Caratterizzazione di cellule immunitarie e mediatori proinfiammatori in ambiente polmonare
Summary
Questo protocollo descrive l’uso della citometria a flusso per identificare i cambiamenti nella composizione delle cellule immunitarie, nel profilo delle citochine e nel profilo delle chemochine nell’ambiente polmonare dopo occlusione transitoria dell’arteria cerebrale media, un modello murino di ictus ischemico.
Abstract
L’espansione, l’attivazione e il traffico delle cellule immunitarie ai polmoni, che sono controllati dall’espressione di citochine e chemochine multiple, possono essere alterati da gravi lesioni cerebrali. Ciò è evidenziato dal fatto che la polmonite è una delle principali cause di mortalità nei pazienti che hanno sofferto di ictus ischemico. L’obiettivo di questo protocollo è descrivere l’uso dell’analisi citometrica a flusso multicolore per identificare 13 tipi di cellule immunitarie nei polmoni dei topi, inclusi macrofagi alveolari, macrofagi interstiziali, cellule dendritiche (DC) CD103+ o CD11b+, DC plasmacitoidi, eosinofili, monociti/cellule derivate da monociti, neutrofili, cellule T e B derivate da linfoidi, cellule NK e cellule NKT, a seguito di induzione di ictus ischemico mediante occlusione transitoria dell’arteria cerebrale media. Inoltre, descriviamo la preparazione di omogenati polmonari utilizzando un metodo di omogeneizzazione delle perle, per determinare i livelli di espressione di 13 diverse citochine o chemochine simultaneamente mediante array di perline multiplex accoppiati con analisi citometrica a flusso. Questo protocollo può anche essere utilizzato per studiare la risposta immunitaria polmonare in altri contesti patologici, come la malattia polmonare infettiva o la malattia allergica.
Introduction
I polmoni sono un organo barriera, esposti all’ambiente esterno e, pertanto, ricevono costantemente sfide immunologiche come agenti patogeni e allergeni1. L’attivazione delle cellule immunitarie residenti nei polmoni e l’infiltrazione delle cellule immunitarie dalla periferia sono necessarie per eliminare i patogeni dall’ambiente polmonare. Inoltre, le cellule immunitarie residenti nei polmoni mantengono la tolleranza ai batteri commensali, suggerendo che queste cellule svolgono un ruolo nella clearance dei patogeni e nel mantenimento dell’omeostasi1. I macrofagi alveolari e interstiziali sono tra le cellule immunitarie sentinella residenti nei polmoni che rilevano i patogeni tramite i recettori di riconoscimento dei modelli e eliminano questi patogeni mediante fagocitosi2. Le cellule dendritiche residenti nei polmoni collegano la risposta immunitaria innata e adattativa attraverso la presentazione dell’antigene3. Inoltre, le cellule immunitarie innate locali attivate producono citochine e chemochine che amplificano la risposta infiammatoria e stimolano l’infiltrazione di cellule immunitarie come monociti, neutrofili e linfociti nei polmoni1. È stato dimostrato che l’ictus ischemico modifica l’immunità sistemica e porta ad una maggiore suscettibilità alle infezioni polmonari; Tuttavia, pochi studi hanno valutato il compartimento polmonare dopo ictus ischemico, anche se alcuni studi lo hanno esaminato durante le condizioni infiammatorie 4,5,6,7,8,9. L’obiettivo dei metodi qui descritti è determinare simultaneamente la patologia polmonare, la composizione delle cellule immunitarie e i livelli di espressione di citochine e chemochine nei polmoni per valutare le alterazioni del compartimento polmonare e valutare potenziali alterazioni della risposta immunitaria polmonare dopo attacco ischemico.
Descritto qui è un protocollo per ottenere sospensioni a singola cellula dai polmoni dei topi per identificare 13 tipi di cellule immunitarie. Questo protocollo si basa sulla digestione dei tessuti con collagenasi D senza la necessità di un dissociatore tissutale automatizzato. Inoltre, abbiamo sviluppato un protocollo per preparare omogenati tissutali che possono essere utilizzati per determinare i livelli di espressione di 13 diverse citochine o chemochine utilizzando array di perline multiplex basati sulla citometria a flusso. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per studiare gli effetti dell’ictus ischemico sull’immunità polmonare e può essere utilizzato anche in altri modelli di malattia.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli qui descritti consentono l’identificazione dei tipi di cellule immunitarie polmonari e l’espressione di chemochine o citochine nello stesso topo. Se si desidera uno studio istopatologico, un lobo individuale può essere rimosso e fissato a tale scopo prima di procedere alle fasi di isolamento di una singola cellula. Una limitazione di questo metodo è che questo approccio potrebbe non essere adatto in alcuni contesti patologici se si prevede che il cambiamento nella composizione delle cellule immunitarie e l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH P20 GM109098 e dall’Innovation Award Program da Praespero a Edwin Wan. Gli esperimenti di citometria a flusso sono stati eseguiti nella WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, supportata dalle sovvenzioni NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 e P20 GM103434.
Materials
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
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