Summary
Beskrivs här är ett protokoll för bestämning av fyra olika tryptofan metaboliter genereras i kynurenin utbildningsavsnittet (kynurenin, 3-hydroxykynurenin, xanthurenic syra, 3-hydroxyanthranilic syra) i mediet samlas in från cancer cell kulturer analyseras av flytande kromatografi i kombination med en enda quadrupole masspektrometri.
Abstract
Kynureninvägen och tryptofankataboliterna som kallas kynureniner har fått ökad uppmärksamhet för sitt engagemang i immunreglering och cancerbiologi. En in vitro-cellkulturanalys används ofta för att lära sig om bidraget från olika tryptofankataboliter i en sjukdomsmekanism och för att testa terapeutiska strategier. Cellkulturmedium som är rikt på utsöndrade metaboliter och signalmolekyler återspeglar statusen för tryptofanmetabolism och andra cellulära händelser. Nya protokoll för tillförlitlig kvantifiering av flera kynureniner i det komplexa cellkulturmediet önskas möjliggöra en tillförlitlig och snabb analys av flera prover. Detta kan åstadkommas med flytande kromatografi i kombination med masspektrometri. Denna kraftfulla teknik används i många kliniska och forskningslaboratorier för kvantifiering av metaboliter och kan användas för att mäta kynureniner.
Presenteras här är användning av flytande kromatografi i kombination med en fyrdubbel massa spektrometri (LC-SQ) för samtidig bestämning av fyra kynureniner, dvs kynurenin, 3-hydroxykynurenin, 3-hydroxyanthranilic och xanthurenic syra i mediet samlas in från in vitro odlade cancerceller. SQ-detektorn är enkel att använda och billigare jämfört med andra masspektrometrar. I SQ-MS-analysen genereras och separeras flera joner från provet enligt deras specifika mass-till-laddningsförhållande (m / z), följt av detektion med hjälp av ett SIM-läge (Single Ion Monitoring).
Detta dokument uppmärksammar fördelarna med den rapporterade metoden och indikerar några svaga punkter. Det är inriktat på kritiska element i LC-SQ-analys inklusive provberedning tillsammans med kromatografi och masspektrometrianalys. Kvalitetskontroll, metodkalibreringsförhållanden och matriseffektfrågor diskuteras också. Vi beskrev en enkel tillämpning av 3-nitrotyrosin som en analog standard för alla mål analyter. Som bekräftas av experiment med mänskliga äggstocks- och bröstcancerceller genererar den föreslagna LC-SQ-metoden tillförlitliga resultat och kan tillämpas ytterligare på andra cellulära in vitro-modeller.
Introduction
Kynurenin väg (KP) är den viktigaste vägen för tryptofan (Trp) katabolism i mänskliga celler. Indoleamin-2,3-dioxygenas (IDO-1) i extrahepatiska celler är det första och begränsande enzymet av KP och omvandlar Trp till N-formylkynurenin1. Ytterligare steg inom KP genererar andra sekundära metaboliter, nämligen kynureniner som uppvisar olika biologiska egenskaper. Kynurenin (Kyn) är den första stabila Trp-kataboliten som visar giftiga egenskaper och reglerar cellulära händelser efter bindning till arylkolvätereceptorn (AhR)2. Därefter omvandlas Kyn till flera molekyler antingen spontant eller i de enzymmedierade processerna, vilket genererar sådana metaboliter som 3-hydroxykynurenin (3HKyn), anthranilic syra (AA), 3-hydroxyanthranilic syra (3-HAA), kynurensyra (Kyna) och xanthurenic syra (XA). En annan nedströms metabolit, 2-amino-3-karboxymukansyra-6-semialdehyd (ACMS), genomgår icke-enzymatisk cyklisering till kinolinsyra (QA) eller picolinsyra (PA)1. Slutligen omvandlas QA ytterligare till nikotinamid-adenin dinukleotid (NAD+)3, KP-slutpunktmetaboliten som är en viktig enzymkofaktor. Vissa kynureniner har neuroprotektiva egenskaper som Kyna och PA, medan de andra, dvs. 3HAA och 3HKyn, är giftiga4. Xanthurenic syra, som bildas av 3HKyn, presenterar antioxidant och vasorelaxation egenskaper5. XA ackumuleras i åldrande linser och leder till apoptos av epitelceller6. KP, som beskrevs i mitten av 1900-talet, fick mer uppmärksamhet när dess engagemang i olika störningar visades. Ökad aktivitet av denna metaboliska väg och ackumulering av vissa kynureniner modulerar immunsvaret och är förknippade med olika patologiska tillstånd som depression, schizofreni, encefalopati, HIV, demens, amyotrofisk lateral skleros, malaria, Alzheimers, Huntingtons sjukdom och cancer4,7. Vissa förändringar i Trp metabolism observeras i tumör microenvironments och cancerceller2,8. Dessutom anses kynureniner vara lovande sjukdomsmarkörer9. Inom cancerforskningen är in vitro-cellkulturmodeller väletablerade och används ofta för preklinisk utvärdering av svar på cancerläkemedel10. Trp metaboliter utsöndras av celler i odlingsmediet och kan mätas för att bedöma statusen på kynureninvägen. Därför finns det ett behov av att utveckla lämpliga metoder för samtidig detektion av så många KP-metaboliter som möjligt i en mängd olika biologiska exemplar med ett enkelt, flexibelt och tillförlitligt protokoll.
