Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinin kontrollü boyut agregaları üretmek ve daha da kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen koşullar altında serebellar organoidlerde farklılaşma uyarmak için dinamik bir kültür sistemi açıklar tek kullanımlık biyoreaktör kullanarak.
Beyincik denge ve motor koordinasyonun korunmasında kritik bir rol oynar ve farklı serebellar nöronlarda fonksiyonel bir defekt serebellar disfonksiyonu tetikleyebilir. Hastalığa bağlı nöronal fenotipler hakkındaki mevcut bilginin çoğu postmortem dokular dayanmaktadır, bu da hastalığın ilerlemesini ve gelişimini zorlaştırır. Hayvan modelleri ve ölümsüzleştirilmiş hücre hatları da nörodejeneratif bozukluklar için model olarak kullanılmıştır. Ancak, onlar tam olarak insan hastalığı özetlemek yok. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) hastalık modelleme için büyük bir potansiyele sahip ve rejeneratif yaklaşımlar için değerli bir kaynak sağlar. Son yıllarda, hasta kaynaklı iPSCs gelen serebral organoidlerin nesil nörodejeneratif hastalık modelleme için umutları geliştirdi. Ancak, organoidler çok sayıda ve 3D kültür sistemlerinde olgun nöronların yüksek verim üreten protokoller eksiktir. Sunulan protokol, organoidlerin serebeller kimlik elde ettiği ölçeklenebilir tek kullanımlık biyoreaktörler kullanılarak kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında insan iPSC kaynaklı organoidlerin tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir üretimi için yeni bir yaklaşımdır. Oluşturulan organoidler hem mRNA hem de protein düzeyinde spesifik belirteçlerin ekspresyonu ile karakterizedir. Belirli protein gruplarının analizi, lokalizasyonu organoid yapının değerlendirilmesi nde önemli olan farklı serebellar hücre popülasyonlarının saptanmasına olanak sağlar. Organoid kriyoselve organoid dilimlerin daha fazla immünboyama belirli serebellar hücre popülasyonlarının varlığını ve mekansal organizasyonlarını değerlendirmek için kullanılır.
İnsan pluripotent kök hücrelerinin ortaya çıkması (PSCs) rejeneratif tıp ve hastalık modelleme için mükemmel bir araç temsil eder, Bu hücrelerin insan vücudunun en hücre soyları içine ayırt edilebilir çünkü1,2. Onların keşfinden bu yana, PSC farklılaşma farklı yaklaşımlar kullanarak farklı hastalıkların model bildirilmiştir, nörodejeneratif bozukluklar da dahil olmak üzere3,4,5,6.
Son zamanlarda, insan serebral yapıları andıran PSCs türetilen 3D kültürlerin raporlar olmuştur; bu beyin organoidlerdenir 3,7,8. Bu yapıların hem sağlıklı hem de hastaya özel SPK’lardan üretimi, insan gelişimi ve nörogelişimsel bozuklukları modellemek için değerli bir fırsat sağlamaktadır. Ancak, bu iyi organize serebral yapılar oluşturmak için kullanılan yöntemler onların büyük ölçekli üretim için uygulamak zordur. Organoidler içinde nekroz olmadan doku morfogenezini özetleyecek kadar büyük yapılar üretmek için protokoller statik koşullarda ilk nöral bağlılığa dayanır, ardından hidrojellerde kapsülleme ve dinamik sistemlerde sonraki kültür3. Ancak, bu tür yaklaşımlar organoid üretimin potansiyel ölçek-up sınırlayabilir. Kortikal, striatal, orta beyin ve omurilik nöronlar9,10,,11,,1012dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin belirli bölgelerine PSC farklılaşma doğrudan psc farklılaşma için yapılmış olsa da, dinamik koşullarda belirli beyin bölgelerinin üretimi hala bir sorundur. Özellikle, 3D yapılarda olgun serebellar nöronların nesil henüz tarif edilmemiştir. Muguruma ve ark. erken serebellar gelişim13 recapitulate kültür koşullarının nesil öncülük ve son zamanlarda insan embriyonik kök hücrelerin in ilk trimester serebellum anımsatan polarize bir yapı oluşturmak için izin veren bir protokol bildirdi7. Ancak, bildirilen çalışmalarda serebellar nöronların olgunlaşmaorganoidlerin ayrışması gerektirir, serebellar atalarının sıralama, ve tek katmanlı kültür sisteminde besleyici hücreleri ile coculture7,14,15,16. Bu nedenle, tanımlanmış koşullar altında hastalık modelleme için istenilen serebellar organoidlerin tekrarlanabilir nesil hala kültür ve besleyici kaynak değişkenliği ile ilişkili bir sorundur.
Bu protokol, tek kullanımlık dikey tekerlek biyoreaktörleri kullanarak 3D genişleme ve insan PsC’lerinin serebellar nöronlara etkin bir şekilde farklılaşması için en uygun kültür koşullarını sunar (spesifikasyonlar için Malzeme Tablosuna bakınız), bundan böyle biyoreaktörler olarak adlandırılır. Biyoreaktörler büyük bir dikey çark ile donatılmıştır, Hangi U-şekilli alt ile birlikte, damar içinde daha homojen bir kesme dağılımı sağlamak, azaltılmış ajitasyon hızları ile nazik sağlayan, düzgün karıştırma ve parçacık süspansiyon17. Bu sistem le daha homojen ve verimli bir farklılaşma için önemli olan şekil ve boyut kontrollü hücre agregaları elde edilebilir. Ayrıca, daha az zahmetli bir şekilde iPSC kaynaklı organoidler daha fazla sayıda oluşturulabilir.
Genellikle kök hücrelerden oluşan 3D çok hücreli yapılar olan organoidlerin ana özelliği, insan morfogenezinde görülenlere benzer şekiller oluşturan farklı hücre tiplerinin kendi kendini organizasyonudur18,19,20. Bu nedenle organoid morfolojisi farklılaşma sürecinde değerlendirilmek üzere önemli bir kriterdir. Organoidlerin kriyoseksiyonu ve organoid dilimlerinin belirli bir antikor seti ile daha fazla immünboyizasyonu, hücre çoğalması, farklılaşma, hücre popülasyon uyruk kimliği ve apoptozu analiz etmek için moleküler belirteçlerin mekansal görselleştirmesine olanak sağlar. Bu protokol ile organoid kriyokesilerin immünboyboya ilefarklılaşmanın 7. Farklılaşma sırasında serebellar kimliğe sahip çeşitli hücre popülasyonları gözlenir. Bu dinamik sistemde 35 gün sonra, serebellar nöroepitel bir apikobazal eksen boyunca organize, çoğalan atalar bir apikal tabaka ve bazal bulunan postmitotik nöronlar. Olgunlaşma sürecinde, gün 35-90 farklılaşma, serebellar nöronların farklı türleri görülebilir, Purkinje hücreleri de dahil olmak üzere (Calbindin+), granül hücreleri (PAX6+/ MAP2+), Golgi hücreleri (Nörogranin+), unipolar fırça hücreleri (TBR2+), ve derin serebellar çekirdekleri projeksiyon nöronlar (TBR1+ ). Ayrıca kültürde 90 gün sonra oluşturulan serebellar organoidlerde önemli miktarda hücre ölümü gözlenmektedir.
Bu sistemde, insan iPSC kaynaklı organoidler farklı serebellar nöronlar içine olgun ve dissociation ve besleyici coculture gerek kalmadan 3 aya kadar hayatta, hastalık modelleme için insan serebellar nöronkaynağı sağlayan.
Uyuşturucu taraması ve rejeneratif tıp uygulamaları için belirli hücre tipleri oluşturmak için büyük hücre numaralarının yanı sıra tanımlanmış kültür koşullarına duyulan ihtiyaç ölçeklenebilir kültür sistemlerinin gelişmesine yol açmıştır. Son yıllarda, çeşitli gruplar nöral atalar ve fonksiyonel nöronların ölçeklenebilir nesil bildirdin32,33,34, nörodejeneratif bozukluklar için yeni mod…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portekiz (UIDB/04565/2020 programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 to T.P.S ve PD/BD/128376/2017 to D.E.S.N., FEDER tarafından ortaklaşa finanse edilen projeler (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTEKIZ 2020) ve FCT hibe PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 ve CEREBEX Nesil Serebellar Organoidler AtaksiA Araştırma hibe LISBOA-01-0145-FEDER-029298. 739572 sayılı Hibe Anlaşması kapsamında Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı’ndan da fon alındı- Keşifler Rejeneratif ve Hassas Tıp Keşifler Merkezi H2020-GENİş-01-2016-2017.
3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
DAPI | 10236276001 | Sigma | |
Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
Glycine | MB014001 | NZYtech | |
Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
Insulin | 91077C | Sigma | |
iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
SB431542 | S4317 | Sigma | |
Sucrose | S7903 | Sigma | |
SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
Tween-20 | P1379 | Sigma | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |