Beschrieben wird hier ein Protokoll zur Bestimmung von vier verschiedenen Tryptophan-Metaboliten, die im Kynurenin-Signalweg (Kynurenin, 3-Hydroxykynurenin, Xanthurensäure, 3-Hydroxyanthranilsäure) in dem Medium erzeugt werden, das aus Krebszellkulturen gesammelt wird, die durch flüssige Chromatographie in Verbindung mit einer einzigen Quadrupol-Massenspektrometrie analysiert werden.
Der Kynurenin-Weg und die Tryptophan-Kataboliten genannt Kynurenine haben erhöhte Aufmerksamkeit für ihre Beteiligung an der Immunregulation und Krebsbiologie erhalten. Ein In-vitro-Zellkultur-Assay wird oft verwendet, um über den Beitrag verschiedener Tryptophan-Kataboliten in einem Krankheitsmechanismus zu lernen und therapeutische Strategien zu testen. Zellkulturmedium, das reich an sezernierten Metaboliten und Signalmolekülen ist, spiegelt den Status des Tryptophan-Stoffwechsels und anderer zellulärer Ereignisse wider. Neue Protokolle zur zuverlässigen Quantifizierung mehrerer Kynurenine im komplexen Zellkulturmedium sind erwünscht, um eine zuverlässige und schnelle Analyse mehrerer Proben zu ermöglichen. Dies kann mit flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie erreicht werden. Diese leistungsstarke Technik wird in vielen klinischen und Forschungslaboratorien für die Quantifizierung von Metaboliten eingesetzt und kann zur Messung von Kynureninen eingesetzt werden.
Hier wird die Verwendung der Flüssigchromatographie gekoppelt mit der Single-Quadrupol-Massenspektrometrie (LC-SQ) zur gleichzeitigen Bestimmung von vier Kynureninen, d.h. Kynurenin, 3-Hydroxykynurenin, 3-Hydroxyanthranilal und Xanthurensäure im Medium, das aus in vitro kultivierten Krebszellen gesammelt wird, vorgestellt. SQ-Detektor ist einfach zu bedienen und im Vergleich zu anderen Massenspektrometern kostengünstiger. In der SQ-MS-Analyse werden mehrere Ionen aus der Probe erzeugt und entsprechend ihrem spezifischen Massen-Zu-Lade-Verhältnis (m/z)getrennt, gefolgt von der Erkennung mit einem SIM-Modus (Single Ion Monitoring).
In diesem Papier wird auf die Vorteile der gemeldeten Methode hingewiesen und einige Schwachstellen aufgewiesen. Es konzentriert sich auf kritische Elemente der LC-SQ-Analyse einschließlich der Probenvorbereitung zusammen mit Chromatographie und Massenspektrometrie-Analyse. Auch die Qualitätskontrolle, Methodenkalibrierungsbedingungen und Matrixeffektfragen werden diskutiert. Wir beschrieben eine einfache Anwendung von 3-Nitrotyrosin als einen analogen Standard für alle Zielanalyten. Wie durch Experimente mit menschlichen Eierstock- und Brustkrebszellen bestätigt, liefert die vorgeschlagene LC-SQ-Methode zuverlässige Ergebnisse und kann weiter auf andere in vitro zelluläre Modelle angewendet werden.
Kynurenin-Weg (KP) ist die Hauptroute von Tryptophan (Trp) Katabolismus in menschlichen Zellen. Indollamin-2,3-Dioxygenase (IDO-1) in extrahepatischen Zellen ist das erste und begrenzende Enzym von KP und wandelt Trp in N-Formylkynurenin1um. Weitere Schritte innerhalb von KP erzeugen andere sekundäre Metaboliten, nämlich Kynurenine, die verschiedene biologische Eigenschaften aufweisen. Kynurenin (Kyn) ist der erste stabile Trp-Katabolit, der toxische Eigenschaften aufweist und zelluläre Ereignisse reguliert, nachdem es an den Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (AhR)2gebunden wurde. Anschließend wird Kyn entweder spontan oder in den enzymvermittelten Prozessen in mehrere Moleküle umgewandelt, die solche Metaboliten wie 3-Hydroxykynurenin (3HKyn), Anthranilic säure (AA), 3-Hydroxyanthranilic acid (3-HAA), Kynurensäure (Kyna) und Xanthurensäure (XA) erzeugen. Ein weiterer nachgeschalteter Metabolit, 2-Amino-3-Carboxymuconinsäure-6-Semialdehyd (ACMS), wird nicht-enzymatischer Zyklisierung zu Chinolinsäure (QA) oder Picolinsäure (PA)1unterzogen. Schließlich wird die QUALITÄTS-Qa weiter in Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+)3umgewandelt, den KP-Endpunktmetaboliten, der ein wichtiger Enzymkofaktor ist. Einige Kynurenine haben neuroprotektive Eigenschaften wie Kyna und PA, während die anderen, d.h. 3HAA und 3HKyn, giftig sind4. Xanthurensäure, die aus 3HKyn gebildet wird, präsentiert antioxidative und vasorelaxation Eigenschaften5. XA sammelt sich in alternden Linsen an und führt zu Apoptose der Epithelzellen6. KP, das Mitte des20. Jahrhunderts beschrieben wurde, erlangte mehr Aufmerksamkeit, als seine Beteiligung an verschiedenen Störungen nachgewiesen wurde. Erhöhte Aktivität dieser Stoffwechselroute und Akkumulation einiger Kynurenine modulieren die Immunantwort und sind mit verschiedenen pathologischen Erkrankungen wie Depression, Schizophrenie, Enzephalopathie, HIV, Demenz, amyotrophe Lateralsklerose, Malaria, Alzheimer, Huntington und Krebsassoziiert 4,7. Einige Veränderungen im Trp-Stoffwechsel werden in Tumormikroumgebungen und Krebszellen2,8beobachtet. Darüber hinaus gelten Kynurenine als vielversprechende Krankheitsmarker9. In der Krebsforschung sind In-vitro-Zellkulturmodelle etabliert und weit verbreitet für die präklinische Bewertung von Reaktionen auf Krebsmedikamente10. Trp-Metaboliten werden von Zellen in das Kulturmedium abgesondert und können gemessen werden, um den Status des Kynurenin-Signalwegs zu bewerten. Daher ist es notwendig, geeignete Methoden für den gleichzeitigen Nachweis möglichst vieler KP-Metaboliten in einer Vielzahl biologischer Proben mit einem einfachen, flexiblen und zuverlässigen Protokoll zu entwickeln.
