 96-Well-Platte. Füllen Sie die Brunnen mit PBS, um das Endvolumen von 50 l zu erreichen.
HINWEIS: Passen Sie bei Bedarf die Lautstärke des Zellenlysats aliquot in jedem Bohrkörper an, damit sie in den linearen Bereich der Kalibrierkurve passt. Halten Sie das Endvolumen auf 50 l der Probe pro Bohrung auf. - Fügen Sie jedem Brunnen 200 L eines Bradford-Reagenzes (5-mal mit Reinstwasser verdünnt) hinzu.
- Inkubieren Sie die 96-Well-Pastete für mindestens 5 min bei Raumtemperatur. Setzen Sie die Platte in einen Mikroplattenleser ein. Messen Sie die Absorption bei n = 595 nm.
- Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve mit einem Tabellenkalkulationsprogramm. Zeichnen Sie den BSA-Betrag (g) im Vergleich zur Absorption. Fügen Sie eine lineare Trendlinie hinzu, zeigen Sie die Kalibrierungskurvengleichung und den Regressionskoeffizienten im Diagramm an.
- Verwenden Sie die lineare Gleichung (y = ax +b, wobei y der Absorption bei n = 595 nm entspricht, a die Steigung ist, x ist ein Proteingehalt (g) und b bezieht sich auf den Kurvenabfang), um die Proteinmenge in der Probe zu berechnen.
HINWEIS: Betrachten Sie einen Probenverdünnungsfaktor in Berechnungen. - Verwenden Sie den geschätzten Proteingehalt, um die Kynureninmenge in der Probe pro 1 mg Protein zu normalisieren. Teilen Sie dazu die in Schritt 8.9 ermittelte Kynureninkonzentration mit dem Gesamtproteingehalt von Schritt 9.10 auf.
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Representative Results
LC-MS bietet unbestreitbare Vorteile bei der Quantifizierung biologisch aktiver Moleküle, auch wenn einige Komponenten komplexer Proben sogenannte Matrixeffekte verursachen und die Ionisierung von Analyten beeinträchtigen. Es führt zu Ionenunterdrückung oder Ionenverstärkung, stark abnehmende Genauigkeit und Auswirkungen auf eine Grenze der Erkennung / Quantifizierung von LC-MS, die als "schwacher" Punkt der Methode betrachtet wird. In unserem Protokoll werden die Ionen durch Elektrospray-Ionisation (ESI) im positiven Modus erzeugt, der auch in anderen Studien zur Trp-Metabolitenbestimmung13eingesetzt wurde. ESI ist jedoch anfälliger für Matrixeffekte als atmosphärische Druckchemische Ionisation (APCI)28. Für die genaue Quantifizierung von Trp-Metaboliten in einem Zellkulturmedium haben wir daher eine interne Standard- und Matrix-abgestimmte Kalibrierung verwendet, um die matrixabhängigen Effekte auf das Analytsignal zu kompensieren und den Verlust der Zielverbindungen während eines Probenvorbereitungsschritts zu korrigieren. Wir haben den gleichen internen Standard (3NT) für alle untersuchten Analyten (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) angewendet. 3NT wurde nicht in dem ursprünglichen, frischen Medium gefunden, das für die Zellkultivierung verwendet wird, und zeigt ein ähnliches Verhalten wie Zielverbindungen unter den angewandten analytischen Bedingungen. Das macht 3NT zum entsprechenden internen Standard27. Um das Protokoll zu vereinfachen, schlagen wir nur einen Schritt der Probenvorbereitung vor, der die Proteinentfernung durch Behandlung mit Methanol enthält, das 1 % (v/v) FA enthält, um es für eine breite Gruppe von Anwendern zugänglicher zu machen.
Innerhalb des vorgestellten Protokolls wird empfohlen, die Kalibrierkurven mit dem gesamten Medium vorzubereiten, das für die Zellkultur verwendet wird. Das Kulturmedium könnte jedoch endogene Kyn enthalten, die eine ordnungsgemäße Schätzung des Analytspitzenbereichs stört, insbesondere in den Kalibrierlösungen bei niedrigen Konzentrationen. Abbildung 1A zeigt DIE LC-SQ-Ergebnisse, die bei der Analyse von DMEM mit 4,5 g/L D-Glucose (DMEM-HG) und 10% (v/v) FBS erzielt wurden, die von unserer Gruppe für eine Krebszellkultur verwendet werden. Wir haben festgestellt, dass das frische komplette Kulturmedium zunächst einige Kyn enthält, die durch Reinigung mit Aktivkohle entfernt werden können (Abbildung 1B). Bei der Analyse der Experimentellen Proben wurde das gesamte DMEM-HG-Kulturmedium auch als Kontrollprobe analysiert, und der Kyn-Spitzenbereich wurde von dem Spitzenbereich subtrahiert, der in jeder getesteten Probe für Kyn aufgezeichnet wurde.
Abbildung 1: Repräsentative LC-SQ-Ergebnisse des gesamten DMEM-HG-Kulturmediums (A) vor und (B) nach Vorbehandlung auf Aktivkohle. Proben des Kulturmediums wurden mit der gleichen Menge des internen Standards (3NT) gespickt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Im folgenden Schritt wurde eine Aufbewahrungszeit für jeden Zielanalyten festgelegt (siehe Chromatogramm in Abbildung 2A). Die bewährte Methode bei der LC-MS-Analyse besteht darin, eine QC-Probe vor den tatsächlichen Proben auszuführen, um die angemessenen Retentionszeiten der Analyten zu bestätigen. Gelegentlich kann eine Verschiebung der LC-Signale beobachtet werden, und Inkongruenzen treten in der Regel auf. Abbildung 2B zeigt eine leichte Veränderung der Retentionszeiten der Analyten, die jedoch korrekte Messungen nicht stört. Auf der anderen Seite stellt Abbildung 2C eine signifikante Veränderung in der Position der Zielspitzen dar. Wie gesehen, wurde das 3NT-Signal deutlich auf eine kürzere Retentionszeit verschoben und kam aus dem eingestellten Zeittor. In diesem Fall war eine angemessene quantitative Analyse nicht möglich, da das interne Standardsignal nicht korrekt gemessen werden kann. Dies kann auf mehrere Faktoren zurückzuführen sein, d. h. unzureichende Säulengleichgewichte, falsche Simmierung der Lösungsmittel in der Pumpe, Verwendung ungeeigneter Probenverdünnungsmittel oder Kontamination der stationären Säulenphase. Abbildung 2Dstellt jedoch eine Situation dar, in der die registrierten Spitzen unter stark niedrigen Intensitäten leiden. Dies kann auf einen Injektionsfehler, ein Leck im System oder MS-Schäden zurückzuführen sein. Darüber hinaus können die mitverdünnenden Matrixkomponenten Ionen erzeugen, bei denen für die Zielanalyten ausgewählt e00ert wurde, wie in Abbildung 3A, wo das Ergebnis der Analyse des MDA-MB-231-Zellenkulturmediums dargestellt wird. Bei der Retentionszeit von ca. 25 min wurde ein starkes Signal beobachtet, das von einer unbekannten Matrixkomponente (Verbindung X) abgeleitet wurde. Der Peak erscheint in der Scan-Periode, wenn das Ion von m/z 206 (ausgewählt für XA) überwacht wurde. Dieses Signal entspricht jedoch aufgrund der Inkompatibilität der Retentionszeit nicht dem Analyten. Um Fehler bei der Spitzenintegration zu vermeiden, wird auch ein Vergleich der Aufbewahrungszeit mit der für QC-Samples aufgezeichneten Zeit empfohlen.
Abbildung 2. Beispiele für korrekte und falsche Ergebnisse. Die korrekten Chromatogramme der QC-Probenanalyse bei (A) mittel und (B) niedrigen Konzentrationen, die in verschiedenen Tagen aufgezeichnet wurden. Beispiel für das falsche Chromatogramm, das sich aus einer signifikanten Änderung der Retentionszeiten der Analyten (C) und unbefriedigenden Intensitäten von Spitzen (D) ergibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse des Kulturmediums, die aus verschiedenen Krebszelllinien gesammelt wurden. Kulturmedium aus (A) MDA-MB-231 (menschlicher Brustkrebs) und (B) SK-OV-3 (humaner Eierstockkrebs) Zellen wurde mit LC-SQ analysiert. Die Verbindung X zeigt das Signal einer unbekannten Verbindung an, die im Kulturmedium vorhanden ist und mit dem Analyten eluiert und zu einem Ion mit m/z ionisiert, das für den Analyt ausgewählt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das für Krebszellen (DMEM) verwendete Kulturmedium enthält erhebliche Mengen an Trp. Sein Isotop (13C-Trp) hat das gleiche Ion wie XA (m/z 206) und könnte die XA-Bestimmung beeinträchtigen. Unter den angewandten chromatographischen Bedingungen ist das Signal von Trp jedoch gut vom XA-Signal getrennt. Daher kamen wir zu dem Schluss, dass die in DMEM enthaltene Trp die XA-Quantifizierung und -Genauigkeit der Methode nicht beeinflusst (Abbildung 4).
Abbildung 4. Position der Tryptophan (Trp) und Xanthurensäure (XA) Signale auf MS Chromatogramm. Standardlösungen von Trp (49,0 mol/L) und XA (48,8 x mol/L) wurden in Lösemittel A (20 mmol/L Ammoniumformat in Wasser, pH 4,3) unter optimierten LC-SQ-Bedingungen hergestellt. Die Ionen von m/z 205 (entspricht [Trp+H]+) und m/z 206 (entsprechend [XA+H]+) wurden auf Trp bzw. XA überwacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die vorgestellte Analysemethode hat den Validierungstest in Bezug auf Linearität, Genauigkeit (Variationskoeffizienten ≤15%), Genauigkeit (96-104%), Wiederherstellung (96-119%) und Matrixeffekte für alle Analyten erfolgreich bestanden, wie es in unserer vorherigen Arbeit 27ausführlich beschrieben wurde.
Schließlich bestätigten wir eine Anwendung des beschriebenen analytischen Ansatzes auf ein Medium, das aus den in vitro kultivierten menschlichen Krebszellen gesammelt wurde. Unsere Daten bestätigten, dass ein Gehalt an Kynureninen in einem Kulturmedium, das aus verschiedenen Zelltypen gesammelt wurde, erheblich variieren kann (Abbildung 3). Wir analysierten das Kulturmedium aus 2 Arten von Krebslinien, d.h. MDA-MB-231 und SK-OV-3 Zellen, die aus Brust- bzw. Eierstockkrebs stammen. Die ausgewählten Linien werden oft als Modelle zur Untersuchung molekularer Ereignisse und für Anti-Krebs-Medikamente-Tests verwendet. Wie wir beobachteten, die Zellen kultiviert in einem Kontrollstandard-Medium freigesetzt verschiedene Mengen von Tryptophan-Metaboliten, d.h. MDA-MB-231-Zellen gaben eine quantifizierbare Menge an Kyn und XA bei niedriger Nmol/L-Konzentration frei (Abbildung 3A), während SK-OV-3-Zellen signifikant mehr Kyn, sehr geringe Sekretion von XA und keine Sekretion anderer untersuchter Kynurenine zeigten, wie durch die Intensität der entsprechenden Spitzen angegeben (Abbildung 3B).
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Discussion
Dieses Papier stellt ein detailliertes LC-SQ-Protokoll zur gleichzeitigen Quantifizierung von vier großen Trp-Metaboliten (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) vor, die in einem Medium aus in vitro kultivierten menschlichen Krebszellen gemessen werden. Besondere Aufmerksamkeit wird der Probenvorbereitung, dem chromatographischen/Massenspektrometrieverfahren und der Dateninterpretation, den wichtigsten Punkten der Analyse, gewidmet.
Im Allgemeinen erfordert die LC-MS-Analyse aufgrund der hohen Empfindlichkeit die höchsten Standards einer Protokollstriktatoganzundlichkeit der verwendeten Materialien. Es bezieht sich auf eine Anwendung von sauber gereinigten und ordnungsgemäß gewaschenen Glaswaren, sowie hochwertige Chemikalien während des standardischen Verfahrens. Es ist sehr wichtig, Lösungsmittel auf Frischwasserbasis einer mobilen Phase zu verwenden, um mikrobielle Kontaminationen zu vermeiden, die bei diesem sensiblen Ansatz die Analyse drastisch beeinflussen könnten. Vor der Injektion in ein LC-System müssen die analysierten Proben sorgfältig auf das Vorhandensein von unlöslichen Partikeln untersucht werden. Es ist wichtig zu beachten, dass die Spalte vor der Stichprobenanalyse ausreichend ausgeglichen werden sollte. Die Nichtbeachtung dieser Vorschriften kann zur Kontamination der Proben, des LC-Systems und der analytischen Spalte oder zu einer unzureichenden Probenionisierung in der MS-Quelle führen, was schließlich zu einer Verschiebung der Signale führt.
Es gibt 2 Schlüsselpunkte innerhalb des Protokolls, die hervorgehoben werden müssen, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Der wichtigste Teil des vorgestellten Protokolls ist der Beispielvorbereitungsschritt. Die Verwendung eines unzureichenden Verfahrens führt zu einem Verlust von Zielverbindungen und damit zu einer ungenauen Quantifizierung. Bei unserem Ansatz wurde während der Methodenentwicklung der Probenvorbereitungsschritt zusammen mit der Auswahl des Lösungsmittels für die Proteinentfernung sorgfältig optimiert. Wie wir ermittelten, ergab die Probenbehandlung mit Methanol, das 1% (v/v) Ameisensäure enthält, die besten Erholungen für alle untersuchten Kynurenine. Die Auswirkungen einer mobilen Phasenzusammensetzung auf das Ausmaß der Analytionisierung wurden ebenfalls bewertet. Wir haben mobile Phasen, bestehend aus 0-20 mmol/L Ammoniumformat oder Ammoniumacetat bei verschiedenen pH-Einstellungen mit Ameisen- oder Essigsäure geprüft. Die mobile Phase mit 20 mmol/L Ammoniumformat in Wasser (pH 4.3, Lösungsmittel A) und Acetonitril (Lösungsmittel B) bot die bestmöglichen Bedingungen für die gleichzeitige Quantifizierung von Kyn, 3HKyn, 3HAA und XA27. Ein weiterer wichtiger Schritt in der LC-MS-Analyse ist die Spitzenintegration. Einige Kynurenine treten in einer Probe bei sehr niedrigen Konzentrationen auf. In diesem Fall können sich die Signale von Co-Eluting-Verbindungen mit dem Zielanalytensignal überlappen oder einen Peak bei einer ähnlichen Retentionszeit erzeugen. Ein unerfahrener Benutzer dieser Methode kann einige Schwierigkeiten mit einer korrekten Spitzenintegration finden, wie in Abbildung 2Cveranschaulicht. Daher ist die Überprüfung der Retentionszeit für die Analyten und der Vergleich mit einer QC-Probe erforderlich und sehr zu empfehlen.
Zu den guten analytischen Verfahren gehört die Auswahl eines geeigneten internen Standards für eine quantitative Analyse. Hierin schlagen wir einen einfachen und kostengünstigen Ansatz vor, bei dem nur ein interner Standard (3NT) als Analogon von vier Kynureninen verwendet wird. Die Ergebnisse bestätigten, dass 3NT ein ähnliches chromatographisches Verhalten wie die Zielverbindungen aufweist und es im Ergebnis ermöglicht, eine gute Präzision und Genauigkeit der Methode27zu erreichen. Unter den angewandten LC-Bedingungen ist die 3NT-Spitze gut von den Signalen der anderen Analyten getrennt und leicht zu messen. Wir sind uns bewusst, dass isotopisch markierte interne Standards (ILIS), die in solchen Analysen verwendet werden14,15, eine bessere Kompensation von Matrixeffekten und eine bessere Kontrolle aller Variablen bieten, die zu falschen Ergebnissen führen können. Auf der anderen Seite sind ILIS für alle Zielanalyten nicht immer leicht verfügbar, geschweige denn ihre hohen Kosten. Außerdem sind ILIS eher für LC-MS/MS als für LC-SQ mit SIM-Modus (Single Ion Monitoring) vorgesehen, den wir in diesem Dokument verwendet haben.
Die Verwendung von 3NT als interner Standard könnte hier als Einschränkung der Methode aufgrund der Möglichkeit einer 3-Nitrotyrosin-Bildung auf Proteinen29betrachtet werden. Bei einem Kulturmedium haben wir jedoch kein freies endogenes 3-Nitrotyrosin beobachtet. Lassen Sie uns 3NT als geeigneten internen Standard erkennen. Wir empfehlen jedoch eine vorherige Bewertung eines anfänglichen endogenen 3NT-Spiegels, insbesondere bei der Untersuchung anderer Zelltypen, die in diesem Bericht getestet wurden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei der Auswahl eines Analogas eines analyten Analyten viele Merkmale berücksichtigt werden müssen, z. B. chemische Ähnlichkeit und anfängliche Abwesenheit in einer Probenmatrix. Darüber hinaus kann sich die Stabilität des analogen internen Standards in einer Probenmatrix, seine Rückgewinnungs- und Ionisationseffizienz in Gegenwart von Matrixkomponenten von den Zielverbindungen unterscheiden. Daher sollten alle diese Merkmale während der Methodenentwicklung berücksichtigt und sorgfältig untersucht werden.
Das Analysesystem in der vorgestellten Methode, bestehend aus einem MS-Detektor, ermöglichte es uns, niedrige Nachweisgrenzen zu erreichen (0,0033 – 0,0108 mol/L)27. Auf diese Weise wurden simultane Messungen von 3HKyn, Kyn, 3HAA, XA im Konzentrationsbereich von 0,018 - 4,46 mol/L, 0,0096 - 3,84 mol/L, 0,033 - 13,06 mol/L bzw. 0,019 – 4,87 mol/L erreicht. Die Hauptbeschränkung jeder LC-SQ-Analyse ist mit einer ordnungsgemäßen Trennung von Probenkomponenten auf einer LC-Säule verbunden. Eine schlechte Trennung trägt zu einer geringeren Selektivität im Vergleich zur Detektion mit einer Tandem-Quadrupol-Massenspektrometrie unter Verwendung von Produktionen und dem MRM-Modus (Multiple Reaction Monitoring) bei. Um Interferenzen von anderen Matrixkomponenten zu vermeiden, die die gleichen oder ähnliche Ionen mit einem Zielmolekül teilen, müssen die LC-Trennbedingungen sorgfältig optimiert werden. Beispielsweise erzeugt 13C Trp-Isotop (in Spurenmengen vorhanden) das gleiche Ion von m/z 206, wie es für die XA-Überwachung ausgewählt wurde. Die Fehlinterpretation wurde hier vermieden, indem die chromatographischen Bedingungen und die zufriedenstellende Trennung von Trp und XA aus der Spalte (Abbildung 4) optimiert wurden.
In zukünftigen Anwendungen können einige Änderungen am Protokoll implementiert werden. Ein potenzieller Benutzer kann eine Konzentration des internen Standards (3NT) ändern, wenn die Konzentrationen der untersuchten Kynurenine voraussichtlich fallen und die hier vorgestellten Konzentrationen. Wichtig ist, dass die 3NT-Konzentration sowohl in den Kalibrierstandards als auch in den Versuchsproben gleich sein sollte. Bei einem extrem hohen Analytgehalt, wie z. B. Bei Kyn in SK-OV-3-Zellen, empfehlen wir, mit einer höheren Konzentration von 3NT zu arbeiten. Wenn eine Probenverdünnung erforderlich ist, wird dies im letzten Schritt des Protokolls durchgeführt, bevor die Probe in die LC-Säule einspritzt wird.
In der Literatur gibt es einige Protokolle für LC-MS/MS quantitative Analyse von Kynureninen in einem Kulturmedium aus verschiedenen Zellen vorgeschlagen. Ein Protokoll ermöglicht eine gleichzeitige Bestimmung von 3 Metaboliten, d.h. Kyn, 3HKyn und 3HAA, aber es ist weniger empfindlich (Grenze der Quantifizierungen (LOQ) auf höheren Ebenen), im Gegensatz zu unserer Methode21. Ein weiterer Bericht präsentierte eine Methode, die quantifizierung von 4 Kynureninen ermöglicht, einschließlich Kyn, 3HKyn, 3HAA und XA mit ähnlichen LOQs25. Keiner von ihnen wurde jedoch für den Nachweis von Kynureninen optimiert, die durch in vitro kultivierte Krebszellen erzeugt werden. Die Komponenten einer Probenmatrix beeinflussen die Analytionisierung in der MS-Quelle, indem sie das Signal verringern oder erhöhen, was eine Ursache für unzuverlässige Ergebnisse ist. Um genauere Daten zu erhalten, schlugen wir vor, einen analogen internen Standard (3NT) in Kombination mit einer Matrix-abgestimmten Kalibrierung zu verwenden, um matrixabhängige Effekte besser zu kompensieren.
Anhand der vorgestellten Methodik konnten wir beobachten, dass Kyn der am häufigsten vorkommende Trp-Metabolit in einem Kulturmedium war, das aus den analysierten Krebszelltypen gesammelt wurde, während die anderen untersuchten Metaboliten unter Kontrollkulturbedingungen nicht nachgewiesen wurden (mit Ausnahme von XA in Spuren, aber nachweisbaren Mengen). Als die Zellen jedoch mit einem potenten Immunaktivator – bakteriellem Lipopolysaccharid – stimuliert wurden, wurde eine größere Menge an XA zusätzlich zu Kyn abgesondert. Auf der anderen Seite waren die erkannten 3HKyn und 3HAA, die vor XA innerhalb von KP gebildet werden, noch unter LOQ27. Dies deutet darauf hin, dass einige KP-Metaboliten, die in kleinen Mengen in einem Kulturmedium vorhanden sind, mit dem vorgeschlagenen LC-SQ-Ansatz schwer zu messen sein könnten. Dennoch ist das vorgestellte Protokoll nützlich, um Änderungen in KP durch Quantifizierung der akkumulierenden Schlüssel-Trp-Metaboliten zu identifizieren. Der Einsatz dieser Methode in zukünftigen Studien, um ein In-vitro-Zellkultursystem zu engagieren, wird neue Biomarker für immunbedingte Krankheiten und Krebs liefern. Unser Ansatz bietet einen validierten und zuverlässigen Test mit relevanter Empfindlichkeit für Zellmodelle, die aufgrund der geringen Konzentrationen der nachgeschalteten KP-Metaboliten anspruchsvoll sind. Die bereitgestellten Anweisungen werden es Forschern aus verschiedenen Bereichen ermöglichen, diesen Ansatz für die Quantifizierung großer Kynurenine im Zusammenhang mit Krebs und anderen Krankheiten zu nutzen. Unsere (unveröffentlichten) Daten zeigen, dass es nützlich ist, um die KP-Modulation in Zellen zu untersuchen, die verschiedenen Glykationsprodukten ausgesetzt sind, aber sie sollten auch eine Anwendung in anderen Forschungsbereichen und Krankheiten mit Immunkomponente finden, z.B. in der Endometriumbiologie und Reproduktion30.
Das vorgestellte Protokoll kann weiter erweitert werden, um zusätzliche Analyten zu bestimmen, die sich in einem Kulturmedium unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ansammeln könnten. Für die Methodenvalidierung sollten die entsprechenden Referenzstandards von Analyten in Bezug auf Genauigkeit, Genauigkeit, Linearität, Wiederherstellung oder Selektivität verwendet werden, bevor sie für quantitative Analysen verwendet werden. Je nach Forschungszweck könnte das Protokoll für einzelne Kynurenine (3HKyn, Kyn, 3HAA oder XA) verwendet werden. In diesem Fall können die Ionen, die Verbindungen entsprechen, die nicht für die Analyse in Betracht gezogen werden, aus den MS-Einstellungen entfernt werden. Die passenden Änderungen im LC-Gradientenprogramm helfen beim Ausschneiden der Analysezeit.
Bei der Untersuchung von KP ist es wichtig, die Aktivität des IDO-Enzyms zu bewerten. Dies könnte einfach geschätzt werden, indem man den Trp-Verbrauch und die Kyn-Freisetzung in ein Kulturmedium misst oder ein Kynurenin-Tryptophan-Konzentrationsverhältnis ([Kyn]/[Trp])31berechnet. In unserem Ansatz haben wir keine Trp-Konzentration gemessen, aber das Protokoll könnte durch Hinzufügen dieses Ziels in der LC-SQ-Analyse erweitert werden. Als biochemisch geeigneteransatz empfehlen wir, die enzymatische IDO-Aktivität als eine Menge Kyn auszudrücken, die von Zellen pro Milligramm Protein pro Minute produziert wird, wie an anderer Stelle dargestellt32. Wir haben einen Vorteil bei der Verwendung dieses Ansatzes in unseren anderen Studien über Krebszellen (Manuskript in Vorbereitung) bemerkt und empfehlen diese Methode bei der Verwendung von In-vitro-Zellkulturmodell.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Europäischen Union aus dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung im Rahmen des Operationellen Programms Entwicklung Ostpolens 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00) von der Fakultät für Biotechnologie und Umweltwissenschaften der Katholischen Universität Lublin (Young Scientists Grant for Ilona Sadok), Polish National Science Centre, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 für Magdalena Staniszewska, Principle Investigator). Die Autoren danken Prof. Agnieszka 'cibior vom Laboratory of Oxidative Stress, Centre for Interdisciplinary Research, JPII CUL für die gemeinsame Nutzung der Ausrüstung für zellulierung und Proteinquantifizierung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
| Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
| Analytical balance | Ohaus | ||
| Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
| Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
| Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
| Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
| Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
| Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
| Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
| Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
| Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
| Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
| Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
| Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
| Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
| See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
| Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
| Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
| Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
| Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
| Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
| Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
| Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
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