Summary
Beskrevet her er en protokol til bestemmelse af fire forskellige tryptofan metabolitter genereret i kynureninvejen (kynurenin, 3-hydroxykynurenin, xanthurensyre, 3-hydroxyanthranilic syre) i mediet indsamlet fra kræftcellekulturer analyseret af flydende kromatografi kombineret med en enkelt firdoblet massespektrometri.
Abstract
Den kynurenine vej og tryptophan katabolitter kaldet kynureniner har fået øget opmærksomhed for deres engagement i immun regulering og kræftbiologi. En in vitro celle kultur assay bruges ofte til at lære om bidraget fra forskellige tryptophan katabolitter i en sygdom mekanisme og til test terapeutiske strategier. Cellekultur medium, der er rig på udskilles metabolitter og signalering molekyler afspejler status for tryptofan stofskifte og andre cellulære begivenheder. Nye protokoller for pålidelig kvantificering af flere kynureniner i det komplekse cellekulturmedium ønskes for at muliggøre en pålidelig og hurtig analyse af flere prøver. Dette kan opnås med flydende kromatografi kombineret med massespektrometri. Denne kraftfulde teknik anvendes i mange kliniske laboratorier og forskningslaboratorier til kvantificering af metabolitter og kan bruges til måling af kynureniner.
Præsenteret her er brugen af flydende kromatografi kombineret med enkelt firedobbelt massespektrometri (LC-SQ) til samtidig bestemmelse af fire kynureniner, dvs. kynurenin, 3-hydroxykynurenin, 3-hydroxyanthranilic og xanthurensyre i mediet indsamlet fra in vitro dyrkede kræftceller. SQ detektor er enkel at bruge og billigere i forhold til andre massespektrometre. I SQ-MS-analysen genereres og adskilles flere ioner fra prøven i henhold til deres specifikke masse-til-opladningsforhold (m/z), efterfulgt af detektionen ved hjælp af en SIM-tilstand (Single Ion Monitoring).
Dette papir henleder opmærksomheden på fordelene ved den rapporterede metode og angiver nogle svage punkter. Den fokuserer på kritiske elementer i LC-SQ-analyse, herunder prøveforberedelse sammen med kromatografi og massespektrometrianalyse. Kvalitetskontrol, metodekalibreringsbetingelser og matrixeffektproblemer diskuteres også. Vi beskrev en simpel anvendelse af 3-nitrotyrosin som en analog standard for alle målanalysander. Som bekræftet af forsøg med humane æggestokke og brystkræftceller genererer den foreslåede LC-SQ-metode pålidelige resultater og kan anvendes yderligere på andre in vitro-cellulære modeller.
Introduction
Kynurenin vej (KP) er den vigtigste rute for tryptofan (Trp) katabolisme i menneskelige celler. Indoleamin-2,3-dioxygenase (IDO-1) i ekstrahepatiske celler er den første og begrænsende enzym af KP og omdanner Trp til N-formylkynurenin1. Yderligere trin inden for KP generere andre sekundære metabolitter, nemlig kynureniner, der udviser forskellige biologiske egenskaber. Kynurenin (Kyn) er den første stabile Trp katabolit, der viser toksiske egenskaber og regulerer cellulære hændelser efter binding til aryl kulbrintereceptoren (AhR)2. Derefter omdannes Kyn til flere molekyler enten spontant eller i de enzymmedierede processer, der genererer sådanne metabolitter som 3-hydroxykynurenin (3HKyn), anthranilic syre (AA), 3-hydroxyanthranilic syre (3-HAA), kynurensyre (Kyna) og xanthurensyre (XA). En anden downstream metabolit, 2-amino-3-carboxymuconic acid-6-semialdehyd (ACMS), gennemgår ikke-enzymatisk cyclization til quinolinsyre (QA) eller picolinsyre (PA)1. Endelig er QA yderligere omdannet til nicotinamid-adenin dinucleotid (NAD+)3, KP endepunkt metabolit, der er en vigtig enzym cofaktor. Nogle kynureniner har neurobeskyttende egenskaber som Kyna og PA, mens de andre, dvs. 3HAA og 3HKyn, er giftige4. Xanthurensyre, som er dannet af 3HKyn, præsenterer antioxidant og vasorelaxation egenskaber5. XA ophobes i aldrende linser og fører til apoptose af epitelceller6. KP, der blev beskrevet i midten af det 20.århundrede, fik mere opmærksomhed, da dets involvering i forskellige lidelser blev demonstreret. Øget aktivitet af denne metaboliske rute og akkumulering af nogle kynureniner modulerer immunresponset og er forbundet med forskellige patologiske tilstande som depression, skizofreni, encephalopati, HIV, demens, amyotrofisk lateral sklerose, malaria, Alzheimers, Huntingtons Sygdom og kræft4,7. Nogle ændringer i Trp metabolisme observeres i tumor mikromiljøer og kræftceller2,8. Desuden betragtes kynureniner som lovende sygdomsmarkører9. I kræftforskning er in vitro-cellekulturmodeller veletablerede og anvendes i vid udstrækning til præklinisk evaluering af reaktioner på kræftmedicin10. Trp metabolitter udskilles af celler i kulturmediet og kan måles for at vurdere status for kynureninvejen. Derfor er der behov for at udvikle passende metoder til samtidig påvisning af så mange KP-metabolitter som muligt i en række biologiske prøver med en nem, fleksibel og pålidelig protokol.
I dette papir beskriver vi en protokol til samtidig bestemmelse af fire kynureninvejmetabolitter: Kyn, 3HKyn, 3HAA og XA af LC-SQ i et postkulturmedie indsamlet fra kræftceller. I en moderne analytisk tilgang foretrækkes flydende kromatografi13,14,15,16 til samtidig påvisning og kvantificering af de enkelte tryptofan katabolitter, i modsætning til biokemiske uspecifikke assays ved hjælp af Ehrlich reagens11,12. På nuværende tidspunkt er der mange metoder til rådighed til kynureniner bestemmelse i menneskelige prøver, hovedsagelig baseret på flydende kromatografi med ultraviolet eller fluorescens detektorer13,17,18,19. Flydende kromatografi kombineret med en massespektrometridetektor (LC-MS) synes mere egnet til denne type analyse på grund af deres højere følsomhed (lavere detektionsgrænser), selektivitet og repeterbarhed.
Trp metabolitter er allerede blevet bestemt i humant serum, plasma og urin13,20,21,22,23, men metoderne til andre biologiske prøver, som cellekulturmedie, ønskes også. Tidligere blev LC-MS brugt til Trp-afledte forbindelser i et medium indsamlet efter dyrkning af humane gliomceller, monocytter, dendritiske celler eller astrocytter behandlet med interferon gamma (IFN-γ)24,25,26. I øjeblikket er der behov for nye validerede protokoller, der kan tillade en vurdering af flere metabolitter i forskellige kulturmedier, celler og behandlinger, der anvendes i kræftmodeller.
Formålet med den udviklede metode er at kvantificere (inden for en analytisk køre) fire store kynureniner, der kan indikere abnormiteter i KP. Præsenteret her er kritiske trin i vores nyligt offentliggjorte protokol for kvantitativ LC-SQ analyse af udvalgte meningsfulde kynureniner ved hjælp af en intern standard (3-nitrotyrosin, 3NT) i mediet indsamlet fra in vitro dyrkede humane kræftceller27. Så vidt vi ved, er det den første LC-SQ-protokol til samtidig kvantificering af 3HKyn, 3HAA, Kyn og XA i et kulturmedium opnået fra in vitro-dyrkede celler. Ved nogle ændringer, kan metoden anvendes yderligere til at studere ændringerne i Trp metabolisme i en bredere vifte af cellekultur modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af standard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard lagerløsninger
- Reagenserne vejes i et hætteglas med den højeste nøjagtighed (0,3 mg hver). For bedre nøjagtighed skaleres reagenserne op, og opløsningsmidlets volumen justeres i henhold til trin 1.2.
- Reagenserne opløses i 300 μL opløsningsmiddel for at opnå en stamopløsning på 1 g/L. 3NT opløses i 1% (v/v) myresyre (FA) i vand Kyn, 3HAA og XA i dimethylsulfoxid (DMSO); 3HKyn i vand syrnet til pH 2,5 med saltsyre (HCl).
ADVARSEL: 3HAA irriterer øjne, næse, hals og lunger. Det er skadeligt ved indånding, i kontakt med huden, og hvis det sluges. Brug passende beskyttelse, dvs. handsker og maske. - Luk hætteglasset tæt og læg det i et ultralydsbad i 1 minut for at fremskynde opløsningen.
BEMÆRK: Opbevar stamopløsningerne ved -20 °C, og minimer frysning/optøning (maks. 3 cyklusser) på grund af lageropløsningernes ustabilitet.
2. Fremstilling af kulbehandlet kulturmedium
- I et rør vejes 280 mg aktivt kul og tilsættes 5 mL af det flydende medium, der er forberedt til dyrkning af de pågældende celler.
- Ryst røret med medium og trækul på en see saw rocker i 2 timer, ved stuetemperatur (sæt hastigheden til 50 svingninger / min). Dernæst centrifuge rørene ved 6000 x g i 15 min.
- Fjern røret fra centrifuge og opsaml forsigtigt supernatanten uden at forstyrre sedimentet. Gentag centrifugering om nødvendigt for at fjerne alle trækulsrester.
- Supernatanten filtreres med et 0,45 μm sprøjtefilter.
- Sørg for, at det forbehandlede kulkulturmedium fratages kynureninerspor ved at køre en pilotprøve på LC-MS som beskrevet i trin 6.3.2. Ellers skal du gentage trin 2.1-2.4.
BEMÆRK: Hvis det komplette dyrkningsmedium i første omgang ikke indeholder kynureniner, kan rensningstrin ved hjælp af trækul udelades. I dette tilfælde skal du udarbejde kalibreringsstandarder og kvalitetskontrolprøver ved hjælp af det komplette medium, der normalt forberedes til celledyrkning. - Det forberedte medium opbevares ved 4 °C indtil analyse.
3. Fremstilling af kalibreringsløsninger og kalibreringskurver
- Det forbehandlede kulkulturmedium tilsættes med 0,75 μL 0,1 g/L 3NT-opløsning, og der tilsættes fire standarder (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) mindst seks forskellige koncentrationer for at dække kalibreringsområder. Det endelige volumen af hver prøve opbevares ved 150 μL. Vortexbrønd. Der anvendes 1,5 mL centrifugerør til prøveforberedelse.
BEMÆRK: Foreslåede kalibreringspunkter for 3HKyn: 0,018, 0,045, 0,22, 1,12, 2,23, 4,46 μmol/L; for Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/L for 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/l for XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/l. - Der tilsættes 150 μL kold methanol (opbevaret ved -20 °C), der indeholder 1% (v/v) myresyre, i hvert rør til prøveproteinisering. Tæt lukke rør og vortex godt.
- Prøverne inkuberes ved -20 °C i 40 min.
- Prøverne centrifuges ved 14.000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Fjern rørene fra centrifuge. Saml supernatants i de nye rør. Forstyr ikke sedimentet.
- 270 μL af supernatanten overføres til glasglasset ved hjælp af en automatisk pipette. Sæt hætteglassene i fordamperen og fordamp forsigtigt, indtil de er tørre. Brug det relevante program for vand/methanolfraktioner til at fordampe flygtige komponenter. Anvend ikke en temperatur på over 40 °C, og undgå overtørring.
BEMÆRK: Flade bundglasglas, dvs. kromatografiske hætteglas, letter hurtigere fordampning og højere genindvinding i forhold til plastiske koniske rør. - Efter 30 minutter skal du kontrollere fordampningsstatus. Hvis det er nødvendigt, fortsætte fordampning (f.eks tilføje ekstra 10 min). Undgå overtørring.
- Tag hætteglassene ud af fordamperen. Hver prøve rekonstrueres i 60 μL på 0,1 % (v/v) myresyre i vand. Opløsningsmidlet tilsættes det hætteglas, der indeholder restmaterialet. Tæt lukke hætteglas og vortex-godt.
- Prøven overføres til et 1,5 mL rør, og der drejes ved 14.000 x g i 15 minutter ved 4 °C for at adskille det udfældede protein.
- Uden at forstyrre proteinpillen overføres supernatanterne til kromatografiske hætteglas med koniske glasindsatser med en automatisk pipette. Luk hætteglassene tæt.
- Kontroller, om der er luftbobler i skærglasset, og fjern dem om nødvendigt (f.eks. ved hvirvelstrøm).
- De kromatografiske hætteglas, der indeholder prøver, overføres til LC-autosampler. Registrer placeringen af prøver, der er placeret i en autosamplerbakke.
4. Udarbejdelse af kvalitetskontrolprøver (QC)
- Det kulforbehandlede dyrkningsmedium tilsat kul (fremstillet i et 1,5 ml centrifugalrør) tilsat 0,75 μL på 0,1 g/l 3NT-opløsning og standarder for fire kynureniner (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) i en koncentration, der er udvalgt fra kalibreringskurvernes lineære område. Prøvens endelige volumen ved 150 μL.
BEMÆRK: Hvis det er relevant, fremstilles flere QC-prøver i forskellige koncentrationer, der falder ind under kalibreringskurvens lineære område. - Følg den protokol, der er beskrevet i afsnit 3 (trin 3.2-3.11).
5. Opsætning af LC-MS-systemet
- Forbered de mobile faseopløsningsmidler: Opløsningsmiddel A: 20 mmol/L ammoniumformat i ultrapurt vand (pH 4.3 justeret med myresyre); Opløsningsmiddel B: 100% acetonitril.
BEMÆRK: Brug kun borosilikatglasflasker. Skyl flasker med ultrapure vand, før du genopfylder det. Brug ikke flasker, der rengøres med vaskemidler.
ADVARSEL: Acetonitrile forårsager alvorlige sundhedsmæssige virkninger eller død. Det antændes let af varme. Acetonitrile væske og damp kan irritere øjne, næse, hals og lunger.- Der fremstilles en 5 mol/L bestandsopløsning af ammoniumformat ved at opløse et krystallinsk reagens (15,77 g) i 50 ml ultrapurt vand i en glasflaske. Rør rundt, indtil alle rester er opløst. Filtrer gennem 0,45 μm membranen for at fjerne eventuelle restaffald (f.eks. ved hjælp af et nylonsprøjtefilter). Lageropløsningen opbevares ved 4 °C.
- Forbered opløsningsmiddel A ved at tilsætte 4 mL 5 mol/L ammoniumformat i vand til 980 mL ultrapure vand i en ravglasflaske og rør godt. Fordyb en omrøring bar og læg flasken med opløsningsmidlet på en magnetisk omrører. Nedsænk en pH-elektrode i opløsningen, og kontroller pH-indbænkning under omrøring. Tilsættes myresyrelageropløsning (98%-100%) dropwise ved hjælp af en automatisk pipette med 0,2 mL spids for at opnå pH 4,3, justere volumen op til 1 L med ultrapure vand og rør godt.
BEMÆRK: Forbered opløsningsmidlerne mindst en gang om ugen for at forhindre mikrobiel vækst.
ADVARSEL: Myresyre (FA) er giftig ved indånding, forårsager hudforbrændinger og øjenskader. Arbejde under røghætten bære beskyttelseshandsker og frakke. - Filtrer alle opløsninger gennem 0,22 μm membranen (f.eks. nylonsprøjtefilter) for at fjerne eventuelle restaffald. Brug eventuelt de opløsningsmiddelindløbsfiltre, der er dedikeret til LC-opløsningsmiddelreservoirer, for at beskytte systemet mod indkommende partikler.
- Start LC-MS-kontrol- og dataopsamlingssoftware.
- Fjern LC-systemet med den mobile fase for at fjerne bobler og for at prime alle opløsningsmiddelkanaler.
- Ensemble en vagt kolonne for at beskytte den analytiske kolonne fra tilstopning.
- Bevogtnings- og analysekolonnen (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) skylles med 100% acetonitrile i ca. 30 min. og derefter med 100% opløsningsmiddel A, indtil der observeres et stabilt tryk i kolonnen. Styr systemets ydeevne ved hjælp af kontrolsoftwaren.
- Angiv de relevante rembursparametre i dataanskaffelsessoftwaren.
- Opsætning af gradientprogrammet: 0-8 min opløsningsmiddel B 0%; 8-17 min opløsningsmiddel B 0-2%; 17-20 min opløsningsmiddel B 2%; 20-32 min opløsningsmiddel B 10-30%; 32-45 min opløsningsmiddel B 0%.
- Den mobile fasestrømshastighed indstilles til 0,15 mL/min., samlet analysetid i 45 min., kolonnetemperatur ved +40 °C og injektionsvolumen ved 10 μL.
- Angiv anskaffelsesparametrene for massespektrometridetektoren.
- Påfør ioniseringsparametre: enkelt ionovervågning (SIM), positiv ionisering, forstøvertryk på 50 psi, +350 °C tørring af gastemperatur, tørring af gasstrømmen på 12 L/min. og 5500 V kapillærspænding.
- Vælg analysandovervågningsionerne: for 3HKyn m/z 225.0 (scanningsperiode: 2-6 min, fragmentorspænding: 100 V); for Kyn m/z 209.0 (scanningsperiode: 6-12 min, fragmentorspænding: 80 V) for 3HAA m/z 154,0 (scanningsperiode: 12-18 min, fragmentorspænding: 80 V); for 3NT m/z 227,0 (scanningsperiode: 18-23 min, fragmentorspænding: 100 V); for XA m/z 206.0 (scanningsperiode: 23-45 min, fragmentorspænding: 100 V).
- Konstruere en arbejdsliste og køre prøver på LC-systemet.
- Før analysen af forsøgsprøverne udtages der først en blindprøve (opløsningsmiddel A) i det mindste i tre eksemplarer efterfulgt af en QC-prøve.
- Åbn dataanalysesoftwaren, og indlæs de resultater, der er opnået for QC-prøven.
- Kontroller placeringen af analysandtoppe på kromatogrammet. Når signalerne skifter ud over den forventede position, justeres tidsportene for at indsamle passende analysandsignaler. Se softwaremanualen for at få vejledning i signalintegration.
6. Konstruktion af kalibreringskurven
- I dataopsamlingssoftwaren skal du tilføje kalibreringsstandarder på arbejdslisten og køre standarderne i tre eksemplarer.
- Det maksimale areal, der svarer til 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT og XA på retentionstidspunktet på henholdsvis ca. 4,4 min., 10 min., 16 min., 21 min. og 30 min.
- Konstruere individuelle kalibreringskurver for hver metabolit ved hjælp af et regnearksprogram.
- Hvis du vil oprette kalibreringsdiagrammet, skal du afbilde værdien for et forhold mellem analysandtoparealet over 3NT-topområdet i forhold til analysandens koncentration.
- Blindprøven analyseres (kulforbehandlet dyrkningsmedium kun tilsat 3NT) for at sikre, at der ikke er spor af de undersøgte analysetter i mediet. Ellers trækkes den opnåede værdi fra hvert kalibreringspunkt.
- Kontroller lineariteten af hver kalibreringskurve.
- Opret individuelt for hver analysand en lineær hældningsligningsligning (y = ax +b), hvor y svarer til forholdet mellem analysandens topareal i forhold til 3NT-toparealet, a er hældningen, x er analysandkoncentrationen (μmol/L), og b refererer til kurveskæringen. Plotte grafen 'y' versus 'x' vil generere kalibrering kurven.
- Føj en lineær tendenslinje til diagrammet, og få vist kalibreringskurveligningen og regressionskoefficienten i diagrammet. Kontroller, at regressionskoefficienten er > 0,990. I tilfælde af uoverensstemmende kalibreringsstandarder skal disse forberedes og/eller analyseres igen. Du kan også ændre kalibreringskurvens koncentrationsområde.
- Analyser QC-prøverne for at kontrollere systemets ydeevne, før du analyserer forsøgsprøverne. I tilfælde af uoverensstemmelser (± 20% afvigelse fra referenceværdien) forberedes de nye kalibreringskurver.
7. In vitro-cellekultur og indsamling af prøver til analyse
- Plade de undersøgte kræftceller (MDA-MB-231 eller SK-OV-3) i DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), der indeholder 4,5 g/l ᴅ-glukose 10% (v/v) føtalt kvægserum (FBS), 2 mmol/L ʟ glutamin og 1 U penicillin/streptomycin og kultur ved 37 °C i fugtig atmosfære på 5% CO2 for at udvide dem til forsøget. Passage cellerne på 80% af sammenløbet.
- Løsrive celler fra kulturretten ved hjælp af trypsin, frø til eksperimentet på 12-brønds plader med en tæthed på 0,3 × 106 celler pr. brønd og placeres i en inkubator natten over.
- Den næste dag, indsug kulturmediet og tilsæt frisk DMEM med eller uden tilsætning af de undersøgte forbindelser, afhængigt af det eksperimentelle design.
- Efter 48 timer opsamles mediet ovenfra cellerne (ca. 500 μL) i et 1,5 mL rør. Centrifuge ved 14.000 x g i 5 minutter for at fjerne cellerester. Supernatanten opsamles og opbevares ved -80 °C indtil analysen.
- Gem den cellulære pellet fra trin 7.4 til proteinvurdering. Prøverne fryses ved -20 °C.
BEMÆRK: Resultaterne for et medium fra forskellige brønde bør normaliseres til det samlede proteinindhold for at tage højde for variationen i celletallet i de enkelte brønde. Proteinkoncentrationen kan vurderes som beskrevet i trin 9.
8. Forbered prøver til LC-MS-analyse
- Optø den frosne prøve ved stuetemperatur og bland godt. 149,25 μL af kulturmediet overføres til et centrifugeringsrør (1,5 mL).
- Der tilsættes 0,75 μL på 0,1 g/l 3NT-opløsning (intern standard). Luk rørene og vortex godt.
- Der tilsættes 150 μL kølet ved -20 °C methanol indeholdende 1% (v/v) FA til prøveafproteinisering. Luk rørene og vortex godt.
- Fortsæt med prøveforberedelse som beskrevet i punkt 3 (trin 3.3-3.11).
BEMÆRK: Nogle kræftceller som SK-OV-3 udskiller store mængder Kyn i et kulturmedium. For at kunne montere dataene i et lineært område af kalibreringskurven er det nødvendigt med ca. 100 gange fortynding af prøven. I dette tilfælde fortyndes en del af prøven med 0,1% (v/v) FA i vand og analyseres ud over den ufortyndede prøve. Referenceprøverne af standarder for kalibreringskurven skal fremstilles i 100 gange fortyndet komplet dyrkningsmedium. Alternativt kan du tilføje flere punkter i kalibreringskurven (hvis der opnås korrekt opløselighed og linearitet) for at tilpasse den til koncentrationsniveauet af Kyn i forsøgsprøven. - Analysér eksemplerne efter LC-MS som beskrevet i afsnit 5. Konstruere en arbejdsliste og køre hver prøve i tre eksemplarer.
- Når arbejdslisten er færdig, skal du måle det højeste analysandområde.
- Generer et regneark ved hjælp af den tilgængelige software og de tilgængelige numeriske data.
- I en regnearkskolonne beregnes forholdet mellem analysandens topareal over toparealet 3NT.
- Brug en individuel lineær kalibreringsligning, der er dedikeret til hver analysand (fra trin 6.3.) til at beregne koncentrationer af analysetter, der er til stede i forsøgsprøverne.
9. Vurdering af proteinindhold og datanormalisering
- Cellulær pelleten blev genbrugt fra trin 7.5 med 100 μL fosfatbufferet saltvand (PBS) i 1,5 mL rør.
BEMÆRK: Der fremstilles PBS-opløsning ved opløsning af 8 g natriumchlorid, 0,2 g kaliumchlorid, 1,44 g natriumphosphatdibasisk, kaliumdihydrogenphosphat i 950 ml ultrapurt vand. Rør godt. PH-vinduet justeres til 7,4 med saltsyre (dropwise). Juster lydstyrken op til 1 L med ultrapure vand. Rør godt, indtil homogen.
ADVARSEL: Saltsyre er stærkt ætsende og skal håndteres med passende sikkerhedsforanstaltninger. Kontakt med menneskers hud kan forårsage rødme, smerte, hudforbrændinger. Arbejde under røghætten bære beskyttelseshandsker og frakke. - Prøverne fryses ved -20 °C og optøs derefter på is. Gentag dette trin 3x.
- Prøverne centrifugeres ved 14.000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Saml supernatanterne i de nye rør. Forstyr ikke pelletlen.
- Fortynd supernatanterne 10x med PBS.
- Der skal konstrueres en kalibreringskurve fra 0 til 2 μg af proteinet pr. brøndområde.
- Forbered BSA-standardopløsning (Bovine Serum Albumin) til kalibreringen. 1,23 μg BSA opløses i 1 mL ultrapurt vand og vortexbrønd.
- På en 96-brønds plade fyldes forskellige mængder BSA-standardopløsning (1,23 μg/ml): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
- Fyld brønden med PBS til det endelige volumen på 50 μL.
- 10 - 15 μL celle lysat fra trin 9.4 på samme 96-brønds plade. Fyld brøndene med PBS for at nå det endelige volumen på 50 μL.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, justeres mængden af celle lysat aliquot i hver brønd, så den passer ind i kalibreringskurvens lineære område. Det endelige volumen skal holdes på 50 μL af prøven pr. brønd. - Der tilsættes 200 μL af et Bradford-reagens (fortyndet 5 gange med ultrapurt vand) til hver brønd.
- Inkubat 96-godt pate i mindst 5 minutter ved stuetemperatur. Sæt pladen i en mikropladelæser. Mål absorbans ved λ = 595 nm.
- Konstruere en kalibreringskurve ved hjælp af et regnearksprogram. Arealer BSA-mængden (μg) i forhold til absorbansen. Tilføj en lineær tendenslinje, vis kalibreringskurveligningen og regressionskoefficienten i diagrammet.
- Brug den lineære ligning (y = ax +b, hvor y svarer til absorbansen ved λ = 595 nm, a er hældningen, x er et proteinindhold (μg) og b refererer til kurveskæringen) til beregning af proteinmængden i prøven.
BEMÆRK: Overvej en prøvefortyndingsfaktor i beregninger. - Brug det anslåede proteinindhold til at normalisere mængden af kynurenin i prøven pr. 1 mg protein. For at gøre dette skal koncentrationen af kynureniner bestemmes i trin 8.9 med det samlede proteinindhold fra trin 9.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LC-MS frembyder ubestridelige fordele ved kvantificering af biologisk aktive molekyler, selv om nogle komponenter i komplekse prøver forårsager såkaldte matrixeffekter og kompromitterer ioniseringen af analysander. Det fører til ionundertrykkelse eller ionforbedring, stærkt faldende nøjagtighed og påvirker en grænse for detektion/kvantificering af LC-MS, der betragtes som et ""svagt" punkt i metoden. I vores protokol genereres ioner ved elektrosprayionisering (ESI) i positiv tilstand, som også blev anvendt i andre undersøgelser af Trp metabolitterbestemmelse13. ESI er imidlertid mere udsat for matrixeffekter end atmosfærisk trykkemisk iionisering (APCI)28. For nøjagtig kvantificering af Trp-metabolitter i et cellekulturmedium brugte vi således en intern standard og matrixmatchet kalibrering til at kompensere for de matrixafhængige virkninger på analysandsignalet og til at korrigere tabet af målforbindelserne under et prøveforberedelsestrin. Vi anvendte den samme interne standard (3NT) for alle de undersøgte analysetter (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA). 3NT blev ikke fundet i det oprindelige, friske medium, der anvendes til celledyrkning og viser en lignende adfærd som målforbindelser under de anvendte analytiske betingelser. Det gør 3NT til den relevante interne standard27. For at forenkle protokollen foreslår vi desuden for at gøre den mere tilgængelig for en bred gruppe brugere kun et trin i prøvepræparatet, der involverer proteinfjernelse ved behandling med methanol, der indeholder 1% (v/ v) FA.
Inden for den præsenterede protokol anbefales det at forberede kalibreringskurverne ved hjælp af det komplette medium, der bruges til cellekultur. Dyrkningsmediet kan dog indeholde endogen Kyn, der forstyrrer korrekt estimering af analysandtopområdet, især i kalibreringsopløsningerne ved lave koncentrationer. Figur 1A illustrerer LC-SQ-resultater opnået under analysen af DMEM, der indeholder 4,5 g/L D-glukose (DMEM-HG) og 10% (v/v) FBS, der anvendes af vores gruppe til en kræftcellekultur. Vi har konstateret, at den friske komplette kultur medium i første omgang indeholder nogle Kyn, der kan fjernes ved rensning med aktivt kul(Figur 1B). Mens man analyserede forsøgsprøverne, blev det komplette DMEM-HG-kulturmedium også analyseret som en kontrolprøve, og Kyn-topområdet blev trukket fra det højeste areal, der blev registreret for Kyn i hver testet prøve.
Figur 1: Repræsentative LC-SQ-resultater af det komplette DMEM-HG-kulturmedium (A) før og (B) efter forbehandling på aktivt kul. Prøver af dyrkningsmedium blev tilsat den samme mængde af den interne standard (3NT). Klik her for at se en større version af dette tal.
I det følgende trin blev der fastsat en retentionstid for hver målanalysand (se et kromatogram i figur 2A). Den gode praksis i LC-MS-analysen er at køre en QC-prøve før de faktiske prøver for at bekræfte passende opbevaringstider for analysanerne. Lejlighedsvis kan der observeres et skift i LC-signaler, og uoverensstemmelser har tendens til at ske. Figur 2B viser en mindre ændring i analysandernes retentionstider, hvilket dog ikke forstyrrer korrekte målinger. På den anden side viser figur 2C en betydelig ændring i en position af måltoppene. Som det ses, blev 3NT-signalet væsentligt flyttet i retning af en kortere retentionstid og kom ud af den indstillede tidsport. I dette tilfælde var en passende kvantitativ analyse umulig, fordi det interne standardsignal ikke kan måles korrekt. Dette kan skyldes flere faktorer, nemlig utilstrækkelig kolonneekvilibrering, forkert blanding af opløsningsmidlerne i pumpen, anvendelse af uhensigtsmæssig prøve fortyndingsmiddel eller kontaminering af kolonnens stationære fase. Figur 2Drepræsenterer imidlertid en situation, hvor de registrerede toppe lider af stærkt lave intensiteter. Dette kan skyldes en injektionsfejl, en lækage i systemet eller MS-skader. Desuden kan de fælles eliterende matrixkomponenter generere ioner med m/z valgt til målanalysanderne, som i figur 3A, hvor resultatet fra analysen af MDA-MB-231-cellernes dyrkningsmedium vises. På retentionstidspunktet på ca. 25 min. blev der observeret et stærkt signal afledt af en ukendt matrixkomponent (sammensatte X). Toppen vises i scanningsperioden, hvor ionen på m/z 206 (udvalgt til XA) blev overvåget. Dette signal svarer dog ikke til analysanden på grund af uforenelighed af retentionstiden. For at undgå fejl under maksimal integration anbefales det også at sammenligne retentionstiden med den, der er registreret for QC-prøver.
Figur 2. Eksempler på korrekte og forkerte resultater. De korrekte kromatogrammer i QC-prøveanalysen ved (A) medium og (B) lave koncentrationsniveauer registreret i forskellige dage. Eksempel på det forkerte kromatogram som følge af en væsentlig ændring i analysandernes retentionstider (C) og utilfredsstillende intensiteter af toppe (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative resultater af kulturmedium indsamlet fra forskellige kræftcellelinjer. Kulturmedium fra (A) MDA-MB-231 (human brystkræft) og (B) SK-OV-3 (human æggestokkræft) celler blev analyseret ved hjælp af LC-SQ. Forbindelsen X angiver signalet for en ukendt forbindelse, der er til stede i dyrkningsmediet, og som sammen pendler med analysanden og ioniserer for at danne en ion med m/z udvalgt til analysanden. Klik her for at se en større version af dette tal.
Det dyrkningsmedium, der anvendes til kræftceller (DMEM), indeholder betydelige mængder Trp. Dens isotop (13C-Trp) deler samme ion som XA (m/z 206) og kan forstyrre XA-bestemmelsen. Under de påførte kromatografiske forhold er signalet fra Trp imidlertid godt adskilt fra XA-signalet. Derfor konkluderede vi, at Trp til stede i DMEM ikke påvirker XA kvantificering og nøjagtighed af metoden (figur 4).
Figur 4. Position af tryptofan (Trp) og xanthurensyre (XA) signaler på MS-kromatogram. Standardopløsninger af Trp (49,0 μmol/L) og XA (48,8 μmol/L) blev fremstillet i opløsningsmiddel A (20 mmol/l ammoniumformat i vand, pH 4.3) under optimerede LC-SQ-forhold. Ioner på m/z 205 (svarende til [Trp+H]+) og m/z 206 (svarende til [XA+H]+) blev overvåget for henholdsvis Trp og XA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Den præsenterede analysemetode bestod valideringstesten med hensyn til linearitet, præcision (variationskoefficienter ≤15%), nøjagtighed (96-104%), restitution (96-119%) og matrixeffekter for alle analysetter, som det blev beskrevet detaljeret i vores tidligere papir 27.
Endelig bekræftede vi en anvendelse af den beskrevne analytiske tilgang til et medium indsamlet fra de in vitro-dyrkede menneskelige kræftceller. Vores data bekræftede, at et niveau af kynureniner kan variere betydeligt i et dyrkningsmedium indsamlet fra forskellige celletyper (Figur 3). Vi analyserede kulturmediet fra 2 typer kræftlinjer, dvs. MDA-MB-231 og SK-OV-3-celler afledt af henholdsvis bryst- og kræft i æggestokkene. De udvalgte linjer bruges ofte som modeller til at studere molekylære hændelser og til test af kræftmedicin. Som vi observerede, cellerne dyrket i en kontrol standard medium frigivet forskellige mængder af tryptofan metabolitter, MDA-MB-231 celler frigav en kvantificerbar mængde Kyn og XA ved lav nmol/L-koncentration (figur 3A), mens SK-OV-3-celler viste betydeligt mere Kyn, meget lav sekretion af XA og ingen udskillelse af andre undersøgte kynureniner som angivet ved intensiteten af de tilsvarende toppe (Figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir præsenterer en detaljeret LC-SQ protokol for samtidig kvantificering af fire store Trp metabolitter (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA), der måles i et medium fra in vitro dyrkede humane kræftceller. Der lægges særlig vægt på prøvepræparatet, kromatografisk/massespektrometriproceduren og datafortolkningen, som er de vigtigste punkter i analysen.
Generelt kræver LC-MS-analyse på grund af høj følsomhed de højeste standarder for en protokols strenghed og renhed af brugte materialer. Det henviser til en anvendelse af pænt rengjort og korrekt vasket glasvarer samt kemikalier af høj kvalitet under hele standardproceduren. Det er meget vigtigt at anvende ferskvandsbaserede opløsningsmidler i en mobil fase for at undgå mikrobiel kontaminering, som i denne følsomme tilgang kan påvirke analysen drastisk. Før de analyserede prøver injiceres i et LC-system, skal de undersøges omhyggeligt for tilstedeværelsen af uopløselige partikler. Det er vigtigt at bemærke, at kolonnen skal være tilstrækkeligt ekvilibreret inden prøveanalysen. Manglende overholdelse af disse regler kan resultere i kontaminering af prøverne, LC-systemet og analysekolonnen eller utilstrækkelig prøveionisering i MS-kilden, hvilket endelig forårsager et skift af signaler.
Der er 2 nøglepunkter i protokollen, der skal fremhæves for at få optimale resultater. Den mest kritiske del i den præsenterede protokol er prøveforberedelsestrinnet. Anvendelse af en utilstrækkelig procedure medfører tab af målforbindelser og dermed unøjagtig kvantificering. I vores tilgang, under metodeudviklingen, blev prøveforberedelsestrin omhyggeligt optimeret sammen med udvælgelsen af opløsningsmidlet til proteinfjernelse. Som vi fastslog, gav prøvebehandling med methanol indeholdende 1% (v/v) myresyre de bedste inddrivelser for alle undersøgte kynureniner. Virkningen af en mobil fasesammensætning på omfanget af analysionisering blev også evalueret. Vi har kontrolleret mobile faser bestående af 0-20 mmol/L ammoniumformate eller ammoniumacetat ved forskellige pH justeret med myre- eller eddikesyre. Den mobile fase, der indeholder 20 mmol/L ammoniumformat i vand (pH 4.3, solvent A) og acetonitrile (opløsningsmiddel B), gav de bedst mulige betingelser for samtidig kvantificering af Kyn, 3HKyn, 3HAA og XA27. Et andet vigtigt skridt i LC-MS-analysen er topintegration. Nogle kynureniner forekommer i en prøve ved meget lave koncentrationsniveauer. I dette tilfælde kan signalerne fra co-eluting forbindelser overlappe med målet analysand signal eller generere et højdepunkt på et lignende retention tid. En uerfaren bruger af denne metode kan finde nogle problemer med en korrekt topintegration, som eksemplificeret i figur 2C. Det er således nødvendigt at kontrollere retentionstiden for analyserne og sammenligne med en QC-prøve og anbefales stærkt.
God analysepraksis omfatter valg af en passende intern standard til en kvantitativ analyse. Heri foreslår vi en enkel og omkostningseffektiv tilgang, der kun bruger en intern standard (3NT) som en analog af fire kynureniner. Resultaterne bekræftede, at 3NT præsenterer lignende kromatografisk adfærd som målforbindelserne, og i resultatet giver det mulighed for at opnå en god præcision og nøjagtighed af metoden27. Under de påførte LC-betingelser er 3NT-toppen godt adskilt fra de andre analysetters signaler og let at måle. Vi er klar over, at isotopisk mærkede interne standarder (ILIS), der anvendes i sådanne analyser14,15, vil give bedre kompensation for matrixeffekter og bedre kontrol over alle de variabler, der kan føre til falske resultater. På den anden side er ILIS'er for alle målanalysetter ikke altid let tilgængelige, endsige deres høje omkostninger. ILIS'er er også dedikeret snarere til LC-MS/MS end LC-SQ med SIM-tilstand (Single Ion Monitoring), som vi brugte i dette papir.
Brug af 3NT som en intern standard kan her betragtes som en begrænsning af metoden på grund af en mulighed for 3-nitrotyrosindannelse på proteiner29. Men i tilfælde af et kulturmedium observerede vi ikke nogen fri endogen 3-nitrotyrosin. Det lad os anerkende 3NT som en passende intern standard. Vi anbefaler dog en forudgående vurdering af et indledende endogent 3NT-niveau, især når man studerer andre celletyper end testet i denne rapport.
Sammenfattende skal man, når man vælger en analog af en analysand, overveje mange funktioner, f.eks. kemisk lighed og indledende fravær i en prøvematrix. Desuden kan en stabilitet af den analoge interne standard i en prøvematrix, dens genvindings- og iioniseringseffektivitet i nærværelse af matrixkomponenter afvige fra målforbindelserne. Således bør alle disse funktioner overvejes og omhyggeligt undersøges under metodeudvikling.
Analysesystemet i den præsenterede metode bestående af en MS-detektor gjorde det muligt for os at opnå lave detektionsgrænser (0,0033 – 0,0108 μmol/L)27. På denne måde samtidige målinger af 3HKyn, Kyn, 3HAA, XA inden for koncentrationsintervallerne 0,018 - 4,46 μmol/l, 0,0096 - 3,84 μmol/l, 0,033 - 13,06 μmol/l og 0,019 – 4,87 μmol/l blev opnået. Hovedbegrænsningen af enhver LC-SQ-analyse er forbundet med en korrekt adskillelse af prøvekomponenter på en remburskolonne. Dårlig adskillelse bidrager til lavere selektivitet sammenlignet med detektionen med en tandem firdobbelt massespektrometri ved hjælp af produktioner og MRM-tilstand (Multiple Reaction Monitoring). For at undgå interferens fra andre matrixkomponenter, der deler de samme eller lignende ioner med et målmolekyle, skal LC-adskillelsesbetingelserne optimeres omhyggeligt. F.eks. genererer 13C Trp-isotop (til stede i spormængder) den samme ion af m/z 206 som valgt til XA-overvågning. Fejlfortolkningen blev undgået her ved at optimere kromatografiske forhold og tilfredsstillende adskillelse af Trp og XA, der er udråbt fra kolonnen (Figur 4).
I fremtidige programmer kan nogle ændringer af protokollen implementeres. En potentiel bruger kan ændre en koncentration af den interne standard (3NT), når niveauet af undersøgte kynureniner forventes at falde beyound de koncentrationer, der præsenteres her. Det er vigtigt, at 3NT-koncentrationen er den samme både i kalibreringsstandarderne og i forsøgsprøverne. I tilfælde af et ekstremt højt analysandniveau, såsom Kyn observeret i SK-OV-3 celler, anbefaler vi at arbejde med en højere koncentration på 3NT. Hvis prøvefortynding er påkrævet, skal det ske på protokollens sidste trin, inden prøveindsprøjtningen sprøjtes ind i LC-kolonnen.
I litteraturen er der foreslået nogle protokoller for LC-MS/MS kvantitativ analyse af kynureniner i et kulturmedium fra forskellige celler. En protokol giver en samtidig bestemmelse af 3 metabolitter, dvs Kyn, 3HKyn og 3HAA, men det er mindre følsomt (grænse for kvantificeringer (LOQ) på højere niveauer), i modsætning til vores metode21. En anden rapport præsenterede en metode, der tillader kvantificering af 4 kynureniner, herunder Kyn, 3HKyn, 3HAA og XA med lignende LOQs25. Ingen af dem blev imidlertid optimeret til påvisning af kynureniner genereret af in vitro dyrkede kræftceller. Komponenterne i en prøvematrix påvirker analysandioniseringen i MS-kilden ved at formindske eller øge signalet, hvilket er en årsag til upålidelige resultater. For at opnå mere nøjagtige data foreslog vi at bruge en analog intern standard (3NT) i kombination med en matrixmatchet kalibrering for bedre kompensation for matrixafhængige effekter.
Ved hjælp af den præsenterede metode kunne vi observere, at Kyn var den mest rigelige Trp-metabolit i et dyrkningsmedium indsamlet fra de analyserede kræftcelletyper, mens de andre undersøgte metabolitter under kontrolkulturforhold ikke blev opdaget (undtagen XA til stede i spor, men påviselige mængder). Men når cellerne blev stimuleret med en potent immun aktivator – bakteriel lipopolysaccharid, en større mængde af XA ud over Kyn blev udskilles. På den anden side var de fundne 3HKyn og 3HAA, der dannes opstrøms for XA inden for KP, stadig under LOQ27. Dette tyder på, at nogle KP-metabolitter, der er til stede i små mængder i et kulturmedium, kan være vanskelige at måle ved hjælp af den foreslåede LC-SQ-tilgang. Ikke desto mindre er den fremlagte protokol nyttig til at identificere ændringer i KP ved kvantificering af de akkumulerende centrale Trp-metabolitter. Anvendelse af denne metode i fremtidige undersøgelser til at engagere en in vitro celle kultur system vil levere nye biomarkører af immun-relaterede sygdomme og kræft. Vores tilgang bringer en valideret og pålidelig analyse med relevant følsomhed for cellulære modeller, der er udfordrende på grund af lave koncentrationer af downstream KP-metabolitterne. De medfølgende instruktioner vil gøre det muligt for forskere fra forskellige områder at anvende denne tilgang til kvantificering af større kynureniner relateret til kræft og andre sygdomme. Vores data (ikke offentliggjort) viser, at det er nyttigt at studere KP-modulering i celler, der udsættes for forskellige glykeringsprodukter, men det bør også finde en anvendelse inden for andre forskningsområder og sygdomme med immunkomponent, dvs. i endometriumbiologi og reproduktion30.
Den præsenterede protokol kan udvides yderligere for at bestemme yderligere analysetter, der kan akkumuleres i et kulturmedium under forskellige eksperimentelle forhold. Der bør anvendes passende referencestandarder for analysetter til metodevalidering med hensyn til nøjagtighed, præcision, linearitet, genvinding eller selektivitet, inden de anvendes til kvantitative analyser. Desuden kan protokollen afhængigt af forskningsformålet anvendes til individuelle kynureniner (3HKyn, Kyn, 3HAA eller XA). I dette tilfælde kan de ioner, der svarer til forbindelser, der ikke kan analyseres, blive fjernet fra MS-indstillingerne. De passende ændringer i LC-gradientprogrammet hjælper med at skære på analysetiden.
Når du studerer KP, er det relevant at vurdere aktiviteten af IDO-enzym. Dette kan anslås blot ved at måle Trp-forbruget og Kyn-udslippet i et dyrkningsmedium eller ved at beregne koncentrationsforholdet mellem kynurenin og tryptophan ([Kyn]/[Trp])31. I vores tilgang har vi ikke målt en Trp-koncentration, men protokollen kan udvides ved at tilføje dette mål i LC-SQ-analysen. Som en mere biokemisk passende tilgang anbefaler vi at udtrykke IDO enzymatisk aktivitet som en mængde Kyn produceret af celler pr. milligram protein pr. Minut som præsenteret andetsteds32. Vi har bemærket en fordel ved at bruge denne tilgang i vores andre undersøgelser af kræftceller (manuskript under forberedelse) og anbefale denne metode, når du bruger in vitro cellekultur model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Den Europæiske Union fra Den Europæiske Fond for Regionaludvikling under det operationelle program for udvikling af det østlige Polen 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), af Fakultetet for Bioteknologi og Miljøvidenskab ved John Paul II Catholic University of Lublin (Young Scientists grant for Ilona Sadok), Det Polske Nationale Videnskabscenter, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 for Magdalena Staniszewska, Princip Investigator). Forfatterne takker prof. Agnieszka Ścibior fra Laboratoriet for Oxidativ Stress, Center for Tværfaglig Forskning, JPII CUL for at dele udstyr til cellekultning og protein kvantificering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
| Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
| Analytical balance | Ohaus | ||
| Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
| Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
| Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
| Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
| Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
| Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
| Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
| Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
| Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
| Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
| Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
| Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
| Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
| See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
| Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
| Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
| Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
| Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
| Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
| Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
| Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
References
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
- Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
- Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
- Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
- Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
- Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).
- Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
- Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
- Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
- Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M.
- Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
- Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
- Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
- Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
- Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
- Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
- Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).
- Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
- Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
- Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
- Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
- Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
- Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
- Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
- Annesley, T. M.
- Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
- Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
- Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416 (2009).
- Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).