In diesem Beitrag beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Bestimmung von vier Kynurenin-Signalweg-Metaboliten: Kyn, 3HKyn, 3HAA und XA von LC-SQ in einem post-culture Medium, das aus Krebszellen gesammelt wird. In einem modernen analytischen Ansatz wird die Flüssigchromatographie13,14,15,16 für die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung der einzelnen Tryptophan-Kataboliten bevorzugt, im Gegensatz zu biochemischen unspezifischen Assays unter Verwendung des Ehrlich-Reagenz11,12. Derzeit gibt es viele Methoden zur Bestimmung von Kynureninen in menschlichen Proben, hauptsächlich auf der Grundlage einer Flüssigchromatographie mit Ultraviolett- oder Fluoreszenzdetektoren13,17,18,19. Die Flüssigchromatographie in Verbindung mit einem Massenspektrometriedetektor (LC-MS) scheint aufgrund ihrer höheren Empfindlichkeit (untere Nachweisgrenzen), Selektivität und Wiederholbarkeit für diese Art der Analyse besser geeignet zu sein.
Trp-Metaboliten wurden bereits im menschlichen Serum, Plasma und Urin13,20,21,22,23bestimmt, aber auch die Methoden für andere biologische Proben, wie Zellkulturmedium, sind erwünscht. Zuvor wurde LC-MS für Trp-abgeleitete Verbindungen in einem Medium verwendet, das nach der Kultivierung menschlicher Gliomzellen, Monozyten, dendritischer Zellen oder Mit Interferon-Gamma (IFN-γ)behandelterbehandeltwurde. Derzeit sind neue validierte Protokolle erforderlich, die eine Bewertung mehrerer Metaboliten in verschiedenen Kulturmedien, Zellen und Behandlungen ermöglichen können, die in Krebsmodellen verwendet werden.
Der Zweck der entwickelten Methode ist es, (innerhalb eines analytischen Laufs) vier große Kynurenine zu quantifizieren, die auf Anomalien in KP hinweisen können. Hier werden kritische Schritte unseres kürzlich veröffentlichten Protokolls zur quantitativen LC-SQ-Analyse ausgewählter aussagekräftiger Kynurenine mit einem internen Standard (3-Nitrotyrosin, 3NT) im Medium aus in vitro kultivierten menschlichen Krebszellen27vorgestellt. Nach bestem Wissen und Gewissen ist es das erste LC-SQ-Protokoll zur gleichzeitigen Quantifizierung von 3HKyn, 3HAA, Kyn und XA in einem Kulturmedium, das aus den in vitro gewachsenen Zellen gewonnen wird. Bei einigen Modifikationen könnte die Methode weiter angewendet werden, um die Veränderungen des Trp-Stoffwechsels in einer breiteren Palette von Zellkulturmodellen zu untersuchen.
Dieses Papier stellt ein detailliertes LC-SQ-Protokoll zur gleichzeitigen Quantifizierung von vier großen Trp-Metaboliten (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) vor, die in einem Medium aus in vitro kultivierten menschlichen Krebszellen gemessen werden. Besondere Aufmerksamkeit wird der Probenvorbereitung, dem chromatographischen/Massenspektrometrieverfahren und der Dateninterpretation, den wichtigsten Punkten der Analyse, gewidmet.
Im Allgemeinen erfordert die LC-MS-Analyse aufgrund der hohen Empfi…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Europäischen Union aus dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung im Rahmen des Operationellen Programms Entwicklung Ostpolens 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00) von der Fakultät für Biotechnologie und Umweltwissenschaften der Katholischen Universität Lublin (Young Scientists Grant for Ilona Sadok), Polish National Science Centre, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 für Magdalena Staniszewska, Principle Investigator). Die Autoren danken Prof. Agnieszka ‘cibior vom Laboratory of Oxidative Stress, Centre for Interdisciplinary Research, JPII CUL für die gemeinsame Nutzung der Ausrüstung für zellulierung und Proteinquantifizierung.
3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
Analytical balance | Ohaus | ||
Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |