Summary

인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

Published: June 13, 2020
doi:

Summary

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포의 제어된 크기 응집을 생성하고 단일 사용 생물 반응기를 사용하여 화학적으로 정의되고 피더가 없는 조건하에서 소뇌 유기체의 분화를 더욱 자극하는 동적 배양 시스템을 설명합니다.

Abstract

소뇌는 균형과 모터 조정의 유지 보수에 중요한 역할을하며, 다른 소뇌 뉴런의 기능적 결함은 소뇌 기능 장애를 유발할 수 있습니다. 질병 관련 신경 표현형에 대한 현재 지식의 대부분은 질병 진행 및 발달의 이해를 어렵게 하는 사후 조직을 기반으로 합니다. 동물 모델과 불멸의 세포주 또한 신경 퇴행 성 장애에 대 한 모델로 사용 되었습니다. 그러나, 그들은 완전히 인간의 질병을 되풀이하지 않습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)는 질병 모델링을위한 큰 잠재력을 가지고 있으며 재생 접근에 대한 귀중한 소스를 제공합니다. 최근 몇 년 동안, 환자 유래 iPSC에서 대뇌 오르가노이드의 생성은 신경 퇴행성 질환 모델링에 대한 전망을 향상. 그러나, 많은 수의 오르가노이드를 생성하는 프로토콜과 3D 배양 시스템에서 성숙한 뉴런의 높은 수율은 부족합니다. 제시된 프로토콜은 유기체가 소뇌 정체성을 취득하는 확장 가능한 일회용 생물 반응기를 사용하여 화학적으로 정의된 조건하에서 인간 iPSC 유래 오르가노이드의 재현 가능하고 확장 가능한 생성을 위한 새로운 접근법입니다. 생성된 오르가노이드는 mRNA 와 단백질 수준에서 특정 마커의 발현을 특징으로 한다. 단백질의 특정 단의 분석은 오르가노이드 구조의 평가에 중요 한 다른 소뇌 세포 집단의 검출을 허용. 유기체 극저분과 오르가노이드 슬라이스의 추가 면역 염색은 특정 소뇌 세포 집단과 공간 조직의 존재를 평가하는 데 사용됩니다.

Introduction

인간 만능 줄기세포(PSC)의 출현은 이러한 세포가인체의대부분의 세포 계보로 분화될 수 있기 때문에 재생 의학 및 질병 모델링을 위한 우수한 도구를 나타낸다1,2. 이들의 발견 이후, 다양한 접근법을 이용한 PSC 분화는 신경퇴행성 질환3,4,,55,6등 다양한 질병을 모델링하는 것으로 보고되었다.,

최근에는 인간 뇌 구조를 닮은 PSCs로부터 파생된 3D 배양에 대한 보고가 있었습니다. 이들은 뇌 오르가노이드3,,7,,8이라고합니다. 건강하고 참을성 있는 특정 PsCs 둘 다에서 이 구조물의 생성은 인간 발달 및 신경 발달 무질서를 모델링할 귀중한 기회를 제공합니다. 그러나, 이러한 잘 조직된 대뇌 구조를 생성하는 데 사용되는 방법은 대규모 생산을 신청하기 어렵다. 오르가노이드 내부의 괴사 없이 조직 형태 발생을 재구성할 수 있을 만큼 큰 구조를 생성하기 위해 프로토콜은 정적 조건에서 초기 신경 약념에 의존하고, 하이드로겔의 캡슐화 및 동적 시스템3의후속 배양에 의존한다. 그러나, 이러한 접근은 오르가노이드 생산의 잠재적 인 확장을 제한 할 수있다. 피질, 줄무늬, 중뇌 및 척수 뉴런,9,,10,11,,12를포함한 중추 신경계의 특정 부위에 PSC 분화를 지시하기 위한 노력이 있었지만, 동적 조건에서 특정 뇌 영역의 생성은 여전히 과제입니다. 특히, 3D 구조에서 성숙한 소뇌 뉴런의 생성은 아직 설명되지 않았다. Muguruma 등은 초기 소뇌 발달을 재구성하는 배양 조건의 생성을개척하고 최근 인간 배아 줄기 세포가 제1 삼분기 소뇌7을연상시키는 편광 구조를 생성할 수 있도록 하는 프로토콜을 보고했다. 그러나, 보고된 연구에서 소뇌뉴런의 성숙은 오르가노이드의 해리, 소뇌선 선조의 분류, 및 단층 배양 시스템에서 피더 세포와 의 공동7배양을 필요로7,14,,15,,16. 따라서, 정의된 조건하에서 질병 모델링을 위한 바람직한 소뇌 유기성 의 재현 가능한 생성은 여전히 배양 및 피더 소스 가변성과 관련된 도전이다.

이 프로토콜은 3D 확장을 위한 최적의 배양 조건과 인간 PSC를 일회용 수직 휠 생체 반응기(사양에 대한 재료 표 참조)를 사용하여 소뇌 뉴런으로 효율적으로 분화하는 최적의 배양 조건을 제시합니다( 이후 생물 반응기라고 하는 재료표 참조). 생물 반응기는 U 자형 바닥과 함께 선박 내부에 더 균일한 전단 분포를 제공하는 대형 수직 임펠러가 장착되어 있어 부드럽고 균일한 혼합 및 입자 서스펜션을 허용하여 교반 속도17을줄입니다. 이 시스템을 사용하면 모양 과 크기 조절 셀 응집체를 얻을 수 있으며, 이는 보다 균일하고 효율적인 분화에 중요합니다. 더욱이, 더 많은 수의 iPSC 유래 오르가노이드가 덜 힘든 방식으로 생성될 수 있다.

일반적으로 줄기 세포에서 형성되는 3D 다세포 구조인 오르가노이드의 주요 특징은 인간 형태 발생18,,19,,20에서볼 수 있는 것과 같은 특정 모양을 형성하는 다른 세포 유형의 자체 조직이다. 따라서, 오르가노이드 형태는 분화 과정에서 평가되는 중요한 기준이다. 유기체의 극저분과 특정 항체 세트를 가진 유기성 슬라이스의 추가 면역 염색은 세포 증식, 분화, 세포 인구 정체성 및 세포 세포 집단 정체성을 분석하기 위해 분자 마커의 공간 시각화를 허용합니다. 이 프로토콜을 사용하면, 면역 염색 유기성 저온 절제에 의해, 초기 효율적인 신경 약념은 분화의 7일에 의해 관찰된다. 분화 하는 동안, 소뇌 정체성을 가진 여러 세포 인구 관찰. 이 동적 시스템에서 35 일 후, 소뇌 신경 에피텔륨은 증식 선조와 유면에 위치한 후유증 뉴런의 정량층과 함께 양봉 축을 따라 구성됩니다. 성숙 과정에서, 분화의 일 35-90에서, 소뇌 뉴런의 별개의 유형은 Purkinje 세포 (칼빈딘+),과립 세포 (PAX6+/MAP2+),골기 세포 (신경그라닌+),단극성 브러시 세포 (TBR2+),깊은 소뇌 핵 프로젝션 뉴런 (TBR1+)등 볼 수 있습니다. 또한, 배지에서 90일 후에 생성된 소뇌 기관지에서 세포사멸의 미미한 양이 관찰된다.

이 시스템에서 인간 iPSC 유래 오르가노이드는 다른 소뇌 뉴런으로 성숙하고 해리와 피더 공동 문화없이 최대 3 개월 동안 생존하여 질병 모델링을위한 인간 소뇌 뉴런의 원천을 제공합니다.

Protocol

1. 단층 문화에서 인간 iPSC의 패시징 및 유지 보수 플레이트 준비 지하 멤브레인 매트릭스 (재료의 표참조) 4 °C에서 주식을 해동하고 60 μL 알리쿼트를 준비합니다. -20°C에서 알리쿼를 동결합니다. 6 웰 플레이트의 우물을 코팅하려면 지하 막 매트릭스의 알리쿼트 하나를 얼음 위에 해동하십시오. 해동하면 DMEM-F12의 6mL에 60 μL을 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 ?…

Representative Results

프로토콜은 0.1 L 생물 반응기(도1A)를사용하여 세포 응집을 촉진함으로써 시작되었다. iPSC의 단일 세포 접종은 27 rpm의 교반 속도를 가진 매체의 60 mL에서 250,000 세포/mL 시드로 수행되었다. 이는 0일로 정의되었습니다. 24시간 후, 세포는 스페로이드 모양의 골재(1일째, 도 1B)를효율적으로 형성하고, 형태는 5일째까지 잘 유지되었고, 크기가 점진적으로 증?…

Discussion

신약 스크리닝 및 재생의학 적용을 위한 특정 세포 유형을 생성하는 정된 배양 조건뿐만 아니라 큰 세포 수의 필요성은 확장 가능한 배양 시스템의 개발을 주도하고 있다. 최근 몇 년 동안, 몇몇 그룹은 신경 선조 및 기능성뉴런32,,33,,34의확장 가능한 생성을 보고하고, 신경 퇴행성 장애를 위한 새로운 모델의 발달에 있는 중요?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), 포르투갈 (UIDB/04565/2020 통해 Programa Operacional 지역 드 리스보아 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 년 T.P.S 및 PD/BD/128376/2017 – D.E.S.N.까지, FEDER(POR 리스보아 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa 포르투갈)이 공동 자금을 지원하는 프로젝트 2020) 및 FCT는 C-정밀 LISBOA-01-0145-FEDER-016394 및 CEREBEX 세대의 실조 연구 보조금 LISBOA-01-0145-FEDER-029298. 기금은 또한 유럽 연합의 호라이즌2020 연구 혁신 프로그램으로부터 보조금 협정 번호 739572-재생 및 정밀 의학 H2020-2016-2017에 따라 수령되었습니다.

Materials

3MM paper WHA3030861 Merck
Accutase A6964 – 500mL Sigma cell detachment medium
Anti-BARHL1 Antibody HPA004809 Atlas Antibodies
Anti-Calbindin D-28k Antibody CB28 Millipore
Anti-MAP2 Antibody M4403 Sigma
Anti-N-Cadherin Antibody 610921 BD Transduction
Anti-NESTIN Antibody MAB1259-SP R&D
Anti-OLIG2 Antibody MABN50 Millipore
Anti-PAX6 Antibody PRB-278P Covance
Anti-SOX2 Antibody MAB2018 R&D
Anti-TBR1 Antibody AB2261 Millipore
Anti-TBR2 Antibody ab183991 Abcam
Anti-TUJ1 Antibody 801213 Biolegend
Apo-transferrin T1147 Sigma
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit 5793 – 500mL Stem cell tecnhnologies
Chemically defined lipid concentrate 11905031 ThermoFisher
Coverslips 24x60mm 631-1575 VWR
Crystallization-purified BSA 5470 Sigma
DAPI 10236276001 Sigma
Dibutyryl cAMP SC- 201567B -500mg Frilabo
DMEM-F12 32500-035 ThermoFisher
Fetal bovine serum A3840001 ThermoFisher
Gelatin from bovine skin G9391 Sigma
Glass Copling Jar E94 ThermoFisher
Glutamax I 10566-016 ThermoFisher
Glycine MB014001 NZYtech
Ham’s F12 21765029 ThermoFisher
Human Episomal iPSC Line A18945 ThermoFisher iPSC6.2
IMDM 12440046 ThermoFisher
Insulin 91077C Sigma
iPS DF6-9-9T.B WiCell
Iso-pentane PHR1661-2ML Sigma
L-Ascorbic acid A-92902 Sigma
Matrigel 354230 Corning basement membrane matrix
Monothioglycerol M6154 Sigma
Mowiol 475904 Millipore mounting medium
mTeSR1 85850 -500ml Stem cell technologies
N2 supplement 17502048 ThermoFisher
Neurobasal 12348017 ThermoFisher
Paraformaldehyde 158127 Sigma
PBS-0.1 Single-Use Vessel SKU: IA-0.1-D-001 PBS Biotech
PBS-MINI MagDrive Base Unit SKU: IA-UNI-B-501 PBS Biotech
Recombinant human BDNF 450-02 Peprotech
Recombinant human bFGF/FGF2 100-18B Peprotech
Recombinant human FGF19 100-32 Peprotech
Recombinant human GDNF 450-10 Peprotech
Recombinant human SDF1 300-28A Peprotech
ROCK inhibitor Y-27632 72302 Stem cell technologies
SB431542 S4317 Sigma
Sucrose S7903 Sigma
SuperFrost Microscope slides 12372098 ThermoFisher adhesion microscope slides
Tissue-Tek O.C.T. Compound 25608-930 VWR
Tris-HCL 1M T3038-1L Sigma
Triton X-100 9002-93-1 Sigma
Tween-20 P1379 Sigma
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 15575020 ThermoFisher

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Silva, T. P., Fernandes, T. G., Nogueira, D. E. S., Rodrigues, C. A. V., Bekman, E. P., Hashimura, Y., Jung, S., Lee, B., Carmo-Fonseca, M., Cabral, J. M. S. Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining. J. Vis. Exp. (160), e61143, doi:10.3791/61143 (2020).

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