Summary
Описано здесь протокол для определения четырех различных триптофан метаболитов, генерируемых в кюнуренин пути (кинуренин, 3-гидроксикинуренин, ксантуреновая кислота, 3-гидроксиантраниловая кислота) в среде, собранной из раковых клеток культур, анализируемых жидкой хроматографии в сочетании с одной четырехугольной массы спектрометрии.
Abstract
Квинуренин путь и триптофан катаболиты называется kynurenines получили повышенное внимание за их участие в иммунной регуляции и биологии рака. Анализ культуры клеток in vitro часто используется, чтобы узнать о вкладе различных триптофан катаболитов в механизм болезни и для тестирования терапевтических стратегий. Среда клеточной культуры, богатая секретными метаболитами и сигнальными молекулами, отражает состояние метаболизма триптофана и других клеточных явлений. Новые протоколы для надежной количественной оценки нескольких кюнуренов в сложной среде культуры клеток желательно, чтобы обеспечить надежный и быстрый анализ нескольких образцов. Это может быть достигнуто с помощью жидкой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Этот мощный метод используется во многих клинических и исследовательских лабораториях для количественной оценки метаболитов и может быть использован для измерения кюнуренов.
Здесь представлено использование жидкой хроматографии в сочетании с одной четырехугольной масс-спектрометрией (LC-S) для одновременного определения четырех кинуренинов, т.е. кюнуренина, 3-гидроксикинуренанина, 3-гидроксиантраницила и ксантуреновой кислоты в среде, собранной из раковых клеток в пробирке. Детектор S'S прост в использовании и дешевле по сравнению с другими масс-спектрометрами. В анализе СЗ-МС несколько ионов из выборки генерируются и отделяются в соответствии с их конкретным соотношением массы к зарядке(м/з),а затем обнаружением с использованием режима единого ионного мониторинга (SIM).
В настоящем документе обращается внимание на преимущества зарегистрированного метода и указываются некоторые слабые стороны. Основное внимание уделяется важнейшим элементам анализа LC-S, включая подготовку образца, а также хроматографию и анализ масс-спектрометрии. Обсуждаются также вопросы контроля качества, калибровки методов и вопросов матричного эффекта. Мы описали простое применение 3-нитротирозина как один аналоговый стандарт для всех целевых аналитов. Как подтверждают эксперименты с яичниками человека и раковыми клетками молочной железы, предлагаемый метод LC-S генерирует надежные результаты и может быть дополнительно применен к другим клеточным моделям in vitro.
Introduction
Кинуренин путь (KP) является основным маршрутом триптофан (Trp) катаболизм в клетках человека. Индолеамин-2,3-диоксигеназа (IDO-1) в экстрагепатических клетках является первым и ограничивающим ферментом ХП и преобразует ГРП в N-формаилкинуренин1. Дальнейшие шаги в рамках ХП генерируют другие вторичные метаболиты, а именно кюнуреины, которые обладают различными биологическими свойствами. Кыненин (Kyn) является первым стабильным Trp катаболит, показывающий токсичные свойства и регулирующие клеточные события после связывания с рецептором ариловых углеводородов (AhR)2. Впоследствии, Кын превращается в несколько молекул либо спонтанно, либо в ферментно-опосредованном процессах, генерируя такие метаболиты, как 3-гидроксикинуренин (3HKyn), атраниловая кислота (AA), 3-гидроксианнраниловая кислота (3-HAA), кинуреновая кислота (Kyna) и ксантуриновая кислота (XA). Другой ниже по течению метаболит, 2-амино-3-карбоксимуконовой кислоты-6-semialdehyde (ACMS), проходит не-энзиматической циклизации к хинолиновой кислоты (КА) или пиколиновой кислоты (PA)1. Наконец, КК далее преобразуется в никотинамид-аденин динуклеотид(NAD) 3, метаболит конечных точечных КП, который является важным кофактором фермента. Некоторые кинуренины имеют нейропротекторные свойства, такие как Kyna и PA, в то время как другие, т.е. 3HAA и 3HKyn, являютсятоксичными 4. Ксантуреновая кислота, которая образуется из 3HKyn, представляет антиоксидантные и вазорелаксирующие свойства5. XA накапливается в стареющих линзах и приводит к апоптозу эпителиальных клеток6. ХП, описанная в середине20-го века, получила больше внимания, когда было продемонстрировано ее участие в различных расстройствах. Повышенная активность этого метаболического маршрута и накопление некоторых кинуренинов модулируют иммунный ответ и связаны с различными патологическими состояниями, такими как депрессия, шизофрения, энцефалопатия, ВИЧ, слабоумие, боковой амиотрофический склероз, малярия, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона ирак 4,7. Некоторые изменения в метаболизме ГТО наблюдаются в микроокурениях опухолей и раковыхклетках 2,8. Кроме того, кинуренины считаются перспективными маркерами заболевания9. В исследованиях рака, в пробирке модели культуры клеток хорошо известны и широко используются для доклинковой оценки ответов на противораковыепрепараты 10. Метаболиты Trp выделяется клетками в культурную среду и могут быть измерены для оценки состояния кюнуренина. Поэтому необходимо разработать соответствующие методы одновременного обнаружения как можно большего количеством метаболитов КП в различных биологических образцах с простым, гибким и надежным протоколом.
В этой статье мы описываем протокол для одновременного определения четырех метаболитов кинуренина: Кын, 3HKyn, 3HAA и XA LC-S в пост-культурной среде, собранной из раковых клеток. В современном аналитическом подходе, жидкойхроматографии 13,14,15,16 является предпочтительным для одновременного обнаружения и количественной оценки отдельных триптофан катаболитов, в отличие от биохимических неспецифических анализов с использованием эрлихов реагент11,12. В настоящее время существует множество методов определения кинуренцев в образцах человека, в основном на основе жидкой хроматографии с ультрафиолетовыми илифлуоресцентных детекторами 13,17,18,19. Для этого типа анализа больше подходит жидкая хроматография в сочетании с детектором масс-спектрометрии (LC-MS) из-за их более высокой чувствительности (нижние пределы обнаружения), избирательности и повторяемости.
Грп метаболиты уже определены в сыворотке крови человека,плазмы и мочи 13,20,21,22,23, однако, методы для других биологических образцов, как клеточная культура среды также желательно. Ранее LC-MS использовался для соединений, полученных из ГРП, в среде, собранной после культивирования клеток глиомы человека, моноцитов, дендритных клеток или астроцитов, обработанных интерфероной гаммой (IFN-γ)24,25,26. В настоящее время существует необходимость в новых проверенных протоколах, которые могут позволить оценить несколько метаболитов в различных культурных средствах массовой информации, клетках и лечении, используемых в моделях рака.
Цель разработанного метода заключается в количественной оценке (в пределах одного аналитического запуска) четырех основных кинуренинов, которые могут указывать на аномалии в ХП. Представлены здесь критические шаги нашего недавно опубликованного протокола для количественного анализа LC-S выбранных значимых kynurenines с использованием одного внутреннего стандарта (3-нитротирозин, 3NT) в среде, собранной из в пробирке культурных раковых клетокчеловека 27. К нашим лучшим знаниям, это первый протокол LC-S для одновременной количественной оценки 3HKyn, 3HAA, Kyn и XA в культурной среде, полученной из выращенных в пробирке клеток. При некоторых изменениях, метод может быть дополнительно применен для изучения изменений метаболизма Гто в более широком диапазоне моделей клеточной культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка стандартных 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, стандартных фондовых решений XA
- Взвешивание реагентов во флаконе с наибольшей точностью (0,3 мг каждый). Для лучшей точности, масштабировать реагенты, регулируя объем растворителя в соответствии с шагом 1.2.
- Растворить реагенты в 300 л растворителя для получения стокового раствора 1 г/л. Растворить 3NT в 1% (v/v) мякоть кислоты (FA) в воде; Кын, 3HAA, и XA в диметил сульфоксид (DMSO); 3HKyn в воде подкисленной до рН 2,5 с соляной кислотой (HCl).
ВНИМАНИЕ: 3HAA раздражает глаза, нос, горло и легкие. Вредно при вдыхании, при контакте с кожей, а при проглатывании. Носите соответствующую защиту, т.е. перчатки и маску. - Плотно закройте флакон и поместите его в ультразвуковую ванну на 1 мин, чтобы ускорить растворение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните фондовые растворы при -20 градусов по Цельсию и минимизируем замораживание/оттаивание (максимум 3 цикла) из-за нестабильности фондовых решений.
2. Подготовка древесного угля обработанной среды культуры
- В трубку взвесить 280 мг активированного угля и добавить 5 мл жидкой среды, подготовленной для культивирования клеток, представляющих интерес.
- Встряхните трубку со средним и древесным углем на видимую пилу рокера на 2 ч, при комнатной температуре (установленная скорость до 50 колебаний/мин). Далее центрифуга труб при 6000 х г в течение 15 мин.
- Снимите трубку с центрифуги и тщательно соберите супернатант, не нарушая осадок. Повторите центрифугирование, если это необходимо, чтобы удалить все остатки древесного угля.
- Фильтр супернатант с помощью фильтра шприца 0,45 мкм.
- Убедитесь, что уголь предварительно обработаемой среды культуры лишен следов kynurenines путем запуска экспериментального образца на LC-MS, как описано в шаге 6.3.2. В противном случае повторите шаги 2.1-2.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если полная среда культуры изначально не содержит kynurenines, шаг очистки с использованием древесного угля может быть опущен. В этом случае подготовь стандарты калибровки и образцы контроля качества с использованием полной среды, обычно подготовленной для культивирования клеток. - Храните подготовленную среду при 4 градусов по Цельсию до анализа.
3. Создание калибровочные решения и кривые калибровки
- Спайк уголь предварительно обработанной среды культуры с 0,75 л 0,1 г / л 3NT раствора и добавить четыре стандарта (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) по крайней мере в шести различных концентрациях для покрытия калибровочные диапазоны. Держите окончательный объем каждого образца на уровне 150 йл. Вихрь хорошо. Для подготовки образца используйте трубы центрифуги 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые точки калибровки для 3HKyn: 0.018, 0.045, 0.22, 1.12, 2.23, 4.46 ммоль/л; для Kyn: 0.0096, 0.048, 0.24, 1.20, 2.40, 3.84 ммоль/л; для 3 ГАА: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 ммоль/л; для XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 ммоль/л. - Добавьте 150 мкл холодного метанола (сохраняется при -20 градусов по Цельсию), содержащего 1% (v/v) мимической кислоты в каждую трубку для депротеинизации образца. Плотно закройте трубы и вихрь хорошо.
- Инкубировать образцы при -20 градусов по Цельсию в течение 40 мин.
- Центрифуга образцов при 14000 х г в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию. Снимите трубки с центрифуги. Собирайте супернатанты в новые трубки. Не беспокоить осадок.