I detta dokument beskriver vi ett protokoll för samtidig bestämning av fyra kynurenin utbildningsavsnitt metaboliter: Kyn, 3HKyn, 3HAA och XA av LC-SQ i ett postkulturellt medium samlas in från cancerceller. I ett modernt analytiskt tillvägagångssätt föredrasflytande kromatografi 13,14,15,16 för samtidig detektion och kvantifiering av de enskilda tryptofankataboliterna, i motsats till biokemiska ospecificerade analyser som använder Ehrlich reagens11,12. För närvarande finns det många metoder tillgängliga för kynureninbestämning i mänskliga exemplar, huvudsakligen baserade på flytande kromatografi med ultravioletta eller fluorescensdetektorer13,17,18,19. Flytande kromatografi i kombination med en masspektrometridetektor (LC-MS) verkar mer lämplig för denna typ av analys, på grund av deras högre känslighet (lägre detektionsgränser), selektivitet och repeterbarhet.
Trp metaboliter har redan fastställts i humant serum, plasma och urin13,20,21,22,23, men metoderna för andra biologiska exemplar, som cellkulturmedium önskas också. Tidigare användes LC- MS för Trp- härledda föreningar i ett medium som samlats in efter odling av mänskliga gliomceller, monocyter, dendritiska celler eller astrocyter behandlade med interferon gamma (IFN-γ)24,25,26. För närvarande finns det ett behov av nya validerade protokoll som kan möjliggöra en bedömning av flera metaboliter i olika odlingsmedier, celler och behandlingar som används i cancermodeller.
Syftet med den utvecklade metoden är att kvantifiera (inom en analytisk körning) fyra stora kynureniner som kan indikera avvikelser i KP. Presenteras här är kritiska steg i vårt nyligen publicerade protokoll för kvantitativ LC-SQ analys av utvalda meningsfulla kynureniner med hjälp av en intern standard (3-nitrotyrosin, 3NT) i mediet som samlats in från in vitro odlade mänskliga cancerceller27. Så väl som vi vet är det det första LC-SQ-protokollet för samtidig kvantifiering av 3HKyn, 3HAA, Kyn och XA i ett odlingsmedium som erhållits från de in vitro-odlade cellerna. Vid vissa modifieringar kan metoden tillämpas ytterligare för att studera förändringarna i Trp-metabolismen i ett bredare spektrum av cellkulturmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av standard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard lagerlösningar
- Väg reagenserna i en flaska med högsta noggrannhet (0,3 mg vardera). För bättre noggrannhet, skala upp reagenserna och justera lösningsmedlets volym enligt steg 1.2.
- Lös upp reagenserna i 300 μL av lösningsmedlet för att få en stamlösning på 1 g/L. Lös upp 3NT i 1% (v/v) myrsyra (FA) i vatten; Kyn, 3HAA och XA i dimetylsulfoxid (DMSO); 3HKyn i vatten försurat till pH 2.5 med saltsyra (HCl).
VARNING: 3HAA irriterar ögon, näsa, hals och lungor. Det är skadligt vid inandning, i kontakt med huden och vid förtätning. Använd lämpligt skydd, t.ex. handskar och mask. - Stäng injektionsflaskan ordentligt och placera den i ett ultraljudsbad i 1 minut för att påskynda upplösningen.
OBS: Förvara lagerlösningarna vid -20 °C och minimera frysning/upptining (max 3 cykler) på grund av instabiliteten i lagerlösningarna.
2. Beredning av kolbehandlat odlingsmedium
- I ett rör, väg 280 mg aktivt kol och tillsätt 5 ml av det flytande mediet som är förberett för odling av de celler som är av intresse.
- Skaka röret med mediet och kolet på en sågrockare i 2 timmar, vid rumstemperatur (ställ in hastigheten på 50 svängningar/min). Centrifugera sedan rören med 6000 x g i 15 minuter.
- Ta bort röret från centrifugen och samla försiktigt supernatanten utan att störa sedimentet. Upprepa centrifugeringen vid behov för att avlägsna alla kolrester.
- Filtrera supernatanten med ett 0,45 μm sprutfilter.
- Se till att kolförbehandlat odlingsmedium berövas kynureninspår genom att köra ett pilotprov på LC-MS enligt beskrivningen i steg 6.3.2. Upprepa annars steg 2.1-2.4.
OBS: Om hela odlingsmediet inledningsvis inte innehåller kynureniner kan reningssteg med kol utelämnas. Förbered i så fall kalibreringsstandarder och kvalitetskontrollprover med hjälp av det kompletta medium som vanligtvis är förberett för cellodling. - Förvara det beredda mediet vid 4 °C tills analysen.
3. Göra kalibreringslösningar och kalibreringskurvor
- Spika kolförbehandlat odlingsmedium med 0,75 μL 0,1 g/L 3NT-lösning och lägg till fyra standarder (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) minst sex olika koncentrationer för att täcka kalibreringsintervall. Håll den slutliga volymen för varje prov på 150 μL. Vortex väl. Använd 1,5 ml centrifugrör för provberedning.
OBS: Föreslagna kalibreringspunkter för 3HKyn: 0,018, 0,045, 0,22, 1,12, 2,23, 4,46 μmol/L; För Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/L; För 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/L. För XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/L. - Tillsätt 150 μL kall metanol (förvaras vid -20 °C) som innehåller 1% (v/v) myrsyra i varje rör för provdeproteinisering. Stäng rören och virveln ordentligt.
- Inkubera proverna vid -20 °C i 40 minuter.
- Centrifugera proverna vid 14 000 x g i 15 min vid 4 °C. Ta bort rören från centrifugen. Samla supernatanter i de nya rören. Stör inte sedimentet.
- Överför 270 μL av supernatanten till glasflaskan med en automatisk pipett. Lägg injektionsflaskan i förångaren och avdunsta försiktigt tills de är torra. Använd lämpligt program för vatten/metanolfraktioner för att avdunsta flyktiga komponenter. Applicera inte en temperatur som är högre än 40 °C och undvik övertorkning.
OBS: Glasflaskor med platt botten, dvs kromatografiska injektionsflaskor underlättar snabbare avdunstning och högre återvinning i jämförelse med plastkoniska rör. - Efter 30 min, kontrollera avdunstningsstatusen. Vid behov, fortsätt avdunstningen (t.ex. tillsätt extra 10 min). Undvik övertorkning.
- Ta bort injektionsflaskan från förångaren. Reconstitute varje prov i 60 μL av 0,1% (v/v) myrsyra i vatten. Tillsätt lösningsmedlet i injektionsflaskan som innehåller restmaterialet. Stäng injektionsflaskan och virvelbrunnen tätt.
- Överför provet till ett 1,5 ml-rör och snurra vid 14 000 x g i 15 minuter vid 4 °C för att separera det fällda proteinet.
- Utan att störa proteinpelleten, överför supernatanterna till kromatografiska injektionsflaskor med koniska glasinsatser med en automatisk pipett. Stäng injektionsflaskan ordentligt.
- Kontrollera om det finns luftbubblor i injektionsflaskan och ta bort dem vid behov (t.ex. genom virvel).
- Överför kromatografiska injektionsflaskan som innehåller prover till LC autosampler. Registrera positionen för prover som placerats i ett autosamplerfack.
4. Utarbetande av kvalitetskontrollprover (QC)
- Spika det kolförbehandlade odlingsmediet (framställt i ett 1,5 ml centrifugalrör) med 0,75 μL 0,1 g/L 3NT-lösning och standarder för fyra kynureniner (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) vid en koncentration som valts från kalibreringskurvorna. Håll provets slutliga volym på 150 μL.
OBS: Om tillämpligt, förbered flera QC-prover vid olika koncentrationer som faller under kalibreringskurvans linjära intervall. - Följ protokollet som beskrivs i avsnitt 3 (steg 3.2-3.11).
5. Ställa in LC-MS-systemet
- Bered de mobila faslösningsmedel: Lösningsmedel A: 20 mmol/L ammoniumformat i ultrapurvatten (pH 4.3 justerat med myrsyra); Lösningsmedel B: 100% acetonitril.
OBS: Använd endast borosilikatglasflaskor. Skölj flaskorna med ultrapurevatten innan du fyller på det. Använd inte flaskor som rengörs med rengöringsmedel.
VARNING: Acetonitrile orsakar allvarliga hälsoeffekter eller dödsfall. Det antänds lätt av värme. Acetonitril vätska och ånga kan irritera ögon, näsa, hals och lungor.- Förbered 5 mol/L stamlösning av ammoniumformat genom att lösa upp ett kristallint reagens (15,77 g) i 50 ml ultrapurevatten i en glasflaska. Rör om tills alla rester löser sig. Filtrera genom 0,45 μm-membranet för att avlägsna eventuellt restskräp (t.ex. med hjälp av ett nylonsprutafilter). Förvara lagerlösningen vid 4 °C.
- Förbered lösningsmedel A genom att tillsätta 4 ml 5 mol/L ammoniumformat i vatten till 980 ml ultrapurevatten i en bärnstensfärgad glasflaska och rör om väl. Sänk ned en omrörningsstång och lägg flaskan med lösningsmedlet på en magnetomrörare. Sänk ner en pH-elektrod i lösningen och styr pH-styret under omrörning. Tillsätt myrsyrabuljonglösning (98%-100%) droppvis med en automatisk pipett med 0,2 ml spets för att erhålla pH 4.3, justera volymen upp till 1 L med ultrapurevatten och rör om väl.
OBS: Förbered lösningsmedierna minst en gång i veckan för att förhindra mikrobiell tillväxt.
VARNING: Myrsyra (FA) är giftig vid inandning, orsakar brännskador i huden och ögonskador. Arbeta under rökhuven; använd skyddshandskar och rock. - Filtrera alla lösningar genom 0,22 μm-membranet (t.ex. nylonsprutafilter) för att avlägsna eventuellt kvarvarande skräp. Alternativt kan du använda inloppsfiltren för lösningsmedel avsedda för LC-lösningsmedelsbehållare för att skydda systemet från inkommande partiklar.
- Starta LC-MS-kontroll- och datainsamlingsprogram.
- Rensa LC-systemet med den mobila fasen för att ta bort bubblor och för att prime alla lösningsmedelskanaler.
- Ensemble en skyddskolonn för att skydda den analytiska kolumnen från igensättning.
- Spola skyddet och analyskolonnen (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) med 100% acetonitril i ca 30 min och sedan med 100% lösningsmedel A tills ett stabilt tryck i kolonnen observeras. Styr systemets prestanda med hjälp av kontrollprogramvaran.
- Ange lämpliga LC-parametrar i datainsamlingsprogrammet.
- Ställ in gradientprogrammet: 0-8 min lösningsmedel B 0%; 8-17 min lösningsmedel B 0-2%; 17-20 min lösningsmedel B 2%; 20-32 min lösningsmedel B 10-30%; 32-45 min lösningsmedel B 0%.
- Ställ in det mobila fasflödet på 0,15 ml/min, total analystid i 45 min, kolumntemperaturen vid +40 °C och injektionsvolymen på 10 μL.
- Ställ in förvärvsparametrarna för masspektrometridetektorn.
- Tillämpa joniseringsparametrar: enkeljonövervakning (SIM), positiv jonisering, nebulisatortryck på 50 psi, +350 °C torkgastemperatur, torkgasflöde på 12 L/min och 5500 V kapillärspänning.
- Välj analytövervakningsjoner: för 3HKyn m/z 225.0 (skanningsperiod: 2-6 min, fragmentorspänning: 100 V); För Kyn m/z 209.0 (skanningsperiod: 6-12 min, fragmentorspänning: 80 V); för 3HAA m/z 154,0 (skanningsperiod: 12-18 min, fragmentorspänning: 80 V); för 3NT m/z 227.0 (skanningsperiod: 18-23 min, fragmentorspänning: 100 V); för XA m/z 206.0 (skanningsperiod: 23-45 min, fragmentorspänning: 100 V).
- Konstruera en arbetslista och kör exempel på LC-systemet.
- Kör först, före analysen av försöksproverna, ett blankprov (lösningsmedel A) åtminstone i tre exemplar, följt av ett QC-prov.
- Öppna dataanalysprogramvaran och läs in de resultat som erhållits för QC-exemplet.
- Kontrollera positionen för analyttoppar på kromatogrammet. När signalerna skiftar bortom det förväntade läget justerar tidsportarna för lämplig analytsignalering. Se programvaruhandboken för instruktioner om signalintegration.
6. Konstruera kalibreringskurvan
- I dataförvärvsprogramvaran lägger du till kalibreringsstandarder i arbetslistan och kör standarderna i triplikater.
- Integrera och mät toppområdet som motsvarar 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT och XA vid retentionstiden på ca 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min respektive 30 min.
- Konstruera individuella kalibreringskurvor för varje metabolit med hjälp av ett kalkylbladsprogram.
- Om du vill skapa kalibreringsdiagrammet ritar du värdet för ett förhållande mellan analyttoppen över 3NT-toppområdet jämfört med koncentrationen av analyten.
- Analysera det tomma provet (kolförbehandlat odlingsmedium spikat endast med 3NT) för att säkerställa att det inte finns några spår av de studerade analyterna i mediet. Subtrahera annars det erhållna värdet från varje kalibreringspunkt.
- Kontrollera linjäriteten för varje kalibreringskurva.
- Individuellt, för varje analyt, skapa en slope-intercept linjär ekvation (y = ax +b), där y motsvarar förhållandet mellan analyt toppområdet jämfört med 3NT toppområde, a är lutningen, x är analytkoncentrationen (μmol/L), och b hänvisar till kurvskärningen. Om du ritar diagrammet "y" kontra "x" genereras kalibreringskurvan.
- Lägg till en linjär trendlinje i diagrammet, visa ekvationen kalibreringskurva och regressionskoefficienten i diagrammet. Kontrollera att regressionskoefficienten är > 0,990. Om kalibreringsstandarderna inte är överens, förbered och/eller analysera dessa igen. Alternativt kan du ändra kalibreringskurvans koncentrationsområde.
- Analysera QC-exemplen för att kontrollera systemets prestanda innan du analyserar experimentproverna. Vid inkompatibiliteter (± 20 % avvikelse från referensvärdet) bereder du de nya kalibreringskurvorna.
7. In vitro-cellkultur och provsamling för analys
- Plätera de studerade cancercellerna (MDA-MB-231 eller SK-OV-3) i DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) som innehåller 4,5 g/L ᴅ-glukos, 10% (v/v) fetala nötkreatur serum (FBS), 2 mmol/L ʟ-glutamin och 1 U penicillin/streptomycin och kultur vid 37 °C i en fuktad atmosfär på 5% CO2 för att expandera dem för experimentet. Passage cellerna vid 80% av confluency.
- Lossa celler från odlingsrätten med trypsin, frö för experimentet på 12-brunnsplattor med en densitet av 0,3 × 106 celler per brunn och placera i en inkubator över natten.
- Nästa dag aspirerar du odlingsmediet och lägger till färsk DMEM med eller utan tillsats av de studerade föreningarna, beroende på den experimentella designen.
- Efter 48 timmar, samla mediet ovanifrån cellerna (ca 500 μL) i ett 1,5 ml-rör. Centrifugera vid 14 000 x g i 5 minuter för att avlägsna cellskräp. Samla supernatanten och förvara vid -80 °C tills analysen.
- Spara cellulär pellet från steg 7.4 för proteinuppskattning. Frys proverna vid -20 °C.
OBS: De resultat som erhålls för ett medium från olika brunnar bör normaliseras till total proteinhalt för att ta hänsyn till variationen i cellnummer i enskilda brunnar. Proteinkoncentrationen kan bedömas enligt beskrivningen i steg 9.
8. Förbered prover för LC-MS-analys
- Tina det frysta provet i rumstemperatur och blanda väl. Överför 149,25 μL av odlingsmediet till ett centrifugationsrör (1,5 ml).
- Tillsätt 0,75 μL 0,1 g/L 3NT-lösning (intern standard). Stäng rören och virveln väl.
- Tillsätt 150 μL kyld vid -20 °C metanol som innehåller 1 % (v/v) FA för provdeproteinisering. Stäng rören och virveln väl.
- Fortsätt med provberedning enligt beskrivningen i avsnitt 3 (steg 3.3-3.11).
OBS: Vissa cancerceller som SK-OV-3 utsöndrar stora mängder Kyn i ett odlingsmedium. För att passa in data i ett linjärt område i kalibreringskurvan krävs ungefär 100-faldig utspädning av provet. Späd i så fall ut en del av provet med 0,1 % (v/v) FA i vatten och analysera utöver det outspädda provet. Referensproverna av standarder för kalibreringskurvan bör beredas i 100 gånger utspädda kompletta odlingsmedium. Alternativt kan du lägga till fler punkter i kalibreringskurvan (om korrekt löslighet och linjäritet uppnås) för att justera den till kynkoncentrationsnivån i försöksprovet. - Analysera proverna av LC-MS enligt beskrivningen i avsnitt 5. Skapa en arbetslista och kör varje exempel i tre exemplar.
- När arbetslistan är klar mäter du toppområdet för analyt.
- Generera ett kalkylblad med hjälp av tillgänglig programvara och hämta numeriska data.
- I en kalkylbladskolumn beräknar du förhållandet mellan analyttoppen över 3NT-toppområdet.
- Använd en individuell linjär kalibreringsekvation avsedd för varje analyt (från steg 6.3) för att beräkna koncentrationer av analyter som finns i försöksproverna.
9. Bedömning av proteininnehåll och datanormalisering
- Återanvänd cellulär pellet från steg 7,5 med 100 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 1,5 ml-rör.
OBS: Förbered PBS-lösningen genom att lösa upp 8 g natriumklorid, 0,2 g kaliumklorid, 1,44 g natriumfosfatdibasiskt, kaliumdikydrogenfosfat i 950 ml ultrapurvatten. Rör om ordentligt. Justera pH till 7,4 med saltsyra (droppe). Justera volymen upp till 1 L med ultrapurevatten. Rör om ordentligt tills det är homogent.
VARNING: Saltsyran är mycket frätande och måste hanteras med lämpliga säkerhetsåtgärder. Kontakt med mänsklig hud kan orsaka rodnad, smärta, hudbrännskador. Arbeta under rökhuven; använd skyddshandskar och rock. - Frys proverna vid -20 °C och tina sedan upp på is. Upprepa det här steget 3x.
- Centrifugera proverna vid 14 000 x g i 15 min vid 4 °C. Samla supernatanterna i de nya rören. Stör inte pelleten.
- Späd supernatanterna 10x med PBS.
- Konstruera en kalibreringskurva från 0 till 2 μg av proteinet per brunnsområde.
- Bered standardlösningen för bovint serumalbumin (BSA) för kalibreringen. Lös upp 1,23 μg BSA i 1 ml ultrapurevatten och virvelbrunn.
- På en 96-brunnsplatta, ladda olika mängder BSA-standardlösning (1,23 μg/ml): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
- Fyll brunnen med PBS till den slutliga volymen på 50 μL.
- Ladda 10 - 15 μL celllyat från steg 9,4 på samma 96-brunnsplatta. Fyll brunnarna med PBS för att nå den slutliga volymen på 50 μL.
OBS: Vid behov, justera volymen på celllyate alikvoten i varje brunn för att passa i kalibreringskurvans linjära intervall. Håll den slutliga volymen till 50 μL av provet per brunn. - Tillsätt 200 μL av ett Bradford-reagens (utspädd 5 gånger med ultrapurevatten) till varje brunn.
- Inkubera 96-brunnspaten i minst 5 minuter vid rumstemperatur. Sätt i plattan i en mikroplatta. Mät absorbansen vid λ = 595 nm.
- Skapa en kalibreringskurva med hjälp av ett kalkylbladsprogram. Plotta BSA-mängden (μg) kontra absorbansen. Lägg till en linjär trendlinje, visa kalibreringskurvans ekvation och regressionskoefficienten i diagrammet.
- Använd den linjära ekvationen (y = ax +b, där y motsvarar absorbansen vid λ = 595 nm, a är lutningen, x är en proteinhalt (μg) och b hänvisar till kurvavlyssningen) för att beräkna proteinmängden i provet.
OBS: Tänk på en utspädningsfaktor för prov i beräkningarna. - Använd den uppskattade proteinhalten för att normalisera kynureninmängden i provet per 1 mg protein. För att göra detta, dela koncentrationen av kynureniner som bestäms i steg 8,9 med den totala proteinhalten från steg 9.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LC-MS uppvisar obestridliga fördelar vid kvantifiering av biologiskt aktiva molekyler, även om vissa komponenter i komplexa exemplar orsakar så kallade matriseffekter och kompromissjonisering av analyter. Det leder till jondämpning eller jonförbättring, vilket kraftigt minskar noggrannheten och påverkar en gräns för detektion/kvantifiering av LC-MS, vilket anses vara en "svag" punkt i metoden. I vårt protokoll genereras jonerna av elektrosprayjonisering (ESI) i det positiva läget, som också användes i andra studier på Trp metaboliter bestämning13. ESI är dock mer benägna att matriseffekter än atmosfärisk tryckkemikalien jonisering (APCI)28. För noggrann kvantifiering av Trp-metaboliter i ett cellkulturmedium använde vi därför en intern standard och matrismatchad kalibrering för att kompensera de matrisberoende effekterna på analytsignalen och för att korrigera förlusten av målföreningarna under ett provberedningssteg. Vi tillämpade samma interna standard (3NT) för alla studerade analyter (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA). 3NT hittades inte i det ursprungliga, färska mediet som används för cellodling och visar ett liknande beteende som målföreningar under de tillämpade analytiska förhållandena. Det gör 3NT till lämplig intern standard27. För att förenkla protokollet, för att göra det mer tillgängligt för en bred grupp användare, föreslår vi dessutom endast ett steg av provberedning som involverar proteinborttagning genom behandling med metanol som innehåller 1% (v/v) FA.
Inom det presenterade protokollet rekommenderas att kalibreringskurvorna förbereds med hjälp av hela mediet som används för cellkultur. Odlingsmediet kan dock innehålla endogena Kyn som stör korrekt uppskattning av analyttoppen, särskilt i kalibreringslösningarna vid låga koncentrationer. Figur 1A illustrerar LC-SQ-resultat som erhållits under analysen av DMEM som innehåller 4,5 g/L D-glukos (DMEM-HG) och 10% (v/v) FBS som används av vår grupp för en cancercellskultur. Vi har funnit att det färska kompletta odlingsmediet ursprungligen innehåller några Kyn som kan avlägsnas genom rening med aktivt kol (Figur 1B). När man analyserade de experimentella proverna analyserades också det kompletta DMEM-HG-odlingsmediet som ett kontrollprov, och Kyn-toppområdet subtraherades från toppområdet som registrerats för Kyn i varje testat prov.
Figur 1: Representativa LC-SQ-resultat av fullständigt DMEM-HG-odlingsmedium (A) före och (B) efter förbehandling på aktivt kol. Prover av odlingsmedium spetsades med samma mängd av den interna standarden (3NT). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
I följande steg fastställdes en retentionstid för varje målanalyt (se ett kromatogram i figur 2A). Den goda praxisen i LC-MS-analysen är att köra ett QC-prov före de faktiska proverna för att bekräfta lämpliga lagringstider för analyterna. Ibland kan en förskjutning av LC-signaler observeras, och missmatchningar tenderar att hända. Figur 2B visar en liten förändring i retentionstiderna för analyterna, vilket dock inte stör korrekta mätningar. Å andra sidan innebär figur 2C en betydande förändring av måltopparna. Som sett flyttades 3NT-signalen avsevärt mot en kortare retentionstid och kom ut ur den inställda tidsporten. I detta fall var en lämplig kvantitativ analys omöjlig eftersom den interna standardsignalen inte kan mätas korrekt. Detta kan bero på flera faktorer, dvs. Figur 2Drepresenterar dock en situation, när de registrerade topparna lider av kraftigt låga intensiteter. Detta kan bero på ett injektionsfel, en läcka i systemet eller MS-skador. Dessutom kan de med eluerande matriskomponenterna generera joner med m/z valt för målanalyterna, som i figur 3A, där resultatet från analysen av MDA-MB-231-cellernas odlingsmedium visas. Vid retentionstiden på ca 25 min observerades en stark signal som härrör från en okänd matriskomponent (förening X). Toppen visas under skanningsperioden när jonen av m/z 206 (vald för XA) övervakades. Denna signal motsvarar dock inte analyten på grund av retentionstidens inkompatibilitet. För att undvika misstag under toppintegration rekommenderas också en jämförelse av retentionstiden med den som registrerats för QC-prover.
Figur 2. Exempel på korrekta och felaktiga resultat. Rätt kromatogram för QC-provanalys vid( A) medium och ( B )lågakoncentrationsnivåer som registrerats under olika dagar. Exempel på felaktigt kromatogram till följd av betydande förändringar i retentionstiderna för analyterna (C) och otillfredsställande intensiteter hos toppar (D). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3. Representativa resultat av kulturmedium som samlats in från olika cancercelllinjer. Kulturmedium från( A) MDA-MB-231 (human bröstcancer) och (B) SK-OV-3 (human äggstockscancer) celler analyserades med hjälp av LC-SQ. Föreningen X indikerar signalen från en okänd förening som finns i odlingsmediet som sam-eluerar med analyten och joniserar för att bilda en jon med m/z valt för analyten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Odlingsmediet som används för cancerceller (DMEM) innehåller betydande mängder Trp. Dess isotop (13C-Trp) delar samma jon som XA(m/z 206) och kan störa XA-bestämningen. Men under de applicerade kromatografiska förhållandena är signalen från Trp väl separerad från XA-signalen. Därför drog vi slutsatsen att Trp i DMEM inte påverkar XA-kvantifieringen och metodens noggrannhet (figur 4).
Figur 4. Position för tryptofan (Trp) och xanthurenic syra (XA) signaler på MS kromatogram. Standardlösningar av Trp (49,0 μmol/L) och XA (48,8 μmol/L) utarbetades i solvent A (20 mmol/L ammoniumformat i vatten, pH 4.3) under optimerade LC-SQ-förhållanden. Jonerna från m/z 205 (motsvarande [Trp+H]+) och m/z 206 (motsvarande [XA+H]+) övervakades för Trp respektive XA. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Den presenterade analysmetoden klarade framgångsrikt valideringstestet när det gäller linjäritet, precision (variationskoefficienter ≤15%), noggrannhet (96-104%), återhämtning (96-119%), och matriseffekter för alla analyter, som det beskrevs i detalj i vårt tidigare papper 27.
Slutligen bekräftade vi en tillämpning av den beskrivna analytiska metoden på ett medium som samlats in från in vitro odlade mänskliga cancerceller. Våra data bekräftade att en nivå av kynureniner kan variera avsevärt i ett odlingsmedium som samlats in från olika celltyper (figur 3). Vi analyserade kulturmediet från 2 typer av cancerlinjer, dvs MDA-MB-231 och SK-OV-3 celler som härrör från bröst- respektive äggstockscancer. De utvalda linjerna används ofta som modeller för att studera molekylära händelser och för testning av cancerläkemedel. Som vi observerade, cellerna odlade i ett kontroll standard medium släppte olika mängder tryptofan metaboliter, MDA-MB-231-celler släppte ut en kvantifierbar mängd Kyn och XA vid låg nmol/L-koncentration (figur 3A), medan SK-OV-3-celler uppvisade betydligt mer Kyn, mycket låg utsöndring av XA och ingen utsöndring av andra studerade kynureniner enligt motsvarande toppars intensitet (figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument presenterar ett detaljerat LC-SQ-protokoll för samtidig kvantifiering av fyra större Trp-metaboliter (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) som mäts i ett medium från in vitro-odlade mänskliga cancerceller. Särskild uppmärksamhet ägnas åt provberedning, kromatografiskt/masspektrometriförfarande och datatolkning, de viktigaste punkterna i analysen.
I allmänhet kräver LC-MS-analys, på grund av hög känslighet, de högsta standarderna för ett protokoll strikthet och renhet hos använda material. Det hänvisar till en applicering av snyggt rengjorda och korrekt tvättade glasvaror, liksom högkvalitativa kemikalier under hela standardproceduren. Det är mycket viktigt att använda sötvattenbaserade lösningsmedel i en mobil fas för att undvika mikrobiell förorening som i detta känsliga tillvägagångssätt drastiskt kan påverka analysen. Innan de injiceras i ett LC-system måste de analyserade proverna noggrant undersökas med avseende på förekomsten av olösliga partiklar. Det är viktigt att notera att kolumnen bör vara tillräckligt jämvikt före provanalysen. Underlåtenhet att följa dessa regler kan leda till kontaminering av proverna, LC-systemet och analyskolonnen eller i otillräcklig provjonisering i MS-källan, vilket slutligen orsakar en förskjutning av signaler.
Det finns två viktiga punkter i protokollet som måste betonas för att få optimala resultat. Den mest kritiska delen i det presenterade protokollet är provberedningssteget. Att använda ett otillräckligt förfarande orsakar förlust av målföreningar och följaktligen felaktig kvantifiering. I vårt tillvägagångssätt optimerades provberedningssteget noggrant under metodutvecklingen tillsammans med valet av lösningsmedel för proteinborttagning. Som vi fastställt gav provbehandling med metanol som innehåller 1% (v/v) myrsyra de bästa återvinningarna för alla studerade kynureniner. Effekten av en mobil fas sammansättning på omfattningen av analyte jonisering utvärderades också. Vi har kontrollerat mobila faser bestående av 0-20 mmol/L ammoniumformat eller ammoniumacetat vid olika pH justerat med myr- eller ättiksyra. Den mobila fasen som innehåller 20 mmol/L ammoniumformat i vatten (pH 4.3, lösningsmedel A) och acetonitril (lösningsmedel B) gav bästa möjliga förutsättningar för samtidig kvantifiering av Kyn, 3HKyn, 3HAA och XA27. Ett annat viktigt steg i LC-MS-analysen är toppintegration. Vissa kynureniner förekommer i ett prov vid mycket låga koncentrationsnivåer. I det här fallet kan signalerna från co-eluting föreningar överlappa mål analyte signalen eller generera en topp vid en liknande retentionstid. En oerfaren användare av denna metod kan hitta vissa svårigheter med en korrekt toppintegration, vilket exemplifieras i figur 2C. Således krävs kontroll av retentionstiden för analyterna och jämförelse med ett QC-prov och rekommenderas starkt.
God analytisk praxis omfattar att välja en lämplig intern standard för en kvantitativ analys. Häri föreslår vi ett enkelt och kostnadseffektivt tillvägagångssätt med endast en intern standard (3NT) som analog av fyra kynureniner. Resultaten bekräftade att 3NT presenterar liknande kromatografiskt beteende som målföreningarna och i resultat gör det det möjligt att uppnå en god precision och noggrannhet i metoden27. Under de tillämpade LC-förhållandena är 3NT-toppen väl separerad från de andra analyternas signaler och lätt att mäta. Vi inser att isotopiskt märkta interna standarder (ILIS) som används i sådana analyser14,15 kommer att ge bättre kompensation för matriseffekter och bättre kontroll över alla variabler som kan leda till falska resultat. Å andra sidan är ILIS för alla målanalyter inte alltid lättillgängliga, för att inte tala om deras höga kostnad. ILISs är också dedikerade snarare för LC-MS / MS än LC-SQ med SIM-läge (Single Ion Monitoring) som vi använde i det här dokumentet.
Att använda 3NT som en intern standard kan här betraktas som en begränsning av metoden på grund av en möjlighet till 3-nitrotyrosinbildning på proteiner29. Men vid ett kulturmedium observerade vi inte något fritt endogent 3-nitrotyrosin. Det låter oss erkänna 3NT som en lämplig intern standard. Vi rekommenderar dock en förhandsbedömning av en första endogen 3NT-nivå, särskilt när man studerar andra celltyper än vad som testas i denna rapport.
Sammanfattningsvis, när man väljer en analog till någon analyt, måste man överväga många funktioner, t.ex. kemisk likhet och initial frånvaro i en provmatris. Dessutom kan en stabilitet hos den analoga interna standarden i en provmatris, dess återvinnings- och joniseringseffektivitet i närvaro av matriskomponenter skilja sig från målföreningarna. Således bör alla dessa funktioner övervägas och noggrant undersökas under metodutveckling.
Analyssystemet i den presenterade metoden som består av en MS-detektor gjorde det möjligt för oss att uppnå låga detektionsgränser (0,0033 – 0,0108 μmol/L)27. På så sätt samtidiga mätningar av 3HKyn, Kyn, 3HAA, XA inom koncentrationsintervallen 0,018 - 4,46 μmol/L, 0,0096 - 3,84 μmol/L, 0,033 - 13,06 μmol/L respektive 0,019 – 4,87 μmol/L uppnåddes. Huvudbegränsningen för alla LC-SQ-analyser är förknippad med en korrekt separation av provkomponenter på en LC-kolumn. Dålig separation bidrar till lägre selektivitet jämfört med detektion med en tandem fyrdubbel masspektrometri som använder produktjoner och MM-läge (Multiple Reaction Monitoring). För att undvika störningar från andra matriskomponenter som delar samma eller liknande joner med en målmolekyl måste LC-separationsförhållandena optimeras noggrant. Som ett exempel genererar 13C Trp isotop (finns i spårmängder) samma jon av m/z 206 som valts för XA-övervakning. Feltolkningen undveks här genom att optimera kromatografiska förhållanden och tillfredsställande separation av Trp och XA som framkallats från kolumnen (figur 4).
I de framtida programmen kan vissa ändringar av protokollet implementeras. En potentiell användare kan ändra en koncentration av den interna standarden (3NT) när nivåerna av studerade kynureniner förväntas falla beyound de koncentrationer som presenteras här. Viktigt är att 3NT-koncentrationen bör vara densamma både i kalibreringsstandarderna och i försöksproverna. Vid en extremt hög analytnivå, såsom Kyn observerad i SK-OV-3 celler, rekommenderar vi att du arbetar med en högre koncentration av 3NT. Om provutspädning krävs, ska det ske i protokollets slutsteg innan provinjektionen på LC-kolonnen.
I litteraturen finns det några protokoll som föreslås för LC-MS/MS kvantitativ analys av kynureniner i ett kulturmedium från olika celler. Ett protokoll ger en samtidig bestämning av 3 metaboliter, dvs. Kyn, 3HKyn och 3HAA men det är mindre känsligt (gräns för kvantifieringar (LOQ) på högre nivåer), i motsats till vår metod21. En annan rapport presenterade en metod som möjliggör kvantifiering av 4 kynureniner, inklusive Kyn, 3HKyn, 3HAA och XA med liknande LOQs25. Ingen av dem var dock optimerad för påvisande av kynureniner som genereras av in vitro-odlade cancerceller. Komponenterna i en provmatris påverkar analytjoniseringen i MS-källan genom att minska eller öka signalen, vilket är en orsak till otillförlitliga resultat. För att få mer exakta data föreslog vi att använda en analog intern standard (3NT) i kombination med en matrismatchad kalibrering för bättre kompensation av matrisberoende effekter.
Med hjälp av den presenterade metoden kunde vi observera att Kyn var den mest rikliga Trp-metaboliten i ett odlingsmedium som samlats in från de analyserade cancercelltyperna, medan de andra studerade metaboliterna under kontrollkulturförhållanden inte upptäcktes (exklusive XA närvarande i spår men detekterbara mängder). Men när cellerna stimulerades med en potent immunaktivator – bakteriell lipopolysackarid utsöndrades en större mängd XA utöver Kyn. Å andra sidan var de upptäckta 3HKyn och 3HAA som bildas uppströms XA inom KP fortfarande under LOQ27. Detta tyder på att vissa KP-metaboliter som förekommer i små mängder i ett odlingsmedium kan vara svåra att mäta med hjälp av den föreslagna LC-SQ-metoden. Det framlade protokollet är dock användbart för att identifiera förändringar i KP genom kvantifiering av de ackumulerande nyckel-Trp-metaboliterna. Genom att använda denna metodik i framtida studier för att engagera ett in vitro-cellkultursystem kommer nya biomarkörer för immunrelaterade sjukdomar och cancer att leverera nya biomarkörer. Vårt tillvägagångssätt ger en validerad och tillförlitlig analys med relevant känslighet för cellulära modeller som är utmanande på grund av låga koncentrationer av nedströms KP-metaboliter. De medföljande instruktionerna kommer att göra det möjligt för forskare från olika områden att använda detta tillvägagångssätt för kvantifiering av större kynureniner relaterade till cancer och andra sjukdomar. Våra data (opublicerade) visar att det är användbart för att studera KP-modulering i celler som utsätts för olika glykationsprodukter, men det bör också hitta en applikation inom andra forskningsområden och sjukdomar med immunkomponent, dvs. i endometriumbiologi och reproduktion30.
Det presenterade protokollet kan utökas ytterligare för att bestämma ytterligare analyter som kan ackumuleras i ett odlingsmedium under olika experimentella förhållanden. Lämpliga referensstandarder för analyter bör användas för metodvalidering i fråga om noggrannhet, precision, linjäritet, återvinning eller selektivitet innan de används för kvantitativa analyser. Dessutom, beroende på forskningssyftet, kan protokollet användas för enskilda kynureniner (3HKyn, Kyn, 3HAA eller XA). I det här fallet kan jonerna som motsvarar föreningar som inte beaktas för analys tas bort från MS-inställningarna. De lämpliga ändringarna i LC-gradientprogrammet hjälper till att minska analystiden.
När du studerar KP är det relevant att bedöma aktiviteten hos IDO-enzym. Detta kan uppskattas helt enkelt genom att mäta Trp-förbrukningen och Kyn frigörs i ett odlingsmedium eller genom att beräkna ett kynurenin-till-tryptofankoncentrationsförhållande ([Kyn]/[Trp])31. I vårt tillvägagångssätt har vi inte mätt en Trp-koncentration, men protokollet kan utökas genom att lägga till detta mål i LC-SQ-analysen. Som ett mer biokemiskt lämpligt tillvägagångssätt rekommenderar vi att uttrycka IDO enzymatisk aktivitet som en mängd Kyn produceras av celler per milligram protein per minut som presenteras någonannanstans 32. Vi har märkt en fördel med att använda detta tillvägagångssätt i våra andra studier på cancerceller (manuskript i förberedelse) och rekommenderar denna metod när du använder in vitro-cellkulturmodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Europeiska unionen från Europeiska regionala utvecklingsfonden inom ramen för det operativa programmets utveckling i östra Polen 2007–2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), av fakulteten för bioteknik och miljövetenskap vid John Paul II Catholic University of Lublin (Young Scientists grant for Ilona Sadok), Polish National Science Centre, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 för Magdalena Staniszewska, huvudutredare). Författarna tackar prof. Agnieszka Ścibior från Laboratoriet för oxidativ stress, Centrum för tvärvetenskaplig forskning, JPII CUL för att dela utrustningen för cellodling och proteink kvantifiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
| Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
| Analytical balance | Ohaus | ||
| Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
| Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
| Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
| Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
| Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
| Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
| Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
| Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
| Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
| Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
| Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
| Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
| Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
| See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
| Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
| Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
| Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
| Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
| Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
| Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
| Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
References
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
- Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
- Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
- Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
- Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
- Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).
- Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
- Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
- Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
- Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M.
- Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
- Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
- Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
- Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
- Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
- Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
- Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).
- Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
- Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
- Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
- Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
- Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
- Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
- Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
- Annesley, T. M.
- Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
- Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
- Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416 (2009).
- Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).
