Summary
وصف هنا هو بروتوكول لتحديد أربعة الأيضات التربتوفان مختلفة ولدت في مسار الكينارينين (الكينارينين، 3-هيدروكسيكينورين، حمض زانثيورينيك، 3-حمض هيدروكسيانثرانياليك) في الوسط الذي تم جمعه من الثقافات الخلايا السرطانية تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب واحد رباعية الطيف الكتلي.
Abstract
وقد تلقى مسار الكينيرينين والانتبولات التربتوفان دعا kynurenines زيادة الاهتمام لمشاركتها في تنظيم المناعة وبيولوجيا السرطان. وغالبا ما تستخدم في المختبر خلية الخلية المقايسة لمعرفة المزيد عن مساهمة مختلف نواتج التريبتوفان في آلية المرض ولاختبار الاستراتيجيات العلاجية. خلية ثقافة المتوسطة التي هي غنية في المستقلبات السرية وجزيئات الإشارات يعكس حالة الأيض التربتوفان وغيرها من الأحداث الخلوية. بروتوكولات جديدة لتحديد موثوق بها من الكينيرينينات متعددة في المتوسطة خلية معقدة ثقافة مطلوبة للسماح لتحليل موثوق وسريع من عينات متعددة. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة مقرونة بمنظار الطيف الكتلي. وتستخدم هذه التقنية القوية في العديد من المختبرات السريرية والبحثية من أجل القياس الكمي من المستقلبات ويمكن استخدامها لقياس الكينيرينينات.
هنا هو استخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب الطيف الطيفي كتلة رباعية واحدة (LC-SQ) لتحديد في وقت واحد من أربعة kynurenines، أي، الكيونرينين، 3-هيدروكسيكي نيورينرينين، 3-هيدروكسيانثرانليك، وحمض xanthurenic في المتوسطة التي تم جمعها من الخلايا السرطانية في المختبر. SQ كاشف بسيط للاستخدام وأقل تكلفة بالمقارنة مع مطياف كتلة أخرى. في تحليل SQ-MS، يتم إنشاء أيونات متعددة من العينة وفصلها وفقًا لنسبة الكتلة إلى الشحنة المحددة(m/z)، متبوعة بالكشف باستخدام وضع مراقبة الأيونات الواحدة (SIM).
وتسترعي هذه الورقة الانتباه إلى مزايا الطريقة المبلغ عنها وتشير إلى بعض نقاط الضعف. وهو يركز على العناصر الحاسمة لتحليل LC-SQ بما في ذلك إعداد العينة جنبا إلى جنب مع تحليل الكروماتوغرافيا وقياس الطيف الكتلي. كما تناقش مراقبة الجودة، وظروف معايرة الأسلوب، وقضايا تأثير المصفوفة. وصفنا تطبيق بسيط من 3-نيتروتروروسين كمعيار واحد التناظرية لجميع التحليلات المستهدفة. وكما أكدت التجارب التي أجريت على خلايا سرطان المبيض والثدي، فإن الطريقة المقترحة من LC-SQ تولد نتائج موثوقة ويمكن تطبيقها كذلك على النماذج الخلوية المختبرية الأخرى.
Introduction
مسار الكينيرينين (KP) هو الطريق الرئيسي للتريبتوفان (Trp) تقويض في الخلايا البشرية. إندولام-2،3-ديوكسيجيناز (IDO-1) في الخلايا خارج الكبد هو أول والحد من إنزيم KP ويحول Trp إلى N-formylkynurenine1. خطوات أخرى داخل KP توليد الأيض الثانوية الأخرى, وهي الكينيرينين التي تحمل خصائص بيولوجية مختلفة. Kynurenine (Kyn) هو أول ثابت Trp مستقرة تظهر الخصائص السامة وتنظيم الأحداث الخلوية بعد ربط لمستقبلات الهيدروكربونات آرل (AhR)2. في وقت لاحق, يتم تحويل كين إلى عدة جزيئات إما تلقائيا أو في العمليات التي تتوسطها انزيم, توليد هذه الأيضات مثل 3-هيدروكسيكينرينين (3HKyn), حمض الجمرة الخبيثة (AA), 3-حمض هيدروكسيانثانليك (3-ها)، حمض الكيونريك (كينا), وحمض xanthurenic (XA). آخر المستقلب المصب، 2-أمينو-3-الكربوكبوكيكونيك حمض-6-شبهالديهيد (ACMS)، يخضع للدراجات غير الانزيمية إلى حمض الكينولينيك (QA) أو حمض بيكولينيك (السلطة الفلسطينية)1. وأخيرا، يتم تحويل المزيد من QA إلى نيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد (NAD+)3، وهو المستقلب نقطة نهاية KP الذي هو عامل مساعد انزيم مهم. بعض الكيرينينات لها خصائص اعصاب مثل كينا والسلطة الفلسطينية، في حين أن الآخرين، أي 3HAA و 3HKyn، هي سامة4. حمض Xanthurenic، الذي يتكون من 3HKyn، ويعرض خصائص مضادات الأكسدة و vasorelaxation5. XA يتراكم في العدسات الشيخوخة ويؤدي إلى موت الخلايا الظهاريةللخلايا الظهارية 6. اكتسبت KP، التي تم وصفها في منتصف القرنالعشرين، المزيد من الاهتمام عندما تم إثبات مشاركتها في اضطرابات مختلفة. زيادة نشاط هذا الطريق الأيضي وتراكم بعض الكينيرينات تعدل الاستجابة المناعية وترتبط مع ظروف مرضية مختلفة مثل الاكتئاب، الفصام، اعتلال الدماغ، فيروس نقص المناعة البشرية، الخرف، التصلب الجانبي الضموري، الملاريا، الزهايمر، مرض هنتنغتون، والسرطان4،7. ويلاحظ بعض التغيرات في التمثيل الغذائي Trp في microenonments الورم والخلايا السرطانية2,8. وعلاوة على ذلك، تعتبر الكينيرينينات علامات المرضالواعدة 9. في أبحاث السرطان، نماذج ثقافة الخلايا في المختبر راسخة وتستخدم على نطاق واسع لتقييم ما قبل الكلينيكي من الردود على العقاقير مكافحة السرطان10. ويفرز الأيض Trp من قبل الخلايا في الوسط ثقافة ويمكن قياسها لتقييم حالة مسار الكينيرينين. ولذلك، هناك حاجة إلى تطوير طرق مناسبة للكشف المتزامن عن أكبر عدد ممكن من نواتج الأيض في النماذج البيولوجية في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية مع بروتوكول سهل ومرن وموثوق به.
في هذه الورقة، نحن وصف بروتوكول لتحديد المتزامنة من أربعة الأيض المسار الكينيرينين: كين، 3HKyn، 3HAA، وXA من قبل LC-SQ في وسط ما بعد الثقافة التي تم جمعها من الخلايا السرطانية. في نهج تحليلي حديث، الكروماتوغرافيا السائل13،14،15،16 ويفضل للكشف في وقت واحد وتكميم من المستقلين التربتوفان الأيض، على النقيض من البيوكيميائية غير محدد مقولات استخدام كاشف Ehrlich11،12. في الوقت الحاضر، هناك العديد من الطرق المتاحة لتحديد الكينيرينين في العينات البشرية، تقوم أساسا على الكروماتوغرافيا السائلة مع الأشعة فوق البنفسجية أو للكشف عن الفلوريسين13،17،18،19. يبدو اللوني السائل مقرونًا بمستشعر لقياس الطيف الكتلي (LC-MS) أكثر ملاءمة لهذا النوع من التحليل ، نظرًا لحساسية أعلى (حدود أقل للكشف) والانتقائية والتكرار.
وقد تم بالفعل تحديد الأيض Trp في مصل الدم البشري والبلازما والبول13،20،21،22،23، ومع ذلك ، فإن أساليب العينات البيولوجية الأخرى ، مثل خلية ثقافة المتوسطة هي أيضا المطلوب. سابقا، LC-MS كانت تستخدم للمركبات المشتقة من Trp في وسط جمعت بعد زراعة خلايا الورم الدبقي البشري، monocytes، الخلايا التشعبية أو الخلايا الفلكية تعامل مع انترفيرون غاما (IFN-γ)24،25،26. حاليا, هناك حاجة لبروتوكولات جديدة التحقق من صحة التي يمكن أن تسمح بإجراء تقييم للعديد من الأيضات في وسائل الإعلام المختلفة الثقافة, الخلايا, والعلاجات المستخدمة في نماذج السرطان.
والغرض من الطريقة المتقدمة هو تحديد (في غضون عملية تحليلية واحدة) أربعة الكينيرينينات الرئيسية التي يمكن أن تشير إلى تشوهات في KP. قدمت هنا هي الخطوات الحاسمة من بروتوكولنا نشرت مؤخرا لتحليل LC-SQ الكمية من kynurenines المحددة ذات مغزى باستخدام معيار داخلي واحد (3-نيتروتروروسين، 3NT) في المتوسطة التي تم جمعها من الخلايا السرطانية البشرية في المختبر مثقف27. على حد علمنا، هو أول بروتوكول LC-SQ لتحديد كمية 3HKyn في وقت واحد، 3HAA، كين وXA في وسط الثقافة التي تم الحصول عليها من الخلايا التي تزرع في المختبر. عند بعض التعديلات، قد يتم تطبيق طريقة مزيد من لدراسة التغييرات في التمثيل الغذائي Trp في مجموعة أوسع من نماذج ثقافة الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد معيار 3NT، كين، 3HKyn، 3HAA، XA حلول الأسهم القياسية
- وزن الكواشف في قارورة بأعلى دقة (0.3 ملغ لكل من الزّين). للحصول على دقة أفضل، وتوسيع نطاق الكواشف، وضبط حجم المذيب وفقا للخطوة 1.2.
- تذوب الكواشف في 300 ميكرولتر من المذيبات للحصول على محلول مخزون من 1 g/L. 3NT في 1٪ (v/v) حمض الفشكل (FA) في الماء؛ Kyn, 3HAA, وXA في ثنائيات الدايميتيل السلفوكسيد (DMSO); 3HKyn في الماء حموضة إلى 2.5 درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك (HCl).
تنبيه: 3HAA يهيج العينين والأنف والحنجرة والرئتين. وهو ضار عند استنشاقه ، في اتصال مع الجلد ، وإذا ابتلع. ارتداء الحماية المناسبة، أي القفازات والقناع. - إغلاق بإحكام القارورة ووضعها في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 1 دقيقة لتسريع حل.
ملاحظة: تخزين حلول الأسهم في -20 درجة مئوية وتقليل التجميد / الذوبان (3 دورات كحد أقصى) بسبب عدم استقرار حلول الأسهم.
2- إعداد الوسيلة الوسيطة لثقافة معالجة الفحم
- في أنبوب، تزن 280 ملغ من الفحم المنشط وإضافة 5 مل من المتوسطة السائلة المعدة لأصناف الخلايا ذات الاهتمام.
- يهز أنبوب مع المتوسطة والفحم على رأى الروك رأى لمدة 2 ساعة، في درجة حرارة الغرفة (السرعة المحددة إلى 50 التذبذبات / دقيقة). بعد ذلك، الطرد المركزي الأنابيب في 6000 س ز لمدة 15 دقيقة.
- إزالة أنبوب من جهاز الطرد المركزي وجمع بعناية فائقة دون إزعاج الرواسب. كرر الطرد المركزي إذا لزم الأمر، لإزالة جميع بقايا الفحم.
- تصفية عظمى باستخدام 0.45 μm مرشاح الحقن.
- تأكد من أن الوسيلة الثقافة المعالجة مسبقة للفحم محرومة من آثار الكينيرينينات عن طريق تشغيل عينة تجريبية على LC-MS كما هو موضح في الخطوة 6.3.2. وإلا، كرر الخطوات 2.1-2.4.
ملاحظة: إذا كانت الثقافة الكاملة المتوسطة في البداية لا تحتوي على الكينيرينينات، قد يتم حذف خطوة تنقية باستخدام الفحم. في هذه الحالة، إعداد معايير المعايرة وعينات مراقبة الجودة باستخدام المتوسطة الكاملة التي عادة ما تكون معدة لأصناف الخلايا. - تخزين المتوسط المعد في 4 درجة مئوية حتى التحليل.
3. جعل حلول المعايرة ومنحنيات المعايرة
- قم بزدّح متوسطة الاستزراع المعالجة مسبقًا بالفحم بـ 0.75 ميكرولتر من 0.1 جرام/لتر 3NT، وأضف أربعة معايير (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) على الأقل عند ستة تركيزات مختلفة لتغطية نطاقات المعايرة. الحفاظ على حجم النهائي من كل عينة في 150 μL. دوامة جيدا. استخدام أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل لإعداد العينات.
ملاحظة: نقاط المعايرة المقترحة لـ 3HKyn: 0.018، 0.045، 0.22، 1.12، 2.23، 4.46 ميكرومول/لتر؛ 0.045، 1.12، 2.23، 4.46 ميكرومول/لتر؛ 0.045، 1.12، 2.23، 4.46 ميكرومول/لتر؛ 0.045، 1.12، 2.23، 4.46 ميكرومول/لتر؛ 0.045، 1.12، 2.23، 4. بالنسبة لـ Kyn: 0.0096, 0.048, 0.24, 1.20, 2.40, 3.84 ميكرومول/لتر؛ بالنسبة إلى 3HAA: 0.033، 0.16، 0.65، 3.27، 6.53، 13.06 ميكرومول/لتر؛ بالنسبة لـ XA: 0.019، 0.13، 0.49، 1.22، 3.65، 4.87 ميكرومول/لتر. - إضافة 150 ميكرولتر من الميثانول البارد (أبقى في -20 درجة مئوية) تحتوي على 1٪ (v/v) حمض الفشكل في كل أنبوب لفك البروتين العينة. بإحكام إغلاق الأنابيب و دوامة جيدا.
- احتضان العينات في -20 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي العينات في 14،000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 °C. إزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي. جمع اغطار في أنابيب جديدة. لا تزعج الرواسب.
- نقل 270 ميكرولتر من ااالزجاج في قارورة الزجاج باستخدام ماصة أوتوماتيكية. ضعي القنينات في المبخر وتتبخرين بلطف حتى تجف. استخدام البرنامج المناسب لكسور الماء / الميثانول لتبخر المكونات المتطايرة. لا تطبق درجة حرارة أعلى من 40 درجة مئوية وتجنب الإفراط في التجفيف.
ملاحظة: قارورة الزجاج المسطحة القاعية، أي قنينات الكروماتوغرافية تسهل التبخر الأسرع واسترجاع أعلى بالمقارنة مع الأنابيب المخروطية البلاستيكية. - بعد 30 دقيقة، والتحقق من حالة التبخر. إذا لزم الأمر، استمر في التبخر (على سبيل المثال، أضف 10 دقائق إضافية). تجنب الإفراط في التجفيف.
- إزالة قارورة من المبخر. إعادة تشكيل كل عينة في 60 ميكرولتر من 0.1٪ (v/v) حمض الفليك في الماء. إضافة المذيبات في القارورة التي تحتوي على المواد المتبقية. إغلاق بإحكام قوارير ودوامة-جيدا.
- نقل العينة إلى أنبوب 1.5 مل وتدور في 14000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية لفصل البروتين المترسب.
- دون إزعاج بيليه البروتين، نقل supernatants في قوارير الكروماتوغرافي مع إدراج الزجاج المخروطي مع ماصة التلقائي. أغلق القنينات بإحكام.
- التحقق من وجود فقاعات الهواء في القارورة إدراج وإزالتها إذا لزم الأمر (على سبيل المثال، عن طريق دوامة).
- نقل قوارير الكروماتوغرافية تحتوي على عينات في LC autosampler. تسجيل موضع العينات الموضوعة في علبة ampler.
4. إعداد عينات مراقبة الجودة (QC)
- اشعل محلول الاستزراع قبل المعالجة بالفحم (المعد في أنبوب طردي 1.5 مل) مع 0.75 ميكرولتر من 0.1 غرام/لتر 3NT حل ومعايير أربعة kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) بتركيز واحد مختار من النطاق الخطي للمنحنيات المعايرة. الحفاظ على حجم النهائي من العينة في 150 μL.
ملاحظة: إذا كان ذلك ممكناً، قم بإعداد عدة عينات من مراقبة الجودة بتركيزات مختلفة تقع تحت النطاق الخطي لمنحنى المعايرة. - اتبع البروتوكول الموضح في القسم 3 (الخطوات 3.2-3.11).
5. إنشاء نظام LC-MS
- تحضير المذيبات المرحلة المتنقلة: المذيب A: 20 mmol/L الأمونيوم formate في الماء فائقة الخطورة (درجة الحموضة 4.3 معدلة مع حمض الفورميك)؛ المذيب B: 100٪ الأسيتونتريل.
ملاحظة: استخدام زجاجات البورسليكات فقط. شطف زجاجات مع الماء فائقة الخطورة قبل إعادة تعبئتها. لا تستخدم الزجاجات تنظيفها مع المنظفات.
تنبيه: يسبب الأسيتونتريل آثارًا صحية شديدة أو الوفاة. ومن السهل أن تشعل من الحرارة. يمكن السائل الأسيتونيتريل والبخار تهيج العينين والأنف والحلق والرئتين.- إعداد 5 مول / ل حل الأسهم من formate الأمونيوم عن طريق حل كاشف بلوري (15.77 غرام) في 50 مل من الماء فائقة السخ في زجاجة. يُحرّك المزيج حتى تذوب جميع المخلفات. تصفية من خلال غشاء 0.45 ميكرومتر لإزالة أي بقايا الحطام (على سبيل المثال، باستخدام مرشح حقنة النايلون). تخزين حل الأسهم عند 4 درجة مئوية.
- إعداد المذيب A بإضافة 4 مل من 5 مول/ لتر formate الأمونيوم في الماء إلى 980 مل من الماء فائقة الخطورة في زجاجة زجاجية العنبر ويحرك جيدا. تزج شريط اثارة ووضع زجاجة مع المذيبات على مُنشر مغناطيسي. غمر قطباً للدغة الهزية في المحلل وتحكم في الـ pH تحت التحريك. إضافة محلول مخزون حمض الفُرق (98٪ -100٪) dropwise باستخدام ماصة التلقائي مع 0.2 مل تلميح للحصول على درجة حًاً 4.3، وضبط مستوى الصوت تصل إلى 1 لتر مع الماء فائقة الخطورة ويحرك جيدا.
ملاحظة: إعداد المذيبات مرة واحدة على الأقل في الأسبوع لمنع أي نمو الميكروبات.
تنبيه: حمض فورميك (FA) سام عند استنشاقه، ويسبب حروقاً جلدية وتلفاً للعين. العمل تحت غطاء الدخان؛ ارتداء قفازات واقية ومعطف. - تصفية جميع الحلول من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر (على سبيل المثال، مرشح حقنة النايلون) لإزالة أي بقايا الحطام. اختياريا، استخدم مرشحات مدخل المذيبات المخصصة لخزانات المذيبات LC لحماية النظام من الجسيمات الواردة.
- بدء تشغيل LC-MS التحكم والبيانات اقتناء البرمجيات.
- تطهير نظام LC مع المرحلة المتنقلة لإزالة الفقاعات، ورئيس جميع القنوات المذيبات.
- طقم عمود حراسة لحماية العمود التحليلي من انسداد.
- مسح العمود الحارس والتحليلي (C18، 2.1 × 100 مم، 1.8 ميكرومتر) مع 100٪ الأسيتونيتريل لحوالي 30 دقيقة، ومن ثم مع 100٪ المذيبات A حتى لوحظ ضغط مستقر في العمود. التحكم في أداء النظام باستخدام برنامج التحكم.
- تعيين معلمات LC المناسبة في برنامج الحصول على البيانات.
- إعداد برنامج التدرج: 0-8 دقيقة المذيب B 0٪; 8-17 دقيقة المذيب B 0-2٪ ؛ 17-20 دقيقة المذيب B 2٪ ؛ 20-32 دقيقة المذيب B 10-30٪ ؛ 32-45 دقيقة المذيب B 0٪.
- تعيين معدل تدفق المرحلة المتنقلة في 0.15 مل / دقيقة، تحليل إجمالي وقت التشغيل لمدة 45 دقيقة، درجة حرارة العمود في +40 درجة مئوية وحجم الحقن في 10 ميكرولتر.
- تعيين المعلمات اقتناء كاشف الطيف الشامل.
- تطبيق المعلمات التأين: رصد أيون واحد (SIM)، المؤين إيجابية، ضغط البخاخات من 50 psi، +350 درجة مئوية تجفيف درجة حرارة الغاز، تجفيف تدفق الغاز من 12 لتر / دقيقة، و 5500 فولت من الشعيرية.
- حدد أيونات الرصد التحليل: ل3HKyn م / ز 225.0 (فترة المسح الضوئي: 2-6 دقيقة، والجهد جزء: 100 V)؛ ل Kyn m/z 209.0 (فترة المسح الضوئي: 6-12 دقيقة، الجهد المجزأ: 80 فولت)؛ ل3HAA م / ز 154.0 (فترة المسح الضوئي: 12-18 دقيقة، والجهد جزء: 80 V)؛ ل3NT م / ز 227.0 (مسح الفترة: 18-23 دقيقة، والجهد جزء: 100 V)؛ لXA م / ض 206.0 (مسح الفترة: 23-45 دقيقة، والجهد جزء: 100 V).
- إنشاء قائمة عمل وتشغيل عينات على نظام LC.
- في البداية، قبل تحليل العينات التجريبية، تشغيل عينة فارغة (المذيب A) على الأقل في ثلاث 333، تليها عينة مراقبة الجودة واحدة.
- افتح برنامج تحليل البيانات وحمّل النتائج التي تم الحصول عليها لعينة QC.
- تحقق من موضع قمم التحليلات على الكروماتوجرام. عندما تتحول الإشارات إلى ما وراء الموضع المتوقع ضبط البوابات الزمنية لجمع إشارات التحليل المناسبة. راجع دليل البرامج للحصول على تعليمات حول تكامل الإشارة.
6. بناء منحنى المعايرة
- في برنامج الحصول على البيانات، أضف معايير المعايرة إلى قائمة العمل وتشغيل المعايير في ثلاث 33.
- دمج وقياس منطقة الذروة المقابلة ل3HKyn، كين، 3HAA، 3NT، وXA في وقت الاحتفاظ حوالي 4.4 دقيقة، 10 دقيقة، 16 دقيقة، 21 دقيقة، و 30 دقيقة، على التوالي.
- بناء منحنيات معايرة الفردية لكل المستقلب باستخدام برنامج جدول البيانات.
- لإنشاء مخطط المعايرة، رسم قيمة نسبة من منطقة الذروة التحليل على منطقة الذروة 3NT مقابل تركيز التحليل.
- تحليل عينة فارغة (الفحم قبل المعالجة المتوسطة الثقافة ارتفعت فقط مع 3NT) لضمان عدم وجود أي أثر من التحليلات درس في الوسط. وإلا، اطرح القيمة التي تم الحصول عليها من كل نقطة معايرة.
- تحقق من الخطية لكل منحنى معايرة.
- على حدة، لكل تحليل، إنشاء معادلة خطية تقاطع الميل (y = ax +b)، حيث y يتوافق مع نسبة منطقة الذروة التحليل مقابل منطقة الذروة 3NT، و a هو الميل، و x هو تركيز التحليل (μmol/L)، و b يشير إلى اعتراض المنحنى. سيؤدي رسم الرسم البياني 'y' مقابل 'x' إلى إنشاء منحنى المعايرة.
- إضافة خط اتجاه خطي إلى المخطط، وعرض معادلة منحنى المعايرة ومعامل الانحدار على المخطط. تأكد من أن معامل الانحدار هو > 0.990. في حالة عدم تطابق معايير المعايرة، قم بإعداد و/أو تحليل هذه مرة أخرى. اختياريا، تغيير نطاق تركيز منحنى المعايرة.
- تحليل عينات مراقبة الجودة للتحقق من أداء النظام قبل تحليل العينات التجريبية. في حالة عدم التوافق (± انحراف 20٪ عن القيمة المرجعية)، قم بإعداد منحنيات المعايرة الجديدة.
7. في خلية في المختبر ثقافة وجمع عينة للتحليل
- لوحة الخلايا السرطانية درس (MDA-MB-231 أو SK-OV-3) في DMEM (متوسط النسر المعدلة دولبيكو) التي تحتوي على 4.5 غرام / لتر من ᴅ الجلوكوز، 10٪ (v/v) مصل الأبقار الجنين (FBS)، 2 مليمول / ل ʟ-الجلوتامين و 1 U البنسلين / ستربتوميسين والثقافة في 37 درجة مئوية في جو رطب من 5٪ CO2 لتوسيعها للتجربة. مرور الخلايا في 80٪ من التقاء.
- فصل الخلايا من طبق الثقافة باستخدام التربسين، البذور للتجربة على لوحات 12-جيدا في كثافة 0.3 × 106 خلايا في البئر ووضع في حاضنة بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، الطامح المتوسطة الثقافة وإضافة DMEM الطازجة مع أو بدون إضافة المركبات درس، اعتمادا على التصميم التجريبي.
- بعد 48 ساعة، وجمع المتوسطة من فوق الخلايا (حوالي 500 ميكرولتر) في أنبوب 1.5 مل. جهاز طرد مركزي في 14، 000 س ز لمدة 5 دقائق لإزالة أي حطام الخلية. جمع المابير وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
- حفظ بيليه الخلوية من الخطوة 7.4 لتقدير البروتين. تجميد العينات في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: ينبغي تطبيع النتائج التي تم الحصول عليها عن وسيط من آبار مختلفة إلى إجمالي محتوى البروتين لمراعاة التباين في رقم الخلية في الآبار الفردية. ويمكن تقييم تركيز البروتين كما هو موضح في الخطوة 9.
8. إعداد عينات لتحليل LC-MS
- اذيب العينة المجمدة في درجة حرارة الغرفة واخلط جيدا. نقل 149.25 ميكرولتر من وسط الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي (1.5 مل).
- إضافة 0.75 ميكرولتر من 0.1 غرام / لتر من 3NT الحل (معيار داخلي). أغلق الأنابيب و الدوامة جيداً.
- إضافة 150 μL من المبردة في -20 درجة مئوية الميثانول تحتوي على 1٪ (v/v) FA لتكثير العينات. أغلق الأنابيب و الدوامة جيداً.
- مواصلة إعداد العينة كما هو موضح في القسم 3 (الخطوات 3-3-3-11).
ملاحظة: بعض الخلايا السرطانية مثل SK-OV-3 تفرز كميات كبيرة من كين في وسط الثقافة. لاحتواء البيانات في نطاق خطي من منحنى المعايرة، من الضروري تخفيف العينة بنحو 100 ضعف. في هذه الحالة، تمييع جزء من العينة مع 0.1٪ (v/v) FA في الماء وتحليل بالإضافة إلى العينة غير مخففة. وينبغي إعداد العينات المرجعية للمعايير لمنحنى المعايرة في 100 مرة مخففة ثقافة كاملة المتوسطة. بدلاً من ذلك، أضف المزيد من النقاط في منحنى المعايرة (إذا تحققت الذوبانية الخطية المناسبة) لضبطه إلى مستوى تركيز كين في العينة التجريبية. - تحليل العينات بواسطة LC-MS كما هو موضح في القسم 5. إنشاء قائمة عمل وتشغيل كل عينة في ثلاثية.
- بعد اكتمال قائمة العمل، قم بقياس منطقة الذروة في التحليل.
- إنشاء جدول بيانات باستخدام البرامج المتوفرة والحصول على البيانات الرقمية.
- في عمود جدول واحد حساب نسبة منطقة الذروة التحليل على منطقة الذروة 3NT.
- استخدم معادلة معايرة خطية فردية مخصصة لكل تحليل (من الخطوة 6.3.) لحساب تركيزات التحليلات الموجودة في العينات التجريبية.
9. تقييم محتوى البروتين وتطبيع البيانات
- Resuspend بيليه الخلوية من الخطوة 7.5 مع 100 ميكرولتر من الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) في أنبوب 1.5 مل.
ملاحظة: إعداد برنامج تلفزيوني حل عن طريق حل 8 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام من كلوريد البوتاسيوم، 1.44 غرام من فوسفات الصوديوم ديباسيتش، فوسفات ديهيدروجين البوتاسيوم في 950 مل من الماء فائقة السخ. يُحرّك جيداً. ضبط الأسى إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك (قطرة). ضبط مستوى الصوت حتى 1 لتر مع الماء فائق الخطورة. يُحرّك جيداً حتى يصبح متجانساً.
تنبيه: حمض الهيدروكلوريك شديد التآكل ويجب التعامل معه باحتياطات السلامة المناسبة. يمكن أن يسبب ملامسة الجلد البشري احمرارًا وألمًا وحروقًا جلدية. العمل تحت غطاء الدخان؛ ارتداء قفازات واقية ومعطف. - تجميد العينات في -20 درجة مئوية ثم تذويب الجليد على الجليد. كرر هذه الخطوة 3x.
- أجهزة الطرد المركزي العينات في 14، 000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. جمع اغطار في أنابيب جديدة. لا تزعج بيليه.
- تمييع 10x مع PBS.
- بناء منحنى المعايرة من 0 إلى 2 ميكروغرام من البروتين في نطاق جيد.
- إعداد البلومين المصل البقري (BSA) حل قياسي للمعايرة. يُحلّل 1.23 ميكروغرام من BSA في 1 مل من الماء فائق الخطورة وبهم دوامة.
- على لوحة 96-جيدا، تحميل كميات مختلفة من الحل القياسي BSA (1.23 ميكروغرام / مل): 0 ميكرولتر، 2 ميكرولتر، 4 ميكرولتر، 5 ميكرولتر، 7 ميكرولتر، 10 ميكرولتر، 15 ميكرولتر، 20 ميكرولتر.
- ملء البئر مع برنامج تلفزيوني إلى حجم النهائي من 50 μL.
- تحميل 10 - 15 μL خلية lysate من الخطوة 9.4 على نفس لوحة 96-well. ملء الآبار مع برنامج تلفزيوني للوصول إلى حجم النهائي من 50 ميكرولتر.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، ضبط حجم aliquot الخلية في كل بئر لتناسب في المدى الخطي لمنحنى المعايرة. الحفاظ على حجم النهائي إلى 50 ميكرولتر من العينة في بئر. - أضف 200 ميكرولتر من كاشف برادفورد (مخفف 5 مرات مع الماء فائق الخطورة) إلى كل بئر.
- احتضان بات 96-جيدا لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. أدخل اللوحة في قارئ microplate. قياس امتصاص في λ = 595 نانومتر.
- إنشاء منحنى معايرة باستخدام برنامج جدول بيانات. رسم مقدار BSA (μg) مقابل الامتصاص. إضافة خط اتجاه خطي، وعرض معادلة منحنى المعايرة ومعامل الانحدار على التخطيط.
- استخدم المعادلة الخطية (y = ax +b، حيث y يتوافق مع الامتصاص في λ = 595 نانومتر، و a هو الميل، و x هو محتوى البروتين (μg)، و b يشير إلى اعتراض المنحنى) لحساب كمية البروتين في العينة.
ملاحظة: خذ بعين الاعتبار عامل تخفيف العينة في الحسابات. - استخدام محتوى البروتين المقدر لتطبيع كمية الكينيرينين في العينة لكل 1 ملغ من البروتين. للقيام بذلك، قم بتقسيم تركيز الكينيرينين المحدد في الخطوة 8.9 مع محتوى البروتين الكلي من الخطوة 9.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LC-MS يقدم مزايا لا جدال فيها في القياس الكمي للجزيئات النشطة بيولوجيا، على الرغم من أن بعض مكونات العينات المعقدة تسبب ما يسمى آثار المصفوفة وتئينات حل وسط من التحليلات. وهو يؤدي إلى قمع الأيونات أو تعزيز أيون، وتناقص دقة بقوة، وتؤثر على حد من الكشف /الكم من LC-MS، والتي تعتبر نقطة ''ضعيفة' من الأسلوب. في بروتوكول لدينا، يتم إنشاء الأيونات عن طريق التأين الكهربائي (ESI) في الوضع الإيجابي، والتي كانت تستخدم أيضا في دراسات أخرى على تحديد الأيض Trp13. ESI، ومع ذلك، هو أكثر عرضة لآثار المصفوفة من ضغط الهواء الكيميائية التأين (APCI)28. وهكذا، للحصول على التحديد الكمي الدقيق لمستقلبات Trp في وسط ثقافة الخلية، استخدمنا معايرة داخلية قياسية ومتطابقة مع المصفوفة لتعويض التأثيرات المعتمدة على المصفوفة على إشارة التحليل ولتصحيح فقدان المركبات المستهدفة أثناء خطوة إعداد العينة. طبقنا نفس المعيار الداخلي (3NT) لجميع التحليلات المدروسة (3HKyn، Kyn، 3HAA، XA). لم يتم العثور على 3NT في الأصل، وسيلة جديدة تستخدم استزراع الخلايا ويظهر سلوك مماثل مثل المركبات المستهدفة في ظل الظروف التحليلية التطبيقية. أن يجعل 3NT المعيار المناسب الداخلية27. وبالإضافة إلى ذلك، لتبسيط البروتوكول، من أجل جعله أكثر سهولة لمجموعة واسعة من المستخدمين، نقترح خطوة واحدة فقط من إعداد العينة التي تنطوي على إزالة البروتين عن طريق العلاج مع الميثانول تحتوي على 1٪ (v/v) FA.
في إطار البروتوكول المقدم، يوصى بإعداد منحنيات المعايرة باستخدام الوسيط الكامل المستخدم في زراعة الخلايا. ومع ذلك، قد تحتوي الوسيلة الاستزراعية على كين الذاتية التي تزعج التقدير الصحيح لمنطقة الذروة التحليلية، خاصة في حلول المعايرة بتركيزات منخفضة. يوضح الشكل 1A نتائج LC-SQ التي تم الحصول عليها أثناء تحليل DMEM التي تحتوي على 4.5 g/L D-glucose (DMEM-HG) و 10٪ (v/v) FBS المستخدمة من قبل مجموعتنا لثقافة الخلايا السرطانية. لقد وجدنا أن الثقافة الطازجة كاملة المتوسطة في البداية يحتوي على بعض كين التي يمكن إزالتها عن طريق تنقية مع الفحم المنشط (الشكل 1B). أثناء تحليل العينات التجريبية، تم تحليل متوسط ثقافة DMEM-HG الكامل كعينة تحكم، وتم طرح منطقة ذروة كين من منطقة الذروة المسجلة لكين في كل عينة تم اختبارها.
الشكل 1: نتائج LC-SQ التمثيلية لوسيلة الثقافة الكاملة لـ DMEM-HG (A) قبل و (ب) بعد المعالجة المسبقة على الفحم المنشط. تم زيادة عينات من الوسيلة الثقافة مع نفس الكمية من المعيار الداخلي (3NT). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في الخطوة التالية، تم تحديد وقت الاحتفاظ لكل تحليل الهدف (انظر الكروم في الشكل 2A). الممارسة الجيدة في تحليل LC-MS هو تشغيل عينة مراقبة الجودة قبل العينات الفعلية لتأكيد أوقات الاحتفاظ المناسبة من التحليلات. في بعض الأحيان، يمكن ملاحظة تحول في إشارات LC، ويميل عدم التطابق إلى الحدوث. ويبين الشكل 2B تغيراً طفيفاً في أوقات الاحتفاظ بالخلّات، وهو ما لا يخل مع ذلك بالقياسات الصحيحة. ومن ناحية أخرى، يمثل الشكل 2C تغييراً كبيراً في موضع الذروة المستهدفة. كما رأينا، تم تحويل إشارة 3NT بشكل كبير نحو وقت الاحتفاظ أقصر وخرج من بوابة الوقت المحدد. وفي هذه الحالة، كان من المستحيل إجراء تحليل كمي مناسب لأنه لا يمكن قياس الإشارة القياسية الداخلية بشكل صحيح. وقد يكون ذلك راجعاً إلى عدة عوامل، أي عدم كفاية توازن الأعمدة، أو خلط غير صحيح للمذيبات في المضخة، أو استخدام عينة غير ملائمة أو تلوث المرحلة الثابتة للعمود. غير أن الشكل 2Dيمثل حالة عندما تعاني القمم المسجلة من شدة منخفضة للغاية. يمكن أن يكون هذا نتيجة لفشل الحقن، تسرب في النظام أو تلف MS. وعلاوة على ذلك، يمكن لمكونات مصفوفة التسليل المشترك توليد الأيونات مع م / ض المحدد لتحليلات الهدف، كما هو الحال في الشكل 3A، حيث تظهر النتيجة من تحليل MDA-MB-231 الخلايا ثقافة المتوسطة. في وقت الاحتفاظ بحوالي 25 دقيقة، لوحظ إشارة قوية مشتقة من مكون مصفوفة غير معروف (المركب X). تظهر الذروة في فترة المسح الضوئي، عندما تم رصد أيون m/z 206 (المحدد لـ XA). ومع ذلك، هذه الإشارة لا تتوافق مع التحليل بسبب عدم التوافق من وقت الاحتفاظ. لتجنب الأخطاء أثناء ذروة التكامل، يوصى أيضاً بمقارنة وقت الاحتفاظ مع ذلك الذي تم تسجيله لعينات مراقبة الجودة.
الشكل 2- الانبعاثات 2 من 100 أمثلة على النتائج الصحيحة وغير الصحيحة. الكروماتوجرام الصحيح من تحليل عينة QC في (A) متوسطة و (ب) مستويات تركيز منخفضة مسجلة في أيام مختلفة. مثال على الكروماتوجرام غير صحيحة الناتجة عن تغيير كبير في أوقات الاحتفاظ من التحليلات(C)وكثافات غير مرضية من القمم (D). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3- الانبعاثات 100-11 نتائج تمثيلية من الثقافة المتوسطة التي تم جمعها من مختلف خطوط الخلايا السرطانية. الثقافة المتوسطة من (A) MDA-MB-231 (سرطان الثدي البشري) و (B) SK-OV-3 (سرطان المبيض البشري) تم تحليل الخلايا باستخدام LC-SQ. يشير المركب X إلى إشارة مركب غير معروف موجود في الوسط الثقافي الذي يُكوّن مع التحليل ويُيَن لتشكيل أيون مع م/ع المختارة للانقار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الوسيلة الثقافة المستخدمة للخلايا السرطانية (DMEM) يحتوي على كميات كبيرة من Trp. النظائر(13C-Trp) تشترك في نفس أيونات XA(م/ ز 206) ويمكن أن تتداخل مع تحديد XA. ومع ذلك، في ظل الظروف الكروماتوغرافية التطبيقية، يتم فصل إشارة من Trp بشكل جيد من إشارة XA. ولذلك، خلصنا إلى أن Trp الموجودة في DMEM لا يؤثر على القياس الكمي لXA ودقة الطريقة(الشكل 4).
الشكل 4- الانبعاثات 100 موقف التربتوفان (Trp) وحمض xanthurenic (XA) إشارات على الكروم . تم إعداد حلول قياسية من Trp (49.0 ميكرومول / لتر) و XA (48.8 ميكرومول / لتر) في المذيب A (20 مليمول / لتر الأمونيوم فورما في الماء، درجة الH 4.3) في ظل ظروف محسنة LC-SQ. ورصدت أيونات m/z 205 (المقابلة لـ [Trp+H]+) و m/z 206 (الموافق [XA+H]+) بالنسبة لـ Trp وXA على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
اجتازت الطريقة التحليلية المقدمة بنجاح اختبار التحقق من الصحة من حيث الخطية والدقة (معاملات التباين ≤15٪) والدقة (96-104٪) والاسترداد (96-119٪) وتأثيرات المصفوفة لجميع التحليلات ، كما تم وصفها بالتفصيل في ورقتنا السابقة 27.
وأخيراً، أكدنا تطبيق المنهج التحليلي الموصوف على وسيط تم جمعه من الخلايا السرطانية البشرية المستزرعة في المختبر. وأكدت بياناتنا أن مستوى الكينيرينينات يمكن أن يختلف بشكل كبير في الوسط ثقافة جمعت من أنواع الخلايا المختلفة(الشكل 3). قمنا بتحليل الوسط الثقافي من نوعين من خطوط السرطان أي خلايا MDA-MB-231 و SK-OV-3 المشتقة من سرطان الثدي والمبيض على التوالي. وغالبا ما تستخدم الخطوط المختارة كنماذج لدراسة الأحداث الجزيئية واختبار الأدوية المضادة للسرطان. كما لاحظنا، الخلايا المستزرعة في وسيلة التحكم القياسية صدر كميات مختلفة من نواتج التريبتوفان، أي، أطلقت خلايا MDA-MB-231 كمية قابلة للقياس الكمي من كين وXA بتركيز nmol/L منخفض(الشكل 3A)،في حين أظهرت خلايا SK-OV-3 بشكل ملحوظ أكثر من كين، وإفراز منخفض جداً من XA، ولا إفراز الكيرينينات المدروسة الأخرى كما تشير إلى ذلك شدة القمم المقابلة(الشكل 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه الورقة يعرض بروتوكول مفصل LC-SQ للقياس الكمي المتزامن من أربعة الأيض Trp الرئيسية (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) التي تقاس في وسط من الخلايا السرطانية البشرية في المختبر. ويولى اهتمام خاص لإعداد العينات، وإجراء قياس الطيف الكروماتوغرافي/الكتلة، وتفسير البيانات، وأهم النقاط في التحليل.
بشكل عام، يتطلب تحليل LC-MS، بسبب الحساسية العالية، أعلى معايير صرامة البروتوكول ونقاء المواد المستخدمة. وهو يشير إلى تطبيق تنظيفها بدقة وغسلها بشكل صحيح الأواني الزجاجية، فضلا عن المواد الكيميائية عالية الجودة في جميع أنحاء الإجراء القياسي. ومن المهم جدا استخدام المذيبات القائمة على المياه العذبة في مرحلة متنقلة لتجنب التلوث الميكروبي الذي قد يؤثر في هذا النهج الحساس بشكل كبير على التحليل. قبل حقن في نظام LC، تحتاج العينات المحللة إلى فحص دقيق لوجود أي جسيمات غير قابلة للذوبان. ومن المهم ملاحظة أنه ينبغي أن يكون العمود على ما يكفي من التوازن قبل تحليل العينة. ويمكن أن يؤدي عدم الامتثال لهذه القواعد إلى تلوث العينات، ونظام LC، والعمود التحليلي، أو في عدم كفاية التأين في مصدر التصلب المتعدد، مما يؤدي في النهاية إلى حدوث تحول في الإشارات.
هناك نقطتان رئيسيتان ضمن البروتوكول تحتاجان إلى التأكيد من أجل الحصول على أفضل النتائج. الجزء الأكثر أهمية في البروتوكول المقدم هو خطوة إعداد العينة. يؤدي استخدام إجراء غير ملائم إلى فقدان المركبات المستهدفة وبالتالي تحديد كمي غير دقيق. في نهجنا، أثناء تطوير الأسلوب، تم تحسين خطوة إعداد العينة بعناية جنبا إلى جنب مع اختيار المذيب لإزالة البروتين. كما حددنا، العلاج عينة مع الميثانول تحتوي على 1٪ (الخامس / الخامس) حمض الفورميك أسفرت عن أفضل عمليات الاسترداد لجميع الكينيرينين درس. كما تم تقييم أثر تكوين المرحلة المتنقلة على مدى التأين التحليلي. لقد تحققنا مراحل متحركة تتكون من 0-20 mmol/L الأمونيوم formate أو خلات الأمونيوم في مختلف الأسي المعدلة مع حمض الفرخي أو الخليك. وقدمت المرحلة المتنقلة التي تحتوي على 20 مليمول/لامونيوم فورما في الماء (الأسي 4.3، المذيب A) والأسيتونيتريل (المذيب B) أفضل الظروف الممكنة لقياس كمي في وقت واحد من كين، 3HKyn، 3HAA و XA27. وثمة خطوة هامة أخرى في تحليل LC-MS هي ذروة التكامل. بعض الكينيرينينات تحدث في عينة عند مستويات تركيز منخفضة جدا. وفي هذه الحالة، قد تتداخل إشارات مركبات التسهّج المشترك مع إشارة التحليلات المستهدفة أو تولد ذروة في وقت احتجاز مماثل. مستخدم غير تجربة من هذه الطريقة قد تجد بعض الصعوبات مع التكامل الذروة الصحيحة، كما هو الحال في الشكل 2C. وبالتالي، فإن فحص وقت الاحتفاظ بالanalytes ومقارنته مع عينة QC مطلوب وموصى به بشدة.
وتشمل الممارسة التحليلية الجيدة اختيار معيار داخلي مناسب لإجراء تحليل كمي. هنا، نقترح نهجاً بسيطاً وفعالاً من حيث التكلفة باستخدام معيار داخلي واحد فقط (3NT) كتماثلي من أربعة kynurenines. وأكدت النتائج أن 3NT يعرض سلوك كروماتوغرافي مماثل مثل المركبات المستهدفة ونتيجة لذلك فإنه يسمح بتحقيق دقة ودقة جيدة من طريقة27. في ظل شروط LC المطبقة، يتم فصل ذروة 3NT بشكل جيد عن إشارات التحليلات الأخرى وسهلة القياس. ونحن ندرك أن النظائر المسمى المعايير الداخلية (ILIS) المستخدمة في مثل هذه التحليلات14،15 سوف توفر أفضل تعويض من آثار المصفوفة وأفضل سيطرة على جميع المتغيرات التي يمكن أن تؤدي إلى نتائج خاطئة. من ناحية أخرى ، لا تتوفر دائماً ILISs لجميع التحليلات المستهدفة بسهولة ، ناهيك عن تكلفتها العالية. أيضا، يتم تخصيص ILISs بدلا من LC-MS/ MS من LC-SQ مع رصد أيون واحد (SIM) وضع التي استخدمنا في هذه الورقة.
يمكن اعتبار استخدام 3NT كمعيار داخلي هنا كقيد من الأسلوب بسبب إمكانية تشكيل 3-نيتروتروسين على البروتينات29. ومع ذلك، في حالة وجود وسيلة الثقافة، لم نلاحظ أي حرة الذاتية 3-نيتتروروسين. دعونا ندرك 3NT كمعيار داخلي مناسب. ومع ذلك، نوصي بإجراء تقييم مسبق لمستوى 3NT داخلي أولي، خاصة عند دراسة أنواع الخلايا الأخرى غير التي تم اختبارها في هذا التقرير.
وباختصار، عند اختيار تناظري لأي تحليل، يحتاج المرء إلى النظر في العديد من السمات، مثل التشابه الكيميائي والغياب الأولي في مصفوفة العينات. وعلاوة على ذلك، قد يختلف ثبات المعيار الداخلي التماثلي في مصفوفة العينات، وكفاءتها في استعادة المكونات المؤينة في وجود مكونات المصفوفة عن المركبات المستهدفة. وهكذا، ينبغي النظر في جميع هذه الميزات والتحقيق بعناية أثناء تطوير الأسلوب.
النظام التحليلي في الطريقة المعروضة التي تتألف من جهاز الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد سمح لنا لتحقيق حدود منخفضة للكشف (0.0033 - 0.0108 μmol / L)27. بهذه الطريقة قياسات متزامنة من 3HKyn، كين، 3HAA، XA ضمن نطاقات تركيز 0.018 - 4.46 ميكرومول / لتر، 0.0096 - 3.84 ميكرومول / لتر، 0.033 - 13.06 ميكرومول / لتر، و0.019 - 4.87 ميكرومول / لتر، على التوالي. ويرتبط القيد الرئيسي لأي تحليل LC-SQ بفصل سليم من مكونات العينة على عمود LC. يساهم ضعف الفصل في انخفاض الانتقائية مقارنة بالكشف مع قياس الطيف الكتلي رباعية الترادف باستخدام أيونات المنتج ووضع مراقبة التفاعلات المتعددة (MRM). من أجل تجنب التداخلات من مكونات المصفوفة الأخرى التي تشترك في نفس الأيونات أو ما شابهها مع جزيء الهدف ، يجب تحسين ظروف الفصل LC بعناية. وعلى سبيل المثال، يولد 13نظيراً من نظائر الـ C Trp (الموجودة بكميات ضئيلة) نفس أيون m/z 206 كما تم اختياره لرصد XA. تم تجنب سوء التفسير هنا عن طريق تحسين الظروف الكروماتوغرافية وفصل مرضية من Trp وXA مائل من العمود (الشكل 4).
في التطبيقات المستقبلية، يمكن تنفيذ بعض التعديلات على البروتوكول. يمكن للمستخدم المحتمل تعديل تركيز المعيار الداخلي (3NT) عندما يتوقع أن تنخفض مستويات الكينيرينينات المدروسة عند التركيزات المعروضة هنا. والأهم من ذلك، ينبغي أن يكون تركيز 3NT هو نفسه في كل من معايير المعايرة وفي العينات التجريبية. في حالة وجود مستوى تحليل عالي للغاية، مثل Kyn لوحظ في خلايا SK-OV-3، نوصي بالعمل مع تركيز أعلى من 3NT. إذا كان هناك حاجة لتخفيف العينة، فإنه يتم shoud في الخطوة الأخيرة من البروتوكول، قبل حقن العينة على العمود LC.
في المؤلفات، هناك بعض البروتوكولات المقترحة للتحليل الكمي LC-MS/MS لل kynurenines في وسط الثقافة من خلايا مختلفة. بروتوكول واحد يوفر تحديد المتزامنة من 3 الأيضات، أي، كين، 3HKyn و 3HAA ولكنه أقل حساسية (حد القياسات الكمية (LOQ) في مستويات أعلى)، على النقيض من طريقتنا21. وقدم تقرير آخر طريقة تسمح بالتكون من 4 كيونرينين، بما في ذلك كين، 3HKyn، 3HAA وXA مع LOQs مماثلة25. ومع ذلك، لم يتم تحسين أي منها للكشف عن الكينيرينينات التي تولدها الخلايا السرطانية المستزرعة في المختبر. عناصر مصفوفة عينة تؤثر على التأين التحليل في مصدر MS عن طريق تقليل أو زيادة الإشارة، وهو سبب لنتائج غير موثوق بها. للحصول على بيانات أكثر دقة، اقترحنا استخدام معيار داخلي تماثلي (3NT) بالاقتران مع معايرة مطابقة للمصفوفة للحصول على تعويض أفضل من الآثار المعتمدة على المصفوفة.
باستخدام المنهجية المعروضة، يمكننا أن نلاحظ أن كين كان أكثر المستقلبات Trp وفرة في ثقافة المتوسطة التي تم جمعها من أنواع الخلايا السرطانية المحللة، في حين لم يتم الكشف عن الأيضات الأخرى المدروسة تحت ظروف ثقافة التحكم (باستثناء XA الموجودة في كميات ضئيلة ولكن يمكن اكتشافها). ومع ذلك, عندما تم تحفيز الخلايا مع المنشط المناعي قوية – lipopolysaccharide البكتيرية, تم إفراز كمية أكبر من XA بالإضافة إلى كين. من ناحية أخرى، تم الكشف عن 3HKyn و 3HAA التي تشكلت في المنبع من XA داخل KP لا تزال تحت LOQ27. وهذا يشير إلى أن بعض نواتج الأيض في إطار عملية كيمبرلي الموجودة بكميات صغيرة في وسط الثقافة قد يكون من الصعب قياسها باستخدام النهج المقترح LC-SQ. ومع ذلك، فإن البروتوكول المقدم مفيد لتحديد التغيرات في KP عن طريق التحديد الكمي لمجمعات المستقلبات Trp الرئيسية. استخدام هذه المنهجية في الدراسات المستقبلية لإشراك نظام زراعة الخلايا في المختبر سوف تقدم المؤشرات الحيوية الجديدة من الأمراض المرتبطة بالمناعة والسرطان. نهجنا يجلب فحص موثوق بها وموثوق بها مع حساسية ذات الصلة للنماذج الخلوية التي تشكل تحديا بسبب تركيزات منخفضة من المستقلبات KP المصب. وسوف تتيح التعليمات المقدمة للباحثين من مختلف المجالات الاستفادة من هذا النهج لتحديد كمي الكينيرينينات الرئيسية المتعلقة بالسرطان وأمراض أخرى. تظهر بياناتنا (غير المنشورة) أنه من المفيد دراسة تعديل KP في الخلايا المعرضة لمنتجات جليكيشن مختلفة ، ولكن يجب أن تجد أيضًا تطبيقًا في مجالات بحثية أخرى والأمراض ذات المكون المناعي ، أي في بيولوجيا بطانة الرحم والتكاثر30.
ويمكن توسيع نطاق البروتوكول المقدم لتحديد التحليلات الإضافية التي قد تتراكم في وسط الثقافة خلال ظروف تجريبية مختلفة. وينبغي استخدام المعايير المرجعية المناسبة للتحليلات للتحقق من صحة الطريقة من حيث الدقة والدقة والخطية والاسترداد أو الانتقائية قبل استخدامها في التحليل الكمي. يمكن استخدام البروتوكول لـ الكينيرينينات الفردية (3HKyn أو Kyn أو 3HAA أو XA) اعتماداً على الغرض البحثي. في هذه الحالة، الأيونات المقابلة للمركبات التي لا تعتبر للتحليل، قد تتم إزالتها من إعدادات MS. التغييرات المناسبة في برنامج التدرج LC سوف تساعد في خفض الوقت التحليل.
عند دراسة KP، فمن المهم لتقييم نشاط إنزيم IDO. ويمكن أن يقدر هذا ببساطة عن طريق قياس استهلاك Trp وإطلاق كين في وسط الثقافة أو عن طريق حساب نسبة تركيز الكينيرينين إلى التربتوفان ([Kyn]/[Trp])31. في نهجنا، لم نقاس تركيز Trp، ومع ذلك، قد يتم توسيع البروتوكول بإضافة هذا الهدف في تحليل LC-SQ. كما نهج أكثر ملاءمة كيميائيا الحيوية، نوصي للتعبير عن النشاط الأنزيمي IDO كمية من كين التي تنتجها الخلايا لكل مليغرام من البروتين في الدقيقة الواحدة كما هو معروض في مكان آخر32. لقد لاحظنا ميزة في استخدام هذا النهج في دراساتنا الأخرى على الخلايا السرطانية (مخطوطة قيد الإعداد) ونوصي بهذه الطريقة عند استخدام نموذج ثقافة الخلايا في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل الاتحاد الأوروبي من صندوق التنمية الإقليمية الأوروبية في إطار تطوير البرنامج التنفيذي لبولندا الشرقية 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00)، من قبل كلية التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيئية التابعة لجامعة جون بول الثانية الكاثوليكية في لوبلين (منحة العلماء الشباب لمنظمة إيلونا سادوك)، المركز البولندي الوطني للعلوم، OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 لماغدالينا ستانيسزسكا، المحقق الرئيسي). يشكر المؤلفون البروفيسور Agnieszka Ścibior من مختبر الأكسدة ، ومركز البحوث متعددة التخصصات ، JPII CUL لتقاسم المعدات لاستزراع الخلايا والتكميم البروتيني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
| Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
| Analytical balance | Ohaus | ||
| Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
| Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
| Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
| Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
| Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
| Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
| Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
| Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
| Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
| Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
| Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
| Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
| Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
| See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
| Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
| Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
| Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
| Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
| Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
| Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
| Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
References
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
- Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
- Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
- Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
- Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
- Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).
- Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
- Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
- Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
- Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M.
- Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
- Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
- Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
- Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
- Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
- Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
- Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).
- Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
- Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
- Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
- Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
- Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
- Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
- Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
- Annesley, T. M.
- Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
- Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
- Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416 (2009).
- Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).
