Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

توصيف الخلايا المناعية والوسطاء الالتهابيين في البيئة الرئوية

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61359
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University, 2Department of Neuroscience, West Virginia University, 3Rockefeller Neuroscience Institute, West Virginia University
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد التغيرات في تكوين الخلايا المناعية ، وملف تعريف السيتوكين ، وملف تعريف الكيموكين في البيئة الرئوية بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر ، وهو نموذج فئران للسكتة الدماغية الإقفارية.

Abstract

قد يتغير توسع الخلايا المناعية وتنشيطها والاتجار بها إلى الرئتين ، والتي يتم التحكم فيها عن طريق التعبير عن السيتوكينات المتعددة والكيموكينات ، بسبب إصابة الدماغ الشديدة. ويتضح ذلك من حقيقة أن الالتهاب الرئوي هو سبب رئيسي للوفيات في المرضى الذين عانوا من السكتة الدماغية الإقفارية. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف استخدام التحليل الخلوي للتدفق الخلوي متعدد الألوان لتحديد 13 نوعا من الخلايا المناعية في رئتي الفئران ، بما في ذلك البلاعم السنخية ، والبلاعم الخلالية ، والخلايا المتغصنة CD103 + أو CD11b + (DCs) ، و DCs البلازما ، والحمضات ، والخلايا الوحيدة / الخلايا المشتقة من الخلايا الأحادية ، والعدلات ، والخلايا التائية والبائية المشتقة من اللمفاوية ، وخلايا NK ، وخلايا NKT ، بعد تحريض السكتة الدماغية الإقفارية عن طريق انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر. علاوة على ذلك ، نصف تحضير متجانسات الرئة باستخدام طريقة تجانس الخرز ، لتحديد مستويات التعبير عن 13 سيتوكينات مختلفة أو كيموكينات في وقت واحد بواسطة صفائف خرز متعددة الإرسال إلى جانب التحليل الخلوي للتدفق. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في الاستجابة المناعية الرئوية في بيئات الأمراض الأخرى ، مثل أمراض الرئة المعدية أو أمراض الحساسية.

Introduction

الرئتين هي عضو حاجز ، يتعرض للبيئة الخارجية ، وبالتالي ، يتلقى باستمرار تحديات مناعية مثل مسببات الأمراض والمواد المسببة للحساسية1. مطلوب تنشيط الخلايا المناعية المقيمة في الرئة وتسلل الخلايا المناعية من المحيط لإزالة مسببات الأمراض من البيئة الرئوية. بالإضافة إلى ذلك ، تحافظ الخلايا المناعية المقيمة في الرئة على التسامح مع البكتيريا المصاحبة ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا تلعب دورا في إزالة مسببات الأمراض والحفاظ على التوازن1. البلاعم السنخية والخلالية هي من بين الخلايا المناعية الخافرة المقيمة في الرئة التي تستشعر مسببات الأمراض عبر مستقبلات التعرف على الأنماط وتزيل هذه مسببات الأمراض عن طريق البلعمة2. تربط الخلايا المتغصنة المقيمة في الرئة الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية من خلال عرض المستضد3. بالإضافة إلى ذلك ، تنتج الخلايا المناعية الفطرية المحلية المنشطة السيتوكينات والكيموكينات التي تضخم الاستجابة الالتهابية وتحفز تسلل الخلايا المناعية مثل الخلايا الوحيدة والعدلات والخلايا الليمفاوية إلى الرئتين1. وقد ثبت أن السكتة الدماغية الإقفارية تعدل المناعة الجهازية وتؤدي إلى زيادة القابلية للإصابة بالعدوى الرئوية. ومع ذلك ، فقد قامت دراسات قليلة بتقييم المقصورة الرئوية بعد السكتة الدماغية الإقفارية ، على الرغم من أن بعض الدراسات فحصتها خلال الظروف الالتهابية4،5،6،7،8،9. الهدف من الطرق الموضحة هنا هو تحديد أمراض الرئة وتكوين الخلايا المناعية ومستويات تعبير السيتوكين والكيموكين في الرئتين في وقت واحد لتقييم التغييرات في المقصورة الرئوية وتقييم التغييرات المحتملة في الاستجابة المناعية الرئوية بعد نوبة نقص التروية.

الموصوف هنا هو بروتوكول للحصول على تعليق خلية واحدة من رئتي الفئران لتحديد 13 نوعا من الخلايا المناعية. يعتمد هذا البروتوكول على هضم الأنسجة باستخدام الكولاجيناز D دون الحاجة إلى جهاز فصل الأنسجة الآلي. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطوير بروتوكول لإعداد متجانسات الأنسجة التي يمكن استخدامها لتحديد مستويات التعبير عن 13 سيتوكينات مختلفة أو chemokines باستخدام صفائف الخرز متعددة الإرسال القائمة على قياس التدفق الخلوي. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح للتحقيق في آثار السكتة الدماغية الإقفارية على المناعة الرئوية ويمكن استخدامه في نماذج الأمراض الأخرى أيضا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات والإجراءات التي تم تنفيذها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة ويست فرجينيا. تم إيواء الفئران في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في vivarium في جامعة فرجينيا الغربية.

