Summary
Descrito aqui é um protocolo para a determinação de quatro metabólitos triptofanos diferentes gerados na via kynurenine (kynurenine, 3-hidroxikynurenine, ácido xanthurenic, ácido 3-hidroxyanthranilic) no meio coletado de culturas de células cancerosas analisadas por cromatografia líquida acoplada com uma única espectrometria de massa quadrupole.
Abstract
O caminho da kynurenine e os catabólitos do triptofano chamados kynurenines têm recebido maior atenção por seu envolvimento na regulação imunológica e biologia do câncer. Um ensaio de cultura in vitro é frequentemente usado para aprender sobre a contribuição de diferentes catabólitos triptofanos em um mecanismo de doença e para testar estratégias terapêuticas. O meio de cultura celular rico em metabólitos secretos e moléculas de sinalização reflete o status do metabolismo triptofano e outros eventos celulares. Novos protocolos para a quantificação confiável de múltiplas kynureninas no complexo meio de cultura celular são desejados para permitir uma análise confiável e rápida de múltiplas amostras. Isso pode ser realizado com cromatografia líquida aliada à espectrometria de massa. Esta poderosa técnica é empregada em muitos laboratórios clínicos e de pesquisa para quantificação de metabólitos e pode ser usada para medir kynurenines.
Apresentado aqui é o uso de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa quadrupole única (LC-SQ) para a determinação simultânea de quatro kynurenines, ou seja, kynurenine, 3-hidroxikynurenine, 3-hidroxyanthranilic, e ácido xanturnic no meio coletado de células cancerígenas in vitro cultivadas. O detector SQ é simples de usar e menos caro em comparação com outros espectrômetros de massa. Na análise SQ-MS, vários íons da amostra são gerados e separados de acordo com sua relação massa-carga específica(m/z),seguida pela detecção usando um modo de Monitoramento de Íons Únicos (SIM).
Este artigo chama a atenção sobre as vantagens do método relatado e indica alguns pontos fracos. É focado em elementos críticos da análise LC-SQ, incluindo preparação de amostras, juntamente com cromatografia e análise de espectrometria de massa. Também são discutidas as condições de controle de qualidade, as condições de calibração do método e os problemas de efeito matricial. Descrevemos uma simples aplicação de 3-nitrotyrosina como um padrão analógico para todos os analitos alvo. Como confirmado por experimentos com ovário humano e células cancerígenas de mama, o método LC-SQ proposto gera resultados confiáveis e pode ser ainda mais aplicado a outros modelos celulares in vitro.
Introduction
O caminho de kynurenine (KP) é a principal rota do catabolismo triptofano (Trp) em células humanas. Indoleamina-2,3-dioxygenase (IDO-1) em células extrahêspticas é a primeira enzima limitante de KP e converte Trp em N-formylkynurenine1. Outros passos dentro do KP geram outros metabólitos secundários, ou seja, kynurenines que exibem várias propriedades biológicas. Kynurenine (Kyn) é o primeiro catabólito Trp estável que mostra propriedades tóxicas e regula eventos celulares após a ligação ao receptor de hidrocarbonetos aryl (AhR)2. Posteriormente, Kyn é transformado em várias moléculas espontaneamente ou nos processos mediados por enzimas, gerando metabólitos como 3-hidroxikynurenine (3HKyn), ácido antoraniano (AA), ácido 3-hidroxyanthranilic (3-HAA), ácido kynurênico (Kyna) e ácido xanturênico (XA). Outro metabólito a jusante, 2-amino-3-carboxymuconic acid-6-semialdeído (ACMS), sofre ciclização não enzimática para ácido quinolínico (QA) ou ácido picolínico (PA)1. Finalmente, a QA é ainda transformada em dinucleotídeo de nicotinamida-adenina (NAD+)3, o metabólito de ponto final KP que é um importante cofator de enzimas. Algumas kynurenines têm propriedades neuroprotetoras como Kyna e PA, enquanto as outras, ou seja, 3HAA e 3HKyn, são tóxicas4. O ácido xanthurenic, formado a partir de 3HKyn, apresenta propriedades antioxidantes e vasorelaxação5. XA se acumula em lentes de envelhecimento e leva à apoptose das células epiteliais6. KP, descrito em meados do séculoXX, ganhou mais atenção quando seu envolvimento em vários transtornos foi demonstrado. O aumento da atividade dessa rota metabólica e o acúmulo de algumas kynurenines modulam a resposta imune e estão associados a diferentes condições patológicas como depressão, esquizofrenia, encefalopatia, HIV, demência, esclerose lateral amiotrófica, malária, Alzheimer, doença de Huntington e câncer4,7. Algumas alterações no metabolismo Trp são observadas em microambientes tumorais e células cancerosas2,8. Além disso, as kynurenines são consideradas como marcadores promissores da doença9. Na pesquisa sobre câncer, os modelos de cultura in vitro são bem estabelecidos e amplamente utilizados para avaliação pré-clínica de respostas a medicamentos anticancerígenos10. Os metabólitos trp são secretados pelas células no meio da cultura e podem ser medidos para avaliar o status da via kynurenina. Portanto, é necessário desenvolver métodos apropriados para a detecção simultânea de tantos metabólitos KP quanto possível em uma variedade de espécimes biológicos com um protocolo fácil, flexível e confiável.
Neste artigo, descrevemos um protocolo para a determinação simultânea de quatro metabólitos de via kynurenina: Kyn, 3HKyn, 3HAA e XA pela LC-SQ em um meio pós-cultura coletado de células cancerosas. Em uma abordagem analítica moderna, a cromatografia líquida13,14,15,16 é preferida para a detecção e quantificação simultâneas dos catabólitos triptofanos individuais, em contraste com ensaios bioquímicos inespecíficos utilizando o reagente Ehrlich11,12. Atualmente, existem muitos métodos disponíveis para a determinação de kynurenines em espécimes humanos, principalmente baseados na cromatografia líquida com detectores de ultravioleta ou fluorescência13,17,18,19. A cromatografia líquida aliada a um detector de espectrometria de massa (LC-MS) parece mais adequada para este tipo de análise, devido à sua maior sensibilidade (limites mais baixos de detecção), seletividade e repetibilidade.
Metabólitos trp já foram determinados em soro humano, plasma e urina13,20,21,22,23, no entanto, os métodos para outros espécimes biológicos, como o meio de cultura celular também são desejados. Anteriormente, o LC-MS era utilizado para compostos derivados de TRP em um meio coletado após acultura de células de glioma humanos, monócitos, células dendríticas ou astrócitos tratados com gama de interferon (IFN-γ)24,25,26. Atualmente, há a necessidade de novos protocolos validados que possam permitir uma avaliação de vários metabólitos em diferentes mídias culturais, células e tratamentos usados em modelos de câncer.
O objetivo do método desenvolvido é quantificar (dentro de uma corrida analítica) quatro kynurenines principais que podem indicar anormalidades em KP. Apresentados aqui estão etapas críticas do nosso protocolo recentemente publicado para análise quantitativa lc-SQ de kynurenines significativas selecionadas usando um padrão interno (3-nitrotyrosina, 3NT) no meio coletado de células cancerígenas humanas in vitro cultivadas 27. Para nosso melhor conhecimento, é o primeiro protocolo LC-SQ para quantificação simultânea de 3HKyn, 3HAA, Kyn e XA em um meio de cultura obtido a partir das células cultivadas in vitro. Após algumas modificações, o método pode ser aplicado ainda mais para estudar as mudanças no metabolismo Trp em uma gama mais ampla de modelos de cultura celular.
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Protocol
1. Preparação das soluções de estoque padrão 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard
- Pesar os reagentes em um frasco com a maior precisão (0,3 mg cada). Para melhor precisão, dimensione os reagentes, ajustando o volume do solvente de acordo com a etapa 1.2.
- Dissolver os reagentes em 300 μL do solvente para obter uma solução de estoque de 1 g/L. Dissolver 3NT em 1% (v/v) ácido fórmico (FA) na água; Kyn, 3HAA e XA em sulfóxido de dimetil (DMSO); 3HKyn em água acidificada para pH 2.5 com ácido clorídrico (HCl).
ATENÇÃO: 3HAA irrita olhos, nariz, garganta e pulmões. É prejudicial quando inalado, em contato com a pele, e se engolido. Use proteção apropriada, ou seja, luvas e máscara. - Feche bem o frasco e coloque-o em um banho ultrassônico por 1 minuto para acelerar a dissolução.
NOTA: Armazene as soluções de estoque a -20 °C e minimize o congelamento/degelo (3 ciclos no máximo) devido à instabilidade das soluções de estoque.
2. Preparação do meio de cultura tratada com carvão
- Em um tubo, pese 280 mg de carvão ativado e adicione 5 mL do meio líquido preparado para a cultura das células de interesse.
- Agite o tubo com o médio e o carvão em um see saw rocker por 2h, em temperatura ambiente (velocidade definida para 50 oscilações/min). Em seguida, centrifugar os tubos a 6000 x g por 15 min.
- Remova o tubo da centrífuga e colete cuidadosamente o supernatante sem perturbar o sedimento. Repita a centrifugação, se necessário, para remover todos os resíduos de carvão.
- Filtre o supernatante usando um filtro de seringa de 0,45 μm.
- Certifique-se de que o meio de cultura pré-tratada de carvão seja privado de traços de kynurenines executando uma amostra piloto em LC-MS, conforme descrito na etapa 6.3.2. Caso contrário, repita as etapas 2.1-2.4.
NOTA: Se o meio de cultura completo inicialmente não contiver kynurenines, a etapa de purificação usando carvão pode ser omitida. Neste caso, prepare padrões de calibração e amostras de controle de qualidade utilizando o meio completo geralmente preparado para cultivo celular. - Armazene o meio preparado a 4 °C até a análise.
3. Fazendo as soluções de calibração e curvas de calibração
- Espetar o meio de cultura pré-tratada de carvão com 0,75 μL de solução 0,1 g/L 3NT e adicionar quatro padrões (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) pelo menos em seis concentrações diferentes para cobrir as faixas de calibração. Mantenha bem o volume final de cada amostra em 150 μL. Vortex. Use tubos de centrífugas de 1,5 mL para preparação da amostra.
NOTA: Pontos de calibração sugeridos para 3HKyn: 0,018, 0,045, 0,22, 1.12, 2.23, 4,46 μmol/L; para Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/L; para 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/L; para XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/L. - Adicione 150 μL de metanol frio (mantido a -20 °C) contendo 1% (v/v) ácido fórmico em cada tubo para desproteinização da amostra. Feche bem os tubos e o vórtice.
- Incubar as amostras a -20 °C por 40 min.
- Centrifugar as amostras a 14.000 x g por 15 min a 4 °C. Remova os tubos da centrífuga. Colete supernantes nos novos tubos. Não perturbe o sedimento.
- Transfira 270 μL do supernante para o frasco de vidro usando uma pipeta automática. Coloque os frascos no evaporador e evapore suavemente até secar. Use o programa apropriado para frações de água/metanol para evaporar componentes voláteis. Não aplique temperatura superior a 40 °C e evite a secagem excessiva.
NOTA: Frascos de vidro de fundo plano, ou seja, frascos cromatográficos facilitam evaporação mais rápida e recuperações mais altas em comparação com tubos cônicos plásticos. - Depois de 30 min, verifique o estado de evaporação. Se necessário, continue evaporando (por exemplo, adicione 10 min extras). Evite a secagem excessiva.
- Remova os frascos do evaporador. Reconstituir cada amostra em 60 μL de ácido fórmico (v/v) na água. Adicione o solvente no frasco que contém o material residual. Feche bem os frascos e o vórtice.
- Transfira a amostra para um tubo de 1,5 mL e gire a 14.000 x g por 15 min a 4 °C para separar a proteína precipitada.
- Sem perturbar a pelota de proteína, transfira os supernantes em frascos cromatográficos com pastilhas cônicas de vidro com uma pipeta automática. Feche bem os frascos.
- Verifique se há presença de bolhas de ar no frasco de inserção e remova-as se necessário (por exemplo, por vórtice).
- Transfira os frascos cromatográficos contendo amostras para o autosampler LC. Registo a posição das amostras colocadas em uma bandeja de autosampler.
4. Preparação de amostras de controle de qualidade (QC)
- Espetar o meio de cultura pré-tratamento de carvão (preparado em um tubo centrífugo de 1,5 ml) com 0,75 μL de solução 0,1 g/L 3NT e padrões de quatro kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) em uma concentração selecionada da faixa linear das curvas de calibração. Mantenha o volume final da amostra em 150 μL.
NOTA: Se for o caso, prepare várias amostras de QC em diferentes concentrações que caem sob a faixa linear da curva de calibração. - Siga o protocolo descrito na seção 3 (etapas 3.2-3.11).
5. Configuração do sistema LC-MS
- Preparar os solventes de fase móvel: Solvente A: formato de amônio de 20 mmol/L em água ultrauso (pH 4.3 ajustado com ácido fórmico); Solvente B: 100% acetonitrila.
NOTA: Use apenas garrafas de vidro borossilicato. Enxágüe garrafas com água ultrauso antes de reabaste farpá-la. Não use garrafas limpas com detergentes.
ATENÇÃO: A acetonitrila causa graves efeitos na saúde ou morte. É facilmente inflamado pelo calor. Líquido de acetonitrila e vapor podem irritar olhos, nariz, garganta e pulmões.- Prepare 5 soluçãos de estoque mol/L de formato de amônio dissolvendo um reagente cristalino (15,77 g) em 50 mL de água ultrapura em uma garrafa de vidro. Mexa até que todos os resíduos se dissolvam. Filtre através da membrana de 0,45 μm para remover quaisquer detritos residuais (por exemplo, usando um filtro de seringa de nylon). Armazene a solução de estoque a 4 °C.
- Prepare o Solvente A adicionando 4 mL de 5 formatos de amônio mol/L na água até 980 mL de água ultrauso em uma garrafa de vidro âmbar e mexa bem. Mergulhe uma barra de agitação e coloque a garrafa com o solvente em um agitador magnético. Mergulhe um eletrodo pH na solução e controle o pH em agitação. Adicionar solução de estoque de ácido fórmico (98%-100%) dropwise usando uma pipeta automática com ponta de 0,2 mL para obter pH 4.3, ajuste o volume até 1 L com água ultrauso e mexa bem.
NOTA: Prepare os solventes pelo menos uma vez por semana para evitar qualquer crescimento microbiano.
ATENÇÃO: O ácido fórmico (FA) é tóxico quando inalado, causa queimaduras na pele e danos oculares. Trabalhe sob o capô da fumaça; usar luvas de proteção e casaco. - Filtre todas as soluções através da membrana de 0,22 μm (por exemplo, filtro de seringa de nylon) para remover quaisquer detritos residuais. Opcionalmente, use os filtros de entrada de solventes dedicados aos reservatórios de solventes LC para proteger o sistema contra partículas de entrada.
- Inicie o software de controle e aquisição de dados LC-MS.
- Purgue o sistema LC com a fase móvel para remover bolhas e para preparar todos os canais de solvente.
- Ensemble uma coluna de guarda para proteger a coluna analítica de entupimento.
- Lave a coluna de proteção e analítica (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) com acetonitrilo de 100% por cerca de 30 min e, em seguida, com 100% de solvente A até que se observe uma pressão estável na coluna. Controle o desempenho do sistema usando o software de controle.
- Defina os parâmetros LC apropriados no software de aquisição de dados.
- Configurar o programa de gradiente: 0-8 min solvente B 0%; 8-17 min solvente B 0-2%; 17-20 min solvente B 2%; 20-32 min solvente B 10-30%; 32-45 min solvente B 0%.
- Defina a taxa de fluxo de fase móvel em 0,15 mL/min, o tempo total de execução da análise por 45 minutos, a temperatura da coluna a +40 °C e o volume de injeção a 10 μL.
- Defina os parâmetros de aquisição do detector de espectrometria de massa.
- Aplicar parâmetros de ionização: monitoramento de íons únicos (SIM), ionização positiva, pressão nebulizadora de 50 psi, +350 °C de temperatura do gás seco, fluxo de gás seco de 12 L/min e tensão capilar de 5500 V.
- Selecione os íons de monitoramento de analitos: para 3HKyn m/z 225.0 (período de varredura: 2-6 min, tensão fragmentor: 100 V); para Kyn m/z 209.0 (período de varredura: 6-12 min, tensão fragmentor: 80 V); para 3HAA m/z 154,0 (período de varredura: 12-18 min, tensão fragmentor: 80 V); para 3NT m/z 227,0 (período de varredura: 18-23 min, tensão fragmentor: 100 V); para XA m/z 206,0 (período de varredura: 23-45 min, tensão fragmentor: 100 V).
- Construa uma lista de trabalho e execute amostras no sistema LC.
- Inicialmente, antes da análise das amostras experimentais, execute uma amostra em branco (Solvente A) pelo menos em triplicados, seguida por uma amostra de QC.
- Abra o software de análise de dados e carregue os resultados obtidos para a amostra de QC.
- Verifique a posição dos picos de analito no cromatograma. Quando os sinais mudam além da posição esperada, ajuste os portões de tempo para coleta adequada de sinais analitos. Consulte o manual de software para instruções sobre integração de sinal.
6. Construindo a curva de calibração
- No software de aquisição de dados, adicione padrões de calibração na lista de trabalho e execute os padrões em triplicados.
- Integre e meça a área de pico correspondente a 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT e XA no tempo de retenção de cerca de 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min e 30 min, respectivamente.
- Construa curvas de calibração individuais para cada metabólito usando um programa de planilha.
- Para criar o gráfico de calibração, plote o valor para uma razão de área de pico de analito sobre a área de pico de 3NT versus a concentração do analito.
- Analise a amostra em branco (meio de cultura pré-tratada de carvão e apenas com 3NT) para garantir que não haja vestígios dos analitos estudados no meio. Caso contrário, subtraia o valor obtido de cada ponto de calibração.
- Verifique a linearidade de cada curva de calibração.
- Individualmente, para cada analito, crie uma equação linear de interceptação de inclinação (y = ax +b), onde y corresponde à razão da área de pico de analito versus área de pico de 3NT, a é a inclinação, x é a concentração de analito (μmol/L), e b refere-se à interceptação da curva. Traçar o gráfico 'y' versus 'x' gerará a curva de calibração.
- Adicione uma linha de tendência linear ao gráfico, exiba a equação da curva de calibração e o coeficiente de regressão no gráfico. Certifique-se de que o coeficiente de regressão é > 0,990. Em caso de padrões de calibração incompatíveis, prepare-os e/ou analise-os mais uma vez. Opcionalmente, altere a faixa de concentração da curva de calibração.
- Analise as amostras de QC para verificar o desempenho do sistema antes de analisar as amostras experimentais. Em caso de incompatibilidade (± desvio de 20% do valor de referência), prepare as novas curvas de calibração.
7. Cultura celular in vitro e coleta de amostras para análise
- Placa das células cancerígenas estudadas (MDA-MB-231 ou SK-OV-3) em DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) contendo 4,5 g/L de glicose, 10% (v/v) soro bovino fetal (FBS), 2 mmol/L e 1 U penicilina/estreptomicina e cultura a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% CO2 para expandi-los para o experimento. Passagem das células em 80% de confluência.
- Desprender células do prato de cultura usando trippsina, semente para o experimento em placas de 12 poços a uma densidade de 0,3 × 106 células por poço e colocar em uma incubadora durante a noite.
- No dia seguinte, aspire o meio de cultura e adicione DMEM fresco com ou sem a adição dos compostos estudados, dependendo do desenho experimental.
- Após 48 h, colete o meio de cima das células (cerca de 500 μL) em um tubo de 1,5 mL. Centrífuga a 14.000 x g por 5 min para remover qualquer detrito celular. Colete o supernatante e armazene a -80 °C até a análise.
- Salve a pelota celular do passo 7.4 para estimativa de proteína. Congele as amostras a -20 °C.
NOTA: Os resultados obtidos para um meio de diferentes poços devem ser normalizados ao conteúdo proteico total para explicar a variabilidade do número celular em poços individuais. A concentração proteica pode ser avaliada conforme descrito na etapa 9.
8. Prepare amostras para análise de LC-MS
- Descongele a amostra congelada à temperatura ambiente e misture bem. Transfira 149,25 μL do meio de cultura para um tubo de centrifugação (1,5 mL).
- Adicione 0,75 μL de 0,1 g/L de solução 3NT (padrão interno). Feche bem os tubos e vórtices.
- Adicione 150 μL de metanol refrigerado a -20 °C contendo 1% (v/v) FA para desproteinização da amostra. Feche bem os tubos e vórtices.
- Continue com a preparação da amostra conforme descrito na seção 3 (etapas 3.3-3.11).
NOTA: Algumas células cancerígenas como SK-OV-3 secretam grandes quantidades de Kyn em um meio cultural. Para encaixar os dados em uma faixa linear da curva de calibração, é necessária aproximadamente 100 vezes a diluição da amostra. Neste caso, diluir uma porção da amostra com 0,1% (v/v) FA na água e analisar, além da amostra não diluída. As amostras de referência das normas para a curva de calibração devem ser preparadas em meio de cultura completa diluída 100 vezes. Alternativamente, adicione mais pontos na curva de calibração (se for possível a solubilidade e a linearidade adequadas) para ajustá-la ao nível de concentração de Kyn na amostra experimental. - Analise as amostras por LC-MS conforme descrito na seção 5. Construa uma lista de trabalho e execute cada amostra em triplicado.
- Após a conclusão da lista de trabalho, meça a área de pico do analito.
- Gere uma planilha usando o software disponível e obter dados numéricos.
- Em uma coluna de planilha, calcule a razão da área de pico de analito sobre a área de pico de 3NT.
- Use uma equação de calibração linear individual dedicada para cada analito (a partir da etapa 6.3.) para calcular as concentrações de analitos presentes nas amostras experimentais.
9. Avaliação do conteúdo proteico e da normalização dos dados
- Resuspende a pelota celular a partir da etapa 7.5 com 100 μL de soro fisco tamponado de fosfato (PBS) em tubo de 1,5 mL.
NOTA: Prepare a solução PBS dissolvendo 8 g de cloreto de sódio, 0,2 g de cloreto de potássio, 1,44 g de fosfato de sódio dibasic, fosfato de dihidrogênio de potássio em 950 mL de água ultrapura. Mexa bem. Ajuste o pH para 7,4 com ácido clorídrico (dropwise). Ajuste o volume até 1 L com água ultrapura. Mexa bem até ficar homogêneo.
ATENÇÃO: O ácido clorídrico é altamente corrosivo e deve ser manuseado com precauções de segurança adequadas. O contato com a pele humana pode causar vermelhidão, dor, queimaduras na pele. Trabalhe sob o capô da fumaça; usar luvas de proteção e casaco. - Congele as amostras a -20 °C e descongele no gelo. Repita esta etapa 3x.
- Centrifugar as amostras a 14.000 x g por 15 min a 4 °C. Colete os supernantes nos novos tubos. Não perturbe a pelota.
- Diluir os supernantes 10x com PBS.
- Construa uma curva de calibração de 0 a 2 μg da proteína por faixa de poço.
- Prepare a solução padrão de albumina de soro bovino (BSA) para a calibração. Dissolva 1,23 μg de BSA em 1 mL de água ultrauso e bem vórtice.
- Em uma placa de 96 poços, carregue diferentes quantidades de solução padrão BSA (1,23 μg/mL): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
- Encha o poço com PBS até o volume final de 50 μL.
- Carga 10 - 15 μL de lise celular a partir da etapa 9.4 na mesma placa de 96 poços. Encha os poços com PBS para chegar ao volume final de 50 μL.
NOTA: Se necessário, ajuste o volume da alíquota de lisato celular em cada poço para caber na faixa linear da curva de calibração. Mantenha o volume final a 50 μL da amostra por poço. - Adicione 200 μL de um reagente Bradford (diluído 5 vezes com água ultrauso) a cada poço.
- Incubar o patê de 96 poços por pelo menos 5 minutos em temperatura ambiente. Insira a placa em um leitor de microplacão. Medir a absorvância em λ = 595 nm.
- Construa uma curva de calibração usando um programa de planilha. Plote a quantidade BSA (μg) versus absorvância. Adicione uma linha de tendência linear, exiba a equação da curva de calibração e o coeficiente de regressão no gráfico.
- Use a equação linear (y = ax +b, onde y corresponde à absorvância em λ = 595 nm, a é a inclinação, x é um teor proteico (μg), e b refere-se à interceptação curva) para calcular a quantidade de proteína na amostra.
NOTA: Considere um fator de diluição amostral nos cálculos. - Use o teor de proteína estimado para normalizar a quantidade de kynurenina na amostra por 1 mg de proteína. Para isso, divida a concentração de kynurenines determinada na etapa 8.9 com o teor total de proteínas da etapa 9.10.
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Representative Results
A LC-MS apresenta vantagens indiscutíveis na quantificação de moléculas biologicamente ativas, embora alguns componentes de espécimes complexos causem os chamados efeitos matriciais e comprometam a ionização dos analitos. Leva à supressão de íons ou ao aprimoramento de íons, diminuindo fortemente a precisão e afetando um limite de detecção/quantificação de LC-MS, que é considerado como um ponto ''fraco' do método. Em nosso protocolo, os íons são gerados pela ionização eletrospray (ESI) no modo positivo, que também foi empregado em outros estudos sobre a determinação de metabólitos Trp13. O ESI, no entanto, é mais propenso a efeitos matriciais do que a ionização química de pressão atmosférica (APCI)28. Assim, para quantificação precisa de metabólitos Trp em um meio de cultura celular, utilizamos uma calibração padrão interna e matricial compatível com a matriz para compensar os efeitos dependentes da matriz no sinal analito e corrigir a perda dos compostos alvo durante uma etapa de preparação da amostra. Aplicamos o mesmo padrão interno (3NT) para todos os analitos estudados (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA). 3NT não foi encontrado no meio original fresco usado para cultivo de células e mostra um comportamento semelhante como compostos-alvo sob as condições analíticas aplicadas. Isso faz do 3NT o padrão interno apropriado27. Além disso, para simplificar o protocolo, a fim de torná-lo mais acessível a um amplo grupo de usuários, propomos apenas uma etapa de preparação amostral envolvendo remoção de proteínas por tratamento com metanol contendo 1% (v/v) FA.
Dentro do protocolo apresentado, recomenda-se preparar as curvas de calibração utilizando o meio completo utilizado para a cultura celular. No entanto, o meio de cultura pode conter kyn endógeno que perturba a estimativa adequada da área de pico de analito, especialmente nas soluções de calibração em baixas concentrações. A Figura 1A ilustra os resultados da LC-SQ obtidos durante a análise do DMEM contendo 4,5 g/L D-glicose (DMEM-HG) e 10% (v/v) FBS utilizados pelo nosso grupo para uma cultura celular cancerosa. Descobrimos que o meio de cultura completa fresco contém inicialmente alguns Kyn que podem ser removidos por purificação com carvão ativado(Figura 1B). Ao analisar as amostras experimentais, o meio de cultura DMEM-HG completo também foi analisado como uma amostra de controle, e a área de pico de Kyn foi subtraída da área de pico registrada para Kyn em cada amostra testada.
Figura 1: Resultados representativos lc-SQ de meio de cultura DMEM-HG completo (A) antes e (B) após o pré-tratamento em carvão ativado. Amostras de meio de cultura foram cravadas com a mesma quantidade do padrão interno (3NT). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Na etapa seguinte, foi estabelecido um tempo de retenção para cada analito alvo (ver um cromatograma na Figura 2A). A boa prática na análise LC-MS é executar uma amostra de QC antes das amostras reais para confirmar os tempos de retenção apropriados dos analitos. Ocasionalmente, uma mudança nos sinais de LC pode ser observada, e incompatibilidades tendem a acontecer. A Figura 2B mostra uma pequena mudança nos tempos de retenção dos analitos, o que, no entanto, não perturba as medidas corretas. Por outro lado, a Figura 2C apresenta uma mudança significativa na posição dos picos alvo. Como visto, o sinal 3NT foi significativamente deslocado para um tempo de retenção mais curto e saiu do portão de tempo definido. Neste caso, uma análise quantitativa adequada era impossível porque o sinal padrão interno não pode ser medido corretamente. Isso pode ser devido a vários fatores, ou seja, equilíbrio insuficiente da coluna, mistura incorreta dos solventes na bomba, uso de diluente amostra inadequado ou contaminação da fase estacionária da coluna. Figura 2D,no entanto, representa uma situação, quando os picos registrados sofrem de intensidades severamente baixas. Isso pode ser resultado de uma falha de injeção, um vazamento no sistema ou danos em MS. Além disso, os componentes da matriz de co-eluição podem gerar íons com m/z selecionados para os analitos de destino, como na Figura 3A,onde o resultado da análise do meio de cultura de células MDA-MB-231 é mostrado. No tempo de retenção de cerca de 25 min, observou-se um sinal forte derivado de um componente de matriz desconhecida (composto X). O pico aparece no período de varredura, quando o íon de m/z 206 (selecionado para XA) foi monitorado. No entanto, este sinal não corresponde ao analito devido à incompatibilidade do tempo de retenção. Para evitar erros durante a integração de pico, também é recomendada uma comparação do tempo de retenção com aquele registrado para amostras de QC.
Figura 2. Exemplos de resultados corretos e incorretos. Os cromatógrafos corretos da análise da amostra DE QC em (A) médio e (B) baixos níveis de concentração registrados em dias diferentes. Exemplo do cromatógrafo incorreto resultante de mudança significativa nos tempos de retenção dos analitos (C) e intensidades insatisfatórias dos picos(D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Resultados representativos do meio cultural coletados de diferentes linhas de células cancerosas. Foi analisado o meio cultural das células(A)MDA-MB-231 (câncer de mama humano) e(B)SK-OV-3 (câncer de ovário humano). O composto X indica o sinal de um composto desconhecido presente no meio de cultura que co-elutes com o analito e ioniza para formar um íon com m/z selecionado para o analito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O meio de cultura utilizado para células cancerígenas (DMEM) contém quantidades significativas de Trp. Seu isótopo (13C-Trp) compartilha o mesmo íon que XA(m/z 206) e pode interferir na determinação da XA. No entanto, sob as condições cromatográficas aplicadas, o sinal de Trp é bem separado do sinal XA. Portanto, concluímos que o Trp presente no DMEM não afeta a quantificação e a precisão do método XA (Figura 4).
Figura 4. Posição de sinais de triptofano (Trp) e ácido xanthurênico (XA) no cromatógrama ms. As soluções padrão de Trp (49,0 μmol/L) e XA (48,8 μmol/L) foram preparadas em Solvente A (formato de amônio de 20 mmol/L em água, pH 4.3) em condições otimizadas LC-SQ. Os íons de m/z 205 (correspondentes a [Trp+H]+) e m/z 206 (correspondentes a [XA+H]+) foram monitorados para Trp e XA, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O método analítico apresentado passou com sucesso no teste de validação em termos de linearidade, precisão (coeficientes de variação ≤15%), precisão (96-104%), recuperação (96-119%) e efeitos matriciais para todos os analitos, como foi descrito detalhadamente em nosso artigo anterior 27.
Finalmente, confirmamos a aplicação da abordagem analítica descrita a um meio coletado das células cancerígenas humanas in vitro. Nossos dados confirmaram que um nível de kynurenines pode variar significativamente em um meio de cultura coletado de diferentes tipos de células(Figura 3). Analisamos o meio cultural de 2 tipos de linhas de câncer, ou seja, células MDA-MB-231 e SK-OV-3 derivadas do câncer de mama e ovário, respectivamente. As linhas selecionadas são frequentemente usadas como modelos para estudar eventos moleculares e para testes de drogas anticâncgenas. Como observamos, as células cultivadas em um meio padrão de controle liberaram diferentes quantidades de metabólitos triptofanos, ou seja, as células MDA-MB-231 liberaram uma quantidade quantificável de Kyn e XA em baixa concentração de nmol/L(Figura 3A),enquanto as células SK-OV-3 mostraram significativamente mais Kyn, secreção muito baixa de XA, e nenhuma secreção de outras kynurenines estudadas como indicado pela intensidade dos picos correspondentes(Figura 3B).
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Discussion
Este artigo apresenta um protocolo LC-SQ detalhado para a quantificação simultânea de quatro principais metabólitos Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) que são medidos em um meio a partir de células cancerígenas humanas in vitro cultivadas. Atenção especial é dada à preparação da amostra, procedimento de espectrometria cromatográfica/de massa e interpretação dos dados, os pontos mais importantes dentro da análise.
Em geral, a análise da LC-MS, devido à alta sensibilidade, requer os mais altos padrões de rigor de protocolo e pureza dos materiais usados. Refere-se a uma aplicação de vidros limpos e devidamente lavados, bem como produtos químicos de alto grau durante todo o procedimento padrão. É muito importante usar solventes à base de água doce de uma fase móvel para evitar a contaminação microbiana que nesta abordagem sensível pode afetar drasticamente a análise. Antes de injetar em um sistema LC, as amostras analisadas precisam ser cuidadosamente examinadas para a presença de quaisquer partículas insolúveis. É importante notar que a coluna deve ser suficientemente equilibrada antes da análise da amostra. O não cumprimento dessas regras pode resultar na contaminação das amostras, do sistema LC e da coluna analítica ou na ionização amostral insuficiente na fonte ms, causando finalmente uma mudança de sinais.
Há 2 pontos-chave dentro do protocolo que precisam ser enfatizados para obter resultados ótimos. A parte mais crítica no protocolo apresentado é a etapa de preparação da amostra. O uso de um procedimento inadequado causa perda de compostos-alvo e, consequentemente, quantificação imprecisa. Em nossa abordagem, durante o desenvolvimento do método, a etapa de preparação da amostra foi cuidadosamente otimizada juntamente com a seleção do solvente para remoção de proteínas. Como determinamos, o tratamento amostral com metanol contendo 1% (v/v) ácido fórmico rendeu as melhores recuperações para todas as kynureninas estudadas. Também foi avaliado o impacto da composição de fase móvel na extensão da ionização de analitos. Verificamos as fases móveis constituídas por 0-20 mmol/L formato de amônio ou acetato de amônio em diferentes pH ajustados com ácido fórmico ou acético. A fase móvel contendo formato de amônio de 20 mmol/L na água (pH 4.3, solvente A) e acetonitrilo (solvente B) proporcionou as melhores condições possíveis para a quantificação simultânea de Kyn, 3HKyn, 3HAA e XA27. Outro passo importante na análise do LC-MS é o pico de integração. Algumas kynurenines ocorrem em uma amostra em níveis de concentração muito baixos. Neste caso, os sinais de co-eluição de compostos podem se sobrepor ao sinal de analito de destino ou gerar um pico em um tempo de retenção semelhante. Um usuário inexperiente deste método pode encontrar algumas dificuldades com uma integração de pico correta, conforme exemplificado na Figura 2C. Assim, verificar o tempo de retenção dos analitos e comparar com uma amostra de QC é necessário e altamente recomendado.
Uma boa prática analítica inclui a seleção de um padrão interno adequado para uma análise quantitativa. Aqui, propomos uma abordagem simples e econômica usando apenas um padrão interno (3NT) como análogo de quatro kynurenines. Os resultados confirmaram que o 3NT apresenta comportamento cromatográfico semelhante aos compostos alvo e, consequentemente, permite alcançar uma boa precisão e precisão do método27. Sob as condições de LC aplicadas, o pico 3NT é bem separado dos sinais dos outros analitos e fácil de medir. Percebemos que as normas internas isototónicas (ILIS) utilizadas nessas análises14,15 proporcionarão melhor compensação dos efeitos matriciais e melhor controle de todas as variáveis que podem levar a resultados falsos. Por outro lado, os ILISs para todos os analitos de destino nem sempre estão facilmente disponíveis, muito menos seu alto custo. Além disso, os ILISs são dedicados ao modo LC-MS/MS do que ao LC-SQ com o modo SIM (Single Ion Monitoring, monitoramento de íons único) que empregamos neste artigo.
O uso do 3NT como padrão interno pode ser considerado aqui como uma limitação do método devido à possibilidade de formação de 3-nitrotyrosina nas proteínas29. No entanto, no caso de um meio de cultura, não observamos nenhuma 3-nitrotyrosina endógena livre. Ele nos permite reconhecer o 3NT como um padrão interno adequado. No entanto, recomendamos uma avaliação prévia de um nível inicial endógeno de 3NT, especialmente quando se estuda outros tipos de células do que testados neste relatório.
Em resumo, ao selecionar um analógico de qualquer analito, é preciso considerar muitas características, por exemplo, similaridade química e ausência inicial em uma matriz amostral. Além disso, uma estabilidade do padrão interno analógico em uma matriz amostral, sua eficiência de recuperação e ionização na presença de componentes matriciais pode diferir dos compostos alvo. Assim, todas essas características devem ser consideradas e cuidadosamente investigadas durante o desenvolvimento do método.
O sistema analítico no método apresentado composto por um detector de MS permitiu atingir baixos limites de detecção (0,0033 – 0,0108 μmol/L)27. Assim, medições simultâneas de 3HKyn, Kyn, 3HAA, XA dentro das faixas de concentração de 0,018 - 4,46 μmol/L, 0,0096 - 3,84 μmol/L, 0,033 - 13,06 μmol/L, e 0,019 – 4,87 μmol/L, respectivamente, foi alcançado. A principal limitação de qualquer análise LC-SQ está associada a uma separação adequada dos componentes amostrais em uma coluna LC. A má separação contribui para a menor seletividade em comparação com a detecção com uma espectrometria de massa quadrupole tandem utilizando íons de produto e modo de Monitoramento de Reação Múltipla (MRM). Para evitar interferências de outros componentes matriciais que compartilham os mesmos íons ou similares com uma molécula-alvo, as condições de separação da LC devem ser cuidadosamente otimizadas. Como exemplo, isótopo de 13C Trp (presente em quantidades de traço) gera o mesmo íon de m/z 206 selecionado para monitoramento XA. A má interpretação foi evitada aqui pela otimização das condições cromatográficas e separação satisfatória de Trp e XA eluidas da coluna(Figura 4).
Nos aplicativos futuros, algumas modificações no protocolo podem ser implementadas. Um usuário em potencial pode modificar uma concentração do padrão interno (3NT) quando os níveis de kynurenines estudados devem cair e as concentrações aqui apresentadas. É importante ressaltar que a concentração de 3NT deve ser a mesma tanto nos padrões de calibração quanto nas amostras experimentais. No caso de um nível de analito extremamente alto, como kyn observado em células SK-OV-3, recomendamos trabalhar com uma maior concentração de 3NT. Se for necessária a diluição da amostra, ela será feita na etapa final do protocolo, antes da injeção amostral na coluna LC.
Na literatura, existem alguns protocolos propostos para a análise quantitativa LC-MS/MS de kynurenines em um meio cultural de diferentes células. Um protocolo fornece uma determinação simultânea de 3 metabólitos, ou seja, Kyn, 3HKyn e 3HAA, mas é menos sensível (limite de quantificações (LOQ) em níveis mais elevados), em contraste com o nosso método21. Outro relatório apresentou um método que permite quantificação de 4 kynurenines, incluindo Kyn, 3HKyn, 3HAA e XA com LOQs semelhantes25. Nenhum deles, no entanto, foi otimizado para a detecção de kynurenines geradas por células cancerígenas in vitro cultivadas. Os componentes de uma matriz amostral influenciam a ionização de analitos na fonte de MS, diminuindo ou aumentando o sinal, que é uma causa de resultados não confiáveis. Para obter dados mais precisos, propusemos o uso de um padrão interno analógico (3NT) em combinação com uma calibração combinada com matriz para uma melhor compensação dos efeitos dependentes da matriz.
Utilizando a metodologia apresentada, observou-se que kyn foi o metabólito Trp mais abundante em um meio de cultura coletado dos tipos de células cancerígenas analisadas, enquanto os outros metabólitos estudados sob condições de cultura de controle não foram detectados (excluindo XA presente em traços, mas quantidades detectáveis). No entanto, quando as células foram estimuladas com um potente ativador imunológico – lipopólise bacteriana, uma quantidade maior de XA além de Kyn foi secretada. Por outro lado, os 3HKyn e 3HAA detectados que são formados a montante de XA dentro de KP ainda estavam sob LOQ27. Isso sugere que alguns metabólitos KP presentes em pequenas quantidades em um meio de cultura podem ser difíceis de medir usando a abordagem LC-SQ proposta. No entanto, o protocolo apresentado é útil para identificar alterações no KP por quantificação dos metabólitos Trp de chave acumulados. A contratação dessa metodologia em estudos futuros para engajar um sistema de cultura celular in vitro fornecerá novos biomarcadores de doenças imunológicas e câncer. Nossa abordagem traz um ensaio validado e confiável com sensibilidade relevante para modelos celulares que são desafiadores devido às baixas concentrações dos metabólitos KP a jusante. As instruções fornecidas permitirão que pesquisadores de diferentes áreas utilizem essa abordagem para quantificação de grandes kynurenines relacionadas ao câncer e outras doenças. Nossos dados (inéditos) mostram que é útil para estudar a modulação de KP em células expostas a diferentes produtos de glicação, mas também deve encontrar uma aplicação em outros campos de pesquisa e doenças com componente imunológico, ou seja, em biologia endométrio e reprodução30.
O protocolo apresentado pode ser expandido ainda mais para determinar analitos adicionais que podem se acumular em um meio de cultura durante diferentes condições experimentais. Os padrões de referência adequados dos analitos devem ser utilizados para validação do método em termos de precisão, precisão, linearidade, recuperação ou seletividade antes de serem utilizados para análises quantitativas. Futhermore, dependendo do propósito de pesquisa, o protocolo pode ser usado para kynurenines individuais (3HKyn, Kyn, 3HAA ou XA). Neste caso, os íons correspondentes a compostos que não são considerados para análise, podem ser removidos das configurações de MS. As alterações adequadas no programa de gradiente LC ajudarão no corte no tempo de análise.
Ao estudar KP, é relevante avaliar a atividade da enzima IDO. Isso pode ser estimado simplesmente medindo o consumo de Trp e a liberação de Kyn em um meio de cultura ou calculando uma taxa de concentração kynurenine-triptofano ([Kyn]/[Trp])31. Em nossa abordagem, não medimos uma concentração de Trp, no entanto, o protocolo pode ser expandido adicionando este alvo na análise LC-SQ. Como uma abordagem mais bioquimicamente apropriada, recomendamos expressar a atividade enzimática ido como uma quantidade de Kyn produzida por células por miligrama de proteína por minuto como apresentado em outros lugares32. Notamos uma vantagem em usar essa abordagem em nossos outros estudos sobre células cancerosas (manuscrito em preparação) e recomendamos este método ao usar o modelo de cultura celular in vitro.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela União Europeia do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional no âmbito do Programa Operacional Desenvolvimento da Polônia Oriental 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), pela Faculdade de Biotecnologia e Ciências Ambientais da Universidade Católica John Paul II de Lublin (Young Scientists grant for Ilona Sadok), Centro Nacional de Ciências Poloneses, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 para Magdalena Staniszewska, Pesquisadora-Princípio). Os autores agradecem ao Prof. Agnieszka Ścibior, do Laboratório de Estresse Oxidativo, Centro de Pesquisa Interdisciplinar, JPII CUL por compartilhar os equipamentos para cultivo celular e quantificação de proteínas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
| Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
| Analytical balance | Ohaus | ||
| Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
| Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
| Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
| Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
| Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
| Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
| Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
| Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
| Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
| Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
| Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
| Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
| Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
| See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
| Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
| Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
| Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
| Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
| Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
| Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
| Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
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