- Перенесите 270 МКЛ супернатанта в стеклянный флакон с помощью автоматической пипетки. Положите флаконы в испаритель и осторожно испариться до высыхания. Используйте соответствующую программу для фракций воды/метанола для испарения летучих компонентов. Не применяйте температуру выше 40 градусов по Цельсию и избегайте чрезмерной сушки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плоские нижние стеклянные флаконы, т.е. хроматографические флаконы облегчают более быстрое испарение и более высокие восстановления по сравнению с пластиковыми коническими трубками. - Через 30 минут проверьте состояние испарения. При необходимости продолжайте испарение (например, добавьте еще 10 мин). Избегайте пересушить.
- Снимите флаконы с испарителя. Восстановить каждый образец в 60 МКЛ 0,1% (v/v) мимической кислоты в воде. Добавьте растворитель во флакон, содержащий остаточный материал. Плотно закройте флаконы и вихрь-хорошо.
- Перенесите образец в трубку 1,5 мл и вращайся при 14 000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия, чтобы отделить осажденный белок.
- Не нарушая белковые гранулы, перенесите супернатанты в хроматографические флаконы с коническими стеклянными вставками с автоматической пипеткой. Плотно закройте флаконы.
- Проверьте наличие пузырьков воздуха в флаконе вставки и при необходимости удалите их (например, путем вихря).
- Перенесите хроматографические флаконы, содержащие образцы, в автоамплеер LC. Завехать положение образцов, помещенных в поднос автоамплеера.
4. Подготовка образцов контроля качества (КК)
- Спайк угольной предварительной культуры среды (подготовлен в 1,5 мл центробежной трубки) с 0,75 л 0,1 г / л 3NT раствор и стандарты четырех kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) в одной концентрации, выбранной из линейного диапазона кривых калибровки. Держите окончательный объем образца на уровне 150 МКЛ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если это применимо, подготовьте несколько образцов КК в различных концентрациях, попадающих под линейный диапазон кривой калибровки. - Следуйте протоколу, описанного в разделе 3 (шаги 3.2-3.11).
5. Настройка системы LC-MS
- Подготовка мобильных растворителей фазы: Solvent A: 20 ммоль/л аммония длямата в ультрапурной воде (рН 4.3 с поправкой на formic кислоту); Растворитель B: 100% ацетонитрил.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только борозиликатные стеклянные бутылки. Промыть бутылки с ультрачистой водой, прежде чем пополнить его. Не используйте бутылки, очищенные моющими средствами.
ВНИМАНИЕ: Ацетонитриле вызывает тяжелые последствия для здоровья или смерти. Он легко воспламеняется теплом. Ацетонитриль жидкости и пара может раздражать глаза, нос, горло и легкие.- Приготовьте 5 растворов бульона из аммония, растворив кристаллический реагент (15,77 г) в 50 мл ультрачистой воды в стеклянной бутылке. Перемешать, пока все остатки растворяются. Фильтр через мембрану 0,45 мкм для удаления любого остаточного мусора (например, с помощью фильтра нейлонового шприца). Храните раствор на складе при 4 градусах Цельсия.
- Подготовка Solvent A, добавив 4 мл 5 моль / л аммония formate в воде до 980 мл ультрапурной воды в бутылке янтарного стекла и хорошо перемешать. Погрузите перемешивание бар и положить бутылку с растворителем на магнитной мешалки. Погрузите электрод рН в раствор и контролйте рН под перемешиванием. Добавить раствор запасов formic кислоты (98%-100%) dropwise с помощью автоматической пипетки с 0,2 мл наконечник для получения рН 4,3, настроить громкость до 1 л с ультрапурной водой и хорошо перемешать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте растворители по крайней мере один раз в неделю, чтобы предотвратить рост микробов.
ВНИМАНИЕ: Formic кислоты (FA) является токсичным при вдыхании, вызывает ожоги кожи и повреждения глаз. Работа под капотом дыма; носить защитные перчатки и пальто. - Фильтруем все растворы через мембрану 0,22 мкм (например, фильтр нейлонового шприца), чтобы удалить остаточный мусор. Дополнительно используйте фильтры в входе растворителя, предназначенные для резервуаров растворителя LC для защиты системы от входящих частиц.
- Запустите программное обеспечение для управления LC-MS и сбора данных.
- Очистить систему LC с мобильной фазы, чтобы удалить пузырьки, и премьер всех каналов растворителя.
- Ансамбль гвардейской колонны для защиты аналитической колонки от засорения.
- Промыть защитную и аналитическую колонку (C18, 2,1 x 100 мм, 1,8 мкм) со 100% ацетонитрилом около 30 мин, а затем со 100% растворителем А до тех пор, пока не будет наблюдаться стабильное давление в столбце. Управление производительностью системы с помощью программного обеспечения управления.
- Установите соответствующие параметры LC в программном обеспечении для сбора данных.
- Настройка градиентной программы: 0-8 мин растворителя B 0%; 8-17 мин растворитель B 0-2%; 17-20 мин растворитель B 2%; 20-32 мин растворитель B 10-30%; 32-45 мин растворитель B 0%.
- Установите скорость потока мобильной фазы на уровне 0,15 мл/мин, общее время времени ведения анализа в течение 45 мин, температуру столбца на уровне 40 градусов по Цельсию и объем впрыска в 10 мкл.
- Установите параметры приобретения детектора масс-спектрометрии.
- Применяют параметры ионизации: одиночный ионный мониторинг (SIM), положительная ионизация, давление небулайзера 50 пси, температура сушки газа в 350 градусов по Цельсию, высыхание газового потока 12 л/мин и напряжение капилляров 5500 В.
- Выберите ионы мониторинга аналита: для 3HKyn m/z 225.0 (период сканирования: 2-6 мин, напряжение фрагмента: 100 В); для Kyn m/z 209.0 (период сканирования: 6-12 мин, фрагментарное напряжение: 80 В); для 3 ГАА м/з 154,0 (период сканирования: 12-18 мин, фрагментарное напряжение: 80 В); для 3NT м/z 227.0 (период сканирования: 18-23 мин, фрагментарное напряжение: 100 В); для XA m/z 206.0 (период сканирования: 23-45 мин, фрагментарное напряжение: 100 В).
- Создать рабочий список и запустить образцы на системе LC.
- Сначала, до анализа экспериментальных образцов, запустить пустой образец (Solvent A) по крайней мере в три раза, а затем один образец КК.
- Откройте программное обеспечение для анализа данных и загрузите результаты, полученные для образца КК.
- Проверьте положение аналитных пиков на хроматограмме. При сдвиге сигналов за пределы ожидаемого положения корректируются ворота времени для соответствующего сбора аналитных сигналов. Смотрите руководство по программному обеспечению для обучения интеграции сигналов.
6. Построение кривой калибровки
- В программном обеспечении для сбора данных добавьте стандарты калибровки в рабочий список и запустите стандарты в трилистах.
- Интеграция и измерение пиковой области, соответствующей 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT и XA во время удержания около 4,4 мин, 10 мин, 16 мин, 21 мин и 30 мин, соответственно.
- Создайте индивидуальные кривые калибровки для каждого метаболита с помощью программы электронной таблицы.
- Чтобы создать калибровочную диаграмму, навекрет значение соотношения области аналитного пика над пиковой областью 3NT по сравнению с концентрацией аналита.
- Проанализируйте пустой образец (уголь предварительно обработанный среды культуры шипами только с 3NT), чтобы убедиться, что нет никаких следов изученных анализаторов в среде. В противном случае вычесть полученное значение из каждой точки калибровки.
- Проверьте линейность каждой кривой калибровки.
- Индивидуально, для каждого аналита, создайте линейное уравнение наклона-перехвата (y ax q b), где y соответствует соотношению области пика аналита против 3NT пиковой области, a является склоном, x является концентрацией аналита (змол/л), и b относится к перехвату кривой. Построение графика 'y' по сравнению с 'x' будет генерировать кривую калибровки.
- Добавьте к графику линейную линию тренда, отобразить уравнение кривой калибровки и коэффициент регрессии на графике. Убедитесь, что коэффициент регрессии составляет 0,990 евро. В случае несоответствия стандартов калибровки подготовьтесь и/или проанализируйте их еще раз. Дополнительно измените диапазон концентрации кривой калибровки.
- Проанализируйте образцы КК, чтобы проверить производительность системы, прежде чем анализировать экспериментальные образцы. В случае несовместимости (± 20% отклонения от эталонного значения) подготовьйте новые кривые калибровки.
7. Культура клеток in vitro и сбор образцов для анализа
- Плита изученных раковых клеток (MDA-MB-231 или SK-OV-3) в DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), содержащая 4,5 г/л ᴅ-глюкозы, 10% (v/v) сыворотка крупного рогатого скота плода (FBS), 2 ммоль/л ʟ-глутамин и 1 U пенициллин/стрептомицин и культура при 37 градусах Цельсия во влажной атмосфере 5% CO2, чтобы расширить их для эксперимента. Прохождение клеток на 80% от слияния.
- Отделить клетки от культуры блюдо с помощью трипсина, семян для эксперимента на 12-хорошо пластин при плотности 0,3 × 106 клеток на колодец и место в инкубаторе на ночь.
- На следующий день, аспирировать культуру среды и добавить свежие DMEM с или без добавления изученных соединений, в зависимости от экспериментального дизайна.
- После 48 ч, собирать среду сверху клетки (около 500 МКЛ) в 1,5 мл трубки. Центрифуга при 14 000 х г в течение 5 минут, чтобы удалить любой клеточный мусор. Соберите супернатант и храните при -80 градусов по Цельсию до анализа.
- Сохраните клеточные гранулы от шага 7.4 для оценки белка. Заморозить образцы при -20 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты, полученные для среды из различных скважин должны быть нормализовываются для общего содержания белка для учета изменчивости числа клеток в отдельных скважинах. Концентрация белка может быть оценена как описано в шаге 9.
8. Подготовка образцов для анализа LC-MS
- Оттепель замороженный образец при комнатной температуре и хорошо перемешать. Передача 149,25 МКЛ среды культуры в центрифугированную трубку (1,5 мл).
- Добавьте 0,75 л 0,1 г/л раствора 3NT (внутренний стандарт). Закройте трубы и вихрь хорошо.
- Добавьте 150 МКЛ охлажденного при -20 градусах по Цельсию метанола, содержащего 1% (v/v) FA для депротеинизации образца. Закройте трубы и вихрь хорошо.
- Продолжить подготовку образца, как описано в разделе 3 (шаги 3.3-3.11).
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые раковые клетки, такие как SK-OV-3, выделяет большое количество Кын в культурную среду. Для того чтобы поместить данные в линейный диапазон кривой калибровки, необходимо примерно 100-кратное разбавление образца. В этом случае разбавьте часть образца 0,1% (v/v) FA в воде и проанализируйте в дополнение к неразбавленной выборке. Справочные образцы стандартов для кривой калибровки должны быть подготовлены в 100 раз разбавленной полной среды культуры. Кроме того, добавьте больше точек в кривой калибровки (если будет достигнута надлежащая солучность и линейность), чтобы приспособить ее к уровню концентрации Kyn в экспериментальном образце. - Проанализируйте образцы LC-MS, описанные в разделе 5. Создать рабочий список и запустить каждый образец в тройном.
- После завершения рабочего списка измерьте пиковую площадь аналита.
- Создание электронной таблицы с использованием доступного программного обеспечения и получения численных данных.
- В одной колонке электронной таблицы вычисляйте соотношение области пика аналита над пиковой областью 3NT.
- Используйте индивидуальное уравнение линейной калибровки, предназначенную для каждого анализатора (из шага 6.3.) для расчета концентраций анализаторов, присутствующих в экспериментальных образцах.
9. Оценка содержания белка и нормализации данных
- Повторное использование клеточных гранул из шага 7.5 со 100 йл фосфат-буферного солевого раствора (PBS) в трубке 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор PBS путем растворения 8 г хлорида натрия, 0,2 г хлорида калия, 1,44 г фосфатного дибаза натрия, фосфата калия в 950 мл ультрапурной воды. Хорошо перемешать. Отрегулируйте рН до 7,4 с помощью соляной кислоты (капля). Отрегулируйте объем до 1 л с ультрачистой водой. Хорошо перемешать до однородности.
ВНИМАНИЕ: Гидрохлорная кислота очень коррозионная и должна быть обработана с подходящими мерами предосторожности. Контакт с кожей человека может вызвать покраснение, боль, ожоги кожи. Работа под капотом дыма; носить защитные перчатки и пальто. - Заморозить образцы при -20 градусов по Цельсию, а затем разморозить на льду. Повторите этот шаг 3x.
- Центрифуга образцов при 14 000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия. Соберите супернатанты в новые трубки. Не беспокоить гранулы.
- Разбавить супернатанты 10x с PBS.
- Постройте кривую калибровки от 0 до 2 мкг белка в диапазоне хорошо.
- Подготовка крупного рогатого скота сыворотки альбумин (BSA) стандартное решение для калибровки. Растворите 1,23 мкг BSA в 1 мл ультрачистой воды и вихря хорошо.
- На пластине из 96 колодец загружаются различные количества стандартного раствора BSA (1,23 мкг/мл): 0 МКЛ, 2 хл, 4 л, 5 йл, 7 КЛ, 10 л, 15 л, 20 ОЛ.
- Заполните колодец с PBS до конечного объема 50 йл.
- Нагрузка 10 - 15 йл ячейки лизируют от шага 9,4 на той же пластине 96-хорошо. Заполните скважины с PBS, чтобы достичь конечного объема 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте объем лицатной алициты ячейки в каждом хорошо, чтобы вписаться в линейный диапазон кривой калибровки. Держите окончательный объем до 50 МКЛ образца на колодец. - Добавьте 200 мкл реагента Брэдфорда (разбавленного 5 раз с ультрапурной водой) к каждой колодец.
- Инкубировать 96-хорошо паштет, по крайней мере 5 минут при комнатной температуре. Вставьте пластину в считыватель микропластиров. Мера абсорбции на й 595 нм.
- Создайте кривую калибровки с помощью программы электронной таблицы. Участок BSA количество (мкг) по сравнению с абсорбансом. Добавьте линейную линию тренда, отобразить уравнение кривой калибровки и коэффициент регрессии на графике.
- Для расчета количества белка в образце используйте линейное уравнение (y ax q b, где у соответствует абсорбции в 595 нм, а это склон, х — содержание белка (мкг), а b относится к перехвату кривой).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим фактор разбавления выборки в расчетах. - Используйте предполагаемое содержание белка для нормализации количества кюнуренина в образце на 1 мг белка. Для этого разделите концентрацию кинуренинов, определяемую в шаге 8.9 с общим содержанием белка от шага 9.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LC-MS представляет неоспоримые преимущества в количественной оценке биологически активных молекул, хотя некоторые компоненты сложных образцов вызывают так называемые матричные эффекты и компромиссную ионизацию аналитов. Это приводит к подавлению ионов или повышению ионов, сильно снижая точность и влияя на предел обнаружения/количественной оценки LC-MS, который считается «слабой» точкой метода. В нашем протоколе, ионы генерируются электроспрей ионизации (ESI) в положительном режиме, который также был использован в других исследованиях по Trp метаболитовопределение 13. ESI, однако, более склонен к матричным эффектам, чем химическое ионизация атмосферного давления (APCI)28. Таким образом, для точной количественной оценки метаболитов Trp в среде клеточной культуры мы использовали внутреннюю стандартную и матричную калибровку, чтобы компенсировать матрично-зависимое воздействие на анализный сигнал и исправить потерю целевых соединений во время шага подготовки образца. Мы применили один и тот же внутренний стандарт (3NT) для всех изученных аналитов (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA). 3NT не был найден в оригинальной свежей среде, используемой для культивирования клеток и показывает аналогичное поведение, как целевые соединения в прикладных аналитических условиях. Это делает 3NT соответствующим внутренним стандартом27. Кроме того, чтобы упростить протокол, чтобы сделать его более доступным для широкой группы пользователей, мы предлагаем только один шаг подготовки образца, включающий удаление белка путем лечения метанолом, содержащим 1% (v/v) FA.
В рамках представленного протокола рекомендуется подготовить кривые калибровки с использованием полной среды, используемой для клеточной культуры. Тем не менее, среда культуры может содержать эндогенный Кин, который нарушает надлежащую оценку области аналитного пика, особенно в калибровочные растворы при низких концентрациях. Рисунок 1A иллюстрирует результаты LC-S, полученные в ходе анализа DMEM, содержащего 4,5 г/л D-глюкозы (DMEM-HG) и 10% (v/v) FBS, используемого нашей группой для культуры раковых клеток. Мы обнаружили, что свежий полный среды культуры первоначально содержит некоторые Kyn, которые могут быть удалены путем очистки с активированным углем (Рисунок 1B). При анализе экспериментальных образцов, полная среда культуры DMEM-HG также была проанализирована в качестве контрольного образца, и область пика Кын была вычтена из пиковой области, записанной для Kyn в каждом протестированном образце.
Рисунок 1: Представитель LC-S результаты полного DMEM-HG культуры среды (A) до и (B) после предварительной обработки активированного угля. Образцы среды культуры были шипами с тем же количеством внутреннего стандарта (3NT). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
На следующем этапе было установлено время удержания для каждого целевого анализатора (см. хроматограмму на рисунке 2A). Хорошей практикой в анализе LC-MS является запуск образца КК до фактических образцов для подтверждения соответствующего времени хранения анализов. Иногда наблюдается сдвиг в сигналах LC, и несоответствия, как правило, случаются. На рисунке 2B показано небольшое изменение времени удержания аналитов, что, однако, не нарушает правильных измерений. С другой стороны, рисунок 2C представляет собой значительное изменение положения целевых пиков. Как видно, сигнал 3NT был значительно сдвинут в сторону более короткого времени удержания и вышел из установленных времени ворот. В этом случае соответствующий количественный анализ был невозможен, поскольку внутренний стандартный сигнал не может быть измерен правильно. Это может быть связано с несколькими факторами, т.е. недостаточной эквивалентности столбца, неправильным смешиванием растворителей в насосе, использованием ненадлежащего разбавительного образца или загрязнением стационарной фазы колонки. Рисунок 2D, однако, представляет собой ситуацию, когда зарегистрированные пики страдают от сильно низкой интенсивности. Это может быть результатом сбоя инъекции, утечки в системе или повреждения MS. Кроме того, компоненты матрицы совместного производства могут генерировать ионы с м/з, выбранными для целевых анализов, как на рисунке 3A, где показан результат анализа среды культуры клеток MDA-MB-231. Во время удержания около 25 мин наблюдался сильный сигнал, полученный от неизвестного матричного компонента (соединения X). Пик появляется в период сканирования, когда отслеживался ион m/z 206 (выбранный для XA). Однако этот сигнал не соответствует аналиту из-за несовместимости времени удержания. Чтобы избежать ошибок во время пиковой интеграции, также рекомендуется сравнение времени хранения с тем, которое было записано для образцов КК.
Рисунок 2. Примеры правильных и неправильных результатов. Правильные хроматограммы анализа образцов КК на ( A )средних и( B )низких уровняхконцентрации, зарегистрированных в разные дни. Пример неправильной хроматограммы в результате значительного изменения времени удержания аналитов(C)и неудовлетворительной интенсивности пиков(D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Репрезентативные результаты культурной среды, собранные из различных линий раковых клеток. Культурная среда изклетокMDA-MB-231 (рак молочной железы человека) и(B)SK-OV-3 (рак яичников человека) была проанализирована с помощью LC-S. Соединение X указывает на сигнал неизвестного соединения, присутствуют в среде культуры, которая со-elutes с анализатом и ионизирует, чтобы сформировать ион с м / з выбран для аналита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Культурная среда, используемая для раковых клеток (DMEM), содержит значительное количество Гто. Его изотоп(13C-Trp) имеет тот же ион, что и XA(m/z 206) и может помешать определению XA. Однако при примененных хроматографических условиях сигнал от ГРП хорошо отделяется от сигнала XA. Поэтому мы пришли к выводу, что ГТО, присутствующий в DMEM, не влияет на количественную оценку XA и точность метода(рисунок 4).
Рисунок 4. Положение триптофана (Trp) и ксантуреновой кислоты (XA) сигнализирует о хроматограмме MS. Стандартные растворы Trp (49,0 мкмоль/л) и XA (48,8 мкмоль/л) были подготовлены в растворителях А (20 ммоль/л аммония в воде, рН 4,3) в оптимизированных условиях ЛК-СЗ. Для Trp и XA, соответственно, отслеживались ионы m/z 205 (соответствующие «Trp»H) и m/z 206 (соответствующие «XA»H) . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Представленный аналитический метод успешно прошел тест проверки с точки зрения линейности, точности (коэффициенты вариации ≤15%), точности (96-104%), восстановления (96-119%) и матричных эффектов для всех анализаторов, как это было подробно описано в нашем предыдущем документе 27.
Наконец, мы подтвердили применение описанного аналитического подхода к среде, собранной из культурных раковых клеток человека in vitro. Наши данные подтвердили, что уровень кинуренинов может значительно варьироваться в среде культуры, собранной из различных типов клеток(рисунок 3). Мы проанализировали культурную среду из 2 типов линий рака, таких как MDA-MB-231 и SK-OV-3 клетки, полученные от рака молочной железы и яичников, соответственно. Выбранные линии часто используются в качестве моделей для изучения молекулярных событий и для тестирования на противоопухоливные препараты. Как мы заметили, клетки, культурные в стандартной среде управления, высвобождали различное количество триптофановых метаболитов, т.е. клетки MDA-MB-231 выпустили количественное количество Kyn и XA при низкой концентрации nmol/L(рисунок 3A), в то время как клетки SK-OV-3 показали значительно больше Kyn, очень низкую секрецию XA, и никакой секреции других изученных кинуренинов, как указано на интенсивность соответствующих пиков(рисунок 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем документе представлен подробный протокол LC-S для одновременной количественной оценки четырех основных метаболитов Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA), которые измеряются в среде из в пробирке культурных раковых клеток человека. Особое внимание уделяется подготовке образца, процедуре хроматографической/массовой спектрометрии и интерпретации данных, что является наиболее важным моментом анализа.
В целом анализ LC-MS, благодаря высокой чувствительности, требует самых высоких стандартов протокольной строгости и чистоты использованных материалов. Это относится к применению аккуратно очищенной и правильно промытой стеклянной посуды, а также высококачественных химических веществ на протяжении всей стандартной процедуры. Очень важно использовать растворители на основе пресной воды мобильной фазы, чтобы избежать микробного загрязнения, которое при этом чувствительном подходе может резко повлиять на анализ. Перед введением в систему LC, проанализированные образцы должны быть тщательно изучены на наличие каких-либо нерастворимых частиц. Важно отметить, что столбец должен быть достаточно уравновешен до анализа выборки. Несоблюдение этих правил может привести к загрязнению образцов, системы LC и аналитической колонки или недостаточной ионизации выборки в источнике MS, что, наконец, приведет к сдвигу сигналов.
В протоколе есть два ключевых момента, которые необходимо подчеркнуть, чтобы получить оптимальные результаты. Наиболее важной частью представленного протокола является этап подготовки выборки. Использование неадекватной процедуры приводит к потере целевых соединений и, следовательно, неточной количественной оценке. В нашем подходе, во время разработки метода, этап подготовки образца был тщательно оптимизирован вместе с выбором растворителя для удаления белка. Как мы определили, методическая обработка метанолом, содержащим 1% (v/v) formic кислоты, дала наилучшее восстановление для всех изученных кюнуренов. Оценивалось также влияние состава мобильной фазы на степень ионизации аналитов. Мы проверили мобильные фазы, состоящие из 0-20 ммоль/л аммония formate или ацетата аммония при различных рН, скорректированных с формической или уксусной кислотой. Мобильная фаза, содержащая 20 ммоль/л аммония в воде (рН 4.3, растворитель А) и ацетонитрил (растворитель В) обеспечила наилучшие условия для одновременной количественной оценки Kyn, 3HKyn, 3HAA и XA27. Другим важным шагом в анализе LC-MS является пик интеграции. Некоторые кинуренины встречаются в выборке при очень низких уровнях концентрации. В этом случае сигналы соэлутирования соединений могут перекрываться с целевым сигналом аналита или генерировать пик в аналогичное время удержания. Неопытный пользователь этого метода может обнаружить некоторые трудности с правильной пиковой интеграцией, о чем свидетельствует рисунок 2C. Таким образом, требуется проверка времени хранения для аналитов и сравнение с образцом КК и настоятельно рекомендуется.
Стим-аналитическая практика включает в себя выбор соответствующего внутреннего стандарта для количественного анализа. В этом случае мы предлагаем простой и экономически эффективный подход, используя только один внутренний стандарт (3NT) в качестве аналога четырех кюнуренинов. Результаты подтвердили, что 3NT представляет аналогичное хроматографическое поведение, как целевые соединения и в результате это позволяет достичь хорошей точности и точностиметода 27. В условиях примененного LC 3NT пик хорошо отделен от сигналов других аналитиков и прост в измерении. Мы понимаем, что isotopically помечены внутренние стандарты (ILIS),используемые в таких анализов 14,15 обеспечит лучшую компенсацию матричных эффектов и лучший контроль всех переменных, которые могут привести к ложным результатам. С другой стороны, ILISs для всех целевых аналитиков не всегда легко доступны, не говоря уже об их высокой стоимости. Кроме того, ILISs предназначены скорее для LC-MS/MS, чем LC-S с режимом единого ионного мониторинга (SIM), который мы использовали в этой статье.
Использование 3NT в качестве внутреннего стандарта можно рассматривать здесь как ограничение метода из-за возможности образования 3-нитротирозина набелках 29. Однако, в случае среды культуры, мы не наблюдали каких-либо свободных эндогенных 3-нитротирозин. Это позволит нам признать 3NT в качестве подходящего внутреннего стандарта. Тем не менее, мы рекомендуем предварительную оценку начального эндогенного уровня 3NT, особенно при изучении других типов клеток, чем протестировано в этом отчете.
Таким образом, при выборе аналога любого анализа необходимо учитывать многие особенности, например, химическое сходство и первоначальное отсутствие в матрице образца. Кроме того, стабильность аналогового внутреннего стандарта в матрице выборки, эффективность его восстановления и ионизации при наличии матричных компонентов могут отличаться от целевых соединений. Таким образом, все эти особенности должны быть рассмотрены и тщательно исследованы в ходе разработки метода.
Аналитическая система в представленном методе, включающем детектор MS, позволила нам достичь низких пределов обнаружения (0,0033 - 0,0108 мкмоль/л)27. Таким образом, одновременные измерения 3HKyn, Kyn, 3HAA, XA в пределах концентрации 0,018 - 4,46 мкмоль/л, 0,0096 - 3,84 ммоль/л, 0,033 - 13,06 ммоль/л и 0,019 - 4,87 ммоль/л, соответственно, было достигнуто. Основное ограничение любого анализа LC-S связано с правильным разделением компонентов выборки на столбце LC. Плохое разделение способствует снижению селективности по сравнению с обнаружением с тандемом четырехугольной масс-спектрометрии с использованием ионов продукта и режима множественного мониторинга реакции (MRM). Для того, чтобы избежать помех от других компонентов матрицы, которые имеют те же или аналогичные ионы с молекулой-мишенью, условия разделения LC должны быть тщательно оптимизированы. Например, изотоп Trp 13C (присутствует в следовых количествах) генерирует тот же ион m/z 206, что и для мониторинга XA. Неправильного толкования здесь удалось избежать, оптимизировал хроматографические условия и удовлетворительное отделение ГРП и XA от колонки(рисунок 4).
В будущих приложениях могут быть реализованы некоторые изменения в протоколе. Потенциальный пользователь может изменить концентрацию внутреннего стандарта (3NT), когда уровни изученных кинуренинов, как ожидается, упадет beyound концентраций, представленных здесь. Важно отметить, что концентрация 3NT должна быть одинаковой как в стандартах калибровки, так и в экспериментальных образцах. В случае чрезвычайно высокого уровня аналита, такого как Кын, наблюдаемого в клетках SK-OV-3, мы рекомендуем работать с более высокой концентрацией 3NT. Если требуется разбавление образца, это делается на заключительном этапе протокола, перед инъекцией образца на столбец LC.
В литературе, Есть некоторые протоколы, предлагаемые для LC-MS / MS количественный анализ kynurenines в среде культуры из разных клеток. Один протокол обеспечивает одновременное определение 3 метаболитов, т.е. Kyn, 3HKyn и 3HAA, но он менее чувствителен (предел количественных данных (ЛОЗ) на более высоких уровнях), в отличие от нашегометода 21. В другом докладе представлен метод, который позволяет количественно 4 kynurenines, в том числе Kyn, 3HKyn, 3HAA и XA с аналогичнымиLO's 25. Ни один из них, однако, не был оптимизирован для обнаружения кинуренинов, генерируемых в пробирке культурных раковых клеток. Компоненты матрицы образца влияют на ионизацию аналита в источнике MS путем уменьшения или увеличения сигнала, что является причиной ненадежных результатов. Для получения более точных данных мы предложили использовать аналоговый внутренний стандарт (3NT) в сочетании с матричной калибровкой для лучшей компенсации матричных эффектов.
Используя представленную методологию, мы могли заметить, что Кын был самым распространенным метаболитом Trp в культурной среде, собранной из анализируемых типов раковых клеток, в то время как другие изученные метаболиты под контролем культурных условий не были обнаружены (за исключением XA, присутствуют в следовых, но обнаруживаемых количествах). Однако, когда клетки были стимулированы с мощным иммунным активатором - бактериальный липополисахарид, большее количество XA в дополнение к Кын был секретирован. С другой стороны, обнаруженные 3HKyn и 3HAA, которые образуются вверх по течению от XA в ХП, все еще находились подЛОЗ 27. Это говорит о том, что некоторые метаболиты ХП, присутствующие в небольших количествах в культурной среде, могут быть трудно измерить с помощью предлагаемого подхода LC-S. Тем не менее представленный протокол полезен для выявления изменений в ХП путем количественной оценки накопления ключевых метаболитов ГТО. Использование этой методологии в будущих исследованиях для привлечения системы культуры клеток in vitro будет поставлять новые биомаркеры иммунных заболеваний и рака. Наш подход приносит проверенный и надежный анализ с соответствующей чувствительностью для клеточных моделей, которые являются сложными из-за низкой концентрации метаболитов КП вниз по течению. Предоставленные инструкции позволят исследователям из различных областей использовать этот подход для количественной оценки основных кинуренинов, связанных с раком и другими заболеваниями. Наши данные (неопубликованные) показывают, что он полезен для изучения модуляции ХП в клетках, подверженных различным продуктам гликации, но он также должен найти применение в других областях исследований и заболеваний с иммунным компонентом, т.е. в биологии эндометрия ивоспроизводства 30.
Представленный протокол может быть расширен для определения дополнительных аналитов, которые могут накапливаться в среде культуры в различных экспериментальных условиях. Соответствующие эталонные стандарты аналитов должны использоваться для проверки метода с точки зрения точности, точности, линейности, восстановления или избирательности, прежде чем использоваться для количественного анализа. Более того, в зависимости от цели исследования, протокол может быть использован для отдельных kynurenines (3HKyn, Kyn, 3HAA или XA). В этом случае ионы, соответствующие соединениям, которые не рассматриваются для анализа, могут быть удалены из настроек MS. Подходящие изменения в программе градиента LC помогут сократить время анализа.
При изучении ХП необходимо оценить активность фермента IDO. Это можно было бы оценить просто путем измерения потребления ГТО и kyn релиз в среде культуры или путем расчета коэффициента концентрации кюнуренина к триптофану («Кин»/«Trp»)31. В нашем подходе мы не измерили концентрацию ГТО, однако протокол может быть расширен путем добавления этой цели в анализ LC-S. В качестве более биохимически подходящего подхода, мы рекомендуем выразить ИДО энзиматической активности, как количество Кын производства клеток на миллиграмм белка в минуту, как представлено в другихместах 32. Мы заметили преимущество в использовании этого подхода в других наших исследованиях на раковых клетках (рукопись в стадии подготовки) и рекомендуем этот метод при использовании модели культуры клеток in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Европейским союзом из Европейского фонда регионального развития в рамках оперативной программы развития Восточной Польши 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), факультетом биотехнологии и экологических наук Люблинского католического университета имени Иоанна Павла II (грант молодых ученых для Илоны Садок), Польского национального научного центра, OPUS13 (2017/25/B/N'4/01198 для Магдалены Станишевской, главный следователь). Авторы благодарят профессора Агнешка Оцибиора из Лаборатории окислительного стресса, Центр междисциплинарных исследований, JPII CUL за совместное использование оборудования для культивирования клеток и количественной оценки белка.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
| Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
| Analytical balance | Ohaus | ||
| Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
| Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
| Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
| Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
| Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
| Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
| Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
| Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
| Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
| Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
| Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
| Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
| Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
| See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
| Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
| Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
| Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
| Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
| Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
| Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
| Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
References
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
- Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
- Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
- Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
- Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
- Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).
- Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
- Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
- Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
- Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M.
- Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
- Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
- Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
- Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
- Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
- Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
- Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).
- Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
- Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
- Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
- Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
- Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
- Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
- Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
- Annesley, T. M.
- Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
- Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
- Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416 (2009).
- Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).
