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本稿では、蚊中腸の品種微生物の単離と同定、蚊腸内細菌の抗生物質枯渇、特定の細菌種の再導入など、個々の蚊腸内細菌の影響を調査するためのプロトコルを提示する。
蚊の中腸は、宿主の代謝、生殖、フィットネス、獣医の能力に影響を与える微生物の複雑なコミュニティを抱えています。各腸内微生物と異なる効果です。このビデオでは、各細菌株または宿主生理学のそれぞれの役割を研究する手順を紹介します。
腸内細菌コロニーの培養を取得するには、無菌状態で蚊の中腸を解剖する。解剖中腸、セロトガネートを接地し、寒天プレートの上に広がります。プレートから単一のコロニーを選び、16個のSRNA遺伝子配列を介して細菌種を同定する。
腸内微生物叢を取り除くために、連続して3日間抗生物質を含むCODエンボスで蚊を養います。抗生物質治療の有効性は、その後の過激派の前にコロニー形成ユニットアッセイのための無菌蚊の中腸を解剖することによって確認することができる。その後、経口摂食アッセイを介して以前に蚊の腸から単離された特定の細菌種を再導入する。
宿主生理学に対する細菌の影響は、未治療の蚊、抗生物質処理された蚊、および蚊が特定の拘束を再導入したのを比較することによって評価することができる。中腸の解剖と培養可能な細菌の分離.まず、アスピレーターでケージ内の蚊を収集し、収集ボックス内の蚊を細胞にします。
蚊を麻酔し、3~5分間4度の温度を下します。蚊を氷の冷たいペトリ皿に入れて麻酔をかけ続けます。ベンチを消毒し、顕微鏡を解剖し、環境からの細菌による汚染を避けるために75%エタノールを噴霧して鉗子を除去する。
表面は、テーピングし、3分間75%エタノールでそれらを振ることによって蚊を殺菌し、PBSバッファーで2回リンスします。PBSのあなたの滴を含む無菌ガラススライド上で別々に蚊を二分します。慎重に鉗子を使用して蚊の足、翼と頭を取り除きます。
蚊の胸と腹部の最後の部分をクランプし、消化管を分離するために引き離しました。鉗子を使用して、消化管から作物とマルピギアンチューブを取り除きます。作物は、中腸のpnteriorに配置され、砂糖水を摂取した後に膨らみます。
マルピギアンチューブは、中腸と後腸の接合部にある細い排泄管のグループです。解剖した化粧を200マイクロリットルの無菌PBSバッファーを備えたEPチューブに入れ、クリーンベンチで無菌研削牧師と一緒に粉砕します。シリアルは、LB寒天プレートと絶望的なプレートに各妄想の50マイクロリットルで3つのテンポ妄想にホモジネートをロードします。
単一のコロニーが実現可能になるまで、1〜2日間プレートを37度としてインキュベートする。50ミリリットルlbブラジャー培地を含む150ミリリットルの円錐形フラスコに単一のコロニーを選びます。一晩で37度で細菌を振る。
種の識別。細菌ゲノムDNA構築キットによりTOTO DNAを抽出し、PCRにより16SRDNAを増幅します。アンブローズゲル電気泳動と駆動回収キットによるPCR産物からのDNA断片の回収と精製。
精製されたDNA断片にDNAシーケンシングを行い、達成された細菌鎖配列を有する。細菌および古細菌およびデータベースに対して細菌を同定する16個のSRNA遺伝子配列を問い合わせにブラスト検索を実行する。種レベルの同定は、最も近いチームバンクエントリと類似性99%16 SRDNA配列以上と定義した。
この分離株を対応する、16 SRDNA配列である場合に属に割り当て、類似性は99%未満であり、95%以上の抗生物質治療および細菌再導入であった。スクロースペニシリンとストレプトマイシンの必要量を量って、ペニシリンの20単位とミリリットル当たりストレプトマイシンの20マイクログラムを試すことを含む10%スクロース溶液を調製する。抗生物質を含むスクロース溶液中の綿球に浸透し、蚊を含む紙コップの上に置きます。
水辺が蒸発するのを防ぐために、綿のボールを10センチメートルのペトリ皿で覆います。綿のボールを2日2回交換し、3日間連続して蚊に餌を与えます。蚊は2つのグループに分かれています。
最初のグループは何の治療もなく蚊のカップに入れられ、綿球の医師は10%だから十字架が毎日与えられた。2番目のグループは抗生物質で治療され、3日間務める。各群で、セルゲイ蚊を解剖した。
このミカを全DNA抽出のために抽出し、QPCRを普遍的な細菌プライマーを用いて実施した、図1は、対照群および抗生物質処理群における16SRNAの発現を示す。結果は、ペニシリンおよびストレプトマイシンのコストまたは実現が成功したことを示す。細菌溶液を調製し、分光光度計でウイルス中の細菌溶液を測定し、EPチューブに1つのOT細菌懸濁液を加える。
5,000 RCAで懸濁液を4度で5分間遠心分離して上清を捨て、細菌パレットを滅菌PBS緩衝液で洗浄する。200マイクロリットルの無菌PBSバッファーで細菌パレットを再中断600マイクロリットル、10%スクロース溶液、200マイクロリットルATP、200マイクロリットルの細菌懸濁液を新しいAPチューブに加え、よく混ぜます。あるいは、細菌は、あなたの血液を活性化する熱で再懸濁することができます。
加熱活性化血液の調製。抗凝固管で新鮮な血液を凝固し、2〜3ミリリットルの新鮮な血液を摂取する。遠心分離機は、血漿および血液細胞を分離するために4度で10分間10分間、1000で。
プラズマを新しいEPチューブに集め、ここで1時間56度で活性化活性化する。滅菌PBSバッファーであなたの時間を通してブラストハウスを洗浄します。加熱活性化プラズマとの懸濁爆風の家をすすい。
膜および供給システムを組み立てる。フィルム病を最大限に引き出します。プラスチックリングと職場のパラフィルムを固定して、準備された細菌溶液をフィーダーユニットに最大財布にゆっくりと追加します。
気泡が一方向から落ちるのを避けるために、フィーダーユニットをシールします。電源を接続します。温度が37度に達するまで待って、フィーダーに細菌溶液とフィーダーユニットを取り付けます。
細菌の餌を与える前に蚊は抗生物質を代謝するために24時間停止する必要があります。蚊と紙コップのフィードユニットのために、その後、90分間の給餌を許可します。完全に奨励された蚊は、さらなる研究のために選ぶことができました。
代表結果。図2は、蚊1人当たりの平均称賛を示しています。抗生物質のプロット給餌が蚊を治療した後、我々は髄膜炎菌を見る。
図3は、Cメニンゴセプチカムを含む血液食後24時間の変異発症関連遺伝子の発現を示す。結果は、対照群および退色群の卵の生産に有意な変化がないことを示す。細菌や抗生物質処理蚊との摂食エッセイに興味を持ってくれてありがとう。
