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Bioengineering

कैंसर सेल संस्कृतियों से एकत्र मध्यम में तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किए गए चुनिंदा किनुरेन्स का एक साथ मात्राकरण

Published: May 9, 2020 doi: 10.3791/61031
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Separation and Spectroscopic Method Applications, Centre for Interdisciplinary Research, The John Paul II Catholic University of Lublin

Summary

यहां वर्णित कैंसर सेल संस्कृतियों से एकत्र माध्यम में काइनुरेनिन मार्ग (काइनुरेनिन, 3-हाइड्रोक्सीक्यूरेनिन, एक्सनथ्यूरिनिक एसिड, 3-हाइड्रोक्सिथ्रिलिक एसिड) में उत्पन्न चार अलग-अलग ट्रिप्टोफान मेटाबोलाइट्स के निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल है जो एक क्वाड्रपोल स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया जाता है।

Abstract

किनुरेनिन पाथवे और किनुरेनिन्स नामक ट्राइप्टोफान कैटाबोलाइट्स को प्रतिरक्षा विनियमन और कैंसर जीव विज्ञान में उनकी भागीदारी के लिए बढ़ा हुआ ध्यान मिला है। एक इन विट्रो सेल संस्कृति परख का उपयोग अक्सर रोग तंत्र में विभिन्न ट्रिप्टोफान कैटाबोलाइट्स के योगदान के बारे में जानने और चिकित्सीय रणनीतियों के परीक्षण के लिए किया जाता है। कोशिका संस्कृति माध्यम जो स्रावित मेटाबोलाइट्स और सिग्नलिंग अणुओं से समृद्ध है, ट्रिप्टोफान मेटाबोलिज्म और अन्य सेलुलर घटनाओं की स्थिति को दर्शाता है। जटिल सेल संस्कृति माध्यम में कई kynurenines के विश्वसनीय मात्राकरण के लिए नए प्रोटोकॉल कई नमूनों के एक विश्वसनीय और त्वरित विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए वांछित हैं । इसे तरल क्रोमेटोग्राफी के साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ पूरा किया जा सकता है। इस शक्तिशाली तकनीक मेटाबोलाइट्स के मात्राकरण के लिए कई नैदानिक और अनुसंधान प्रयोगशालाओं में कार्यरत है और kynurenines को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

यहां प्रस्तुत तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग चार किनुरेनिन्स के एक साथ निर्धारण के लिए एकल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एसक्यू) के साथ मिलकर किया गया है, यानी किनुरेनिन, 3-हाइड्रोक्सीकिनुरेनिन, 3-हाइड्रोक्सीनथ्रिनिलिक, और विट्रो कल्चरल कैंसर कोशिकाओं से एकत्र किए गए माध्यम में xanthurenic एसिड । एसक्यू डिटेक्टर का उपयोग करने के लिए सरल है और अन्य बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर की तुलना में कम महंगा है। एसक्यू-एमएस विश्लेषण में, नमूने से कई आयनों को उनके विशिष्ट मास-टू-चार्ज अनुपात(एम/जेड)के अनुसार उत्पन्न और अलग किया जाता है, जिसके बाद एकल आयन मॉनिटरिंग (सिम) मोड का उपयोग करके पता लगाया जाता है।

यह पेपर रिपोर्ट की गई विधि के फायदों पर ध्यान खींचता है और कुछ कमजोर बिंदुओं को इंगित करता है। यह क्रोमेटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ नमूना तैयारी सहित एलसी-एसक्यू विश्लेषण के महत्वपूर्ण तत्वों पर केंद्रित है। गुणवत्ता नियंत्रण, विधि अंशांकन स्थितियों और मैट्रिक्स प्रभाव के मुद्दों पर भी चर्चा की जाती है। हमने 3-नाइट्रोटिरोसिन के एक साधारण आवेदन को सभी लक्ष्य विश्लेषण के लिए एक एनालॉग मानक बताया। जैसा कि मानव अंडाशय और स्तन कैंसर कोशिकाओं के साथ प्रयोगों द्वारा पुष्टि की गई है, प्रस्तावित एलसी-एसक्यू विधि विश्वसनीय परिणाम उत्पन्न करती है और आगे अन्य इन विट्रो सेलुलर मॉडलों पर लागू की जा सकती है।

Introduction

किनुरेनिन पाथवे (केपी) मानव कोशिकाओं में ट्राइप्टोफान (टीआरपी) कैटाबोलिज्म का प्रमुख मार्ग है। इंडोलमाइन-2,3-डायोक्सीजेनेज (इडो-1) एक्सपेरिमेंटिक कोशिकाओं में केपी का पहला और सीमन एंजाइम है और टीआरपी को एन-फॉर्मिलक्नुरेनिन1में परिवर्तित करता है। केपी के भीतर आगे के कदम अन्य माध्यमिक मेटाबोलाइट्स उत्पन्न करते हैं, अर्थात् किनुरेनिन जो विभिन्न जैविक गुणों को प्रदर्शित करते हैं। Kynurenine (Kyn) पहली स्थिर टीआरपी कैटाबोलाइट विषाक्त गुणों को दिखाने और aryl हाइड्रोकार्बन रिसेप्टर (AhR)2के लिए बाध्यकारी के बाद सेलुलर घटनाओं को विनियमित है । इसके बाद, Kyn को अनायास या एंजाइम-मध्यस्थता प्रक्रियाओं में कई अणुओं में बदल दिया जाता है, जो 3-हाइड्रोक्सीक्यून्यूरेनिन (3HKyn), एंथ्रोलिक एसिड (एए), 3-हाइड्रोक्सेन्थ्रिलिक एसिड (3-HAA), kynurenic एसिड (Kyna), और xanthurenic एसिड (XA) जैसे मेटाबोलाइट्स पैदा करते हैं । एक और डाउनस्ट्रीम मेटाबोलाइट, 2-अमीनो-3-कार्बोक्सीमुकोनिक एसिड-6-सेमीलडिहाइड (एसीएम), क्विनोलिक एसिड (क्यूए) या पिकालिक एसिड (पीए)1के लिए गैर-एंजाइमेटिक साइक्लिंग से गुजरता है । अंत में क्यूए को आगे निकोटिनामाइड-एडेनाइन डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडी+)3,केपी एंड-पॉइंट मेटाबोलाइट में तब्दील कर दिया जाता है जो एक महत्वपूर्ण एंजाइम कोफैक्टर है । कुछ किनुरेन्स में न्यूरोप्रोटेक्टिव गुण जैसे कि कायना और पीए होते हैं, जबकि अन्य, यानी, 3HAA और 3HKyn, विषाक्त4हैं। Xanthurenic एसिड, जो 3HKyn से बनता है, एंटीऑक्सीडेंट और वासोरलेक्सेशन गुण5प्रस्तुत करता है । XA एजिंग लेंस में जमा होता है और एपिथेलियल कोशिकाओं के एपोप्टोसिस की ओर जाता है6. 20वीं शताब्दी के मध्य में वर्णित केपी ने विभिन्न विकारों में अपनी भागीदारी का प्रदर्शन करने पर अधिक ध्यान दिया। इस मेटाबोलिक मार्ग की बढ़ी हुई गतिविधि और कुछ किनुरेनिन्स का संचय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करता है और अवसाद, सिजोफ्रेनिया, एंसेफेलोपैथी, एचआईवी, डिमेंशिया, एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस, मलेरिया, अल्जाइमर, हंटिंगटन रोग और कैंसर4,7जैसी विभिन्न रोगों की स्थितियों से जुड़ा हुआ है। टीआरपी मेटाबॉलिज्म में कुछ परिवर्तन ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंटमेंट्स और कैंसर कोशिकाओं में देखे जाते हैं2,8. इसके अलावा, kynurenines आशाजनक रोग मार्कर 9 के रूप में मानाजाताहै । कैंसर अनुसंधान में, इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल अच्छी तरह से स्थापित किए जाते हैं और व्यापक रूप से कैंसर रोधी दवाओं के लिए प्रतिक्रियाओं के पूर्व-नैदानिक मूल्यांकन के लिए उपयोग किए जाते हैं10। टीआरपी मेटाबोलाइट्स को कोशिकाओं द्वारा संस्कृति माध्यम में स्रावित किया जाता है और उन्हें किनुरेनिन मार्ग की स्थिति का आकलन करने के लिए मापा जा सकता है। इसलिए, एक आसान, लचीला और विश्वसनीय प्रोटोकॉल के साथ विभिन्न जैविक नमूनों में यथासंभव अधिक से अधिक केपी मेटाबोलाइट्स का एक साथ पता लगाने के लिए उपयुक्त तरीके विकसित करने की आवश्यकता है।

इस पेपर में, हम कैंसर कोशिकाओं से एकत्र किए गए संस्कृति के बाद के माध्यम में एलसी-एसक्यू द्वारा चार किनुरेनिन पाथवे मेटाबोलाइट्स के एक साथ दृढ़ संकल्प के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं: Kyn, 3HKyn, 3HAA, और XA। आधुनिक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण में, तरल क्रोमेटोग्राफी13,14,15,16 को जैव रासायनिक गैर-विशिष्ट परिशोधन के विपरीत, ईहरलिच रिएजेंट11,12 का उपयोग करने के विपरीत व्यक्तिगत ट्रिप्टोफान कैटाबोलाइट्स का एक साथ पता लगाने और मात्राकरण के लिए पसंद कियाजाताहै। वर्तमान में, मानव नमूनों में किनुरेन्स निर्धारण के लिए कई विधियां उपलब्ध हैं, मुख्य रूप से पराबैंगनी या फ्लोरेसेंस डिटेक्टरों13,17, 18,19के साथ तरल क्रोमेटोग्राफी पर आधारित हैं। तरल क्रोमेटोग्राफी एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डिटेक्टर (एलसी-एमएस) के साथ मिलकर इस प्रकार के विश्लेषण के लिए अधिक उपयुक्त लगता है, उनकी उच्च संवेदनशीलता (पता लगाने की निचली सीमा), चयनशीलता और पुनरावृत्ति के कारण।

टीआरपीमेटाबोलाइट्स पहले से ही मानव सीरम, प्लाज्मा और मूत्र13, 20, 21,22,23में निर्धारित किया गया है, हालांकि, सेल संस्कृति माध्यम कीतरहअन्य जैविक नमूनों के लिए तरीके भी वांछित हैं। इससे पहले, मानव ग्लियोमा कोशिकाओं, मोनोसाइट्स, डेंड्रिटिक कोशिकाओं या एस्ट्रोसाइट्स के इलाज के बाद एकत्र किए गए माध्यम में टीआरपी-व्युत्पन्न यौगिकों के लिए एलसी-एमएस का उपयोग इंटरफेरॉन गामा (आईएफएन-γ)24, 25, 26के साथ कियाजाताथा। वर्तमान में, नए मान्य प्रोटोकॉल की आवश्यकता है जो कैंसर मॉडल में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न संस्कृति मीडिया, कोशिकाओं और उपचारों में कई मेटाबोलाइट्स के आकलन की अनुमति दे सकते हैं।

विकसित विधि का उद्देश्य (एक विश्लेषणात्मक रन के भीतर) चार प्रमुख किनुरेनिन्स को निर्धारित करना है जो केपी में असामान्यताओं को इंगित कर सकते हैं। यहां प्रस्तुत एक आंतरिक मानक (3-नाइट्रोटिरोरोसिन, 3NT) का उपयोग कर चयनित सार्थक kynurenines के मात्रात्मक एलसी-एसक्यू विश्लेषण के लिए हमारे हाल ही में प्रकाशित प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम हैं, जो इन विट्रो सुसंस्कृत मानव कैंसर कोशिकाओं से एकत्र किए गए माध्यम में27हैं। हमारे सर्वोत्तम ज्ञान के लिए, यह इन विट्रो उगाई कोशिकाओं से प्राप्त संस्कृति माध्यम में 3HKyn, 3HAA, Kyn और XA के एक साथ मात्राकरण के लिए पहला एलसी-एसक्यू प्रोटोकॉल है। कुछ संशोधनों पर, विधि को सेल संस्कृति मॉडल की एक व्यापक श्रृंखला में टीआरपी चयापचय में परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए आगे लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. मानक 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA मानक स्टॉक समाधान की तैयारी

  1. उच्चतम सटीकता (0.3 मिलीग्राम प्रत्येक) के साथ एक शीशी में अभिकर्मकों का वजन करें। बेहतर सटीकता के लिए, रिएजेंट्स को स्केल करें, स्टेप 1.2 के अनुसार सॉल्वेंट की मात्रा को समायोजित करें।
  2. 1 g/L का स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए सॉल्वेंट के 300 माइक्रोन में रिएजेंट्स को भंग करें पानी में 1% (v/v) फॉरमिक एसिड (एफए) में 3NT भंग करें; केन, 3HAA, और XA में डाइमथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ); हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के साथ पीएच 2.5 को अम्लीय पानी में 3HKyn।
    सावधानी: 3HAA आंखों, नाक, गले और फेफड़ों को परेशान करता है। यह हानिकारक है जब साँस, त्वचा के संपर्क में है, और अगर निगल लिया । उचित सुरक्षा यानी दस्ताने और मास्क पहनें।
  3. शीशी को कसकर बंद करें और विघटन में तेजी लाने के लिए इसे 1 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक स्नान में रखें।
    नोट: स्टॉक समाधानों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और स्टॉक समाधानों की अस्थिरता के कारण ठंड/विगलन (3 चक्र अधिकतम) को कम करें।

2. चारकोल उपचारित संस्कृति माध्यम की तैयारी

  1. एक ट्यूब में, 280 मिलीग्राम सक्रिय चारकोल का वजन करें और ब्याज की कोशिकाओं को तैयार करने के लिए तैयार तरल माध्यम का 5 एमएल जोड़ें।
  2. एक देखने पर मध्यम और लकड़ी का कोयला के साथ ट्यूब हिला 2 घंटे के लिए देखा झूली कुरसी, कमरे के तापमान पर (५० दोलनों के लिए गति सेट/ इसके बाद, 15 मिनट के लिए 6000 x g पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें।
  3. अपकेंद्रित्र से ट्यूब निकालें और ध्यान से तलछट परेशान किए बिना सुपरनेट इकट्ठा करें। सभी चारकोल अवशेषों को हटाने के लिए, यदि आवश्यक हो तो अपकेंद्री दोहराएं।
  4. 0.45 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके सुपरनैंट को फ़िल्टर करें।
  5. सुनिश्चित करें कि चारकोल पूर्वअनुचारित संस्कृति माध्यम एलसी-एमएस पर एक पायलट नमूना चलाकर kynurenines निशान से वंचित है के रूप में कदम ६.३.२ में वर्णित है । अन्यथा, चरण 2.1-2.4 दोहराएं।
    नोट: यदि पूर्ण संस्कृति माध्यम शुरू में kynurenines शामिल नहीं है, शुद्धिकरण चारकोल का उपयोग कर कदम छोड़ा जा सकता है । इस मामले में, आमतौर पर सेल संस्कृति के लिए तैयार किए गए पूर्ण माध्यम का उपयोग करके अंशांकन मानकों और गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों को तैयार करें।
  6. तैयार माध्यम को विश्लेषण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. अंशांकन समाधान और अंशांकन घटता बनाना

  1. 0.1 ग्राम/एल 3NT समाधान के 0.75 माइक्रोन के साथ चारकोल प्रीपचारित संस्कृति माध्यम को स्पाइक करें और अंशांकन श्रेणियों को कवर करने के लिए कम से कम छह अलग-अलग सांद्रता में चार मानकों (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) जोड़ें। प्रत्येक नमूने की अंतिम मात्रा 150 माइक्रोल भंवर में अच्छी तरह से रखें। नमूना तैयार करने के लिए 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब का उपयोग करें।
    नोट: 3HKyn के लिए सुझाए गए अंशांकन अंक: 0.018, 0.045, 0.22, 1.12, 2.23, 4.46 माइक्रोमोल/एल; Kyn के लिए: 0.0096, 0.048, 0.24, 1.20, 2.40, 3.84 μmol/L; 3HAA के लिए: 0.033, 0.16, 0.65, 3.27, 6.53, 13.06 μmol/L; XA के लिए: 0.019, 0.13, 0.49, 1.22, 3.65, 4.87 μmol/L.
  2. नमूना डेप्रोटीनाइजेशन के लिए प्रत्येक ट्यूब में 1% (v/v) फोर्मिक एसिड युक्त ठंड मेथनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया) का 150μL जोड़ें। कसकर ट्यूब और भंवर अच्छी तरह से बंद करो।
  3. नमूनों को 40 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. 15 मिनट के लिए 14,000 एक्स ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें। सेंट्रलाइज से ट्यूब निकालें। नई ट्यूबों में सुपरनेटेंट ले लीजिए। तलछट को परेशान न करें।
  5. एक स्वचालित पिपेट का उपयोग करके ग्लास शीशी में सुपरनैट के 270 माइक्रोन स्थानांतरित करें। वाष्पीकरण में शीशियों रखो और धीरे सूखी जब तक वाष्पित । अस्थिर घटकों को वाष्पित करने के लिए पानी/मेथनॉल अंशों के लिए उपयुक्त कार्यक्रम का उपयोग करें । 40 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान न लगाएं और अधिक सूखने से बचें।
    नोट: फ्लैट बॉटम ग्लास शीशियां, यानी क्रोमेग्राफिक शीशियां प्लास्टिक शंकुन ट्यूबों की तुलना में तेजी से वाष्पीकरण और अधिक वसूली की सुविधा प्रदान करती हैं।
  6. 30 मिनट के बाद वाष्पीकरण की स्थिति की जांच करें। यदि आवश्यक हो, तो वाष्पीकरण जारी रखें (उदाहरण के लिए, अतिरिक्त 10 मिनट जोड़ें)। ओवर ड्राई होने से बचें।
  7. वाष्पीकरण से शीशियों को हटा दें। प्रत्येक नमूने को 0.1% (v/v) पानी में 0.1% (v/v) फोर्मिक एसिड के 60 माइक्रोल में पुनर्गठित करें। अवशिष्ट सामग्री युक्त शीशी में सॉल्वेंट जोड़ें। शीशियों और भंवर-कुएं को कसकर बंद करें।
  8. नमूने को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और उपजी प्रोटीन को अलग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर स्पिन करें।
  9. प्रोटीन गोली को परेशान किए बिना, सुपरनेटेंट को स्वचालित पिपेट के साथ शंकु ग्लास आवेषण के साथ क्रोमेग्राफिक शीशियों में स्थानांतरित करें। शीशियों को कसकर बंद करें।
  10. सम्मिलित शीशी में हवा के बुलबुले की उपस्थिति की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो उन्हें हटा दें (उदाहरण के लिए, भंवर से)।
  11. नमूनों वाली क्रोमेटोग्राफिक शीशियों को एलसी ऑटोसंपलर में स्थानांतरित करें। ऑटोसंप्लर ट्रे में रखे गए नमूनों की स्थिति रिकॉर्ड करें।

4. गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) नमूनों की तैयारी

  1. कैलिब्रेशन वक्र्स की रैखिक रेंज से चयनित एक एकाग्रता पर 0.1 ग्राम/एल 3NT समाधान और चार kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) के मानकों के 0.75 μL के साथ चारकोल-प्रीट्रीप्ड कल्चर मीडियम (1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज्ड ट्यूब में तैयार) स्पाइक करें। नमूने की अंतिम मात्रा 150 माइक्रोन पर रखें।
    नोट: यदि लागू हो, तो अंशांकन वक्र की रैखिक सीमा के तहत आने वाली विभिन्न सांद्रता पर कई क्यूसी नमूने तैयार करें।
  2. धारा 3 (चरण 3.2-3.11) में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करें।

5. एलसी-एमएस प्रणाली की स्थापना

  1. मोबाइल चरण सॉल्वैंट्स तैयार करें: सॉल्वेंट ए: अल्ट्रापुरे पानी में 20 mmol/L अमोनियम फोर्टमेट (पीएच 4.3 फॉरमिक एसिड के साथ समायोजित); सॉल्वेंट बी: 100% एसीटोनीट्रिल।
    नोट: केवल बोरोसिलिकेट ग्लास बोतलों का उपयोग करें। इसे रिफिल करने से पहले अल्ट्रापुरे पानी से बोतलें कुल्लाएं। डिटर्जेंट से साफ की गई बोतलों का इस्तेमाल न करें।
    सावधानी: एसीटोनिट्रिल गंभीर स्वास्थ्य प्रभाव या मृत्यु का कारण बनता है। यह गर्मी से आसानी से प्रज्वलित हो जाता है। एसीटोनिट्रिल लिक्विड और वाष्प आंखों, नाक, गले और फेफड़ों को परेशान कर सकते हैं।
    1. कांच की बोतल में अल्ट्रापुरे पानी के 50 एमएल में क्रिस्टलीय रिएजेंट (15.77 ग्राम) को भंग करके अमोनियम फोर्टमेट का 5 मोल/एल स्टॉक घोल तैयार करें। जब तक सभी अवशेष भंग न हो जाएं तब तक हिलाएं। किसी भी अवशिष्ट मलबे को हटाने के लिए 0.45 माइक्रोन झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करें (उदाहरण के लिए, नायलॉन सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके)। स्टॉक सॉल्यूशन को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. एक एम्बर ग्लास की बोतल में 980 मिलियन पानी के लिए पानी में 5 मोल/एल अमोनियम formate के 4 एमएल जोड़कर सॉल्वेंट ए तैयार करें और अच्छी तरह से हलचल करें। एक सरगर्मी बार विसर्जित कर दिया और एक चुंबकीय उभारकर पर विलायक के साथ बोतल डाल दिया। समाधान में एक पीएच इलेक्ट्रोड विसर्जित करें और सरगर्मी के तहत पीएच को नियंत्रित करें। फोर्मिक एसिड स्टॉक समाधान जोड़ें (98%-100%) पीएच 4.3 प्राप्त करने के लिए 0.2 मिली लीटर टिप के साथ एक स्वचालित पिपेट का उपयोग करके ड्रॉपवाइज, अल्ट्रापुरे पानी के साथ 1 एल तक की मात्रा को समायोजित करें और अच्छी तरह से हिलाएं।
      नोट: किसी भी माइक्रोबियल विकास को रोकने के लिए सप्ताह में कम से कम एक बार सॉल्वैंट्स तैयार करें।
      सावधानी: हाँस लेने पर टॉमिक एसिड (एफए) विषाक्त होता है, त्वचा जलने और आंखों को नुकसान पहुंचाता है। धूम हुड के तहत काम करें; सुरक्षात्मक दस्ताने और कोट पहनें।
    3. किसी भी अवशिष्ट मलबे को हटाने के लिए 0.22 माइक्रोन झिल्ली (जैसे, नायलॉन सिरिंज फिल्टर) के माध्यम से सभी समाधान फ़िल्टर करें। वैकल्पिक रूप से, आने वाले कणों से सिस्टम की रक्षा के लिए एलसी सॉल्वेंट जलाशयों के लिए समर्पित सॉल्वेंट इनलेट फिल्टर का उपयोग करें।
  2. एलसी-एमएस नियंत्रण और डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें।
  3. बुलबुले को हटाने के लिए मोबाइल चरण के साथ एलसी सिस्टम को शुद्ध करें, और सभी सॉल्वेंट चैनलों को प्राइम करें।
  4. विश्लेषणात्मक कॉलम को क्लोजिंग से बचाने के लिए एक गार्ड कॉलम पहनावा।
  5. गार्ड और विश्लेषणात्मक कॉलम (C18, 2.1 x 100 मिमी, 1.8 माइक्रोन) के बारे में 30 मिनट के लिए 100% एसीटोनि्रिल के साथ फ्लश करें, और फिर कॉलम में स्थिर दबाव देखा जाता है जब तक 100% विलायक ए के साथ। नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रणाली प्रदर्शन को नियंत्रित करें।
  6. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में उपयुक्त एलसी पैरामीटर सेट करें।
    1. ढाल कार्यक्रम की स्थापना: 0-8 मिनट विलायक बी 0%; 8-17 मिनट विलायक बी 0-2%; 17-20 मिनट विलायक बी 2%; 20-32 मिनट विलायक बी 10-30%; 32-45 मिनट सॉल्वेंट बी 0% ।
    2. मोबाइल चरण प्रवाह दर 0.15 एमएल/मिनट पर सेट करें, 45 मिनट के लिए कुल विश्लेषण रन समय, कॉलम तापमान +40 डिग्री सेल्सियस पर और इंजेक्शन की मात्रा 10 माइक्रोन पर।
  7. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डिटेक्टर के अधिग्रहण मापदंडों को निर्धारित करें।
    1. आयनीकरण पैरामीटर लागू करें: एकल आयन निगरानी (सिम), सकारात्मक आयनीकरण, 50 साई का नेबुलाइजर दबाव, +350 डिग्री सेल्सियस सुखाने गैस का तापमान, 12 एल/मिनट के गैस प्रवाह सूखने, और 5500 वी केशिका वोल्टेज।
    2. विश्लेषण निगरानी आयनों का चयन करें: 3HKyn m/z 225.0 के लिए (स्कैन अवधि: 2-6 मिनट, खंडित वोल्टेज: 100 V); Kyn m/z 209.0 के लिए (स्कैन अवधि: 6-12 मिनट, खंडित वोल्टेज: 80 V); 3HAA m/z 154.0 के लिए (स्कैन अवधि: 12-18 मिनट, खंडित वोल्टेज: 80 V); 3NT m/z 227.0 के लिए (स्कैन अवधि: 18-23 मिनट, खंडित वोल्टेज: 100 V); XA m/z 206.0 के लिए (स्कैन अवधि: 23-45 मिनट, खंडित वोल्टेज: 100 V)।
  8. एक वर्कलिस्ट का निर्माण और एलसी प्रणाली पर नमूने चलाते हैं।
  9. सबसे पहले, प्रायोगिक नमूनों के विश्लेषण से पहले, कम से कम ट्रिपलआईटी में एक खाली नमूना (सॉल्वेंट ए) चलाएं, इसके बाद एक क्यूसी नमूना।
  10. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और क्यूसी नमूने के लिए प्राप्त परिणामों को लोड करें।
  11. क्रोमेटोग्राम पर एनालिटे चोटियों की स्थिति की जांच करें। जब सिग्नल अपेक्षित स्थिति से परे शिफ्ट होते हैं तो उपयुक्त विश्लेषण संकेतों के संग्रह के लिए समय द्वार समायोजित करें। सिग्नल एकीकरण पर निर्देश के लिए सॉफ्टवेयर मैनुअल देखें।

6. अंशांकन वक्र का निर्माण

  1. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, वर्कलिस्ट में अंशांकन मानकों को जोड़ें और ट्रिपलिट्स में मानकों को चलाएं।
  2. क्रमशः लगभग 4.4 मिनट, 10 मिनट, 16 मिनट, 21 मिनट और 30 मिनट के प्रतिधारण समय पर 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT और XA के अनुरूप चोटी के क्षेत्र को एकीकृत और मापें।
  3. स्प्रेडशीट कार्यक्रम का उपयोग करके प्रत्येक मेटाबोलाइट के लिए व्यक्तिगत अंशांकन घटता का निर्माण करें।
    1. अंशांकन चार्ट बनाने के लिए, 3NT पीक क्षेत्र पर एनालिटे पीक क्षेत्र के अनुपात के लिए मूल्य की साजिश करें बनाम विश्लेषण की एकाग्रता।
    2. खाली नमूने का विश्लेषण करें (लकड़ी का कोयला-पूर्वनिचारित संस्कृति माध्यम केवल 3NT के साथ नुकीला) यह सुनिश्चित करने के लिए कि माध्यम में अध्ययन किए गए विश्लेषण का कोई निशान नहीं है। अन्यथा, प्रत्येक अंशांकन बिंदु से प्राप्त मूल्य को घटाएं।
    3. प्रत्येक अंशांकन वक्र की रैखिकता की जांच करें।
      1. व्यक्तिगत रूप से, प्रत्येक विश्लेषण के लिए, एक ढलान-अवरोधन रैखिक समीकरण (वाई = एक्स + बी) बनाएं, जहां वाई एनालिटे पीक क्षेत्र बनाम 3 एनटी पीक क्षेत्र के अनुपात से मेल खाता है, एक ढलान है, एक्स विश्लेषण एकाग्रता (μmol/L) है, और बी वक्र अवरोधक को संदर्भित करता है। ग्राफ 'वाई' बनाम 'एक्स' की साजिश रचने से अंशांकन वक्र उत्पन्न होगा।
      2. चार्ट में एक रैखिक ट्रेंडलाइन जोड़ें, चार्ट पर अंशांकन वक्र समीकरण और प्रतिगमन गुणांक प्रदर्शित करें। सुनिश्चित करें कि प्रतिगमन गुणांक और 0.990 है। बेमेल अंशांकन मानकों के मामले में, तैयार करें और/या इनका एक बार फिर विश्लेषण करें । वैकल्पिक रूप से, अंशांकन वक्र की एकाग्रता सीमा बदलें।
    4. प्रयोगात्मक नमूनों का विश्लेषण करने से पहले सिस्टम प्रदर्शन की जांच करने के लिए क्यूसी नमूनों का विश्लेषण करें। असंगति (संदर्भ मूल्य से 20% विचलन ± के मामले में), नए अंशांकन घटता तैयार करें।

7. इन विट्रो सेल संस्कृति और विश्लेषण के लिए नमूना संग्रह

  1. डीएमईएम (Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम) में अध्ययन कैंसर कोशिकाओं (एमडीए-एमबी-231 या एसके-ओवी-3) की प्लेट जिसमें ᴅ-ग्लूकोज के 4.5 ग्राम/एल होते हैं, 10% (v/v) भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2 mmol/L ʟ-ग्लूटामाइन और 1 यू पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन और संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के आर्द्र वातावरण में उन्हें प्रयोग के लिए विस्तार करने के लिए । 80% की ढुलमुलता पर कोशिकाओं को मार्ग।
  2. ट्रिपसिन का उपयोग करके संस्कृति पकवान से अलग कोशिकाओं, 0.3 × 10 6 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से एक घनत्व पर 12 अच्छीतरह से प्लेटों पर प्रयोग के लिए बीज और एक इनक्यूबेटर में रात भर जगह है।
  3. अगले दिन, संस्कृति माध्यम को आकांक्षी करें और प्रायोगिक डिजाइन के आधार पर अध्ययन किए गए यौगिकों के अलावा या बिना नए डीएमईएम जोड़ें।
  4. 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं के ऊपर से माध्यम (लगभग 500 माइक्रोन) को 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। किसी भी सेल मलबे को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 14, 000 x g पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को इकट्ठा करें और विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. प्रोटीन अनुमान के लिए सेलुलर गोली को चरण 7.4 से बचाएं। नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
    नोट: विभिन्न कुओं से एक माध्यम के लिए प्राप्त परिणामों को व्यक्तिगत कुओं में सेल संख्या में परिवर्तनशीलता के लिए खाते में कुल प्रोटीन सामग्री के लिए सामान्यीकृत किया जाना चाहिए । प्रोटीन एकाग्रता का आकलन किया जा सकता है जैसा कि चरण 9 में वर्णित है।

8. एलसी-एमएस विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करें

  1. कमरे के तापमान पर जमे हुए नमूने को पिघलाएं और अच्छी तरह से मिलाएं। संस्कृति माध्यम के 149.25 माइक्रोन को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब (1.5 एमएल) में स्थानांतरित करें।
  2. 3NT समाधान (आंतरिक मानक) के 0.1 ग्राम/एल के 0.75 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूब और भंवर अच्छी तरह से बंद करें।
  3. नमूना डेप्रोटीनाइजेशन के लिए 1% (v/v) एफए युक्त -20 डिग्री सेल्सियस मेथनॉल पर ठंडा 150 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूब और भंवर अच्छी तरह से बंद करें।
  4. धारा 3 (चरण 3.3-3.11) में वर्णित नमूना तैयारी के साथ जारी रखें।
    नोट: एसके-OV-3 की तरह कुछ कैंसर कोशिकाओं को एक संस्कृति माध्यम में Kyn की बड़ी मात्रा में स्राव । अंशांकन वक्र की एक रैखिक रेंज में डेटा फिट करने के लिए, नमूने के लगभग 100 गुना कमजोर पड़ने आवश्यक है। इस मामले में, पानी में 0.1% (v/v) एफए के साथ नमूने के एक हिस्से को पतला करें और बिना पतला नमूने के अलावा विश्लेषण करें। अंशांकन वक्र के लिए मानकों के संदर्भ नमूने 100 गुना पतला पूर्ण संस्कृति माध्यम में तैयार किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, प्रयोगात्मक नमूने में Kyn के एकाग्रता स्तर पर समायोजित करने के लिए अंशांकन वक्र (यदि उचित घुलनशीलता और रैखिकता प्राप्त कर रहे हैं) में अधिक अंक जोड़ें।
  5. धारा 5 में वर्णित एलसी-एमएस द्वारा नमूनों का विश्लेषण करें। एक वर्कलिस्ट का निर्माण करें और प्रत्येक नमूने को ट्रिपलीकेट में चलाएं।
  6. वर्कलिस्ट पूरा होने के बाद, विश्लेषण के पीक एरिया को मापें।
  7. उपलब्ध सॉफ्टवेयर और प्राप्त संख्यात्मक डेटा का उपयोग करके एक स्प्रेडशीट उत्पन्न करें।
  8. एक स्प्रेडशीट कॉलम में 3NT पीक क्षेत्र पर एनालिटे पीक क्षेत्र के अनुपात की गणना करें।
  9. प्रयोगात्मक नमूनों में मौजूद विश्लेषण की सांद्रता की गणना करने के लिए प्रत्येक विश्लेषण (चरण 6.3 से) के लिए समर्पित एक व्यक्तिगत रैखिक अंशांकन समीकरण का उपयोग करें।

9. प्रोटीन सामग्री और डेटा सामान्यीकरण का आकलन

  1. 1.5 एमएल ट्यूब में फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 100 माइक्रोन के साथ स्टेप 7.5 से सेलुलर पेलेट को फिर से रीसुस्ट करें।
    नोट: 8 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 0.2 ग्राम पोटेशियम क्लोराइड, 1.44 ग्राम सोडियम फॉस्फेट डायबेसिक, पोटेशियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट को 950 एमएल अल्ट्रापुरे पानी में घोलकर पीबीएस समाधान तैयार करें। अच्छी तरह से हिलाओ। पीएच को हाइड्रोक्लोरिक एसिड (ड्रॉपवाइज) के साथ 7.4 पर समायोजित करें। अल्ट्रापुरे पानी के साथ 1 एल तक वॉल्यूम को एडजस्ट करें। सजातीय होने तक अच्छी तरह से हिलाओ।
    सावधानी: हाइड्रोक्लोरिक एसिड अत्यधिक संक्षारक है और उपयुक्त सुरक्षा सावधानियों के साथ संभाला जाना चाहिए। मानव त्वचा के साथ संपर्क लालिमा, दर्द, त्वचा जलने का कारण बन सकता है। धूम हुड के तहत काम करें; सुरक्षात्मक दस्ताने और कोट पहनें।
  2. नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें और फिर बर्फ पर डिफ्रॉस्ट करें। इस चरण को 3x दोहराएं।
  3. 14, 000 एक्स ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूनों को सेंट्रलाइज करें। नई ट्यूबों में सुपरनेटेंट ले लीजिए। गोली को परेशान न करें।
  4. पीबीएस के साथ सुपरनेटेंट 10x को पतला करें।
  5. प्रोटीन प्रति अच्छी रेंज के 0 से 2 माइक्रोग्राम तक एक अंशांकन वक्र का निर्माण करें।
    1. अंशांकन के लिए गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) मानक समाधान तैयार करें। 1 एमएल ऑफ अल्ट्रापुरे वाटर और भंवर कुएं में बीएसए के 1.23 माइक्रोग्राम घोलें।
    2. एक 96-अच्छी प्लेट पर, बीएसए मानक समाधान (1.23 माइक्रोग्राम/एमएल) की विभिन्न मात्रा लोड करें: 0 माइक्रोन, 2 माइक्रोन, 4 माइक्रोन, 5 माइक्रोन, 7 माइक्रोन, 10 माइक्रोल, 15 माइक्रोन, 20 माइक्रोन।
    3. 50 μL की अंतिम मात्रा के लिए पीबीएस के साथ अच्छी तरह से भरें।
  6. लोड 10 - 15 μL सेल एक ही 96-अच्छी तरह से प्लेट पर कदम 9.4 से lysate। 50 माइक्रोन की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए पीबीएस के साथ कुओं को भरें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो अंशांकन वक्र की रैखिक सीमा में फिट होने के लिए प्रत्येक कुएं में सेल लिसेट एलिकोट की मात्रा को समायोजित करें। नमूने के 50 माइक्रोन को अंतिम मात्रा में अच्छी तरह से रखें।
  7. प्रत्येक कुएं में ब्रैडफोर्ड रिएजेंट (अल्ट्रापुरे पानी के साथ 5-बार पतला) के 200 माइक्रोल जोड़ें।
  8. कमरे के तापमान पर कम से कम 5 मिनट के लिए 96-अच्छी तरह से पीटे को इनक्यूबेट करें। प्लेट को माइक्रोप्लेट रीडर में डालें। λ = 595 एनएम पर अवशोषण को मापें।
  9. स्प्रेडशीट कार्यक्रम का उपयोग करके एक अंशांकन वक्र का निर्माण करें। बीएसए राशि (माइक्रोन) बनाम अवशोषण की साजिश करें। एक रैखिक ट्रेंडलाइन जोड़ें, चार्ट पर अंशांकन वक्र समीकरण और प्रतिगमन गुणांक प्रदर्शित करें।
  10. रैखिक समीकरण (वाई = ऐक्स + बी, जहां वाई λ = 595 एनएम पर अवशोषण से मेल खाता है, एक ढलान है, एक्स एक प्रोटीन सामग्री (μg) है, और बी नमूने में प्रोटीन की मात्रा की गणना करने के लिए वक्र अवरोधक को संदर्भित करता है।
    नोट: गणना में एक नमूना कमजोर पड़ने कारक पर विचार करें ।
  11. प्रति 1 मिलीग्राम प्रोटीन के नमूने में काइनुरेनिन की मात्रा को सामान्य करने के लिए अनुमानित प्रोटीन सामग्री का उपयोग करें। ऐसा करने के लिए, चरण 9.10 से कुल प्रोटीन सामग्री के साथ चरण 8.9 में निर्धारित kynurenines की एकाग्रता को विभाजित करें।

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Representative Results

एलसी-एमएस जैविक रूप से सक्रिय अणुओं के परिमाणीकरण में निर्विवाद लाभ प्रस्तुत करता है, भले ही जटिल नमूनों के कुछ घटक तथाकथित मैट्रिक्स प्रभाव और विश्लेषण के समझौते आयनीकरण का कारण बनते हैं। यह आयन दमन या आयन वृद्धि की ओर जाता है, दृढ़ता से सटीकता कम करने और एलसी-एमएस, जो विधि के एक ' कमजोर ' बिंदु के रूप में माना जाता है की पहचान/मात्राकरण की एक सीमा को प्रभावित । हमारे प्रोटोकॉल में, आयनों को सकारात्मक मोड में इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) द्वारा उत्पन्न किया जाता है, जिसे टीआरपी मेटाबोलाइट्स दृढ़ संकल्प13पर अन्य अध्ययनों में भी नियोजित किया गया था। ईएसआई, हालांकि, वायुमंडलीय दबाव रासायनिक आयनीकरण (एपीसीआई)28की तुलना में मैट्रिक्स प्रभाव से अधिक प्रवण है । इस प्रकार, सेल कल्चर माध्यम में टीआरपी मेटाबोलाइट्स के सटीक मात्राकरण के लिए, हमने विश्लेषणात्मक संकेत पर मैट्रिक्स-निर्भर प्रभावों की भरपाई करने और नमूना तैयारी चरण के दौरान लक्ष्य यौगिकों के नुकसान को सही करने के लिए एक आंतरिक मानक और मैट्रिक्स-मिलान अंशांकन का उपयोग किया। हमने सभी अध्ययन किए गए विश्लेषण (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) के लिए एक ही आंतरिक मानक (3NT) लागू किया। 3NT मूल, ताजा सेल खेती के लिए इस्तेमाल माध्यम में नहीं पाया गया था और लागू विश्लेषणात्मक शर्तों के तहत लक्ष्य यौगिकों की तरह एक समान व्यवहार से पता चलता है । इससे 3NT उपयुक्त आंतरिक मानक27बनाता है । इसके अलावा, प्रोटोकॉल को सरल बनाने के लिए, इसे उपयोगकर्ताओं के एक व्यापक समूह के लिए अधिक सुलभ बनाने के लिए, हम 1% (v/v) एफए युक्त मेथनॉल के साथ उपचार द्वारा प्रोटीन हटाने से जुड़े नमूना तैयारी के केवल एक कदम का प्रस्ताव करते हैं ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल के भीतर, सेल संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले पूर्ण माध्यम का उपयोग करके अंशांकन घटता तैयार करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, संस्कृति माध्यम में अंतर्जात Kyn हो सकता है जो विश्लेषणकौट पीक क्षेत्र के उचित अनुमान को परेशान करता है, विशेष रूप से कम सांद्रता पर अंशांकन समाधानों में। चित्रा 1A 4.5 ग्राम/एल डी-ग्लूकोज (डीएमईएम-एचजी) और 10% (v/v) एफबीएस युक्त डीएमईएम के विश्लेषण के दौरान प्राप्त एलसी-एसक्यू परिणामों को दिखाता है जो हमारे समूह द्वारा कैंसर सेल संस्कृति के लिए उपयोग किया जाता है। हमने पाया है कि ताजा पूर्ण संस्कृति माध्यम में शुरू में कुछ Kyn होता है जिसे सक्रिय चारकोल(चित्रा 1 बी)के साथ शुद्धि द्वारा हटाया जा सकता है। प्रायोगिक नमूनों का विश्लेषण करते समय, पूर्ण डीएमईएम-एचजी संस्कृति माध्यम को भी नियंत्रण नमूने के रूप में विश्लेषण किया गया था, और प्रत्येक परीक्षण नमूने में Kyn के लिए दर्ज पीक क्षेत्र से Kyn पीक क्षेत्र को घटाया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: सक्रिय चारकोल पर पूर्व उपचार के बाद पूर्ण डीएमईएम-एचजी संस्कृति माध्यम (ए) से पहले और (बी) के प्रतिनिधि एलसी-एसक्यू परिणाम। संस्कृति माध्यम के नमूनों को आंतरिक मानक (3NT) की समान राशि के साथ नुकीला किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

निम्नलिखित चरण में, प्रत्येक लक्ष्य विश्लेषण के लिए एक प्रतिधारण समय स्थापित किया गया था (चित्रा 2 एमें एक क्रोमोग्राम देखें)। एलसी-एमएस विश्लेषण में अच्छा अभ्यास विश्लेषण के उचित प्रतिधारण समय की पुष्टि करने के लिए वास्तविक नमूनों से पहले एक क्यूसी नमूना चलाना है। कभी-कभी, एलसी संकेतों में बदलाव देखा जा सकता है, और बेमेल होते हैं। चित्रा 2B विश्लेषण के प्रतिधारण समय में थोड़ा परिवर्तन दिखाता है, जो हालांकि, सही माप को परेशान नहीं करता है। दूसरी ओर, चित्रा 2C लक्ष्य चोटियों की स्थिति में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रस्तुत करता है । जैसा कि देखा गया, 3NT सिग्नल को काफी कम प्रतिधारण समय की ओर स्थानांतरित कर दिया गया था और सेट समय गेट से बाहर आ गया था। इस मामले में, एक उपयुक्त मात्रात्मक विश्लेषण असंभव था क्योंकि आंतरिक मानक संकेत को सही ढंग से मापा नहीं जा सकता है। यह कई कारकों के कारण हो सकता है, यानी अपर्याप्त कॉलम संतुलन, पंप में सॉल्वैंट्स का गलत मिश्रण, अनुचित नमूना मंद या कॉलम स्थिर चरण के संदूषण का उपयोग। चित्रा 2D,हालांकि, एक स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है, जब पंजीकृत चोटियों गंभीर रूप से कम तीव्रता से पीड़ित हैं । यह एक इंजेक्शन विफलता, सिस्टम में रिसाव या एमएस क्षति का परिणाम हो सकता है। इसके अलावा, सह-eluting मैट्रिक्स घटक लक्ष्य विश्लेषण के लिए चुने गए एम/जेड के साथ आयन उत्पन्न कर सकते हैं, जैसे चित्रा 3 एमें, जहां एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं संस्कृति माध्यम के विश्लेषण से परिणाम दिखाया जाता है। लगभग 25 मिनट के अवधारण समय पर, अज्ञात मैट्रिक्स घटक (यौगिक एक्स) से प्राप्त एक मजबूत संकेत देखा गया। चोटी स्कैन अवधि में दिखाई देता है, जब m/z २०६ (XA के लिए चयनित) के आयन पर नजर रखी गई थी । हालांकि, यह संकेत प्रतिधारण समय की असंगति के कारण विश्लेषण के अनुरूप नहीं है। पीक एकीकरण के दौरान गलतियों से बचने के लिए, क्यूसी नमूनों के लिए दर्ज किए गए एक के साथ प्रतिधारण समय की तुलना की भी सिफारिश की जाती है।

Figure 2
चित्रा 2। सही और गलत परिणामों के उदाहरण। क्यूसी नमूना विश्लेषण के सही क्रोमेटोग्राम(ए)मध्यम और(बी)निम्न एकाग्रता स्तर पर अलग-अलग दिनों में दर्ज किए गए। गलत क्रोमेटोग्राम का उदाहरण जो एनालाइट्स(सी)के अवधारण समय में महत्वपूर्ण परिवर्तन और चोटियों(डी)की असंतोषजनक तीव्रता के परिणामस्वरूप होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3। विभिन्न कैंसर सेल लाइनों से एकत्र संस्कृति माध्यम के प्रतिनिधि परिणाम। एलसी-एसक्यू का उपयोग करके(ए)एमडीए-एमबी-231 (मानव स्तन कैंसर) और(बी)एसके-ओवी-3 (मानव अंडाशय कैंसर) कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया । यौगिक एक्स संस्कृति माध्यम में मौजूद एक अज्ञात यौगिक के संकेत को इंगित करता है जो एनालिटे के साथ सह-elutes और आयनाइज को एनालिटे के लिए चुने गए एम/जेड के साथ आयन बनाने के लिए करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कैंसर कोशिकाओं (डीएमईएम) के लिए उपयोग किए जाने वाले संस्कृति माध्यम में टीआरपी की महत्वपूर्ण मात्रा होती है। इसका आइसोटोप(13सी-टीआरपी) XA(m/z २०६) के रूप में एक ही आयन साझा करता है और XA दृढ़ संकल्प के साथ हस्तक्षेप कर सकता है । हालांकि, एप्लाइड क्रोमेग्राफिक स्थितियों के तहत टीआरपी से सिग्नल को एक्सए सिग्नल से अच्छी तरह से अलग किया जाता है। इसलिए, हमने निष्कर्ष निकाला कि डीएमईएम में मौजूद टीआरपी XA मात्राकरण और विधि की सटीकता को प्रभावित नहीं करता है(चित्र 4)।

Figure 4
चित्र 4. एमएस क्रोमेटोग्राम पर ट्राइप्टोफन (टीआरपी) और एक्सएनथुरनिक एसिड (XA) संकेतों की स्थिति। टीआरपी (49.0 माइक्रोमोल/एल) और एक्सए (48.8 माइक्रोमोल/एल) के मानक समाधान अनुकूलित एलसी-एसक्यू शर्तों के तहत सॉल्वेंट ए (20 mmol/L अमोनियम फोरमेट इन वाटर, पीएच 4.3) में तैयार किए गए थे। एम/जेड २०५ ([टीआरपी + एच]+ +के अनुरूप) और एम/जेड २०६ ([XA + H]+ +के अनुरूप) के आयनों पर क्रमशः टीआरपी और एक्सए के लिए नजर रखी गई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रस्तुत विश्लेषणात्मक विधि सफलतापूर्वक रैखिकता, परिशुद्धता (भिन्नता ≤15%), सटीकता (96-104%), वसूली (96-119%), और सभी विश्लेषण के लिए मैट्रिक्स प्रभाव के संदर्भ में सत्यापन परीक्षण पारित कर दिया, जैसे कि यह हमारे पिछले कागज 27में विस्तार से वर्णित किया गया था ।

अंत में, हमने इन विट्रो सुसंस्कृत मानव कैंसर कोशिकाओं से एकत्र किए गए माध्यम के लिए वर्णित विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण के एक आवेदन की पुष्टि की। हमारे डेटा ने पुष्टि की है कि विभिन्न सेल प्रकारों(चित्र 3)से एकत्र किए गए संस्कृति माध्यम में किनुरेनिन का स्तर काफी भिन्न हो सकता है। हमने क्रमशः स्तन और अंडाशय के कैंसर से प्राप्त 2 प्रकार की कैंसर लाइनों यानी एमडीए-एमबी-231 और एसके-ओवी-3 कोशिकाओं से संस्कृति माध्यम का विश्लेषण किया। चयनित लाइनों अक्सर मॉडल के रूप में आणविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए और कैंसर विरोधी दवा परीक्षण के लिए उपयोग किया जाता है । जैसा कि हमने देखा, एक नियंत्रण मानक माध्यम में सुसंस्कृत कोशिकाओं ने ट्राइप्टोफान मेटाबोलाइट्स की विभिन्न मात्रा जारी की, यानी, एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं ने कम nmol/L एकाग्रता(चित्रा 3A)में Kyn और XA की मात्रात्मक मात्रा जारी की, जबकि एसके-ओवी-3 कोशिकाओं ने काफी अधिक Kyn, XA का बहुत कम स्राव दिखाया, और अन्य अध्ययन किए गए किनुरेनिन का कोई स्राव नहीं किया गया जैसा कि इसी चोटियों(चित्रा 3B)की तीव्रता से संकेत मिलता है।

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Discussion

यह पेपर चार प्रमुख टीआरपी मेटाबोलाइट्स (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) के एक साथ मात्राकरण के लिए एक विस्तृत एलसी-एसक्यू प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जिसे इन विट्रो सुसंस्कृत मानव कैंसर कोशिकाओं से एक माध्यम में मापा जाता है। नमूना तैयार करने, क्रोमेग्राफिक/मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रक्रिया, और डेटा व्याख्या, विश्लेषण के भीतर सबसे महत्वपूर्ण बिंदुओं पर विशेष ध्यान दिया जाता है।

सामान्य तौर पर, उच्च संवेदनशीलता के कारण एलसी-एमएस विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल सख्ती और उपयोग की गई सामग्रियों की शुद्धता के उच्चतम मानकों की आवश्यकता होती है। यह बड़े करीने से साफ और ठीक से धोया कांच के बर्तन, साथ ही मानक प्रक्रिया भर में उच्च ग्रेड रसायनों के एक आवेदन को संदर्भित करता है । माइक्रोबियल संदूषण से बचने के लिए मोबाइल चरण के ताजे पानी आधारित सॉल्वैंट्स का उपयोग करना बहुत महत्वपूर्ण है कि इस संवेदनशील दृष्टिकोण में विश्लेषण को काफी प्रभावित कर सकता है। एलसी प्रणाली में इंजेक्शन लगाने से पहले, विश्लेषण किए गए नमूनों को किसी भी अघुलनशील कणों की उपस्थिति के लिए सावधानीपूर्वक जांच करने की आवश्यकता होती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि नमूना विश्लेषण से पहले कॉलम को पर्याप्त रूप से बराबर किया जाना चाहिए। इन नियमों का पालन करने में विफलता के परिणामस्वरूप नमूनों, एलसी सिस्टम और विश्लेषणात्मक कॉलम या एमएस स्रोत में अपर्याप्त नमूना आयनीकरण हो सकता है, अंत में संकेतों का एक बदलाव हो सकता है।

प्रोटोकॉल के भीतर 2 प्रमुख बिंदु हैं जिन्हें इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए जोर देने की आवश्यकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा नमूना तैयारी कदम है। अपर्याप्त प्रक्रिया का उपयोग करने से लक्ष्य यौगिकों की हानि होती है और परिणामस्वरूप गलत मात्रा में होता है । हमारे दृष्टिकोण में, विधि विकास के दौरान, प्रोटीन हटाने के लिए सॉल्वेंट के चयन के साथ-साथ नमूना तैयारी चरण को सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया गया था। जैसा कि हमने निर्धारित किया, 1% (v/v) फोर्मिक एसिड युक्त मेथनॉल के साथ नमूना उपचार सभी अध्ययन kynurenines के लिए सबसे अच्छा वसूली मिले । एनालिट आयनीकरण की सीमा पर मोबाइल चरण संरचना के प्रभाव का भी मूल्यांकन किया गया था। हमने मोबाइल चरणों की जांच की है जिसमें 0-20 mmol/L अमोनियम फोरमेट या अमोनियम एसीटेट शामिल हैं जो फोर्मिक या एसिटिक एसिड के साथ समायोजित विभिन्न पीएच पर हैं । 20 mmol/L अमोनियम फोर्टमेट इन वॉटर (पीएच ४.३, सॉल्वेंट ए) और एसीटोनिट्रिल (सॉल्वेंट बी) वाले मोबाइल फेज ने काइएन, 3HKyn, 3HAA और XA27के एक साथ मात्रा के लिए सर्वोत्तम संभव स्थितियां प्रदान कीं । एलसी-एमएस विश्लेषण में एक और महत्वपूर्ण कदम पीक एकीकरण है। कुछ किनुरेनिन्स बहुत कम एकाग्रता स्तर पर एक नमूने में होते हैं। इस मामले में, सह-eluting यौगिकों के संकेत लक्ष्य विश्लेषण संकेत के साथ ओवरलैप या एक समान प्रतिधारण समय पर एक चोटी उत्पन्न हो सकता है । इस विधि के एक अनुभवहीन उपयोगकर्ता को एक सही चोटी एकीकरण के साथ कुछ कठिनाइयां मिल सकती हैं, जैसा कि चित्रा 2 सीमें उदाहरण है। इस प्रकार, विश्लेषण के लिए प्रतिधारण समय की जांच और क्यूसी नमूने के साथ तुलना करना आवश्यक है और अत्यधिक अनुशंसित है।

अच्छा विश्लेषणात्मक अभ्यास मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त आंतरिक मानक का चयन भी शामिल है। इसके साथ ही, हम चार किनुरेन्स के एनालॉग के रूप में केवल एक आंतरिक मानक (3NT) का उपयोग करके एक सरल और लागत प्रभावी दृष्टिकोण का प्रस्ताव करते हैं। परिणामों ने इस बात की पुष्टि की कि 3NT लक्ष्य यौगिकों की तरह समान क्रोमेग्राफिक व्यवहार प्रस्तुत करता है और परिणामस्वरूप यहविधि 27की अच्छी सटीकता और सटीकता प्राप्त करने की अनुमति देता है । लागू एलसी शर्तों के तहत, 3NT चोटी अच्छी तरह से अन्य विश्लेषण के संकेतों से अलग है और मापने के लिए आसान है। हमें पता है कि इस तरह के विश्लेषणों में उपयोग किए जाने वाले आइसोटोपुलिकल लेबल आंतरिक मानक (आईलिस)14,15 मैट्रिक्स प्रभावों का बेहतर मुआवजा और सभी चरों का बेहतर नियंत्रण प्रदान करेगा जो झूठे परिणाम दे सकते हैं। दूसरी ओर, सभी लक्ष्य विश्लेषण के लिए ILISs हमेशा आसानी से उपलब्ध नहीं होते हैं, अकेले अपनी उच्च लागत को छोड़ देते हैं। इसके अलावा, ILISs एकल आयन निगरानी (सिम) मोड है कि हम इस कागज में कार्यरत के साथ एलसी-एस के बजाय एलसी-एमएस/एमएस के लिए समर्पित कर रहे हैं ।

एक आंतरिक मानक के रूप में 3NT का उपयोग प्रोटीन29पर 3-नाइट्रोथारोसिन गठन की संभावना के कारण विधि की एक सीमा के रूप में यहां माना जा सकता है । हालांकि, संस्कृति माध्यम के मामले में, हमने किसी भी मुक्त अंतर्जात 3-नाइट्रोटिरोसिन का पालन नहीं किया। यह हमें एक उपयुक्त आंतरिक मानक के रूप में 3NT पहचानते हैं । हालांकि, हम एक प्रारंभिक अंतर्जात 3NT स्तर के पूर्व मूल्यांकन की सलाह देते हैं, खासकर जब इस रिपोर्ट में परीक्षण की तुलना में अन्य सेल प्रकारों का अध्ययन करते हैं।

संक्षेप में, किसी भी विश्लेषण के एनालॉग का चयन करते समय, किसी को कई विशेषताओं पर विचार करने की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, रासायनिक समानता और नमूना मैट्रिक्स में प्रारंभिक अनुपस्थिति। इसके अलावा, एक नमूना मैट्रिक्स में एनालॉग आंतरिक मानक की स्थिरता, मैट्रिक्स घटकों की उपस्थिति में इसकी वसूली और आयनीकरण दक्षता लक्ष्य यौगिकों से भिन्न हो सकती है। इस प्रकार, विधि विकास के दौरान इन सभी विशेषताओं पर विचार किया जाना चाहिए और सावधानीपूर्वक जांच की जानी चाहिए।

प्रस्तुत विधि में विश्लेषणात्मक प्रणाली जिसमें एक एमएस डिटेक्टर शामिल है, ने हमें पता लगाने की कम सीमा (0.0033 - 0.0108 μmol/L)27प्राप्त करने की अनुमति दी। इस तरह से 3HKyn के एक साथ माप, Kyn, 3HAA, XA ०.०१८ की एकाग्रता पर्वतमाला के भीतर-४.४६ μmol/L, ०.००९६-३.८४ μmol/L, ०.०३३-१३.०६ माइक्रोमोल/एल, और ०.०१९-४.८७ μmol/L, क्रमशः हासिल किया गया था । किसी भी एलसी-एसक्यू विश्लेषण की मुख्य सीमा एलसी कॉलम पर नमूना घटकों के उचित पृथक्करण से जुड़ी है। खराब पृथक्करण उत्पाद आयनों और मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) मोड का उपयोग करने वाले एक टैंडेम क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ पता लगाने की तुलना में कम चयनशीलता में योगदान देता है। अन्य मैट्रिक्स घटकों से हस्तक्षेप से बचने के लिए जो एक लक्ष्य अणु के साथ समान या समान आयनों को साझा करते हैं, एलसी अलगाव की स्थिति को सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया जाना चाहिए। एक उदाहरण के रूप में, 13सी टीआरपी आइसोटोप (ट्रेस मात्रा में मौजूद) XA निगरानी के लिए चयनित एम/जेड २०६ के समान आयन उत्पन्न करता है । क्रोमेग्राफिक स्थितियों को अनुकूलित करके यहां गलत व्याख्या से बचा गया और कॉलम(चित्र 4)से टीआरपी और एक्सए के संतोषजनक पृथक्करण से परहेज किया गया ।

भविष्य के अनुप्रयोगों में, प्रोटोकॉल में कुछ संशोधनों को लागू किया जा सकता है। एक संभावित उपयोगकर्ता आंतरिक मानक (3NT) की एकाग्रता को संशोधित कर सकता है जब अध्ययन किए गए किनुरेन्स के स्तर से यहां प्रस्तुत सांद्रता में गिरावट आने की उम्मीद है। महत्वपूर्ण बात, 3NT एकाग्रता अंशांकन मानकों और प्रायोगिक नमूनों दोनों में एक ही होना चाहिए । एक अत्यंत उच्च विश्लेषण स्तर के मामले में, जैसे कि एसके-ओवी-3 कोशिकाओं में मनाया गया Kyn, हम 3NT की उच्च एकाग्रता के साथ काम करने की सलाह देते हैं। यदि नमूना कमजोर पड़ने की आवश्यकता है, तो एलसी कॉलम पर नमूना इंजेक्शन से पहले प्रोटोकॉल के अंतिम चरण में इसे किया जा सकता है।

साहित्य में विभिन्न कोशिकाओं से संस्कृति माध्यम में कानुरेनिन्स के एलसी-एमएस/एमएस मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कुछ प्रोटोकॉल प्रस्तावित हैं । एक प्रोटोकॉल 3 मेटाबोलाइट्स, यानी, Kyn, 3HKyn और 3HAA का एक साथ निर्धारण प्रदान करता है, लेकिन यह हमारी विधि21के विपरीत कम संवेदनशील (मात्राकरण (LOQ) की उच्च स्तर पर सीमा है । एक अन्य रिपोर्ट में एक विधि प्रस्तुत की गई है जो इसी तरह के LOQs25के साथ Kyn, 3HKyn, 3HAA और XA सहित 4 kynurenines के मात्राकरण की अनुमति देता है । हालांकि, उनमें से किसी को भी इन विट्रो सुसंस्कृत कैंसर कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न किनुरेन्स का पता लगाने के लिए अनुकूलित नहीं किया गया था। नमूना मैट्रिक्स के घटक सिग्नल को कम करने या बढ़ाने से एमएस स्रोत में विश्लेषण आयनीकरण को प्रभावित करते हैं, जो अविश्वसनीय परिणामों का एक कारण है। अधिक सटीक डेटा प्राप्त करने के लिए, हमने मैट्रिक्स-निर्भर प्रभावों के बेहतर मुआवजे के लिए मैट्रिक्स-मिलान अंशांकन के साथ संयोजन में एक एनालॉग आंतरिक मानक (3NT) का उपयोग करने का प्रस्ताव किया।

प्रस्तुत पद्धति का उपयोग करते हुए, हम देख सकते हैं कि कार्न विश्लेषण कैंसर सेल प्रकारों से एकत्र किए गए संस्कृति माध्यम में सबसे प्रचुर मात्रा में टीआरपी मेटाबोलाइट था, जबकि नियंत्रण संस्कृति स्थितियों के तहत अन्य अध्ययन मेटाबोलाइट्स का पता नहीं लगाया गया था (ट्रेस में मौजूद XA को छोड़कर लेकिन पता लगाने योग्य मात्रा)। हालांकि, जब कोशिकाओं को एक शक्तिशाली प्रतिरक्षा सक्रियक के साथ उत्तेजित किया गया था - बैक्टीरियल लिपोपोलिनासैकराइड, Kyn के अलावा एक्सए की एक बड़ी मात्रा स्रावित किया गया था।  दूसरी ओर, केपी के भीतर XA के ऊपर से बनने वाले 3HKyn और 3HAA का पता लगाया गया था, जो अभी भी LOQ27के तहत थे । इससे पता चलता है कि संस्कृति माध्यम में छोटी मात्रा में मौजूद कुछ केपी मेटाबोलाइट्स को प्रस्तावित एलसी-एसक्यू दृष्टिकोण का उपयोग करके मापना मुश्किल हो सकता है। फिर भी, प्रस्तुत प्रोटोकॉल जमा कुंजी टीआरपी मेटाबोलाइट्स के परिमाणीकरण द्वारा केपी में परिवर्तन की पहचान करने के लिए उपयोगी है। भविष्य के अध्ययनों में इस पद्धति को नियोजित करने के लिए एक इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणाली संलग्न प्रतिरक्षा से संबंधित रोगों और कैंसर के उपंयास बायोमार्कर उद्धार होगा । हमारा दृष्टिकोण सेलुलर मॉडल के लिए प्रासंगिक संवेदनशीलता के साथ एक मान्य और विश्वसनीय परख लाता है जो डाउनस्ट्रीम केपी मेटाबोलाइट्स की कम सांद्रता के कारण चुनौतीपूर्ण हैं। प्रदान किए गए निर्देश विभिन्न क्षेत्रों के शोधकर्ताओं को कैंसर और अन्य बीमारियों से संबंधित प्रमुख किन्नूरेनियों के परिमाणीकरण के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने की अनुमति देंगे । हमारे डेटा (अप्रकाशित) से पता चलता है कि यह विभिन्न ग्लाइशन उत्पादों के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में केपी मॉड्यूलेशन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, लेकिन इसे प्रतिरक्षा घटक के साथ अन्य अनुसंधान क्षेत्रों और रोगों में एक आवेदन भी लगाना चाहिए, यानी एंडोमेट्रियम जीव विज्ञान और प्रजनन30में।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल को अतिरिक्त विश्लेषण निर्धारित करने के लिए और विस्तारित किया जा सकता है जो विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों के दौरान संस्कृति माध्यम में जमा हो सकता है। मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने से पहले सटीकता, परिशुद्धता, रैखिकता, वसूली या चयनशीलता के संदर्भ में विधि सत्यापन के लिए विश्लेषण के उचित संदर्भ मानकों को नियोजित किया जाना चाहिए। फ्यूथरमोर, अनुसंधान उद्देश्य के आधार पर, प्रोटोकॉल का उपयोग व्यक्तिगत किनुरेन्स (3HKyn, Kyn, 3HAA या XA) के लिए किया जा सकता है। इस मामले में, विश्लेषण के लिए विचार नहीं कर रहे हैं कि यौगिकों के लिए इसी आयनों, एमएस सेटिंग्स से हटा दिया जा सकता है। एलसी ढाल कार्यक्रम में उपयुक्त परिवर्तन विश्लेषण समय पर काटने के साथ मदद मिलेगी ।

केपी का अध्ययन करते समय, इडो एंजाइम की गतिविधि का आकलन करना प्रासंगिक है। यह सिर्फ टीआरपी की खपत को मापने और Kyn एक संस्कृति माध्यम में जारी करने या एक kynurenine-से-triptophan एकाग्रता अनुपात ([Kyn]/[Trp])31की गणना करके अनुमान लगाया जा सकता है । हमारे दृष्टिकोण में, हमने टीआरपी एकाग्रता को मापा नहीं है, हालांकि, एलसी-एसक्यू विश्लेषण में इस लक्ष्य को जोड़कर प्रोटोकॉल का विस्तार किया जा सकता है। एक अधिक जैव रासायनिक रूप से उपयुक्त दृष्टिकोण के रूप में, हम प्रति मिनट प्रोटीन के प्रति मिलीग्राम कोशिकाओं द्वारा उत्पादित Kyn की मात्रा के रूप में IDO एंजाइमेटिक गतिविधि व्यक्त करने की सलाह देते हैं जैसा कि कहीं और प्रस्तुत किया गयाहै। हमने कैंसर कोशिकाओं (तैयारी में पांडुलिपि) पर हमारे अन्य अध्ययनों में इस दृष्टिकोण का उपयोग करने में एक लाभ देखा है और इन विट्रो सेल कल्चर मॉडल का उपयोग करते समय इस विधि की सलाह देते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को यूरोपीय संघ द्वारा पूर्वी पोलैंड के परिचालन कार्यक्रम विकास के तहत यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष से समर्थन दिया गया था 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), जैव प्रौद्योगिकी के संकाय और पर्यावरण विज्ञान के संकाय द्वारा जॉन पॉल द्वितीय कैथोलिक विश्वविद्यालय लुब्लिन (युवा वैज्ञानिकों अनुदान इलोना सवोक के लिए), पोलिश नेशनल साइंस सेंटर, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 मगदलीना Staniszewska, सिद्धांत अन्वेषक के लिए) ।  लेखकों ने सेल क्रीडिंग और प्रोटीन क्वांटिफिकेशन के लिए उपकरण साझा करने के लिए ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस, सेंटर फॉर इंटरडिसिप्लिनरी रिसर्च, जेपीआईआई CUL की प्रयोगशाला से प्रो एग्निस्का स्काइबियर का शुक्रिया अदा किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-hydroksy-DL-kynurenina Sigma-Aldrich H1771
3-hydroxyanthranilic acid Sigma-Aldrich 148776 97%
3-nitro-L-tyrosine Sigma-Aldrich N7389
Acetonitrile Supelco 1.00029 hypergrade for LC-MS LiChrosolv
Activated charcoal Supelco 05105 powder
Analytical balance Ohaus
Analytical column Agilent Technologies 959764-902 Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm)
Ammonium formate Supelco 7022 eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0%
Bovine Serum Albumin Sigma 1001887398
Caps for chromatographic vials Agilent Technologies 5185-5820 blue screw caps,PTFE/red sil sepa
Cell culture dish Nest 704004 polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Cell culture plate Biologix 07-6012 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille
Cell incubator Thermo Fisher Scientific HERAcell 150i Cu
Centrifuge Eppendorf model 5415R
Centrifuge Eppendorf model 5428
Centrifuge tubes Bionovo B-2278 Eppendorf type, 1.5 mL
Centrifuge tubes Bionovo B-3693 Falcon type, 50 mL, PP
Chromatographic data acqusition and analysis software Agilent Technologies LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Chromatographic insert vials Agilent Technologies 9301-1387 100 µL
Chromatographic vials Agilent Technologies 5182-0714 2 mL, clear glass
Dimethyl sulfoxide Supelco 1.02950 Uvasol
Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) PAN Biotech P04-41450
Dual meter pH/conductivity Mettler Toledo SevenMulti
Evaporator Genevac model EZ-2.3 Elite
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F9665
Formic acid Supelco 5.33002 for LC-MS LiChropur
Glass bottle for reagents storage Bionovo S-2070 50 mL, clear glass
Guard column Agilent Technologies 959757-902 Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm)
Hydrochloric acid Merck 1.00317.1000
L-kynurenine Sigma-Aldrich K8625 ≥98% (HPLC)
Magnetic stirrer Wigo ES 21 H
Microbalance Mettler Toledo model XP6
Milli-Q system Millipore ZRQSVPO30 Direct-Q 3 UV with Pump
Quadrupole mass spectrometer Agilent Technologies G1948B model 6120
Penicillin-Streptomycin Sigma-Adrich 048M4874V
Plate reader Bio Tek Synergy 2 operated by Gen5
Potassium chloride Merck 1.04936.1000
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1.05108.0500
Protein Assay Dye Reagent Concentrate BioRad 500-0006
See-saw rocker Stuart SSL4
Serological pipette Nest 326001 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Merck 1.06346.1000
Solvent inlet filter Agilent Technologies 5041-2168 glass filter, 20 μm pore size
Solvent reservoir (for LC-MS) Agilent Technologies 9301-6524 1 L, clear glass
Solvent reservoir (for LC-MS) Agilent Technologies 9301-6526 1 L, amber glass
Spreadsheet program Microsoft Office Microsoft Office Excel
Stir bar Bionovo 6-2003 teflon coated
Syringe filters for culture medium filtration Bionovo 7-8803 regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm
Syringe filters for mobile phase components filtration Bionovo 6-0018 nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm
Tissue culture plates VWR 10062-900 96-wells, sterille
Trypsin-EDTA Solution Sigma-Aldrih T4049-100 mL
Ultra-High Performance Liquid Chromatography system Agilent Technologies G1367D, G1379B, G1312B, G1316C 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C)
Ultrasound bath Polsonic 104533 model 6D
Vortex Biosan model V-1 plus
Xanthurenic acid Sigma-Aldrich D120804 96%

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 159 तरल-क्रोमेटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री ट्रिप्टोफान मेटाबोलाइट्स किनुरेनिन 3-हाइड्रोक्सीक्यून्यूरेनिन एक्सनथ्यूरिनिक एसिड 3-हाइड्रोक्सेन्थ्रिलिक एसिड कैंसर कोशिकाएं नमूना तैयारी
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Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures. J. Vis. Exp. (159), e61031, doi:10.3791/61031 (2020).

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