1. إعداد الحلول

  1. تحضير المخزن المؤقت للتروية (محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، PBS). استخدم ما يقرب من اثنين من الأليكوتات 10 مل من PBS المثلج البارد لكل ماوس.
  2. تحضير وسط خلايا الرئة / المخزن المؤقت FACS. يحتوي مخزن FACS المخزن المؤقت على PBS مع 1٪ مصل بقري جنيني (FBS). الحفاظ على البرد المتوسط طوال عملية استئصال الرئة ونقلها. تحضير ما يقرب من 8 مل لكل عينة رئة. قم بإعداد وسيط جديد / مخزن مؤقت FACS قبل التجارب.
  3. قم بإعداد مخزن مؤقت للتفكك لعزل خلية واحدة. يحتوي المخزن المؤقت على 1 ملغم / مل كولاجيناز D و 200 ميكروغرام / مل DNase I في محلول الملح المخزن مؤقتا من هانك (HBSS). تحضير طازجة من محلول المخزون (100 ملغ / مل كولاجيناز D و 10 ملغ / مل DNase I) قبل التجارب. هناك حاجة إلى حوالي 6 مل لكل عينة رئة. تأكد من وصول المخزن المؤقت إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  4. إعداد المخزن المؤقت للتجانس لتجانس أنسجة الرئة. يحتوي Buffer على PBS و 1x بروتين وكوكتيل مثبط للفوسفاتيز (المخزون = 100x). تحضير طازج قبل التجارب. حافظ على برودة المخزن المؤقت أثناء عملية التجانس بأكملها. ما يقرب من 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت يكفي لتجانس فص أيمن واحد من الرئتين.

2. انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر (tMCAO)

ملاحظة: تم توثيق إجراءات tMCAO عن طريق إدخال خيوط أحادية إلى الشريان الدماغي الأوسط بالتفصيل سابقا10. في هذه التجارب ، تم استخدام الفئران الذكور C57BL / 6J التي تتراوح أعمارها بين 8 و 12 أسبوعا ، والتي تزن 25-30 جم.

  1. باختصار ، قم بإعطاء 2 مغ / كغ من الميلوكسيكام تحت الجلد للفئران قبل الجراحة. تخدير الفئران بعمق في غرفة الحث باستخدام 5٪ من الأيزوفلوران. تأكد من التخدير العميق باستخدام طريقة قرصة إصبع القدم. الحفاظ على التخدير مع 1-2 ٪ من الأيزوفلوران أثناء الجراحة باستخدام مخروط الأنف. حافظ على درجة حرارة الجسم عند 36.5 - 38 درجة مئوية طوال الإجراء عن طريق وضع بطانية دافئة تحت الفئران. يجب تعقيم جميع الأدوات الجراحية بواسطة الأوتوكلاف قبل يوم من الجراحة.
  2. حلق وتحضير الجلد على الرقبة البطنية باستخدام 70٪ من الإيثانول متبوعا بفرك الكلورهيكسيدين. إدارة تحت الجلد 2 مغ / كغ بوبيفاكايين على منطقة شق قبل إجراء الشق الأول. استخدم مرهم العين لتغطية العينين لمنع الجفاف. قم بعمل شق في خط الوسط في الرقبة. اسحب الأنسجة الرخوة جانبا بلطف حول القصبة الهوائية.
  3. تحديد الشريان السباتي المشترك الأيسر والشريان السباتي الخارجي.
  4. ضع خياطة مؤقتة (بحجم 6/0) على الشريان السباتي المشترك لوقف تدفق الدم. قم بعمل شق في الشريان السباتي الخارجي.
  5. أدخل خيطا أحاديا مغلفا بالمطاط السيليكوني (حجم 6-0) في الشريان السباتي الخارجي ، ثم تقدم الخيوط الأحادية إلى الشريان الدماغي الأوسط. اترك الخيط الأحادي في الشريان الدماغي الأوسط لمدة 60 دقيقة (انسداد).
  6. راقب معدل تدفق الدم باستخدام قياس تدفق دوبلر بالليزر. يشير انخفاض معدل التدفق إلى الشريان الدماغي الأوسط الذي يبلغ > 80٪ إلى نجاح الانسداد.
  7. بعد 60 دقيقة من الانسداد ، قم بإزالة الخيوط الأحادية للسماح بحدوث التروية. أغلق الشق.
  8. في الفئران التي تعمل بالصورية ، قم بتنفيذ الخطوات 2.1-2.6 دون إدخال الخيوط الأحادية. في هذه الفئران ، يجب أن يظل معدل تدفق الدم ثابتا خلال الإجراء بأكمله.
  9. راقب الفئران يوميا وقياس العجز العصبي باستخدام معايير التسجيل القياسية11. 0 – لا يوجد عجز عصبي; 1 – يتراجع عن مقدمة الطرف المقابل عند رفعه بواسطة الذيل ؛ 2- دوائر إلى المقابل عند رفعها بواسطة الذيل ؛ 3- السقوط على النقيض أثناء المشي. 4- لا يمشي تلقائيا أو في غيبوبة. 5- ميت.
  10. توفير الحقن تحت الجلد من محلول ملحي طبيعي ومسكن (ميلوكسيكام، 2 مغ/كغ) كل 24 ساعة لمدة 3 أيام بعد الجراحة.
  11. اعزل الرئتين 24 و 72 ساعة بعد tMCAO لتحليل المصب.

3. حصاد أنسجة الرئة

  1. تخدير عميق للفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p) من 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغ / كغ من الزيلازين. تأكد من التخدير العميق باستخدام طريقة قرصة إصبع القدم.
  2. لأداء تروية الجسم كله عبر القلب12 ، قم بتثبيت الماوس على المنصة الجراحية والفراء الرطب بالإيثانول بنسبة 70٪ لتقليل توزيع الفراء في تجويف الجسم. استخدم مقص التشريح الدقيق لإجراء شق عرضي في البطن الذيلي ثم شق خط الوسط في الصفاق ، والتوقف عند التجويف الصدري قبل ثقب الحجاب الحاجز.
    1. لا تقطع العضلات / تختبئ في التجويف البريتوني ولا تستمر في شق البطن الماضي.
  3. أوقف الشق بمجرد الوصول إلى التجويف الصدري قبل ثقب الحجاب الحاجز. الحرص على عدم إتلاف القلب والرئتين مما قد يضر بجودة التروية أو استعادة الخلايا
  4. باستخدام مقص تشريح دقيق ، قم بعمل شق في خط الوسط للصفاق يتوقف عند التجويف الصدري قبل ثقب الحجاب الحاجز.
  5. أمسك الفأر من الطرف البعيد من القص باستخدام الملقط وارفعه لأعلى أثناء قطع الحجاب الحاجز للتأكد من عدم إتلاف القلب أو الرئتين أو الأوعية الدموية. بمجرد أن تصبح الأعضاء مرئية ، قم بعمل شق عبر القفص الصدري وفصل وتثبيت علبة الضلع بحيث يتعرض القلب والرئتين بالكامل.
  6. قم بعمل شق صغير بعناية في الأذين الأيمن بالقرب من قوس الأبهر. سيكون هذا بمثابة تدفق للتروية.
  7. بعد ذلك مباشرة ، أدخل بلطف إبرة 25 جم × 5/8 متصلة بحقنة مملوءة ب 10 مل من PBS البارد في السطح العلوي البعيد للبطين الأيسر. احرص على عدم إدخال الحاجز البطيني عبر البطين الأيمن. يجب إدخال الإبرة بالكاد في البطين الأيسر.
    ملاحظة: إذا تم ثقب الحاجز البطيني ، فسوف يندفع السائل من أنف الماوس. هذا سوف يقلل من جودة التروية ويؤدي إلى فقدان الخلايا.
  8. إذا رغبت في ذلك ، يمكن استخدام المشبك لتثبيت الإبرة بشكل آمن في مكانها في البطين الأيسر أثناء التروية.
  9. ادفع بثبات ولكن بلطف 10 مل من PBS البارد إلى القلب. يجب أن تبدأ أنسجة الفأر في التسرب وإزالة الدم عند خروج السائل من الأذين الأيمن.
    1. ادفع أليكوت ثان من 10 مل من PBS حتى يحدث تطهير دم كاف. سيكون للكبد مظهر بني فاتح وستنتقل الرئتين من اللون الوردي المحمر إلى اللون الأبيض في الغالب.
  10. باستخدام الملقط ومقص التشريح الدقيق ، قم بإزالة جميع الأنسجة المحيطة بعناية بما في ذلك القلب والقصبة الهوائية والمريء والغدة الصعترية والنسيج الضام والغدد الليمفاوية والشعب الهوائية الكبيرة.
  11. افصل فصوص الرئة الفردية وضع الفصوص في طبق بتري على الجليد يحتوي على 1-2 مل من وسط خلايا الرئة الباردة.

4. تجانس أنسجة الرئة لمصفوفات الخرز متعددة الإرسال باستخدام مجانس الخرز

  1. قم بتبريد أنبوب غطاء لولبي مخروطي سعة 2 مل يحتوي على 3 حبات زركونيا / سيليكا معقمة مقاس 2.3 مم. أضف 200 ميكرولتر من مخزن التجانس البارد إلى الأنبوب.
  2. وزن الفص ، ونقل الفص إلى أنبوب مخروطي مبرد مسبقا يحتوي على الخرز والمخزن المؤقت للتجانس.
    ملاحظة: ما يقرب من 50-100 ملغ من الأنسجة المتجانسة في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت ستكون كافية للكشف عن تعبير السيتوكين والكيموكين في العينة.
    1. قم بتجانس الفص باستخدام مجانس قائم على الخرز (انظر جدول المواد) عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
    2. تأكد من أن الأنسجة متجانسة تماما. زيادة الوقت إذا لزم الأمر.
  3. بعد التجانس ، قم بالطرد المركزي للأنبوب في جهاز طرد مركزي صغير مبرد مسبقا (4 درجات مئوية) عند 15,870 × g لمدة 3 دقائق.
  4. انقل المواد الفائقة إلى أنبوب دقيق 1.5 مل مبرد مسبقا.
  5. ضع العينة مباشرة على الجليد للاستخدام الفوري أو قم بتخزين العينة عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. تجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة.

5. تفكك أنسجة الرئة وعزل خلية واحدة

  1. صب وسط خلايا الرئة ، من فصوص الرئة المتبقية لتجنب تخفيف العازلة للانفصال. ثم ، أدخل بعناية حقنة 1 مل مع إبرة 25G و 5/8 تحتوي على 1 مل من العازل الانفصالي في أنسجة الرئة.
  2. حقن أجزاء صغيرة (حوالي 1/4عشر إلى 1/5ث) من العازلة التفكك في كل فص الرئة وتضخيم بلطف.
    ملاحظة: معظم المخزن المؤقت سوف يندفع بعد فترة وجيزة من النفخ حيث تم استئصال الفص.
  3. كرر حقن المخزن المؤقت للتفكك 1-2x.
  4. احتضن فصوص الرئة باستخدام عازل للتفكك لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بفرم فصوص الرئة إلى قطع صغيرة باستخدام مقص تشريح ناعم.
  6. انقل قطع الرئة المفرومة باستخدام العازل للتفكك إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.  تكملة مع العازلة تفكك إضافية إلى ما مجموعه 6 مل. دوامة بقوة لمدة 1 دقيقة.
  7. احتضن العينة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. دوامة بقوة كل 7-8 دقائق.
  8. بعد 45 دقيقة من الحضانة ، دوامة العينة بقوة لمدة 1 دقيقة للحصول على أفضل النتائج.
  9. قم بفصل العينة عن طريق المرور عبر مصفاة خلية 100 ميكرومتر لإزالة الأنسجة الضامة المتبقية وغير المرغوب فيها والخلالية.
  10. الطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق في 380 × غرام ، وتجاهل supernatant.
  11. أضف 5 مل من وسط خلايا الرئة الباردة إلى العينة. أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق دوامة لطيفة.
  12. الطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق في 380 × غرام ، وتجاهل supernatant.
  13. أضف 1 مل من وسط خلايا الرئة الباردة. أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق دوامة لطيفة.
  14. تمر عبر مصفاة خلية 100 ميكرومتر ، وتحسب الخلايا.

6. تحليل التدفق الخلوي لمكانة الخلايا المناعية الرئوية

  1. البذور 1-2 × 106 خلايا / جسم مضاد مجموعة في 96 لوحة سفلية مستديرة جيدا (3 مجموعات في المجموع). الطرد المركزي للخلايا لمدة 3 دقائق في 830 × غرام. تخلص من السوبرناتونات.
  2. أعد تعليق بيليه الخلية في 50 ميكرولتر من PBS البارد الذي يحتوي على بقعة حية / ميتة قابلة للإصلاح. تحضير البقعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. احتضان الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة محمية من الضوء. الطرد المركزي للخلايا لمدة 3 دقائق في 830 × غرام. تخلص من السوبرناتونات.
  4. أعد تعليق حبيبة الخلية مع 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد FACS الذي يحتوي على 5 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة المضادة للفأر CD16/32. تحضن في 4 درجات مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
  5. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد FACS الذي يحتوي على مجموعات الأجسام المضادة المدرجة في الجدول 1 إلى الخلايا. اخلطيه عن طريق السحب اللطيف.
    ملاحظة: الحجم الإجمالي للمخزن المؤقت FACS لتلطيخ الأجسام المضادة هو 50 ميكرولتر. لذلك ، عند إعداد مزيج رئيسي من الأجسام المضادة في 25 ميكرولتر ، يجب أن يكون تركيز الأجسام المضادة ضعف التركيز النهائي.
  6. احتضان الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة محمية من الضوء. الطرد المركزي للخلايا لمدة 3 دقائق في 830 × غرام. تخلص من السوبرناتونات.
  7. أعد تعليق الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS البارد. الطرد المركزي للخلايا لمدة 3 دقائق في 830 × غرام. تخلص من السوبرناتونات.
  8. أعد تعليق الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS البارد. نقل إلى البوليسترين مستديرة القاع 5 مل أنبوب FACS يحتوي على 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACs إضافية. قم بتحليل العينة على الفور باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: يسمح تثبيت الخلايا باستخدام الخطوات التالية بتحليل العينات لاحقا.
  9. بعد الخطوة 6.7.، أعد تعليق العينة مع 100 ميكرولتر من 1٪ بارافورمالديهايد في PBS.
  10. احتضان العينة عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء. الطرد المركزي للخلايا لمدة 3 دقائق في 830 × غرام. تخلص من السوبرناتونات.
  11. أعد تعليق الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS البارد. الطرد المركزي للخلايا لمدة 3 دقائق في 830 × غرام. تخلص من السوبرناتونات.
  12. أعد تعليق الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS البارد. تخزين الخلايا في 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء. تحليل العينة في غضون 72 ساعة.

7. صفائف حبة متعددة الإرسال للكشف عن السيتوكين والكيموكين

ملاحظة: تم استخدام ألواح الكيموكين متعددة الإرسال والتهاب الالتهاب المتاحة تجاريا لتحديد تعبير الكيموكينات والسيتوكينات في الرئتين بعد تحريض tMCAO وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، والذي تم وصفه بالتفصيل13.

  1. باختصار ، قم بإذابة التحليلات على الجليد إذا تم تخزينها عند -80 درجة مئوية بعد تجانس الأنسجة. قم بالطرد المركزي للعينة عند 590 × g لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام لإزالة أي أنسجة متبقية.
  2. قم بإنشاء منحنى قياسي عن طريق التخفيف المتسلسل للكوكتيل القياسي (C7) الذي يكون بتركيز معروف يبلغ 10 نانوغرام / مل إلى 7 معايير (C1-6) مع المعيار الأخير هو المخزن المؤقت للمقايسة وحده (C0).
  3. بمجرد ارتفاع درجة حرارة جميع الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 25 ميكرولتر من كل معيار و 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى لوحة بئر V أسفل 96.
  4. إلى كل عينة بشكل جيد ، أضف 25 ميكرولتر من تجانس الرئة (تحليل) و 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى لوحة بئر V السفلية 96
  5. دوامة الخرز المطلي مسبقا بقوة ، ثم إضافة 25 ميكرولتر من الخرز المطلي مسبقا إلى كل من الآبار القياسية والعينة.
  6. أغلق اللوحة واحميها من الضوء عن طريق تغطيتها بورق القصدير. هز اللوحة عند 110 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  7. جهاز طرد مركزي عند 230 × جم لمدة 5 دقائق. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل عند 1x (محلول المخزون هو 20x ، تمييع إلى 1x بالماء). احتضان لمدة 1 دقيقة.
  8. جهاز طرد مركزي عند 230 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق المعيار والعينة بأجسام مضادة للكشف عن 25 ميكرولتر.
  9. قم بإغلاق اللوحة وتغطيتها للحماية من الضوء. رج اللوحة عند 110 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  10. أضف 25 ميكرولتر من الستربتافيدين فيكويريثرين (SA-PE) إلى كل معيار وعينة جيدة.
  11. قم بإغلاق اللوحة وتغطيتها للحماية من الضوء. رجه بسرعة 110 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  12. قم بتدوير اللوحة على 230 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق المعيار والعينات في مخزن مؤقت للغسيل بمعدل 1x.
  13. انقل إلى أنبوب FACS من البوليسترين ذو القاع الدائري سعة 5 مل المسمى جيدا والذي يحتوي على 150 ميكرولتر إضافية من مخزن مؤقت للغسيل 1x.
  14. تحديد شدة تألق إشارة PE للمعايير والعينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
  15. قم ببناء منحنى قياسي لكل كيموكاين وسيتوكين باستخدام متوسط كثافة التألق (MFI) ل PE مقابل التركيزات المحددة مسبقا.
  16. أوجد تركيز كل كيموكين وسيتوكين باستخدام المنحنى القياسي ومؤشر MFI من كل عينة. توفر لوحة الإرسال المتعدد برنامج تحليل البيانات الذي يمكن استخدامه لتحديد تركيز كل تحليل. يستخدم وزن الفص القمي / العلوي لتحديد تركيز السيتوكينات أو الكيموكين لكل ملليغرام من الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لقد أبلغنا مؤخرا أن تحريض السكتة الدماغية الإقفارية في الفئران يغير تكوين الخلايا المناعية للرئتين11. على وجه التحديد ، زاد نقص التروية الدماغية العابرة من النسب المئوية للبلاعم السنخية ، والعدلات ، و CD11b + DCs ، مع تقليل النسب المئوية للخلايا التائية CD4 + ، والخلايا التائية CD8 + ، والخلايا البائية ، وخلايا NK ، والحمضات في المقصورة الرئوية. علاوة على ذلك ، يتوافق التغيير الخلوي مع مستويات متناقصة بشكل كبير من الكيموكينات المتعددة في الرئتين. الموصوفة هنا هي طريقة لعزل وتحديد مجموعات الخلايا المناعية المختلفة في المقصورة الرئوية. كانت النتائج التمثيلية الموضحة هنا من الفئران التي خضعت لتحريض tMCAO وعملية صورية.

حددنا 13 مجموعة مختلفة من الخلايا المناعية في الرئتين (L1-L13) باستخدام 3 مجموعات من مجموعات الأجسام المضادة مع كل مجموعة تحتوي على 5-7 أجسام مضادة (الشكل 1). تم استبعاد الخلايا الميتة باستخدام بقعة حية / ميتة في كل مجموعة. وترد في الجدول 1 الأجسام المضادة وعلامات التمييز بين أنواع الخلايا المناعية المختلفة. تم تحديد البلاعم السنخية والخلالية ، و CD103 + DCs ، و CD11b + DCs ، والحمضات في المجموعة 1 (الشكل 1A ، B). تم تحديد الخلايا الوحيدة والعدلات المحفزة للالتهابات في المجموعة 2 (الشكل 1C). أثناء الاستجابات الالتهابية، تهاجر الخلايا الوحيدة إلى موقع الالتهاب، حيث تتمايز هذه الخلايا إلى خلايا عرض مستضدات مشتقة من الخلية الأحادية (mo-APCs)14. يعد خفض تنظيم Ly6C و CCR2 من سمات تمايز الخلايا الأحادية ، والتي يمكن تقييمها باستخدام المجموعة 215.  تم تحديد الخلايا التائية CD4+ والخلايا التائية CD8+ والخلايا البائية والخلايا البلازمية DCs وخلايا NK وخلايا NKT باستخدام المجموعة 3 (الشكل 1D).

لتحديد جودة بروتوكول عزل الخلية الواحدة لدينا، قارنا عدد الخلايا القابلة للحياة والخلايا المناعية CD45+ المعزولة باستخدام الطريقة اليدوية مع الخلايا المعزولة باستخدام فاصل الأنسجة المتاح تجاريا (انظر جدول المواد)، والذي يستخدم غالبا لعزل الخلايا من الأنسجة16،17،18،19،20 . في البروتوكول الأخير ، تم نقل فصوص الرئة إلى أنبوب خاص بالفاصل (انظر جدول المواد) بعد حقن المخزن المؤقت للتفكك ، وتم هضم الأنسجة باستخدام برنامج 37C_m_LDK_1. كان العدد الإجمالي للخلايا القابلة للحياة ، والنسبة المئوية لخلايا CD45 + ، والعدد الإجمالي لخلايا CD45 + التي تم الحصول عليها قابلة للمقارنة بين الطريقتين (الشكل 2A-C). كانت النسبة المئوية لموت الخلايا بين خلايا CD45 + باستخدام كلا البروتوكولين ~ 10٪ (الشكل 2D). تشير هذه النتائج إلى أن البروتوكول المعروض هنا يسمح باستعادة الخلايا بإنتاجية عالية وجودة عالية دون مساعدة من جهاز فصل الأنسجة الآلي.

واستخدم مقايسة متعددة الإرسال متاحة تجاريا مقترنة بتحليل التدفق الخلوي لتحديد تركيز 13 كيموكينات باستخدام 25 ميكرولتر من العينة (الشكل 3). تم تحديد حجمين مختلفين من الخرز لأول مرة بواسطة FSC / SSC (الشكل 3A). كل حبة مغلفة ب 6-7 أجسام مضادة أولية ، والتي يمكن تمييزها بكثافة التألق في قناة APC (الشكل 3B). يتناسب مستوى الكيموكينات في العينة مع كثافة التألق في قناة PE ، والتي يمكن تحديدها بواسطة MFI (الشكل 3C). من خلال مقارنة قيمة MFI لكل كيموكين مع المنحنى القياسي الذي تم بناؤه بتركيزات معروفة من الكيموكين ، يمكن تحديد التركيز في العينة (لكل ملغ من الأنسجة).

Figure 1
الشكل 1: تحديد 13 نوعا من الخلايا المناعية من الرئتين بعد هضم الأنسجة باستخدام الكولاجيناز D بعد السكتة الدماغية الإقفارية. تم استئصال أنسجة الرئة على مدار 24 ساعة بعد عملية tMCAO أو عملية صورية ، وتم تحليل الخلايا المناعية في الرئتين عن طريق قياس التدفق الخلوي ، الذي تم تحديده بواسطة علامات السطح المدرجة في الجدول 1. (أ) في مجموعة الأجسام المضادة 1 ، تم أولا وضع بوابات الخلايا القابلة للحياة CD45 + (*) على Siglec F و CD11b لتحديد البلاعم السنخية (L1) ، التي عبرت عن CD11c و MHC II ، والحمضات (L2) ، التي لم تعبر عن CD11c و MHC II. (ب) ثم تم وضع بوابات للخلايا داخل مجموعة Siglec F (**) في A لتحديد التعبير عن CD103 و CD11b. CD103 + CD11b - (***). كما تم وضع بوابات إضافية لتحديد التعبير عن CD11c وMHC II. عبرت CD103+ DCs عن كل من CD11c و MHC II (L3) ولكنها لم تعبر عن CD64. تم وضع بوابات إضافية لسكان CD11b hi (****) لتحديد تعبير CD64 و MHC II. عبرت CD11b+ DCs عن MHC II ولكن ليس CD64 (L4) ، في حين عبرت البلاعم الخلالية (L5) عن كلا العلامتين. (C) في مجموعة الأجسام المضادة 2 ، تم إغلاق الخلايا القابلة للحياة CD45 + في A لتحديد التعبير عن CD11b و Ly6C. تمثل خلايا Ly6C hi (*) الخلايا الوحيدة غير المتمايزة التي حافظت على مستوى عال من تعبير CCR2 (L6 ، المخطط الأوسط) ، في حين أن الخلايا المنخفضة Ly6C (**) تحتوي على مجموعة مختلطة من الخلايا الوحيدة المتباينة التي كانت Ly6G - (L6 ، المخطط الأيمن) ، والعدلات Ly6G + (L7). (D) في مجموعة الأجسام المضادة 3 ، تم إغلاق الخلايا القابلة للحياة CD45 + في A لتحديد التعبير عن CD11c و B220 لتحديد الخلايا البائية (L8) و DCs البلازما (L9). ثم تم وضع بوابات على مجموعة CD11c و B220 (*) لتحديد التعبير عن CD4 و CD8 لتحديد الخلايا التائية CD4 + (L10) والخلايا التائية CD8 + (L11). تم وضع بوابة إضافية على السكان CD4- CD8 (**) لتحديد التعبير عن NK1.1 و TCRb لتحديد خلايا NK (L12) وخلايا NKT (L13). تظهر قطع أرض تمثيلية من 12 فئران C57BL/6J بعد tMCAO وعملية صورية. تمت إعادة طباعة أجزاء من الشكل من الأدبيات المنشورة سابقا11 بإذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مقارنة بين طريقة التفكك اليدوي واستخدام أداة فصل الأنسجة لعزل الخلايا المفردة عن الرئتين. (أ-ج) تمت مقارنة العدد الإجمالي للخلايا، والنسبة المئوية لخلايا CD45+، والعدد الإجمالي لخلايا CD45+. تظهر نتائج مجمعة من 3 تجارب مستقلة. NS: ليست ذات دلالة إحصائية. (د) مخططات تمثيلية لتحديد النسبة المئوية لخلايا CD45+ الميتة بعد العزل. تظهر مؤامرات تمثيلية من 3 تجارب مستقلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: السكتة الدماغية الإقفارية تمنع إنتاج الكيموكينات المتعددة في الرئتين. (أ-ج) مخططات تمثيلية توضح تحديد مستوى 13 كيموكين في الرئتين بواسطة صفيف خرز متعدد الإرسال.  (أ) استخدمت بوابة FSC/SSC لتحديد الخرز A و B بأحجام مختلفة. (ب) يمكن تمييز الأجسام المضادة الأولية المغلفة على الخرز بكثافة التألق في قناة APC. (ج) كان مستوى الكيموكينات في العينة متناسبا مع شدة التألق في قناة PE. تظهر قطع أرض تمثيلية من 12 فأرا C57BL/6J بعد عملية صورية. (د) تم تجانس أنسجة الرئة 24 ساعة بعد tMCAO أو operatio الزائفة. تم تحديد مستوى 13 chemokines في رئتي الحيوانات الفردية بواسطة صفيف خرز متعدد الإرسال. البيانات المعروضة هي نتائج مجمعة من ثلاث تجارب مستقلة مع n = 11-12 حيوانا لكل مجموعة. *، P < 0.05؛ ** ، P < 0.01 ؛ ، P < 0.001. NS ، لا تختلف إحصائيا. تمت إعادة طباعة أجزاء من الشكل من الأدبيات المنشورة سابقا11 بإذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جسم استنساخ نوع الخلية المناعية سكان تعبير علامة السطح
CD45-FITC 30-F11 البلاعم الفيلوار L1 CD45+ سيجليك F+ CD11b-
سيجليك F-PE E50-2440 الحمضات L2 CD45+ سيجليك F+ CD11b+
CD11c-Percp/Cy5.5 N418 CD103+ DCs L3 CD45+ Siglec F- CD11b- CD103+ CD11c+ MHC II+
CD11b-PE/Cy7 م1/70 CD11b + DCs L4 CD45+ سيجليك F - CD11b مرحبا CD103 - CD64 - MHC II +
CD64-APC X54-5/7.1 البلاعم الخلالية L5 CD45 + سيجليك F - CD11b مرحبا CD103 - CD64 + MHC II +
CD103-BV421 2E7
MHC II-BV510 م5/114.15.2
يعيش / ميت APC / Cy7
CD45-FITC 30-F11 الخلايا الوحيدة/المودي سي L8 CD45 + CD11b مرحبا Ly6C مرحبا / انت CCR2 + / - Ly6G-
Ly6C-PE هونج كونج1.4 العدلات L9 CD45 + CD11b مرحبا Ly6C الدولية CCR2 - Ly6G +
CD11b-PE/Cy7 م1/70
CCR2-BV421 SA203G11
Ly6G-BV510 1أ٨
يعيش / ميت APC / Cy7
CD45-FITC 30-F11 البلازما DCs L6 CD45+ B220+ CD11c+
CD8-PE 53-6.7 الخلايا البائية L7 CD45+ B220+ CD11c-
NK1.1-Percp/Cy5.5 PK136 خلايا CD4+ T L10 CD45+ B220- CD11c- CD4+ CD8-
CD11c-PE/Cy7 N418 خلايا CD8+ T L11 CD45+ B220 - CD11c - CD4 - CD8+
APC-B220 RA3-6B2 خلايا NK L12 CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb-
CD4-BV421 GK1.5 خلايا NKT L13 CD45+ B220 - CD11c - CD4 - CD8 - NK1.1 + TCRb +
تي سي آر بي-BV510 H57-597
يعيش / ميت APC / Cy7

الجدول 1: علامات السطح ومجموعات الأجسام المضادة لتحديد الخلايا المناعية المعزولة من الرئتين بعد tMCAO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تسمح البروتوكولات الموصوفة هنا بتحديد أنواع الخلايا المناعية الرئوية والتعبير عن الكيموكينات أو السيتوكينات في نفس الماوس. إذا كانت هناك حاجة إلى إجراء دراسة لأمراض الأنسجة ، فيمكن إزالة الفص الفردي وتثبيته لهذا الغرض قبل المتابعة إلى خطوات عزل الخلية الواحدة. أحد القيود على هذه الطريقة هو أن هذا النهج قد لا يكون مناسبا في بعض بيئات المرض إذا كان من المتوقع أن يكون التغيير في تكوين الخلايا المناعية والتعبير عن الكيموكينات و / أو السيتوكينات موزعا بشكل غير متساو بين الفصوص المختلفة للرئتين. على سبيل المثال ، تظهر بعض البكتيريا ، مثل المتفطرة السلية ، ميلا لإصابة فصوص معينة من الرئة21. في هذه الحالة ، قد تكون هناك حاجة إلى مقارنة بين الفصوص.

يؤثر تركيز ووقت الحضانة ودرجة حرارة بروتوكول عزل الخلية الواحدة من الرئتين بشكل حاسم على استعادة الخلايا المناعية من الرئتين. تعد جودة الكولاجيناز D أمرا بالغ الأهمية للحصول على أفضل النتائج ويجب اختبارها إذا تم استخدام مصدر مختلف للكولاجيناز D. الإفراط في هضم الأنسجة يؤدي إلى زيادة موت الخلايا. في حين أن نقص هضم الأنسجة يسبب انخفاض إنتاجية الخلايا المناعية ، وخاصة البلاعم و DCs.

استخدمنا 3 مجموعات من الأجسام المضادة لتحديد 13 مجموعة من الخلايا المناعية في الرئتين ، مع كل مجموعة تحتوي على 5-7 أجسام مضادة وبقعة حية / ميتة. يمكن دمج الأجسام المضادة في كل مجموعة إذا كان عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من العينات محدودا.  ومع ذلك ، فإن إحدى القضايا الرئيسية التي تنشأ عند زيادة عدد الأجسام المضادة هي أن تعويض إشارة التألق على مقياس التدفق الخلوي يمكن أن يكون تحديا ، خاصة عند التمييز بين الخلايا والخط النخاعي في ظل الظروف الالتهابية. يمكن استخدام كوكتيلات إضافية من الأجسام المضادة لتحديد الخلايا المناعية الفطرية الأخرى داخل تعليق الخلية الواحدة ، مثل الخلايا اللمفاوية الفطرية والخلايا التائية γδ ، التي تساهم في الاستجابة المناعية في الرئتين22,23. نظرا لأن فصيصا واحدا من الرئة يؤخذ للمصفوفة متعددة الإرسال ، فلا يمكن تحديد العدد الدقيق لكل نوع من أنواع الخلايا في الرئتين ومقارنته بشكل نهائي ، وهذا يشكل قيدا على هذه الطريقة. لمعالجة هذا ، يمكن عزل عدد محدد من الخلايا من رئتي الفئران الصورية والفئران التي يسببها tMCAO. في هذه الحالة ، يمكن مقارنة العدد المطلق لكل نوع من الخلايا المناعية بدقة بين المجموعتين. بالإضافة إلى ذلك ، لا تسمح هذه الطريقة بتحديد توطين الخلايا المناعية في الرئة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق إجراء الكيمياء النسيجية المناعية على أقسام الرئة.

في الختام ، تم استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في تأثير السكتة الدماغية الإقفارية في المناعة الرئوية ، ولكن يمكن استخدامه أيضا لدراسة نماذج الأمراض الأخرى ، مثل العدوى والحساسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة P20 GM109098 وبرنامج جائزة الابتكار من Praespero إلى Edwin Wan. تم إجراء تجارب قياس التدفق الخلوي في منشأة WVU Flow Cytometry & Single Cell Core ، والتي تدعمها منح المعاهد الوطنية للصحة S10 OD016165 و U57 GM104942 و P30 GM103488 و P20 GM103434.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B220-APC, clone RA3-6B2 Biolegend 103212 1:200 dilution
Beadbug 3 position bead homogenizer Benchmark Scientific D1030 Tissue homogenizer
CCR2-BV421, clone SA203G11 Biolegend 150605 1:200 dilution
CD103-BV421, clone 2E7 Biolegend 121422 1:200 dilution
CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 Biolegend 101216 1:400 dilution
CD11c-PE/Cy7, clone N418 Biolegend 117318 1:200 dilution
CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 Biolegend 117328 1:200 dilution
CD4-BV421, clone GK1.5 Biolegend 100443 1:200 dilution
CD45-FITC, clone 30-F11 Biolegend 103108 1:200 dilution
CD64-APC, clone X54-5/7.1 Biolegend 139306 1:200 dilution
CD8-PE, clone 53-6.7 Biolegend 100708 1:800 dilution
Collagenase D Sigma Aldrich 11088882001 Component in the dissociation buffer
Conical screw cap tube ThermoFisher 02-681-344 Tube for tissue homogenization
DNase I Sigma Aldrich 10104159001 Component in the dissociation buffer
Fc block CD16/32 antibody Biolegend 101320 1:100 dilution
genlteMACS dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator
gentleMACS C tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator
Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial ThermoFisher 78442 Component in the homogenization buffer
Laser doppler monitor Moor MOORVMS-LDF Blood flow monitoring during tMCAO
LEGENDplex proinflammatory chemokine panel Biolegend 740451 Multiplex bead array
LIVE/DEAD fixable near-IR stain ThermoFisher L34976 Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis
Ly6C-PE, clone HK1.4 Biolegend 128008 1:800 dilution
Ly6G-BV510, clone 1A8 Biolegend 127633 1:200 dilution
MCAO suture L56 reusable 6-0 medium Doccol 602356PK10Re tMCAO
MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 Biolegend 107636 1:800 dilution
NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 Biolegend 108728 1:200 dilution
Siglec F-PE, clone E50-2440 BD Biosciences 552126 1:200 dilution
Silk suture thread, size 6/0 Fine Science Tools 18020-60 tMCAO
SomnoSuite anesthesia system Kent Scientific SS-01 Mouse anaesthetization for tMCAO
TCRb-BV510, clone H57-897 Biolegend 109234 1:200 dilution
Zirconia/silica beads, 2.3 mm Biospec 11079125z Beads for tissue homogenization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
  2. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
  3. Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
  4. Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
  5. Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
  6. McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
  7. Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
  8. Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
  9. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  10. Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
  11. Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  13. Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
  14. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  15. Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
  16. Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
  17. Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
  18. Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
  19. Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
  20. Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
  21. Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
  22. Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
  23. Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 160، المناعة الرئوية، تنميط الخلايا المناعية، السيتوكينات، الكيموكينات، قياس التدفق الخلوي، صفائف الخرز متعددة الإرسال، السكتة الدماغية الإقفارية
توصيف الخلايا المناعية والوسطاء الالتهابيين في البيئة الرئوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monaghan, K. L., Farris, B. Y.,… More

Monaghan, K. L., Farris, B. Y., Zheng, W., Wan, E. C. K. Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment. J. Vis. Exp. (160), e61359, doi:10.3791/61359 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter