Denne protokollen beskriver et dynamisk kultursystem for å produsere kontrollerte størrelsesaggregater av menneskelige pluripotente stamceller og ytterligere stimulere differensiering i lillehjernen organoider under kjemisk definerte og materfrie forhold ved hjelp av en engangsbioreaktor.
Lillehjernen spiller en kritisk rolle i vedlikehold av balanse og motorisk koordinering, og en funksjonell defekt i forskjellige lillehjernen nevroner kan utløse lillehjernen dysfunksjon. Mesteparten av dagens kunnskap om sykdomsrelaterte nevronale fenotyper er basert på postmortemvev, noe som gjør forståelsen av sykdomsprogresjon og utvikling vanskelig. Dyremodeller og udødelige cellelinjer har også blitt brukt som modeller for nevrodegenerative lidelser. Imidlertid gjenoppretter de ikke helt menneskelig sykdom. Humane induserte pluripotente stamceller (iPSCer) har stort potensial for sykdomsmodellering og gir en verdifull kilde til regenerative tilnærminger. I de senere årene har genereringen av cerebrale organoider fra pasientavledede iPSCer forbedret utsiktene for neurodegenerativ sykdomsmodellering. Imidlertid mangler protokoller som produserer et stort antall organoider og et høyt utbytte av modne nevroner i 3D-kultursystemer. Protokollen som presenteres er en ny tilnærming for reproduserbar og skalerbar generasjon av menneskelige iPSC-avledede organoider under kjemisk definerte forhold ved hjelp av skalerbare engangsbioreaktorer, der organoider får lillehjernens identitet. De genererte organoidene er preget av uttrykk for spesifikke markører på både mRNA og proteinnivå. Analysen av spesifikke grupper av proteiner tillater påvisning av forskjellige lillehjernecellepopulasjoner, hvis lokalisering er viktig for evaluering av organoid struktur. Organoid kryoseksjon og ytterligere immunstaining av organoidskiver brukes til å evaluere tilstedeværelsen av spesifikke lillehjernencellepopulasjoner og deres romlige organisasjon.
Fremveksten av menneskelige pluripotente stamceller (PSCer) representerer et utmerket verktøy for regenerativ medisin og sykdomsmodellering, fordi disse cellene kan differensieres i de fleste cellelinjer i menneskekroppen1,2. Siden oppdagelsen har PSC differensiering ved hjelp av ulike tilnærminger blitt rapportert å modellere ulike sykdommer, inkludert nevrodegenerativelidelser 3,4,5,6.
Nylig har det vært rapporter om 3D-kulturer avledet fra PSCer som ligner menneskelige hjernestrukturer; disse kalles hjerneorganoider3,7,8. Genereringen av disse strukturene fra både sunne og pasientspesifikke PSCer gir en verdifull mulighet til å modellere menneskelig utvikling og nevroutviklingsforstyrrelser. Metodene som brukes til å generere disse velorganiserte hjernestrukturene, er imidlertid vanskelige å søke om deres store produksjon. For å produsere strukturer som er store nok til å rekafulere vevmorfogenese uten nekrose inne i organoidene, er protokoller avhengige av den første nevrale forpliktelsen i statiske forhold, etterfulgt av innkapsling i hydrogeler og påfølgende kultur i dynamiske systemer3. Slike tilnærminger kan imidlertid begrense den potensielle oppskalering av organoidproduksjon. Selv om det er gjort forsøk på å lede PSC differensiering til bestemte regioner i sentralnervesystemet, inkludert kortikale, striatal, midbrain, og ryggmargsnevroner9,,10,,11,12, er genereringen av spesifikke hjerneregioner under dynamiske forhold fortsatt en utfordring. Spesielt har generasjonen modne cerebellar nevroner i 3D-strukturer ennå ikke blitt beskrevet. Muguruma et al. pionerer generasjonen av kulturforhold som rekafulerer tidlig cerebellar utvikling13 og nylig rapportert en protokoll som gjør det mulig for menneskelige embryonale stamceller å generere en polarisert struktur som minner om første trimester lillehjernen7. Modningen av cerebellar nevroner i de rapporterte studiene krever imidlertid dissosiasjon av organoider, sortering av cerebellar stamfarer og kokultur med materceller i et monolayer kultursystem7,14,15,16. Derfor er den reproduserbare generasjonen av de ønskede lillehjernen organoider for sykdomsmodellering under definerte forhold fortsatt en utfordring forbundet med kultur og materkildevariabilitet.
Denne protokollen presenterer optimale kulturforhold for 3D-utvidelse og effektiv differensiering av menneskelige PSCer i cerebellar nevroner ved hjelp av engangs vertikale hjul bioreaktorer (se Table of Materials for spesifikasjoner), heretter kalt bioreaktorer. Bioreaktorer er utstyrt med et stort vertikalt løpehjul, som i kombinasjon med en U-formet bunn gir en mer homogen skjærfordeling inne i fartøyet, slik at mild, jevn blanding og partikkelsuspensjon med reduserte agitasjonshastigheter17. Med dette systemet kan form og størrelseskontrollerte celleaggregater oppnås, noe som er viktig for en mer homogen og effektiv differensiering. Videre kan et større antall iPSC-avledede organoider genereres på en mindre arbeidskrevende måte.
Hovedtrekket i organoidene, som er 3D flercellede strukturer som vanligvis dannes fra stamceller, er selvorganiserende av forskjellige celletyper som danner bestemte former som de som er sett i menneskelig morfogenese18,19,20. Derfor er organoid morfologi et viktig kriterium som skal evalueres under differensieringsprosessen. Kryoseksjon av organoider og ytterligere immunstaining av organoidskiver med et bestemt sett med antistoffer tillater romlig visualisering av molekylære markører for å analysere cellespredning, differensiering, cellepopulasjonsidentitet og apoptose. Med denne protokollen, ved å immunstaining organoide kryoseksjoner, observeres en innledende effektiv neural forpliktelse avden 7. Under differensiering observeres flere cellepopulasjoner med lillehjernens identitet. Etter 35 dager i dette dynamiske systemet organiserer cerebellar neuroepithelium langs en apicobasal akse, med et apisk lag av voksende forfedre og basalt plassert postmitotiske nevroner. Under modningsprosessen, fra dag 35-90 av differensiering, kan distinkte typer cerebellar nevroner ses, inkludert Purkinje celler (Calbindin+), granulceller (PAX6+/ MAP2+), Golgi celler (Neurogranin+), unipolar børsteceller (TBR2+), og dype lillehjernen kjerner projeksjon nevroner (TBR+). Også en ubetydelig mengde celledød observeres i de genererte lillehjernen organoider etter 90 dager i kultur.
I dette systemet modnes menneskelige iPSC-avledede organoider til forskjellige lillehjernennevroner og overlever i opptil 3 måneder uten behov for dissosiasjon og materkokultur, noe som gir en kilde til menneskelige lillehjernernevroner for sykdomsmodellering.
Behovet for store celletall samt definerte kulturforhold for å generere spesifikke celletyper for narkotikascreening og regenerative medisinapplikasjoner har drivt utviklingen av skalerbare kultursystemer. I de senere årene har flere grupper rapportert den skalerbare generasjonen av nevrale stamfar og funksjonelle nevroner32,33,34, noe som gir betydelige fremskritt i utviklingen av nye modeller for nevrodegenerative lidelser. …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 gjennom Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 til T.P.S og PD/BD/128376/2017 til D.E.S.N.), prosjekter finansiert av FEDER (POR Lisboa 2020– Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) og FCT gjennom tilskudd PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 og CEREBEX Generasjon av Cerebellar Organoids for Ataxia Research stipend LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Det ble også mottatt midler fra EUs Horizon 2020 Research and Innovation Programme, i henhold til tilskuddsavtalen nummer 739572 – The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.
3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
DAPI | 10236276001 | Sigma | |
Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
Glycine | MB014001 | NZYtech | |
Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
Insulin | 91077C | Sigma | |
iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
SB431542 | S4317 | Sigma | |
Sucrose | S7903 | Sigma | |
SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
Tween-20 | P1379 | Sigma | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |