Summary
这里描述的是一个协议，用于确定从液体色谱分析的癌细胞培养物中收集的介质中产生的四种不同的色氨酸代谢物（金黄素、3-羟基核素、Xanthurenic酸、3-羟基苯甲酸）。
Abstract
基努雷宁通路和色氨酸卡塔博利特称为基努雷宁已经受到越来越多的关注，因为他们参与免疫调节和癌症生物学。 体外 细胞培养分析通常用于了解不同色氨酸卡托邦细胞在疾病机制中的贡献以及用于测试治疗策略。富含分泌代谢物和信号分子的细胞培养介质反映了色氨酸代谢和其他细胞事件的状态。需要在复杂的细胞培养介质中可靠量化多种基努他宁的新协议，以便对多个样本进行可靠和快速的分析。这可以通过液体色谱与质谱学相结合来完成。这种强大的技术用于许多临床和研究实验室的代谢物的定量，可用于测量基努他宁。
这里介绍的是使用液相色谱与单四足质谱（LC-SQ）同时确定四个基努他宁，即基努雷宁，3-羟基核素，3-羟基苯甲酸，和从 体外 培养癌细胞中收集的介质中的黄曲霉素酸。SQ探测器使用简单，与其他质谱仪相比更便宜。在 SQ-MS 分析中，根据样品的特定质量与电荷比（m/z）生成并分离多个离子，然后使用单离子监控 （SIM） 模式进行检测。
本文注重报告方法的优点，指出了一些薄弱环节。它侧重于LC-SQ分析的关键要素，包括样品准备以及色谱和质谱分析。还讨论了质量控制、方法校准条件和矩阵效应等问题。我们描述了一个简单的应用3硝基酪氨酸作为一个模拟标准的所有目标分析。经人类卵巢癌和乳腺癌细胞实验证实，建议的LC-SQ方法产生可靠的结果，并可进一步应用于其他 体外 细胞模型。
Introduction
基努琳通路 （KP） 是人类细胞中色氨酸 （Trp） 催化的主要途径。在肝外细胞中，印度胺-2，3-二氧酶（IDO-1）是第一种限制KP酶，并将Trp转化为N-形成基核素1。KP 内的进一步步骤会生成其他次要代谢物，即具有各种生物特性的基努他宁。Kynurenine （Kyn） 是第一个稳定的 Trp 催化物， 显示有毒性质和调节细胞事件后， 结合到阿丽尔碳氢化合物受体 （AhR）2.随后，Kyn被自发地或在酶介质过程中转化为几个分子，产生诸如3-羟基核素（3HKyn）、炭酸（AA）、3-羟基苯甲酸（3-HAA）、基努雷尼酸（Kyna）和Xanthurenic酸（XA）等代谢物。另一种下游代谢物，2-氨基-3-卡博基霉素酸-6-半醛（ACMS），经历非酶循环奎诺利尼酸（QA）或野餐酸（PA）1.最后，QA被进一步转化为烟酰胺-腺苷二核苷酸（NAD+）3，KP端点代谢物，是一个重要的酶共同因子。一些基努肾上腺素具有神经保护特性，如Kyna和PA，而其他，即3HAA和3HKyn，是有毒的4。由3HKyn形成的Xanthurenic酸具有抗氧化和血管电离特性5。XA在老化的镜片中积累，导致上皮细胞6的凋亡。KP在20世纪中叶被描述，当它参与各种疾病被证明时，它得到了更多的关注。这种代谢途径的增加和一些kynurenine的积累调节免疫反应，并与不同的病理条件，如抑郁症，精神分裂症，脑病，艾滋病毒，痴呆症，肌萎缩性侧索硬化症，疟疾，阿尔茨海默氏症，亨廷顿舞蹈症和癌症4，7。在肿瘤微环境和癌细胞2，8中观察到Trp新陈代谢的一些变化。此外，基努雷宁被认为是有希望的疾病标记9。在癌症研究中，体外细胞培养模型已建立并广泛应用于抗癌药物10的药前评价。Trp代谢物由细胞分泌到培养基中，可以测量以评估基努艾琳通路的状态。因此，需要开发适当的方法，以简单、灵活和可靠的协议，在各种生物标本中同时检测尽可能多的KP代谢物。
在本文中，我们描述了一个协议，用于同时确定四个基努艾琳通路代谢物：Kyn、3HKyn、3HAA和XA，由LC-SQ在从癌细胞中收集的培养基中。在现代分析方法中，液相色谱13、14、15、16优先于同时检测和量化单个色氨酸催化物，而使用Erlich试剂11、12进行生化非特异性检测。目前，人类标本中有许多用于基努他宁测定的方法，主要基于带有紫外线或荧光检测仪13、17、18、19的液相色谱。液相色谱与质谱探测器 （LC-MS） 似乎更适合此类分析，因为其灵敏度较高（检测范围较低）、选择性和可重复性。
Trp代谢物已经确定在人类血清，血浆和尿液13，20，21，22，23，但是，其他生物标本的方法，如细胞培养介质也是需要的。此前，LC-MS用于培养人类胶质瘤细胞、单核细胞、支气管细胞或用干扰素伽马（IFN-γ）治疗的星形细胞（IFN-γ）24、25、26后收集的介质中的Trp衍生化合物。目前，需要新的验证协议，可以评估不同培养基、细胞和癌症模型中使用的治疗方法中的几个代谢物。
开发方法的目的是量化（在一次分析运行内）四个主要的基努雷宁，可以指示KP的异常。这里介绍的是我们最近出版的协议的关键步骤，定量LC-SQ分析选定的有意义的基努雷宁使用一个内部标准（3-硝基罗辛，3NT）在从 体外 培养的人类癌细胞27收集的介质。据我们所知，这是第一个LC-SQ协议，用于在从 体外 生长细胞获得的培养基中同时量化3HKyn、3HAA、Kyn和XA。经过一些修改后，该方法可以进一步应用于研究Trp代谢在更广泛的细胞培养模型中的变化。
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Protocol
1. 准备标准 3NT、Kyn、3HKyn、3HAA、XA 标准库存解决方案
- 以最高精度（每瓶0.3毫克）在小瓶中称量试剂。为了提高准确性，请放大试剂，根据步骤 1.2 调整溶剂的体积。
- 溶解溶剂在溶剂的300μL，以获得1克/升的库存溶液。溶解3NT在1%（v/v）的微酸（FA）在水中;金，3HAA和XA在二甲基硫化物（DMSO）;3HKyn 在水中酸化到 pH 2.5 与盐酸 （HCL）.
警告：3HAA刺激眼睛、鼻子、喉咙和肺部。吸入、接触皮肤和吞咽时有害。佩戴适当的防护服，即手套和面罩。 - 紧闭小瓶，放在超声波浴缸中1分钟，以加速溶解。
注意：将库存解决方案存储在 -20 °C，并最大限度地减少由于库存解决方案不稳定造成的冻结/解冻（最大 3 个周期）。
2. 木炭处理文化媒介的制备
- 在一根管子中，重280毫克的活性炭，并加入5 mL的液体介质，准备培养感兴趣的细胞。
- 在室温下（将速度设置为 50 振荡/分钟），用锯锯摇杆上的介质和木炭摇动管 2 小时。接下来，将管子在 6000 x g 下离心 15 分钟。
- 从离心机中取出管子，小心收集超纳坦，而不会干扰沉积物。如有必要，重复离心，以去除所有木炭残留物。
- 使用 0.45 μm 注射器过滤器过滤超强剂。
- 通过在LC-MS上运行第 6.3.2 步中描述的试点样本，确保木炭预处理培养基被剥夺了 kynurenine 痕迹。否则，重复步骤 2.1-2.4。
注：如果完整的培养基最初不含基努他宁，则可能会省略使用木炭的净化步骤。在这种情况下，使用通常用于细胞培养的完整介质准备校准标准和质量控制样品。 - 将准备好的介质存储在4°C，直到分析。
3. 制作校准解决方案和校准曲线
- 用 0.75 μL 的 0.1 g/L 3NT 溶液喷涂木炭预处理培养基，并添加四个标准（3HKyn、3HAA、Kyn、XA）至少六种不同浓度，以覆盖校准范围。将每个样品的最终体积保持在 150μL. 漩涡良好。使用 1.5 mL 离心管进行样品准备。
注：3HKyn建议校准点：0.018、0.045、0.22、1.12、2.23、4.46 μmol/L：Kyn： 0.0096， 0.048， 0.24， 1.20， 2.40， 3.84 μmol/L;3HAA： 0.033， 0.16， 0.65， 3.27， 6.53， 13.06 μmol/L;XA： 0.019， 0.13， 0.49， 1.22， 3.65， 4.87 μmol/L. - 在每个管子中加入 150 μL 的冷甲醇（保持在 -20 °C），其中含有 1% （v/v） 的甲醇，用于样品脱蛋白。紧紧地关闭管子和漩涡。
- 在-20°C下孵化样品40分钟。
- 在 4 °C 下将样品在 14，000 x g 下离心 15 分钟。 从离心机中取出管子。将超纳丁收集到新管中。请勿干扰沉积物。
- 使用自动移液器将 270μL 的超级麻醉剂转移到玻璃瓶中。将小瓶放入蒸发器中，轻轻蒸发，直到干燥。使用适当的程序对水/甲醇分数蒸发挥发性成分。不要应用温度高于40°C，避免过度干燥。
注：平底玻璃瓶，即色谱瓶，与塑料圆锥管相比，可促进更快的蒸发和更高的回收。 - 30分钟后，检查蒸发状态。如有必要，继续蒸发（例如，额外增加10分钟）。避免过度干燥。
- 从蒸发器中取出小瓶。将每个样品在 60 μL 中重新构合 0.1% （v/v） 水中的微酸。将溶剂加入含有残留物质的瓶中。紧紧关闭小瓶和漩涡井。
- 将样品转移到 1.5 mL 管中，在 14，000 x g 下旋转 15 分钟，在 4 °C 下分离沉淀的蛋白质。
- 在不干扰蛋白质颗粒的情况下，使用带自动移液器的锥形玻璃插入将超级纳坦转移到色谱小瓶中。紧紧关闭小瓶。
- 检查插入瓶中是否存在气泡，如有必要，将其取出（例如，通过涡旋）。
- 将含有样品的色谱小瓶转移到LC自动取样器中。记录放置在自动取样器托盘中的样品的位置。
4. 编制质量控制 （QC） 样品
- 用0.75微升的0.1克/升3NT溶液和四种基努他宁（3HKyn、3HAA、Kyn、XA）的标准，在从校准曲线的线性范围内选择的浓度中，将木炭预处理培养基（在1.5毫升离心管中制备）尖峰。将样品的最终体积保持在 150 μL。
注：如果适用，请准备几个不同浓度的QC样品，这些样品属于校准曲线的线性范围。 - 遵循第 3 节中描述的协议（步骤 3.2-3.11）。
5. 建立LC-MS系统
- 准备移动相溶剂：溶剂A：超纯水中的20毫升/升铵（pH 4.3经氨酸调节）：溶剂 B： 100% 丙酮三星。
注意：仅使用波罗西酸玻璃瓶。在重新灌装之前用超纯水冲洗瓶子。不要使用用洗涤剂清洗的瓶子。
警告：丙酮三星会导致严重的健康影响或死亡。它很容易被热点燃。丙酮液体和蒸汽会刺激眼睛、鼻子、喉咙和肺部。- 将晶体试剂（15.77克）溶解在玻璃瓶中的50毫升超纯净水中，准备5摩尔/L铵汤溶液。搅拌，直到所有残留物溶解。过滤 0.45 μm 膜以清除任何残留碎片（例如，使用尼龙注射器过滤器）。将库存解决方案存储在4°C。
- 准备溶剂A通过添加4毫升5摩尔/升铵在水中到980毫升的超纯水在琥珀色玻璃瓶和搅拌井。浸入搅拌棒，将带溶剂的瓶子放在磁性搅拌器上。将 pH 电极浸入溶液中，并在搅拌下控制 pH。添加氨酸库存溶液 （98%-100%）使用带 0.2 mL 尖端的自动移液器获得 pH 4.3，用超纯水将音量调整至 1 L，搅拌良好。
注意：每周至少准备一次溶剂以防止任何微生物生长。
警告：福密酸 （FA） 吸入时有毒，导致皮肤灼伤和眼睛损伤。在烟雾罩下工作;戴防护手套和外套。 - 通过 0.22 μm 膜（例如尼龙注射器过滤器）过滤所有溶液，以清除任何残留碎片。可选地，使用专用于LC溶剂储层的溶剂进气口过滤器，以保护系统免受传入颗粒的射入。
- 启动LC-MS控制和数据采集软件。
- 使用移动相清除LC系统以去除气泡，并使所有溶剂通道都处于最佳状态。
- 组合一个守卫柱，以保护分析列免受堵塞。
- 用 100% 丙酮三星冲洗护栏和分析柱（C18、2.1 x 100 mm、1.8 μm）约 30 分钟，然后用 100% 溶剂 A 冲洗，直到观察到柱子中的稳定压力。使用控制软件控制系统性能。
- 在数据采集软件中设置相应的LC参数。
- 设置梯度方案：0-8分钟溶剂B 0%：8-17 分钟溶剂 B 0-2%：17-20分钟溶剂B 2%：20-32 分钟溶剂 B 10-30%：32-45 分钟溶剂 B 0%。
- 将移动相流速设置为 0.15 mL/min，总分析运行时间为 45 分钟，柱温为 +40 °C，喷射体积为 10μL。
- 设置质谱探测器的采集参数。
- 应用电化参数：单离子监测（SIM）、正电化、雾化压力50 psi、+350°C干燥气体温度、12升/分钟的干燥气体流量和5500 V毛细管电压。
- 选择分析监测离子：3HKyn m/z 225.0（扫描周期：2-6分钟，碎块电压：100 V）：用于 Kyn m/z 209.0（扫描周期：6-12 分钟，碎块电压：80 V）：3HAA m/z 154.0（扫描周期：12-18 分钟，碎块电压：80 V）：3NT m/z 227.0（扫描周期：18-23分钟，碎块电压：100 V）：XA m/z 206.0（扫描周期：23-45分钟，碎块电压：100 V）。
- 构建工作列表并在LC系统上运行示例。
- 首先，在分析实验样品之前，至少在三个样本中运行一个空白样本（溶剂A），然后是一个QC样本。
- 打开数据分析软件并加载为 QC 样本获得的结果。
- 检查色谱上分析峰的位置。当信号移到预期位置之外时，请调整时间门以进行适当的分析信号收集。有关信号集成的说明，请参阅软件手册。
6. 构建校准曲线
- 在数据采集软件中，将校准标准添加到工作列表中，并在三次运行标准。
- 分别在约4.4分钟、10分钟、16分钟、21分钟和30分钟的保留时间内，对应3HKyn、Kyn、3HA、3NT和XA的峰值区域进行集成和测量。
- 使用电子表格程序为每个代谢物构建单个校准曲线。
- 要创建校准图，则绘制 3NT 峰值区域中分析峰值区域与分析物浓度的比率值。
- 分析空白样本（仅用3NT喷射的炭预处理培养基），确保介质中没有研究分析物的痕迹。否则，从每个校准点减去所获得的价值。
- 检查每个校准曲线的线性。
- 单独地，对于每个分析器，创建一个斜面拦截线性方程（y = ax +b），其中 y 对应分析峰值区域与 3NT 峰值区域的比例，a是斜率，x是分析浓度（μmol/L），b 表示曲线拦截。绘制图形"y"与"x"将生成校准曲线。
- 在图表中添加线性趋势线，在图表上显示校准曲线方程和回归系数。确保回归系数为+0.990。如果校准标准不匹配，再次准备和/或分析这些标准。可选地更改校准曲线的浓度范围。
- 在分析实验样品之前，先分析 QC 样本以检查系统性能。如果不兼容（±参考值偏离 20%），则准备新的校准曲线。
7. 体外细胞培养和样本收集，供分析
- 板研究的癌细胞（MDA-MB-231或SK-OV-3）在DMEM（杜尔贝科的改良鹰的介质）含有4.5克/升的ᴅ葡萄糖， 10% （v/v） 胎儿牛血清 （FBS）， 2 mmol/L ʟ-谷氨酰胺和 1 U 青霉素/链霉素和培养在 37 °C 在 5% CO2 的加湿大气中， 以扩大他们为实验.以 80% 的汇合率通过细胞。
- 使用trypsin将细胞从培养皿中分离出，在12口井板上进行实验的种子，密度为每口井0.3×106 个细胞，并放置在孵化器中过夜。
- 第二天，吸气培养基，并添加新鲜的DMEM，无论是否添加研究的化合物，这取决于实验设计。
- 48小时后，从细胞上方（约500μL）收集介质到1.5 mL管中。离心机在14，000 x g 5分钟，以消除任何细胞碎片。收集超纳坦并储存在-80°C，直到分析。
- 将细胞颗粒从步骤 7.4 中保存以进行蛋白质估计。将样品冻结在-20°C。
注：从不同油井获得的介质结果应标准化为总蛋白质含量，以考虑单个油井中细胞数的变异性。蛋白质浓度可以按照第 9 步进行评估。
8. 为LC-MS分析准备样品
- 在室温下解冻冷冻样品，混合均好。将培养基的149.25μL转移到离心管（1.5 mL）中。
- 添加 3NT 解决方案 0.1 克/升的 0.75 微升（内部标准）。关闭管子和漩涡很好。
- 添加 150 μL 的冰镇在 -20 °C 甲醇含有 1% （v/v） FA 样品去蛋白化。关闭管子和漩涡很好。
- 继续第 3 节（步骤 3.3-3.11）中描述的样品准备。
注：一些癌细胞，如SK-OV-3，将大量的Kyn分泌到培养基中。要将数据放入校准曲线的线性范围内，需要对样品进行大约 100 倍的稀释。在这种情况下，在水中用 0.1% （v/v） FA 稀释部分样品，并分析未稀释的样品。校准曲线标准的参考样本应在100倍稀释的完整培养介质中编写。或者，在校准曲线中添加更多点（如果达到适当的溶解度和线性），使其调整到实验样本中 Kyn 的浓度水平。 - 分析第 5 节中描述的 LC-MS 样本。构建一个工作列表，并将每个样本运行三次。
- 工作表完成后，测量分析的峰值区域。
- 使用可用的软件生成电子表格和获取的数字数据。
- 在一个电子表格列中计算 3NT 峰值区域上的分析峰值区域比率。
- 使用专用于每个分析量（从步骤 6.3.）的单个线性校准方程来计算实验样本中存在的分析物浓度。
9. 评估蛋白质含量和数据正常化
- 将细胞颗粒从步骤 7.5 中重新悬生，在 1.5 mL 管中使用 100μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
注：在950mL超纯水中溶解8克氯化钠、0.2克氯化钾、1.44克磷酸二酸钠、磷酸二氢钾，准备PBS溶液。搅拌好。用盐酸（滴式）将pH调整为7.4。用超纯水调整体积高达 1 L。搅拌好，直到均匀。
注意：盐酸具有高度腐蚀性，必须采取适当的安全防范措施。与人的皮肤接触可导致发红、疼痛、皮肤灼伤。在烟雾罩下工作;戴防护手套和外套。 - 将样品冷冻在-20°C，然后在冰上解冻。重复此步骤3倍。
- 在 4 °C 下将样品在 14，000 x g 下离心 15 分钟。 将超纳托收集到新管中。不要打扰颗粒。
- 用PBS稀释超常剂10倍。
- 构造一个校准曲线，每个井范围的蛋白质为 0 到 2 μg。
- 准备牛血清白蛋白 （BSA） 标准溶液进行校准。溶解 1.23 μg 的 BSA 在 1 mL 的超纯水和涡井。
- 在 96 井板上，装载不同数量的 BSA 标准解决方案（1.23 μg/mL）：0 μL、2 μL、4 μL、5 μL、7 μL、10 μL、15 μL、20 μL。
- 用 PBS 填充油井，最终体积为 50 μL。
- 加载 10 - 15 μL 细胞从步骤 9.4 在同一 96 井板上解压。用 PBS 填充油井，达到 50 μL 的最终体积。
注：如有必要，请调整每口井中细胞解液的量，以适应校准曲线的线性范围。将每个油井的样本最终体积保持在 50μL。 - 在每个井中加入 200μL 的布拉德福德试剂（用超纯水稀释 5 次）。
- 在室温下将96口井的馅饼孵育至少5分钟。将板插入微板读取器。测量λ=595nm的吸收量。
- 使用电子表格程序构建校准曲线。绘制 BSA 量 （μg） 与吸收量。添加线性趋势线，在图表上显示校准曲线方程和回归系数。
- 使用线性方程（y = ax +b，其中y对应于λ = 595 nm 的吸收，a是斜率，x是蛋白质含量（μg），b 指曲线截获）来计算样品中的蛋白质量。
注：在计算中考虑样品稀释因子。 - 使用估计的蛋白质含量来使每1毫克蛋白质样本中的基努他宁量正常化。为此，将第 8.9 步确定的 kynurenine 浓度与第 9.10 步的总蛋白质含量分开。
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Representative Results
LC-MS在生物活性分子的量化方面具有无可争辩的优势，尽管复杂标本的某些成分会导致所谓的基质效应，并损害分析物的电位化。它导致离子抑制或离子增强，严重降低精度，并影响LC-MS的检测/量化极限，这被认为是该方法的"弱"点。在我们的协议中，离子是由正模式下的电喷雾电离子化（ESI）产生的，这也用于Trp代谢物测定13的其他研究。然而，与大气压力化学电化（APCI）28相比，ESI更容易产生基质效应。因此，为了准确量化细胞培养介质中的 Trp 代谢物，我们使用内部标准和矩阵匹配校准来补偿矩阵依赖对分析信号的影响，并在样品准备步骤中纠正目标化合物的损失。我们对所有研究分析（3HKyn、Kyn、3HAA、XA）应用了相同的内部标准（3NT）。3NT 未在用于细胞培养的原始新鲜介质中找到，并且在应用分析条件下表现出类似目标化合物的行为。这使得3NT成为适当的内部标准27。此外，为了简化协议，为了让广大用户更容易获得该协议，我们建议只使用含有 1% （v/v） FA 的甲醇处理，进行蛋白质去除的样品制备步骤。
在提交的协议中，建议使用用于细胞培养的完整介质来准备校准曲线。然而，培养基可能含有内源性 Kyn，干扰分析峰值区域的正确估计，尤其是在低浓度校准溶液中。 图 1A 说明了在分析包含 4.5 g/L D-葡萄糖 （DMEM-HG） 和 10% （v/v） FBS 用于癌细胞培养的 DMEM 期间获得的 LC-SQ 结果。我们发现，新鲜完整的培养基最初含有一些Kyn，可以通过活性炭（图1B）净化去除。在分析实验样品的同时，还分析完整的DMEM-HG培养基作为对照样本，从每个测试样本中Kyn记录的峰值区域中减去Kyn峰区。
图1：活性炭预处理前（A）和（B）完整DMEM-HG培养介质（A）的代表性LC-SQ结果。 培养介质的样本以相同数量的内部标准 （3NT） 尖峰。 请点击这里查看此数字的较大版本。
在下一步中，确定了每个目标分析的保留时间（见 图 2A中的色谱图）。LC-MS 分析的良好做法是在实际样品之前运行 QC 样本，以确认分析仪的适当保留时间。有时，可以观察到LC信号的移动，并且容易发生不匹配。 图 2B 显示分析器的保留时间略有变化，但是，这不会干扰正确的测量。另一方面， 图 2C 显示目标峰值位置的重大变化。如前所示，3NT 信号显著转向较短的保留时间，并从设定的时间关口出来。在这种情况下，由于无法正确测量内部标准信号，因此无法进行适当的定量分析。这可能是由于几个因素，即柱平衡不足、泵中的溶剂混合不当、使用不当的样品 diluent 或柱静止相污染。图 2D，但是，代表的情况，当注册的峰值遭受严重低强度。这可能是注射失败、系统泄漏或 MS 损坏的结果。此外，联合分离矩阵组件可以生成用于目标分析的 m/z 离子，如 图 3A中，其中显示了 MDA-MB-231 细胞培养介质分析的结果。在大约25分钟的保留时间，观察到来自未知矩阵组件（复合X）的强信号。峰值出现在扫描期间，当 监测 m/z 206 离子（选择为 XA）时。但是，由于保留时间不兼容，此信号与分析不符。为了避免在峰值集成过程中出现错误，还建议将保留时间与为 QC 样本记录的保留时间进行比较。
图2。正确和不正确的结果示例。 QC样本分析的正确色谱在（A） 中等和（B） 低浓度水平记录在不同的天。分析器（C）的保留时间发生显著变化和峰值强度不尽如人意（D）导致的不正确的色谱示例。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3。从不同的癌细胞系中收集的文化介质的代表性结果。使用LC-SQ对来自（A）MDA-MB-231（人类乳腺癌）和（B）SK-OV-3（人类卵巢癌）细胞的培养介质进行了分析。化合物X表示培养介质中存在的未知化合物的信号，该化合物与分析器共用并电化，形成离子，并选择用于分析的m/z。请点击这里查看此数字的较大版本。
用于癌细胞（DMEM）的培养介质含有大量的Trp。其同位素（13C-Trp） 与 XA（m/z 206） 共享相同的离子，并可能干扰 XA 的确定性。但是，在应用的色谱条件下，来自 Trp 的信号与 XA 信号完全分离。因此，我们得出结论，DMEM 中的 Trp 不会影响该方法的 XA 量化和准确性（图 4）。
图4。色氨酸 （Trp） 和 X 氨酸 （XA） 信号在 MS 色谱图上的位置。Trp （49.0 μmol/L） 和 XA （48.8 μmol/L） 的标准解决方案在优化的 LC-SQ 条件下在溶剂 A 中制备（水中为 20 mmol/L 铵，pH 4.3）。m/z 205（对应[Trp+H]）和m/z 206（对应[XA+H]+）的离子分别被监测为Trp和XA。请点击这里查看此数字的较大版本。
所呈现的分析方法在线性、精度（变异系数≤15%）、精度（96-104%）、恢复（96-119%）和所有分析物的矩阵效应等方面都顺利通过了验证测试，如上一篇论文 27中详细描述的那样。
最后，我们确认了描述的分析方法应用于从 体外 培养的人类癌细胞中收集的介质。我们的数据证实，在从不同细胞类型（图3）收集的文化介质中，基努他宁水平可能显著变化。我们分别分析了来自乳腺癌和卵巢癌的2种癌症系，即MDA-MB-231和SK-OV-3细胞的培养介质。选定的线条通常用作研究分子事件和抗癌药物测试的模型。正如我们观察到的，在控制标准介质中培养的细胞释放出不同数量的色氨酸代谢物， 即MDA-MB-231细胞在低nmol/L浓度（图3A）下释放出可量化的Kyn和XA量，而SK-OV-3细胞显示Kyn显著增加，XA分泌非常低，其他研究的Kynurenine没有分泌，如相应峰值的强度（图3B）所示。
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Discussion
本文提出了一个详细的LC-SQ协议，用于同时量化四个主要的Trp代谢物（3HKyn，Kyn，3HAA，XA），这些代谢物是用 体外 培养的人类癌细胞的介质测量的。特别注意样品的准备、色谱/质谱过程和数据解释，这是分析中最重要的一点。
一般来说，LC-MS 分析由于灵敏度高，需要对二手材料的严格性和纯度进行最高标准的协议。它是指在整个标准程序中应用整齐清洁和正确洗涤的玻璃器皿以及高档化学品。使用移动阶段的淡水溶剂以避免微生物污染非常重要，这种敏感方法可能会对分析产生重大影响。在注入LC系统之前，需要仔细检查分析的样品是否存在任何不溶性颗粒。需要注意的是，在进行样品分析之前，应充分平衡该列。不遵守这些规则可能导致样品、LC 系统和分析柱的污染，或在 MS 源中样品电化不足，最终导致信号转移。
为了获得最佳结果，协议中有 2 个关键点需要强调。所提交协议中最关键的部分是样品准备步骤。使用不当的程序会导致目标化合物的丢失，从而导致数量不准确。在我们的方法中，在方法开发过程中，随着蛋白质去除溶剂的选择，样品制备步骤得到了仔细的优化。正如我们确定的那样，用含有1%（v/v）甲醇的甲醇进行样品处理，为所有研究的基努他宁提供了最佳的恢复。还评估了移动相组成对分析电离子化程度的影响。我们已经检查了移动相，包括 0-20 mmol/L 铵的二甲酸铵或醋酸铵在不同的 pH 度调整与福米奇或醋酸。在水中含有20毫升/升铵（pH 4.3，溶剂A）和丙酮三叶草（溶剂B）的移动相为同时量化Kyn、3HKyn、3HAA和XA27提供了最好的条件。LC-MS 分析的另一个重要步骤是峰值集成。一些基努他宁发生在非常低浓度的样品中。在这种情况下，共发化合物的信号可能会与目标分析信号重叠，或在类似的保留时间生成峰值。这种方法的未经验用户可能会发现一些困难与正确的峰值集成，如 图2C。因此，需要检查分析器的保留时间并与 QC 样本进行比较，并强烈推荐。
良好的分析实践包括选择适当的内部标准进行定量分析。在此，我们提出了一种简单且具有成本效益的方法，仅使用一种内部标准 （3NT） 作为四种 kynurenine 的类似方法。结果证实，3NT具有与目标化合物类似的色谱行为，因此它使方法27具有很好的精确性和准确性。在应用的LC条件下，3NT峰值与其他分析器的信号完全分离，易于测量。我们认识到，在此类分析中使用的同位素标记的内部标准 （ILIS）14、15将更好地补偿矩阵效应，并更好地控制可能导致错误结果的所有变量。另一方面，所有目标分析器的 ILIS 并不总是容易获得，更不用说其高成本了。此外，ILISs 专用于 LC-MS/MS，而不是我们本文中采用的单离子监控 （SIM）模式的 LC-SQ。
使用3NT作为内部标准可以在这里被视为方法的局限性，因为蛋白质29上可能形成3-硝基酪氨酸。然而，在培养基介质的情况下，我们没有观察到任何自由内源性三硝基酪氨酸。它让我们认识到3NT是一个合适的内部标准。但是，我们建议对初始内源性 3NT 水平进行事先评估，尤其是在研究本报告中测试的其他细胞类型时。
总之，在选择任何分析的模拟时，需要考虑许多特征，例如，样品矩阵中的化学相似性和初始缺失。此外，样品基质中模拟内部标准的稳定性、矩阵组件存在的恢复和电离效率可能与目标化合物不同。因此，在方法开发过程中，应考虑和仔细研究所有这些特征。
由 MS 探测器组成的呈现方法中的分析系统使我们能够实现低检测极限 （0.0033 – 0.0108 μmol/L）27。这种方式同时测量3HKyn，金， 3HAA、XA 的浓度范围分别为 0.018 - 4.46 μmol/L、0.0096 - 3.84 μmol/L、0.033 - 13.06 μmol/L 和 0.019 - 4.87 μmol/L。任何 LC-SQ 分析的主要局限性都与 LC 列上的样本组件正确分离相关。与采用产品离子和多反应监测 （MRM） 模式的串联四足质谱仪的检测相比，分离性差有助于降低选择性。为了避免来自与目标分子共享相同或相似离子的其他矩阵组件的干扰，必须仔细优化LC分离条件。例如 ，13C Trp 同位素（以微量表示）生成与 XA 监测选择的 m/z 206 离子相同。通过优化色谱条件和将 Trp 和 XA 从列中分离出来（图 4），避免了误解。
在以后的应用程序中，可以对协议进行一些修改。当研究的基努他宁水平预计将低于此处提供的浓度时，潜在用户可以修改内部标准 （3NT） 的浓度。重要的是，3NT浓度在校准标准和实验样品中都应该相同。如果分析水平极高，例如在SK-OV-3细胞中观察到的Kyn，我们建议使用浓度较高的3NT。如果需要样品稀释，则应在协议的最后一步进行，然后将样品注入到LC柱上。
在文献中，有一些协议建议LC-MS/MS定量分析kynurenine在培养基来自不同细胞。一个协议提供了3个代谢物的同步确定，即Kyn，3HKyn和3HAA，但它不太敏感（在较高级别的量化限制（LOQ），相比之下，我们的方法21。另一份报告提出了一种方法，允许量化4基努雷宁，包括金，3HKyn，3HAA和XA与类似的LOQs25。然而，没有一种被优化用于检测体 外 培养癌细胞产生的基努他宁。样本矩阵的组件通过减少或增加信号来影响 MS 源中的分析电互化，这是导致不可靠的结果的原因。为了获得更准确的数据，我们建议使用模拟内部标准 （3NT） 与矩阵匹配校准相结合，以便更好地补偿矩阵依赖效应。
使用所呈现的方法，我们可以观察到，Kyn是从分析的癌细胞类型中收集的文化介质中最丰富的Trp代谢物，而其他在控制培养条件下研究的代谢物没有被发现（不包括XA存在于微量但可检测的数量）。然而，当细胞被一个强大的免疫活化剂刺激时——细菌脂聚糖，除了Kyn之外，还有更多的XA被分泌。 另一方面，在KP内XA上游形成的3HKyn和3HAA仍在LOQ27之下。这表明，在培养基中少量存在的一些 KP 代谢物可能难以使用提议的 LC-SQ 方法进行测量。然而，所提交的协议有助于通过量化累积的关键 Trp 代谢物来识别 KP 的变化。在未来的研究中采用这种方法进行体外细胞培养系统，将提供免疫相关疾病和癌症的新生物标志物。我们的方法为由于下游 KP 代谢物浓度低而具有挑战性的细胞模型带来了验证和可靠的检测，具有相关灵敏度。所提供的说明将允许来自不同领域的研究人员利用这种方法量化与癌症和其他疾病有关的主要基努他宁。我们的数据（未发表）表明，它有助于研究暴露于不同糖化产物的细胞中的KP调制，但它也应该找到一个应用在其他研究领域和疾病与免疫成分，即子宫内膜生物学和生殖30。
可进一步扩大所提交的协议，以确定在不同实验条件下可能积累在培养基中的其他分析因素。在用于定量分析之前，应采用适当的分析数据参考标准，用于准确性、精度、线性、恢复或选择性方面的方法验证。未来，根据研究目的，该协议可用于单个基努他宁（3HKyn，Kyn，3HAA或XA）。在这种情况下，可从 MS 设置中去除与未考虑分析的化合物相对应的离子。LC 渐变程序的适当更改将有助于缩短分析时间。
在研究 KP 时，评估 IDO 酶的活性是相关的。这可以通过测量Trp消耗和Kyn释放到一个文化媒介或计算基努雷宁到色氨酸浓度比（[Kyn]/[Trp]）31来估计。在我们的方法中，我们尚未测量 Trp 浓度，但是，通过在 LC-SQ 分析中添加此目标，可能会扩展协议。作为一种更适合生物化学的方法，我们建议将IDO酶活性表达为每毫克蛋白质细胞产生的Kyn量，如其他地方所示。我们已经注意到在其他癌细胞研究（准备手稿）中使用这种方法的优点，并在使用体外细胞培养模型时推荐这种方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到欧洲联盟根据《2007-2013年波兰东部业务方案发展》获得欧洲联盟区域发展基金的支持（POPW.01.03.00-06-003/09-00），由卢布林约翰·保罗二世天主教大学生物技术和环境科学学院（波兰国家科学中心为伊洛娜·萨多克提供青年科学家赠款）， OPUS13 （2017/25/B/NZ4/01198 马格达莱娜·斯塔尼谢夫斯卡，原则调查员）。 作者感谢JPY CUL跨学科研究中心氧化应激实验室的阿格涅什卡·奇比尔教授分享细胞培养和蛋白质定量设备。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
| Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
| Analytical balance | Ohaus | ||
| Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
| Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
| Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
| Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
| Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
| Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
| Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
| Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
| Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
| Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
| Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
| Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
| Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
| See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
| Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
| Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
| Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
| Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
| Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
| Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
| Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
References
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
- Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
- Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
- Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
- Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
- Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).
- Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
- Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
- Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
- Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M.
- Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
- Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
- Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
- Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
- Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
- Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
- Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).
- Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
- Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
- Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
- Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
- Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
- Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
- Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
- Annesley, T. M.
- Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
- Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
- Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416 (2009).
- Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).
