Summary
Beskrevet her er en protokoll for bestemmelse av fire forskjellige tryptofan metabolitter generert i kynurenin banen (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic syre, 3-hydroksyantranisyre) i mediet samlet inn fra kreftcellekulturer analysert av flytende kromatografi kombinert med en enkelt quadrupole massespektrometri.
Abstract
Kynurenine banen og tryptofan katabolitter kalt kynurenines har fått økt oppmerksomhet for deres engasjement i immunregulering og kreftbiologi. En in vitro celle kultur analyse brukes ofte til å lære om bidraget fra ulike tryptofan katabolitter i en sykdomsmekanisme og for å teste terapeutiske strategier. Cellekulturmedium som er rik på utskillede metabolitter og signalmolekyler gjenspeiler statusen til tryptofanmetabolismen og andre cellulære hendelser. Nye protokoller for pålitelig kvantifisering av flere kynureniner i det komplekse cellekulturmediet er ønsket å tillate en pålitelig og rask analyse av flere prøver. Dette kan oppnås med flytende kromatografi kombinert med massespektrometri. Denne kraftige teknikken er ansatt i mange kliniske og forskningslaboratorier for kvantifisering av metabolitter og kan brukes til å måle kynurenines.
Presentert her er bruk av flytende kromatografi kombinert med enkelt quadrupole massespektrometri (LC-SQ) for samtidig bestemmelse av fire kynurenines, det vil si kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroksyantranilic, og xanthurenic syre i mediet samlet fra in vitro kultiverte kreftceller. SQ detektor er enkel å bruke og billigere i forhold til andre massespektrometre. I SQ-MS-analysen genereres flere ioner fra prøven og skilles i henhold til deres spesifikke masse-til-lade-forhold (m/z), etterfulgt av gjenkjenningen ved hjelp av en SIM-modus (Single Ion Monitoring).
Dette papiret trekker oppmerksomheten på fordelene med den rapporterte metoden og indikerer noen svake punkter. Det er fokusert på kritiske elementer av LC-SQ analyse inkludert prøve forberedelse sammen med kromatografi og massespektrometri analyse. Kvalitetskontroll, metodekalibreringsforhold og matriseeffektproblemer diskuteres også. Vi beskrev en enkel anvendelse av 3-nitrotyrosin som en analog standard for alle målanalytter. Som bekreftet av eksperimenter med humane eggstokk- og brystkreftceller, genererer den foreslåtte LC-SQ-metoden pålitelige resultater og kan videre brukes på andre in vitro cellulære modeller.
Introduction
Kynurenine pathway (KP) er den viktigste ruten for tryptofan (Trp) katabolisme i menneskelige celler. Indoleamin-2,3-dioksygenase (IDO-1) i ekstrahepatiske celler er det første og begrensende enzymet av KP og konverterer Trp til N-formylkynurenine1. Ytterligere trinn i KP genererer andre sekundære metabolitter, nemlig kynurenines som viser ulike biologiske egenskaper. Kynurenine (Kyn) er den første stabile Trp catabolite som viser giftige egenskaper og regulerer cellulære hendelser etter binding til arylhydrokarbonreseptoren (AhR)2. Deretter blir Kyn forvandlet til flere molekyler enten spontant eller i enzymmedierte prosesser, og genererer slike metabolitter som 3-hydroksykynurenin (3HKyn), antranilic acid (AA), 3-hydroksyantranisyre (3-HAA), kynurensyre (Kyna) og xanthurenic acid (XA). En annen nedstrøms metabolitt, 2-amino-3-karboksymukonsyre-6-semialdehyd (ACMS), gjennomgår ikke-enzymatisk syklonisering til quinolinic acid (QA) eller picolinsyre (PA)1. Til slutt blir QA videre forvandlet til nikotinamid-adenin dinucleotide (NAD+)3,KP sluttpunktmetabolitten som er en viktig enzymkofaktor. Noen kynureniner har nevrobeskyttende egenskaper som Kyna og PA, mens de andre, det vil at 3HAA og 3HKyn er giftige4. Xanthurenic acid, som er dannet av 3HKyn, presenterer antioksidant og vasorelaxation egenskaper5. XA akkumuleres i aldrende linser og fører til apoptose av epitelceller6. KP, beskrevet i midten av 1900-tallet, fikk mer oppmerksomhet da dens engasjement i ulike lidelser ble demonstrert. Økt aktivitet av denne metabolske ruten og akkumulering av noen kynureniner modulerer immunresponsen og er forbundet med forskjellige patologiske tilstander som depresjon, schizofreni, encefalopati, HIV, demens, amyotrofisk lateral sklerose, malaria, Alzheimers, Huntingtons sykdom og kreft4,7. Noen endringer i Trp metabolisme observeres i tumor mikromiljøer og kreftceller2,8. Videre anses kynurenines som lovende sykdomsmarkører9. I kreftforskning er in vitro cellekulturmodeller godt etablert og mye brukt til preklinisk evaluering av respons på kreftmedisiner10. Trp metabolitter utskilles av celler i kulturmediet og kan måles for å vurdere statusen til kynureninebanen. Derfor er det behov for å utvikle egnede metoder for samtidig påvisning av så mange KP-metabolitter som mulig i en rekke biologiske prøver med en enkel, fleksibel og pålitelig protokoll.
I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for samtidig bestemmelse av fire kynureninveimetabolitter: Kyn, 3HKyn, 3HAA og XA av LC-SQ i et postkulturmedium samlet inn fra kreftceller. I en moderne analytisk tilnærming foretrekkes flytende kromatografi13,14,15,16 for den samtidige deteksjon og kvantifisering av de enkelte tryptofan katabolitter, i motsetning til biokjemiske uspesifikke analyser som bruker Ehrlich reagens11,12. I dag er det mange metoder tilgjengelig for kynurenines bestemmelse i menneskelige prøver, hovedsakelig basert på flytende kromatografi med ultrafiolett eller fluorescensdetektorer 13,17,18,19. Flytende kromatografi kombinert med en massespektrometridetektor (LC-MS) virker mer egnet for denne typen analyse, på grunn av deres høyere følsomhet (nedre grenser for deteksjon), selektivitet og repeterbarhet.
Trp metabolitter har allerede blitt bestemt i humant serum, plasma og urin13,20,21,22,23,men metodene for andre biologiske prøver, som cellekultur medium er også ønsket. Tidligere ble LC-MS brukt til Trp-avledede forbindelser i et medium samlet etter dyrking av humane gliomceller, monocytter, dendrittiske celler eller astrocytter behandlet med interferon gamma (IFN-γ)24,25,26. For tiden er det behov for nye validerte protokoller som kan tillate en vurdering av flere metabolitter i ulike kulturmedier, celler og behandlinger som brukes i kreftmodeller.
Formålet med den utviklede metoden er å kvantifisere (innen ett analytisk løp) fire store kynureniner som kan indikere abnormiteter i KP. Presentert her er kritiske trinn i vår nylig publiserte protokoll for kvantitativ LC-SQ analyse av utvalgte meningsfulle kynureniner ved hjelp av en intern standard (3-nitrotyrosin, 3NT) i mediet samlet inn fra in vitro kultiverte humane kreftceller27. Så vidt vi vet, er det den første LC-SQ-protokollen for samtidig kvantifisering av 3HKyn, 3HAA, Kyn og XA i et kulturmedium hentet fra de in vitro dyrkede cellene. Ved noen modifikasjoner, metoden kan brukes videre for å studere endringene i Trp metabolisme i et bredere spekter av celle kultur modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av standard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard lagerløsninger
- Vei reagensene i et hetteglass med høyest nøyaktighet (0,3 mg hver). For bedre nøyaktighet, skaler opp reagensene, justere volumet av oppløsningsvæsken i henhold til trinn 1.2.
- Oppløs reagensene i 300 μL av oppløsningsvæsken for å oppnå en lagerløsning på 1 g/l. Løs opp 3NT i 1 % (v/v) maursyre (FA) i vann; Kyn, 3HAA og XA i dimetylsulfoksid (DMSO); 3HKyn i vann surgjort til pH 2.5 med saltsyre (HCl).
FORSIKTIG: 3HAA irriterer øyne, nese, hals og lunger. Det er skadelig ved innånding, i kontakt med huden, og ved svelging. Bruk egnet beskyttelse, det vil vil skinne og maske. - Lukk hetteglasset tett og legg det i et ultralydbad i 1 min for å akselerere oppløsningen.
MERK: Oppbevar lagerløsningene ved -20 °C og minimer frysing/tining (maks. 3 sykluser) på grunn av ustabiliteten i lagerløsningene.
2. Utarbeidelse av kullbehandlet kultur medium
- I et rør, veie 280 mg aktivt kull og tilsett 5 ml av væskemediet forberedt for å kultere cellene av interesse.
- Rist røret med mediet og kullet på en see saw rocker i 2 timer, ved romtemperatur (sett hastighet til 50 svingninger / min). Deretter sentrifuger rørene på 6000 x g i 15 min.
- Fjern røret fra sentrifugen og samle forsiktig opp supernatanten uten å forstyrre sedimentet. Gjenta sentrifugering om nødvendig, for å fjerne alle kullrester.
- Filtrer supernatanten med et sprøytefilter på 0,45 μm.
- Sørg for at kullet forbehandlet kultur medium er fratatt kynurenines spor ved å kjøre en pilot prøve på LC-MS som beskrevet i trinn 6.3.2. Ellers gjentar du trinn 2.1-2.4.
MERK: Hvis hele kulturmediet i utgangspunktet ikke inneholder kynurenines, kan rensetrinn ved hjelp av trekull utelates. I dette tilfellet, forberede kalibrering standarder og kvalitetskontroll prøver ved hjelp av hele mediet vanligvis forberedt for celle dyrking. - Oppbevar det tilberedte mediet ved 4 °C til analyse.
3. Lage kalibreringsløsninger og kalibreringskurver
- Spike kullforbehandlet kultur medium med 0,75 μL på 0,1 g / L 3NT løsning og legge til fire standarder (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) minst seks forskjellige konsentrasjoner for å dekke kalibrering områder. Hold det endelige volumet av hver prøve ved 150 μL. Vortex godt. Bruk 1,5 ml sentrifugerør for prøveklargjøring.
MERK: Foreslåtte kalibreringspunkter for 3HKyn: 0,018, 0,045, 0,22, 1,12, 2,23, 4,46 μmol/l; for Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/l; for 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/ L; for XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/l. - Tilsett 150 μL kald metanol (holdt ved -20 °C) som inneholder 1 % (v/v) maursyre i hvert rør for prøvedeproteinisering. Tett lukke rørene og virvel godt.
- Inkuber prøvene ved -20 °C i 40 min.
- Sentrifuger prøvene ved 14 000 x g i 15 min ved 4 °C. Fjern rørene fra sentrifugen. Samle supernatants inn i de nye rørene. Ikke forstyrr sedimentet.
- Overfør 270 μL av supernatanten til hetteglasset med en automatisk pipette. Sett hetteglassene i fordamperen og fordampe forsiktig til de er tørre. Bruk riktig program for vann/metanolfraksjoner for å fordampe flyktige komponenter. Ikke påfør temperatur høyere enn 40 °C og unngå overtørking.
MERK: Flate hetteglass med bunnglass, det vil si kromatografiske hetteglass, letter raskere fordampning og høyere gjenopprettinger sammenlignet med koniske plastrør. - Etter 30 min, sjekk fordampningsstatus. Fortsett eventuelt fordampningen (f.eks. tilsett ekstra 10 min). Unngå overtørking.
- Fjern hetteglassene fra fordamperen. Rekonstituer hver prøve i 60 μL på 0,1 % (v/v) maursyre i vann. Tilsett oppløsningsvæsken i hetteglasset som inneholder restmaterialet. Lukk hetteglassene og virvelen godt.
- Overfør prøven til et 1,5 ml rør og spinn på 14 000 x g i 15 min ved 4 °C for å skille det utfelte proteinet.
- Uten å forstyrre proteinpellet, overfør supernativane til kromatografiske hetteglass med koniske glassinnsatser med en automatisk pipette. Lukk hetteglassene tett.
- Kontroller at luftboblene er tilstedeværelsen i hetteglasset med innsats, og fjern dem om nødvendig (f.eks. ved å virvle).
- Overfør kromatografiske hetteglass som inneholder prøver til LC autosampler. Registrer plasseringen av prøver som er plassert i en autosamplerskuff.
4. Utarbeidelse av kvalitetskontroll (QC) prøver
- Spike kull-forbehandlet kultur medium (utarbeidet i en 1,5 ml sentrifugalrør) med 0,75 μL på 0,1 g / L 3NT løsning og standarder for fire kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) ved en konsentrasjon valgt fra lineærområdet av kalibreringskurvene. Hold det endelige volumet av prøven ved 150 μL.
MERK: Hvis det er aktuelt, må du forberede flere QC-prøver ved forskjellige konsentrasjoner som faller under det lineære området til kalibreringskurven. - Følg protokollen som er beskrevet i avsnitt 3 (trinn 3.2-3.11).
5. Sette opp LC-MS-systemet
- Klargjør de mobile fase løsemidler: Løsemiddel A: 20 mmol / L ammonium format i ultrapure vann (pH 4.3 justert med maursyre); Oppløsningsvæske B: 100% acetonitril.
MERK: Bruk kun borosilikatglassflasker. Skyll flasker med ultrarent vann før du fyller den på. Ikke bruk flasker rengjort med vaskemidler.
FORSIKTIG: Acetonitril forårsaker alvorlige helseeffekter eller død. Det er lett antent av varme. Acetonitril væske og damp kan irritere øyne, nese, hals og lunger.- Forbered 5 mol /L lagerløsning av ammoniumformat ved å oppløse et krystallinsk reagens (15,77 g) i 50 ml ultrarent vann i en glassflaske. Rør til alle rester oppløses. Filtrer gjennom 0,45 μm membranen for å fjerne rester (f.eks. ved hjelp av et nylonsprøytefilter). Oppbevar lageroppløsningen ved 4 °C.
- Forbered løsningsmiddel A ved å tilsette 4 ml 5 mol/l ammoniumformat i vann til 980 ml ultrarent vann i en gul glassflaske og rør godt. Senk en rørebar og legg flasken med løsningsmidlet på en magnetisk rører. Senk en pH-elektrode ned i løsningen og kontroller pH-en under omrøring. Tilsett formisk syrelagerløsning (98 %-100 %) ved hjelp av en automatisk pipette med 0,2 ml tupp for å oppnå pH 4.3, juster volumet opp til 1 L med ultrarent vann og rør godt.
MERK: Klargjør løsemidlene minst en gang i uken for å forhindre mikrobiell vekst.
FORSIKTIG: Maursyre (FA) er giftig ved innånding, forårsaker hudforbrenninger og øyeskader. Arbeid under røykhetten; bruk vernehansker og frakk. - Filtrer alle oppløsninger gjennom 0,22 μm membranen (f.eks. nylonsprøytefilter) for å fjerne rester. Du kan eventuelt bruke løsemiddelinntaksfiltrene som er dedikert til LC-løsningsmiddelreservoarer for å beskytte systemet mot innkommende partikler.
- Start LC-MS-kontroll- og datainnsamlingsprogramvare.
- Tøm LC-systemet med mobilfasen for å fjerne bobler, og for å prime alle løsemiddelkanaler.
- Ensemble en vaktkolonne for å beskytte den analytiske kolonnen mot tilstopping.
- Skyll vakt og analytisk søyle (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) med 100% acetonitril i ca 30 min, og deretter med 100% løsningsmiddel A til et stabilt trykk i kolonnen observeres. Kontroller systemytelsen ved hjelp av kontrollprogramvaren.
- Angi de riktige LC-parameterne i datainnsamlingsprogramvaren.
- Sett opp gradientprogrammet: 0-8 min løsningsmiddel B 0%; 8-17 min oppløsningsmiddel B 0-2%; 17-20 min løsemiddel B 2%; 20-32 min løsemiddel B 10-30%; 32-45 min oppløsningsmiddel B 0%.
- Still inn den mobile fasestrømningshastigheten ved 0,15 ml/min, total analysetid i 45 min, kolonnetemperatur ved +40 °C og injeksjonsvolum ved 10 μL.
- Angi oppkjøpsparametrene for massespektrometridetektoren.
- Påfør ioniseringsparametere: enkeltionovervåking (SIM), positiv ionisering, forstøvertrykk på 50 psi, +350 °C tørkegasstemperatur, tørkegassstrøm på 12 l/min og 5500 V kapillærspenning.
- Velg analyttovervåkingsioner: for 3HKyn m/z 225,0 (skanneperiode: 2-6 min, fragmentorspenning: 100 V); for Kyn m/z 209.0 (skanneperiode: 6-12 min, fragmentorspenning: 80 V); for 3HAA m/z 154,0 (skanneperiode: 12-18 min, fragmentorspenning: 80 V); for 3NT m/z 227,0 (skanneperiode: 18-23 min, fragmentorspenning: 100 V); for XA m/z 206.0 (skanneperiode: 23-45 min, fragmentorspenning: 100 V).
- Lag en arbeidsliste og kjør eksempler på LC-systemet.
- Først, før analysen av eksperimentelle prøver, kjør en tom prøve (Løsningsmiddel A) i hvert fall i triplicates, etterfulgt av en QC-prøve.
- Åpne dataanalyseprogramvaren og last inn resultatene som er oppnådd for QC-eksemplet.
- Kontroller plasseringen av analytiske topper på kromatrammet. Når signalene skifter utover den forventede posisjonen, justerer du tidsportene for riktig analysesignaloppsamling. Se programvarehåndboken for instruksjon om signalintegrasjon.
6. Konstruere kalibreringskurven
- I datainnsamlingsprogramvaren legger du til kalibreringsstandarder i arbeidslisten og kjører standardene i triplicates.
- Integrer og mål toppområdet tilsvarende 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT og XA på oppbevaringstiden på ca. 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min og 30 min.
- Konstruer individuelle kalibreringskurver for hver metabolitt ved hjelp av et regnearkprogram.
- Hvis du vil opprette kalibreringsdiagrammet, plotter du verdien for et forhold mellom å analysere toppområdet over 3NT-toppområdet kontra konsentrasjonen av analytten.
- Analyser den tomme prøven (kull-forbehandlet kultur medium spiked bare med 3NT) for å sikre at det ikke er spor av de studerte analytene i mediet. Ellers trekker du den oppnådde verdien fra hvert kalibreringspunkt.
- Kontroller lineariteten til hver kalibreringskurve.
- Individuelt, for hver analyse, lage en skråning-avskjæring lineær ligning (y = øks +b), hvor y tilsvarer forholdet mellom analytisk toppområdet versus 3NT peak området, a er skråningen, x er analyte konsentrasjonen (μmol / L), og b refererer til kurven avskjæring. Plotting av grafen 'y' versus 'x' vil generere kalibreringskurven.
- Legg til en lineær trendlinje i diagrammet, og vis kalibreringskurveformelen og regresjonskoeffisienten i diagrammet. Kontroller at regresjonskoeffisienten er > 0,990. Ved samsvarende kalibreringsstandarder, klargjør og/eller analyser disse igjen. Du kan eventuelt endre konsentrasjonsområdet til kalibreringskurven.
- Analyser QC-prøvene for å kontrollere systemytelsen før du analyserer eksperimentelle prøver. Ved inkompatibilitet (± 20 % avvik fra referanseverdien), klargjør du de nye kalibreringskurvene.
7. In vitro cellekultur og prøvesamling for analyse
- Plate de studerte kreftcellene (MDA-MB-231 eller SK-OV-3) i DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) som inneholder 4,5 g / L ᴅ-glukose, 10% (v / v) fosterbovin serum (FBS), 2 mmol / L ʟ-glutamin og 1 U penicillin / streptomycin og kultur ved 37 ° C i en fuktet atmosfære på 5% CO2 for å utvide dem for eksperimentet. Passage cellene ved 80% av samløpet.
- Løsne celler fra kulturfatet ved hjelp av trypsin, frø for eksperimentet på 12-brønnsplater med en tetthet på 0,3 × 10 6 celler perbrønn og plasser i en inkubator over natten.
- Neste dag aspirerer kulturmediet og legger til fersk DMEM med eller uten tillegg av de studerte forbindelsene, avhengig av eksperimentell design.
- Etter 48 timer, samle mediet fra over cellene (ca 500 μL) i en 1,5 ml rør. Sentrifuge ved 14, 000 x g i 5 min for å fjerne eventuelle cellerester. Samle supernatant og lagre ved -80 °C til analysen.
- Lagre cellulær pellet fra trinn 7.4 for proteinestimering. Frys prøvene ved -20 °C.
MERK: Resultatene som oppnås for et medium fra ulike brønner bør normaliseres til totalt proteininnhold for å ta høyde for variasjonen i cellenummer i individuelle brønner. Proteinkonsentrasjon kan vurderes som beskrevet i trinn 9.
8. Klargjøre prøver for LC-MS-analyse
- Tin den frosne prøven ved romtemperatur og bland godt. Overfør 149,25 μL av kulturmediet til et sentrifugeringsrør (1,5 ml).
- Tilsett 0,75 μL på 0,1 g/l 3NT-oppløsning (intern standard). Lukk rørene og virvelen godt.
- Tilsett 150 μL kjølt ved -20 °C metanol som inneholder 1 % (v/v) FA for prøvedeproteinisering. Lukk rørene og virvelen godt.
- Fortsett med prøveklargjøring som beskrevet i avsnitt 3 (trinn 3.3-3.11).
MERK: Noen kreftceller som SK-OV-3 utskiller store mengder Kyn i et kulturmedium. For å få dataene til et lineært område av kalibreringskurven, er det nødvendig med ca. 100 ganger fortynning av prøven. I dette tilfellet fortynner du en del av prøven med 0,1% (v / v) FA i vann og analyserer i tillegg til den ufortynnede prøven. Referanseprøvene av standarder for kalibreringskurven bør tilberedes i 100 ganger fortynnet komplett kulturmedium. Alternativt kan du legge til flere punkter i kalibreringskurven (hvis riktig løselighet og linearitet oppnås) for å justere den til konsentrasjonsnivået til Kyn i den eksperimentelle prøven. - Analyser prøvene med LC-MS som beskrevet i avsnitt 5. Lag en arbeidsliste og kjør hver prøve i triplicate.
- Når arbeidslisten er fullført, måler du toppområdet for analyse.
- Generer et regneark ved hjelp av den tilgjengelige programvaren og få numeriske data.
- I én regnearkkolonne beregner du forholdet mellom området for analytisk topp over 3NT-toppområdet.
- Bruk en individuell lineær kalibreringsligning dedikert for hver analyse (fra trinn 6.3.) til å beregne konsentrasjoner av analytter som finnes i de eksperimentelle prøvene.
9. Vurdere proteininnhold og data normalisering
- Bruk den cellulære pelleten på nytt fra trinn 7,5 med 100 μL fosfatbufret saltvann (PBS) i 1,5 ml rør.
MERK: Klargjør PBS-oppløsning ved å oppløse 8 g natriumklorid, 0,2 g kaliumklorid, 1,44 g natriumfosfatdibasisk, kaliumdihydrogenfosfat i 950 ml ultrarent vann. Rør godt. Juster pH til 7,4 med saltsyre (dråpevis). Juster volumet opp til 1 L med ultrarent vann. Rør godt til homogen.
FORSIKTIG: Saltsyre er svært korroderende og må håndteres med egnede sikkerhetsforanstaltninger. Kontakt med menneskelig hud kan forårsake rødhet, smerte, hudforbrenninger. Arbeid under røykhetten; bruk vernehansker og frakk. - Frys prøvene ved -20 °C og tine deretter på isen. Gjenta dette trinnet 3x.
- Sentrifuger prøvene ved 14, 000 x g i 15 min ved 4 °C. Samle supernativa i de nye rørene. Ikke forstyrr pelleten.
- Fortynn supernativa 10x med PBS.
- Konstruer en kalibreringskurve fra 0 til 2 μg av proteinet per brønnområde.
- Klargjør storfe serumalbumin (BSA) standardløsning for kalibreringen. Oppløs 1,23 μg BSA i 1 ml ultrarent vann og virvelbrønn.
- På en 96-brønnsplate laster du i forskjellige mengder BSA-standardoppløsning (1,23 μg/ml): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
- Fyll brønnen med PBS til det endelige volumet på 50 μL.
- Legg 10 - 15 μL cellelyat fra trinn 9.4 på samme 96-brønnsplate. Fyll brønnene med PBS for å nå det endelige volumet på 50 μL.
MERK: Juster om nødvendig volumet på cellelylat aliquot i hver brønn for å passe inn i det lineære området til kalibreringskurven. Hold det endelige volumet til 50 μL av prøven per brønn. - Tilsett 200 μL av en Bradford-reagens (fortynnet 5 ganger med ultrarent vann) til hver brønn.
- Inkuber 96-brønnspaten i minst 5 min ved romtemperatur. Sett platen inn i en mikroplateleser. Mål absorpsjon ved λ = 595 nm.
- Lag en kalibreringskurve ved hjelp av et regnearkprogram. Plott BSA-mengden (μg) versus absorbans. Legg til en lineær trendlinje, vis kalibreringskurveligningen og regresjonskoeffisienten i diagrammet.
- Bruk den lineære ligningen (y = ax +b, hvor y tilsvarer absorbansen ved λ = 595 nm, a er skråningen, x er et proteininnhold (μg), og b refererer til kurven avskjæring) for å beregne proteinmengden i prøven.
MERK: Vurder en prøvefortynningsfaktor i beregninger. - Bruk det estimerte proteininnholdet til å normalisere kynureninmengden i prøven per 1 mg protein. For å gjøre dette, del konsentrasjonen av kynureniner bestemt i trinn 8.9 med det totale proteininnholdet fra trinn 9.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LC-MS gir udiskutable fordeler i kvantifiseringen av biologisk aktive molekyler, selv om noen komponenter av komplekse prøver forårsaker såkalte matriseeffekter og kompromissionisering av analytter. Det fører til ionundertrykkelse eller ionforbedring, sterkt avtagende nøyaktighet og påvirker en grense for deteksjon / kvantifisering av LC-MS, som regnes som et "'svakt" punkt av metoden. I vår protokoll genereres ionene ved elektrosprayionisering (ESI) i positiv modus, som også ble brukt i andre studier på Trp-metabolitter bestemmelse13. ESI er imidlertid mer utsatt for matriseeffekter enn atmosfærisk trykkkjemisk ionisering (APCI)28. Derfor, for nøyaktig kvantifisering av Trp-metabolitter i et cellekulturmedium, brukte vi en intern standard og matrisematchet kalibrering for å kompensere de matriseavhengige effektene på analyttsignalet og for å korrigere tapet av målforbindelsene under et prøveforberedelsestrinn. Vi brukte samme interne standard (3NT) for alle studerte analytter (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA). 3NT ble ikke funnet i det opprinnelige, friske mediet som brukes til celle culturing og viser en lignende oppførsel som målforbindelser under de påførte analytiske forholdene. Det gjør 3NT riktig intern standard27. I tillegg foreslår vi bare ett trinn av prøveforberedelsen som involverer proteinfjerning ved behandling med metanol som inneholder 1% (v / v) FA.
I den presenterte protokollen anbefales det å forberede kalibreringskurvene ved hjelp av hele mediet som brukes til cellekultur. Kulturmediet kan imidlertid inneholde endogene Kyn som forstyrrer riktig estimering av analytttoppområdet, spesielt i kalibreringsløsningene ved lave konsentrasjoner. Figur 1A illustrerer LC-SQ resultater oppnådd under analysen av DMEM som inneholder 4,5 g / L D-glukose (DMEM-HG) og 10% (v / v) FBS brukes av vår gruppe for en kreftcellekultur. Vi har funnet ut at det friske komplette kulturmediet i utgangspunktet inneholder noen Kyn som kan fjernes ved rensing med aktivt kull (figur 1B). Mens du analyserte eksperimentelle prøver, ble det komplette DMEM-HG-kulturmediet også analysert som en kontrollprøve, og Kyn-toppområdet ble trukket fra toppområdet registrert for Kyn i hver testede prøve.
Figur 1: Representative LC-SQ-resultater av komplett DMEM-HG kulturmedium (A) før og (B) etter forbehandling på aktivt kull. Eksempler på kulturmedium ble spiked med samme mengde av den interne standarden (3NT). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I det følgende trinnet ble det opprettet en oppbevaringstid for hvert målanalyse (se et kromatrammet i figur 2A). Den gode praksisen i LC-MS-analyse er å kjøre en QC-prøve før de faktiske prøvene for å bekrefte passende oppbevaringstider for analysene. Av og til kan et skifte i LC-signaler observeres, og uoverensstemmelser har en tendens til å skje. Figur 2B viser en liten endring i retensjonstidene til analytene, som imidlertid ikke forstyrrer riktige målinger. På den annen side presenterer figur 2C en betydelig endring i en posisjon av måltoppene. Som sett ble 3NT-signalet betydelig forskjøvet mot en kortere oppbevaringstid og kom ut av den innstilte tidsporten. I dette tilfellet var en passende kvantitativ analyse umulig fordi det interne standardsignalet ikke kan måles riktig. Dette kan skyldes flere faktorer, det vil si utilstrekkelig kolonnelikevekt, feil blanding av løsemidlene i pumpen, bruk av upassende prøvediluent eller forurensning av kolonnestillingsfasen. Figur 2Drepresenterer imidlertid en situasjon, når de registrerte toppene lider av sterkt lave intensiteter. Dette kan skyldes en injeksjonsfeil, en lekkasje i systemet eller MS-skade. Videre kan co-eluting matrisekomponentene generere ioner med m / z valgt for målanalytter, som i figur 3A, hvor resultatet av analysen av MDA-MB-231 celler kultur medium vises. På oppbevaringstiden på ca. 25 min ble det observert et sterkt signal fra en ukjent matrisekomponent (sammensatt X). Toppen vises i skanneperioden, når ion av m/z 206 (valgt for XA) ble overvåket. Dette signalet samsvarer imidlertid ikke med analytten på grunn av inkompatibilitet av oppbevaringstiden. For å unngå feil under toppintegrasjon anbefales også en sammenligning av oppbevaringstiden med den som er registrert for QC-prøver.
Figur 2. Eksempler på riktige og uriktige resultater. De riktige kromatrammene for QC-prøveanalyse ved (A) medium og (B) lave konsentrasjonsnivåer registrert i forskjellige dager. Eksempel på feil kromatogramme som følge av betydelig endring i retensjonstidene til analytene (C) og utilfredsstillende intensiteter av topper (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Representative resultater av kulturmedium samlet inn fra ulike kreftcellelinjer. Kulturmedium fra (A) MDA-MB-231 (human brystkreft) og (B) SK-OV-3 (human eggstokkkreft) celler ble analysert ved hjelp av LC-SQ. Forbindelsen X indikerer signalet om en ukjent forbindelse tilstede i kulturmediet som er samtidig med analytten og ioniserer for å danne en ion med m / z valgt for analytten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Kulturmediet som brukes til kreftceller (DMEM) inneholder betydelige mengder Trp. Isotopen (13C-Trp) deler samme ion som XA (m / z 206) og kan forstyrre XA bestemmelse. Men under de påførte kromatografiske forholdene er signalet fra Trp godt atskilt fra XA-signalet. Derfor konkluderte vi med at Trp tilstede i DMEM ikke påvirker XA kvantifisering og nøyaktighet av metoden (figur 4).
Figur 4. Posisjon av tryptofan (Trp) og xanthurenic acid (XA) signaler på MS kromatrammet. Standardløsninger av Trp (49,0 μmol/l) og XA (48,8 μmol/l) ble tilberedt i løsningsmiddel A (20 mmol/l ammoniumformat i vann, pH 4,3) under optimaliserte LC-SQ-forhold. Ionene til m/z 205 (tilsvarende henholdsvis [Trp+H]+) og m/z 206 (tilsvarende [XA+H]+) ble overvåket for henholdsvis Trp og XA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Den presenterte analytiske metoden besto valideringstesten med hell i form av linearitet, presisjon (variasjonskoeffisienter ≤15%), nøyaktighet (96-104%), gjenoppretting (96-119%), og matriseeffekter for alle analytter, som det ble beskrevet i detalj i vår forrige papir 27.
Til slutt bekreftet vi en anvendelse av den beskrevne analytiske tilnærmingen til et medium samlet fra in vitro-kultiverte humane kreftceller. Våre data bekreftet at et nivå av kynurenines kan variere betydelig i et kulturmedium samlet inn fra forskjellige celletyper (figur 3). Vi analyserte kulturmediet fra 2 typer kreftlinjer, det vil vil vil at MDA-MB-231- og SK-OV-3-celler stammer fra henholdsvis brystkreft og eggstokkreft. De valgte linjene brukes ofte som modeller for å studere molekylære hendelser og for anti-kreft narkotikatesting. Som vi observerte, cellene dyrket i en kontroll standard medium utgitt ulike mengder tryptofan metabolitter, MDA-MB-231-celler ga ut en kvantifiserbar mengde Kyn og XA ved lav nmol/l konsentrasjon (figur 3A), mens SK-OV-3-celler viste signifikant mer Kyn, svært lav sekresjon av XA, og ingen sekresjon av andre studerte kynureniner som indikert av intensiteten til de tilsvarende toppene (figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papiret presenterer en detaljert LC-SQ-protokoll for samtidig kvantifisering av fire store Trp-metabolitter (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) som måles i et medium fra in vitro kultiverte humane kreftceller. Spesiell oppmerksomhet er betalt til prøveforberedelsen, kromatografisk / massespektrometriprosedyre og datatolkning, de viktigste punktene i analysen.
Generelt krever LC-MS-analyse, på grunn av høy følsomhet, de høyeste standardene for en protokollseshet og renhet av brukte materialer. Det refererer til en påføring av pent rengjort og riktig vasket glass, samt høyverdige kjemikalier gjennom hele standardprosedyren. Det er svært viktig å bruke ferskvannsbaserte løsemidler i en mobil fase for å unngå mikrobiell forurensning som i denne følsomme tilnærmingen kan drastisk påvirke analysen. Før du injiserer i et LC-system, må de analyserte prøvene undersøkes nøye for tilstedeværelse av uoppløselige partikler. Det er viktig å merke seg at kolonnen skal være tilstrekkelig likevekt før prøveanalysen. Hvis disse reglene ikke overholder disse reglene, kan det føre til at prøvene, LC-systemet og den analytiske kolonnen eller utilstrekkelig prøveionisering i MS-kilden ikke overholdes, noe som til slutt forårsaker et signalskifte.
Det er 2 nøkkelpunkter i protokollen som må vektlegges for å få optimale resultater. Den mest kritiske delen i den presenterte protokollen er prøveforberedelsestrinnet. Ved hjelp av en utilstrekkelig prosedyre forårsaker tap av målforbindelser og dermed unøyaktig kvantifisering. I vår tilnærming, under metodeutviklingen, ble prøveforberedelsestrinnet nøye optimalisert sammen med valg av løsningsmidlet for proteinfjerning. Som vi bestemte, ga prøvebehandling med metanol som inneholder 1% (v / v) maursyre de beste gjenopprettingene for alle studerte kynureniner. Virkningen av en mobil fasesammensetning på omfanget av analyseionisering ble også evaluert. Vi har sjekket mobile faser bestående av 0-20 mmol / L ammonium format eller ammoniumacetat ved forskjellig pH justert med maursyre eller eddiksyre. Den mobile fasen som inneholder 20 mmol / L ammoniumformat i vann (pH 4.3, løsningsmiddel A) og acetonitril (løsningsmiddel B) ga best mulige forhold for samtidig kvantifisering av Kyn, 3HKyn, 3HAA og XA27. Et annet viktig skritt i LC-MS-analysen er toppintegrasjon. Noen kynureniner forekommer i en prøve ved svært lave konsentrasjonsnivåer. I dette tilfellet kan signalene fra samtidige forbindelser overlappe med målanalyttsignalet eller generere en topp på et lignende oppbevaringstids tidspunkt. En uerfaren bruker av denne metoden kan finne noen problemer med en riktig toppintegrasjon, som eksemplifisert i figur 2C. Dermed er det nødvendig med å sjekke oppbevaringstid for analytene og sammenligne med en QC-prøve og anbefales på det sterkeste.
God analytisk praksis inkluderer å velge en passende intern standard for en kvantitativ analyse. Her foreslår vi en enkel og kostnadseffektiv tilnærming ved hjelp av bare en intern standard (3NT) som analog av fire kynurenines. Resultatene bekreftet at 3NT presenterer lignende kromatografisk oppførsel som målforbindelsene, og i resultat gjør det det mulig å oppnå en god presisjon og nøyaktighet av metoden27. Under de påførte LC-forholdene er 3NT-toppen godt atskilt fra de andre analytenes signaler og lett å måle. Vi innser at isotopisk merkede interne standarder (ILIS) som brukes i slike analyser14,15 vil gi bedre kompensasjon av matriseeffekter og bedre kontroll over alle variablene som kan føre til falske resultater. På den annen side er ILISs for alle målanalytter ikke alltid lett tilgjengelige, enn si deres høye kostnader. ILISs er også dedikert i stedet for LC-MS/ MS enn LC-SQ med Single Ion Monitoring (SIM)-modus som vi ansatt i dette papiret.
Bruk av 3NT som en intern standard kan betraktes her som en begrensning av metoden på grunn av en mulighet for 3-nitrotyrosindannelse påproteiner 29. Men i tilfelle av et kulturmedium observerte vi ikke noen gratis endogene 3-nitrotyrosin. Det lar oss gjenkjenne 3NT som en passende intern standard. Vi anbefaler imidlertid en tidligere vurdering av et innledende endogent 3NT-nivå, spesielt når du studerer andre celletyper enn testet i denne rapporten.
Oppsummert, når man velger en analog av en hvilken som helst analyt, må man vurdere mange funksjoner, for eksempel kjemisk likhet og innledende fravær i en prøvematrise. Videre kan en stabilitet av den analoge interne standarden i en prøvematrise, dens utvinning og ioniseringseffektivitet i nærvær av matrisekomponenter avvike fra målforbindelsene. Dermed bør alle disse funksjonene vurderes og nøye undersøkes under metodeutvikling.
Det analytiske systemet i den presenterte metoden bestående av en MS-detektor tillot oss å oppnå lave deteksjonsgrenser (0,0033 – 0,0108 μmol/L)27. På denne måten samtidige målinger av 3HKyn, Kyn, 3HAA, XA innenfor konsentrasjonsområdet 0,018 - 4,46 μmol/l, 0,0096 - 3,84 μmol/l, henholdsvis 0,033 - 13,06 μmol/l og 0,019 – 4,87 μmol/l. Hovedbegrensningen for enhver LC-SQ-analyse er forbundet med en riktig separasjon av eksempelkomponenter i en LC-kolonne. Dårlig separasjon bidrar til lavere selektivitet sammenlignet med deteksjonen med en tandem quadrupole massespektrometri ved hjelp av produktioner og MULTIPLE Reaction Monitoring (MRM) modus. For å unngå forstyrrelser fra andre matrisekomponenter som deler de samme eller lignende ionene med et målmolekyl, må LC-separasjonsforholdene optimaliseres nøye. Som et eksempel genererer 13C Trp isotop (finnes i spormengder) samme ion av m/z 206 som valgt for XA-overvåking. Feiltolkningen ble unngått her ved å optimalisere kromatografiske forhold og tilfredsstillende separasjon av Trp og XA eluted fra kolonnen (figur 4).
I fremtidige programmer kan noen endringer i protokollen implementeres. En potensiell bruker kan endre en konsentrasjon av den interne standarden (3NT) når nivåene av studerte kynureniner forventes å falle beyound konsentrasjonene som presenteres her. Viktigere, 3NT konsentrasjon bør være den samme både i kalibrering standarder og i eksperimentelle prøver. Ved ekstremt høyt analysenivå, som Kyn observert i SK-OV-3-celler, anbefaler vi at du arbeider med en høyere konsentrasjon på 3NT. Hvis prøvefortynning er nødvendig, det shoud gjøres på det siste trinnet av protokollen, før prøveinjeksjon på LC-kolonnen.
I litteraturen er det noen protokoller foreslått for LC-MS / MS kvantitativ analyse av kynureniner i et kulturmedium fra forskjellige celler. En protokoll gir en samtidig bestemmelse av 3 metabolitter, det vil si Kyn, 3HKyn og 3HAA, men det er mindre følsomt (grense for kvantifiseringer (LOQ) på høyere nivåer), i motsetning til vår metode21. En annen rapport presenterte en metode som tillater kvantifisering av 4 kynurenines, inkludert Kyn, 3HKyn, 3HAA og XA med lignende LOQs25. Ingen av dem ble imidlertid optimalisert for påvisning av kynureniner generert av in vitro kultiverte kreftceller. Komponentene i en prøvematrise påvirker analytioniseringen i MS-kilden ved å redusere eller øke signalet, noe som er årsaken til upålitelige resultater. For å få mer nøyaktige data foreslo vi å bruke en analog intern standard (3NT) i kombinasjon med en matrisematchet kalibrering for bedre kompensasjon av matriseavhengige effekter.
Ved hjelp av den presenterte metodikken kunne vi observere at Kyn var den mest tallrike Trp-metabolitten i et kulturmedium samlet inn fra de analyserte kreftcelletypene, mens de andre studerte metabolittene under kontrollkulturforhold ikke ble oppdaget (unntatt XA tilstede i spor, men påviselige mengder). Men når cellene ble stimulert med en potent immunaktivator – bakteriell lipopolysakkarid, ble en større mengde XA i tillegg til Kyn utskilles. På den annen side var den oppdagede 3HKyn og 3HAA som er dannet oppstrøms av XA i KP fortsatt under LOQ27. Dette tyder på at noen KP-metabolitter som finnes i små mengder i et kulturmedium, kan være vanskelig å måle ved hjelp av den foreslåtte LC-SQ-tilnærmingen. Likevel er den presenterte protokollen nyttig for å identifisere endringer i KP ved kvantifisering av de akkumulerende viktige Trp-metabolittene. Ved hjelp av denne metoden i fremtidige studier for å engasjere et in vitro cellekultursystem vil levere nye biomarkører av immunrelaterte sykdommer og kreft. Vår tilnærming gir en validert og pålitelig analyse med relevant følsomhet for cellulære modeller som er utfordrende på grunn av lave konsentrasjoner av nedstrøms KP-metabolitter. De gitte instruksjonene vil tillate forskere fra ulike felt å bruke denne tilnærmingen for kvantifisering av store kynureniner knyttet til kreft og andre sykdommer. Våre data (upublisert) viser at det er nyttig for å studere KP-modulasjon i celler utsatt for forskjellige glykasjonsprodukter, men det bør også finne et program i andre forskningsfelt og sykdommer med immunkomponent, det vil si i endometriumbiologi ogreproduksjon 30.
Den presenterte protokollen kan utvides ytterligere for å bestemme ytterligere analyser som kan akkumuleres i et kulturmedium under ulike eksperimentelle forhold. De riktige referansestandardene for analyser bør benyttes for metodevalidering når det gjelder nøyaktighet, presisjon, linearitet, gjenoppretting eller selektivitet før de brukes til kvantitative analyser. Futhermore, avhengig av forskningsformålet, protokollen kan brukes for individuelle kynurenines (3HKyn, Kyn, 3HAA eller XA). I dette tilfellet kan ionene som tilsvarer forbindelser som ikke vurderes for analyse, fjernes fra MS-innstillingene. De egnede endringene i LC gradient programmet vil hjelpe med å kutte på analysetid.
Når du studerer KP, er det relevant å vurdere aktiviteten til IDO-enzymet. Dette kan anslås ganske enkelt ved å måle Trp-forbruket og Kyn slippes ut i et kulturmedium eller ved å beregne et kynurenine-til-tryptofankonsentrasjonsforhold ([Kyn]/[Trp])31. I vår tilnærming har vi ikke målt en Trp-konsentrasjon, men protokollen kan utvides ved å legge til dette målet i LC-SQ-analysen. Som en mer biokjemisk hensiktsmessig tilnærming anbefaler vi å uttrykke IDO enzymatisk aktivitet som en mengde Kyn produsert av celler per mg protein per minutt som presentert andre steder32. Vi har lagt merke til en fordel ved å bruke denne tilnærmingen i våre andre studier på kreftceller (manuskript i forberedelse) og anbefaler denne metoden når du bruker in vitro celle kultur modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av EU fra European Regional Development Fund under Operasjonell programutvikling i Øst-Polen 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), av Fakultet for bioteknologi og miljøvitenskap ved John Paul II Catholic University of Lublin (Young Scientists grant for Ilona Sadok), Polish National Science Centre, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 for Magdalena Staniszewska, prinsippetterforsker). Forfatterne takker prof. Agnieszka Ścibior fra Laboratory of Oxidative Stress, Centre for Interdisciplinary Research, JPII CUL for å dele utstyret for celle culturing og protein kvantifisering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
| Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
| Analytical balance | Ohaus | ||
| Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
| Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
| Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
| Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
| Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
| Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
| Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
| Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
| Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
| Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
| Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
| Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
| Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
| See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
| Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
| Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
| Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
| Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
| Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
| Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
| Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
References
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
- Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
- Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
- Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
- Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
- Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).
- Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
- Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
- Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
- Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M.
- Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
- Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
- Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
- Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
- Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
- Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
- Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).
- Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
- Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
- Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
- Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
- Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
- Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
- Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
- Annesley, T. M.
- Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
- Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
- Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416 (2009).
- Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).
