Summary

Caratterizzazione di cellule immunitarie e mediatori proinfiammatori in ambiente polmonare

Published: June 24, 2020
doi:

Summary

Questo protocollo descrive l’uso della citometria a flusso per identificare i cambiamenti nella composizione delle cellule immunitarie, nel profilo delle citochine e nel profilo delle chemochine nell’ambiente polmonare dopo occlusione transitoria dell’arteria cerebrale media, un modello murino di ictus ischemico.

Abstract

L’espansione, l’attivazione e il traffico delle cellule immunitarie ai polmoni, che sono controllati dall’espressione di citochine e chemochine multiple, possono essere alterati da gravi lesioni cerebrali. Ciò è evidenziato dal fatto che la polmonite è una delle principali cause di mortalità nei pazienti che hanno sofferto di ictus ischemico. L’obiettivo di questo protocollo è descrivere l’uso dell’analisi citometrica a flusso multicolore per identificare 13 tipi di cellule immunitarie nei polmoni dei topi, inclusi macrofagi alveolari, macrofagi interstiziali, cellule dendritiche (DC) CD103+ o CD11b+, DC plasmacitoidi, eosinofili, monociti/cellule derivate da monociti, neutrofili, cellule T e B derivate da linfoidi, cellule NK e cellule NKT, a seguito di induzione di ictus ischemico mediante occlusione transitoria dell’arteria cerebrale media. Inoltre, descriviamo la preparazione di omogenati polmonari utilizzando un metodo di omogeneizzazione delle perle, per determinare i livelli di espressione di 13 diverse citochine o chemochine simultaneamente mediante array di perline multiplex accoppiati con analisi citometrica a flusso. Questo protocollo può anche essere utilizzato per studiare la risposta immunitaria polmonare in altri contesti patologici, come la malattia polmonare infettiva o la malattia allergica.

Introduction

I polmoni sono un organo barriera, esposti all’ambiente esterno e, pertanto, ricevono costantemente sfide immunologiche come agenti patogeni e allergeni1. L’attivazione delle cellule immunitarie residenti nei polmoni e l’infiltrazione delle cellule immunitarie dalla periferia sono necessarie per eliminare i patogeni dall’ambiente polmonare. Inoltre, le cellule immunitarie residenti nei polmoni mantengono la tolleranza ai batteri commensali, suggerendo che queste cellule svolgono un ruolo nella clearance dei patogeni e nel mantenimento dell’omeostasi1. I macrofagi alveolari e interstiziali sono tra le cellule immunitarie sentinella residenti nei polmoni che rilevano i patogeni tramite i recettori di riconoscimento dei modelli e eliminano questi patogeni mediante fagocitosi2. Le cellule dendritiche residenti nei polmoni collegano la risposta immunitaria innata e adattativa attraverso la presentazione dell’antigene3. Inoltre, le cellule immunitarie innate locali attivate producono citochine e chemochine che amplificano la risposta infiammatoria e stimolano l’infiltrazione di cellule immunitarie come monociti, neutrofili e linfociti nei polmoni1. È stato dimostrato che l’ictus ischemico modifica l’immunità sistemica e porta ad una maggiore suscettibilità alle infezioni polmonari; Tuttavia, pochi studi hanno valutato il compartimento polmonare dopo ictus ischemico, anche se alcuni studi lo hanno esaminato durante le condizioni infiammatorie 4,5,6,7,8,9. L’obiettivo dei metodi qui descritti è determinare simultaneamente la patologia polmonare, la composizione delle cellule immunitarie e i livelli di espressione di citochine e chemochine nei polmoni per valutare le alterazioni del compartimento polmonare e valutare potenziali alterazioni della risposta immunitaria polmonare dopo attacco ischemico.

Descritto qui è un protocollo per ottenere sospensioni a singola cellula dai polmoni dei topi per identificare 13 tipi di cellule immunitarie. Questo protocollo si basa sulla digestione dei tessuti con collagenasi D senza la necessità di un dissociatore tissutale automatizzato. Inoltre, abbiamo sviluppato un protocollo per preparare omogenati tissutali che possono essere utilizzati per determinare i livelli di espressione di 13 diverse citochine o chemochine utilizzando array di perline multiplex basati sulla citometria a flusso. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per studiare gli effetti dell’ictus ischemico sull’immunità polmonare e può essere utilizzato anche in altri modelli di malattia.

Protocol

Tutti i protocolli e le procedure eseguite sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della West Virginia University. I topi sono stati alloggiati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni nel vivaio della West Virginia University. 1. Preparazione delle soluzioni Preparare tampone di perfusione (soluzione salina tamponata fosfato, PBS). Utilizzare circa due aliquote da 10 ml di PBS ghiacciato per mouse. Preparare il mezzo delle cel…

Representative Results

Abbiamo recentemente riportato che l’induzione dell’ictus ischemico nei topi altera la composizione delle cellule immunitarie dei polmoni11. In particolare, l’ischemia cerebrale transitoria ha aumentato le percentuali di macrofagi alveolari, neutrofili e DC CD11b +, mentre ha diminuito le percentuali di cellule T CD4 +, cellule T CD8 +, cellule B, cellule NK ed eosinofili nel compartimento polmonare. Inoltre, l’alterazione cellulare corrispondeva a livelli significativamente diminuiti di chemochin…

Discussion

I protocolli qui descritti consentono l’identificazione dei tipi di cellule immunitarie polmonari e l’espressione di chemochine o citochine nello stesso topo. Se si desidera uno studio istopatologico, un lobo individuale può essere rimosso e fissato a tale scopo prima di procedere alle fasi di isolamento di una singola cellula. Una limitazione di questo metodo è che questo approccio potrebbe non essere adatto in alcuni contesti patologici se si prevede che il cambiamento nella composizione delle cellule immunitarie e l…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH P20 GM109098 e dall’Innovation Award Program da Praespero a Edwin Wan. Gli esperimenti di citometria a flusso sono stati eseguiti nella WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, supportata dalle sovvenzioni NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 e P20 GM103434.

Materials

B220-APC, clone RA3-6B2 Biolegend 103212 1:200 dilution
Beadbug 3 position bead homogenizer Benchmark Scientific D1030 Tissue homogenizer
CCR2-BV421, clone SA203G11 Biolegend 150605 1:200 dilution
CD103-BV421, clone 2E7 Biolegend 121422 1:200 dilution
CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 Biolegend 101216 1:400 dilution
CD11c-PE/Cy7, clone N418 Biolegend 117318 1:200 dilution
CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 Biolegend 117328 1:200 dilution
CD4-BV421, clone GK1.5 Biolegend 100443 1:200 dilution
CD45-FITC, clone 30-F11 Biolegend 103108 1:200 dilution
CD64-APC, clone X54-5/7.1 Biolegend 139306 1:200 dilution
CD8-PE, clone 53-6.7 Biolegend 100708 1:800 dilution
Collagenase D Sigma Aldrich 11088882001 Component in the dissociation buffer
Conical screw cap tube ThermoFisher 02-681-344 Tube for tissue homogenization
DNase I Sigma Aldrich 10104159001 Component in the dissociation buffer
Fc block CD16/32 antibody Biolegend 101320 1:100 dilution
genlteMACS dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator
gentleMACS C tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator
Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial ThermoFisher 78442 Component in the homogenization buffer
Laser doppler monitor Moor MOORVMS-LDF Blood flow monitoring during tMCAO
LEGENDplex proinflammatory chemokine panel Biolegend 740451 Multiplex bead array
LIVE/DEAD fixable near-IR stain ThermoFisher L34976 Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis
Ly6C-PE, clone HK1.4 Biolegend 128008 1:800 dilution
Ly6G-BV510, clone 1A8 Biolegend 127633 1:200 dilution
MCAO suture L56 reusable 6-0 medium Doccol 602356PK10Re tMCAO
MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 Biolegend 107636 1:800 dilution
NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 Biolegend 108728 1:200 dilution
Siglec F-PE, clone E50-2440 BD Biosciences 552126 1:200 dilution
Silk suture thread, size 6/0 Fine Science Tools 18020-60 tMCAO
SomnoSuite anesthesia system Kent Scientific SS-01 Mouse anaesthetization for tMCAO
TCRb-BV510, clone H57-897 Biolegend 109234 1:200 dilution
Zirconia/silica beads, 2.3 mm Biospec 11079125z Beads for tissue homogenization

References

  1. Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
  2. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
  3. Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
  4. Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
  5. Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
  6. McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
  7. Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
  8. Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
  9. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  10. Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
  11. Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  13. Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
  14. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  15. Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
  16. Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
  17. Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
  18. Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
  19. Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
  20. Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3′-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
  21. Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
  22. Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
  23. Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).

Play Video

Cite This Article
Monaghan, K. L., Farris, B. Y., Zheng, W., Wan, E. C. K. Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment. J. Vis. Exp. (160), e61359, doi:10.3791/61359 (2020).

View Video