Questo protocollo descrive un sistema di coltura dinamica per produrre aggregati di dimensioni controllate delle cellule staminali pluripotenti umane e stimolare ulteriormente la differenziazione negli organoidi cerebellari in condizioni chimicamente definite e senza alimentatori utilizzando un bioreaettore monouso.
Il cervelletto svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell’equilibrio e della coordinazione motoria, e un difetto funzionale in diversi neuroni cerebellari può innescare disfunzione cerebellare. La maggior parte delle conoscenze attuali sui fenotipi neuronali correlati alla malattia si basa sui tessuti post-mortem, il che rende difficile la comprensione della progressione e dello sviluppo della malattia. I modelli animali e le linee cellulari immortalate sono stati utilizzati anche come modelli per i disturbi neurodegenerativi. Tuttavia, non ricapitolano completamente la malattia umana. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSC) hanno un grande potenziale per la modellazione della malattia e forniscono una fonte preziosa per gli approcci rigenerativi. Negli ultimi anni, la generazione di organoidi cerebrali da iPSC derivati dal paziente ha migliorato le prospettive per la modellazione delle malattie neurodegenerative. Tuttavia, mancano protocolli che producono un gran numero di organoidi e un’elevata resa di neuroni maturi nei sistemi di coltura 3D. Il protocollo presentato è un nuovo approccio per la generazione riproducibile e scalabile di organoidi umani derivati da iPSC in condizioni chimicamente definite utilizzando bioreattori mono uso scalabili, in cui gli organoidi acquisiscono l’identità cerebellare. Gli organoidi generati sono caratterizzati dall’espressione di marcatori specifici sia a livello di mRNA che di proteine. L’analisi di specifici gruppi di proteine consente di rilevare diverse popolazioni di cellule cerebellari, la cui localizzazione è importante per la valutazione della struttura organoide. La criosezione organoide e l’ulteriore immunosostenimento delle fette organoidi vengono utilizzate per valutare la presenza di specifiche popolazioni di cellule cerebellari e della loro organizzazione spaziale.
L’emergere di cellule staminali pluripotenti umane (PSC) rappresenta un ottimo strumento per la medicina rigenerativa e la modellazione della malattia, perché queste cellule possono essere differenziate nella maggior parte delle linee cellulari del corpoumano 1,2. Dalla loro scoperta, la differenziazione PSC utilizzando approcci diversi è stata segnalata per modellare diverse malattie, tra cui disturbi neurodegenerativi3,4,5,6.
Recentemente, ci sono state segnalazioni di colture 3D derivate da PSC simili a strutture cerebrali umane; questi sono chiamati organoidi cerebrali3,7,8. La generazione di queste strutture da PSC sani e specifici per il paziente offre una preziosa opportunità per modellare lo sviluppo umano e i disturbi del neurosviluppo. Tuttavia, i metodi utilizzati per generare queste strutture cerebrali ben organizzate sono difficili da applicare per la loro produzione su larga scala. Per produrre strutture sufficientemente grandi da ricapitolare la morfogenesi dei tessuti senza necrosi all’interno degli organoidi, i protocolli si basano sull’impegno neurale iniziale in condizioni statiche, seguito dall’incapsulamento negli idrogel e dalla successiva coltura nei sistemidinamici 3. Tuttavia, tali approcci possono limitare il potenziale aumento della produzione di organoidi. Anche se sono stati fatti sforzi per dirigere la differenziazione PSC a specifiche regioni del sistema nervoso centrale, tra cui corticale, striatale, midbrain, e neuroni del midollo spinale9,10,11,12, la generazione di regioni cerebrali specifiche in condizioni dinamiche è ancora una sfida. In particolare, la generazione di neuroni cerebellari maturi in strutture 3D deve ancora essere descritta. Muguruma et al. ha aperto la strada alla generazione di condizioni di coltura che ricapitolano lo sviluppo cerebellareprecoce 13 e ha recentemente riportato un protocollo che consente alle cellule staminali embrionali umane di generare una struttura polarizzata che ricorda il primo cervellettodel trimestre 7. Tuttavia, la maturazione dei neuroni cerebellari negli studi riportati richiede la dissociazione degli organoidi, lo smistamento dei progenitori cerebellari e la coculazione con cellule di alimentazione in un sistema di coltura monostrato7,14,15,16. Pertanto, la generazione riproducibile degli organoidi cerebellari desiderati per la modellazione della malattia in condizioni definite è ancora una sfida associata alla variabilità della coltura e dell’alimentazione.
Questo protocollo presenta condizioni di coltura ottimali per l’espansione 3D e la differenziazione efficiente dei PSC umani nei neuroni cerebellari utilizzando bioreattori a ruota verticale monoiose (vedi Tabella dei materiali per le specifiche), in seguito chiamati bioreattori. I bioreattori sono dotati di un grande impeller verticale, che in combinazione con un fondo a forma di U, fornisce una distribuzione di taglio più omogenea all’interno del vaso, consentendo una miscelazione delicata e uniforme e sospensioni di particelle con velocità di agitazioneridotte 17. Con questo sistema, è possibile ottenere aggregati cellulari controllati da forma e dimensioni, che è importante per una differenziazione più omogenea ed efficiente. Inoltre, un maggior numero di organoidi derivati da iPSC può essere generato in modo meno laborioso.
La caratteristica principale degli organoidi, che sono strutture multicellulari 3D di solito formate da cellule staminali, è l’auto-organizzazione di diversi tipi di cellule che forma forme specifiche come quelle osservate nella morfogenesiumana 18,19,20. Pertanto, la morfologia organoide è un criterio importante da valutare durante il processo di differenziazione. La criosezione degli organoidi e l’ulteriore immunosostenimento delle fette di organoidi con un insieme specifico di anticorpi consentono la visualizzazione spaziale dei marcatori molecolari per analizzare la proliferazione cellulare, la differenziazione, l’identità della popolazione cellulare e l’apoptosi. Con questo protocollo, immunostaining criosezioni organoidi, un impegno neurale efficiente iniziale è osservatodal 7 esimo giorno di differenziazione. Durante la differenziazione, vengono osservate diverse popolazioni di cellule con identità cerebellare. Dopo 35 giorni in questo sistema dinamico, il neuroepithelium cerebellare si organizza lungo un asse apicobasale, con uno strato apico di progenitori proliferanti e neuroni postmitotici situati in modo basalmente. Durante il processo di maturazione, dai giorni 35-90 di differenziazione, si possono vedere tipi distinti di+neuroni cerebellari, tra cui le cellule Purkinje (Calbindin , , le cellule di granulo (PAX6+– /MAP2, le cellule di Golgi (Neurogranin+), le cellule del pennello unipolare (TBR2+) e i neuroni di proiezione nuclei cerebellari profondi (TBR1 ) .+ Inoltre, una quantità non significativa di morte cellulare è osservata negli organoidi cerebellari generati dopo 90 giorni in coltura.
In questo sistema, gli organoidi umani derivati da iPSC maturano in diversi neuroni cerebellari e sopravvivono fino a 3 mesi senza la necessità di dissociazione e coculazione di alimentatori, fornendo una fonte di neuroni cerebellari umani per la modellazione della malattia.
La necessità di grandi numeri di cellulare e di condizioni di coltura definite per generare tipi di cellule specifiche per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa ha guidato lo sviluppo di sistemi di coltura scalabili. Negli ultimi anni, diversi gruppi hanno segnalato la generazione scalabile di progenitori neurali e neuroni funzionali32,33,34, fornendo progressi significativi nello sviluppo di nuo…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da Fundao para a Ciància e a Tecnologia (FCT), Portogallo (UIDB/04565/2020 attraverso Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Progetto N. 007317, DA PD/BD/105773/2014 a T.P.S e da PD/BD/128376/2017 a D.E.S.N.), progetti cofinanziati da FEDER (POR Lisboa 2020 -Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 20 2020) e FCT attraverso sovvenzione PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 e CEREBEX Generazione di Organoidi Cerebellar per Ataxia Research sovvenzione LISBOA-01-0145-FEDER-029298. I finanziamenti sono stati ricevuti anche dal programma orizzonte 2020 dell’Unione europea per la ricerca e l’innovazione, nell’ambito dell’accordo di sovvenzione numero 739572: il Centro di scoperta per la medicina rigenerativa e di precisione H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.
3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
DAPI | 10236276001 | Sigma | |
Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
Glycine | MB014001 | NZYtech | |
Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
Insulin | 91077C | Sigma | |
iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
SB431542 | S4317 | Sigma | |
Sucrose | S7903 | Sigma | |
SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
Tween-20 | P1379 | Sigma | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |