Summary
Detta protokoll beskriver användningen av flödescytometri för att identifiera förändringarna i immuncellkomposition, cytokinprofil och kemokinprofil i lungmiljön efter övergående mellersta cerebral artärocklusion, en murin modell av ischemisk stroke.
Abstract
Immuncellsutvidgning, aktivering och handel med lungorna, som styrs av uttrycket av flera cytokiner och kemokiner, kan förändras av allvarlig hjärnskada. Detta framgår av det faktum att lunginflammation är en viktig orsak till dödlighet hos patienter som har drabbats av ischemisk stroke. Målet med detta protokoll är att beskriva användningen av flerfärgad flödescytometrisk analys för att identifiera 13 typer av immunceller i lungorna hos möss, inklusive alveolära makrofager, interstitiella makrofager, CD103 + eller CD11b + dendritiska celler (DC), plasmacytoid DC, eosinofiler, monocyter / monocyt-härledda celler, neutrofiler, lymfoid-härledda T- och B-celler, NK-celler och NKT-celler, efter ischemisk strokeinduktion genom övergående mellersta cerebral artärocklusion. Dessutom beskriver vi beredningen av lunghomogenater med användning av en pärlhomogeniseringsmetod för att bestämma uttrycksnivåerna för 13 olika cytokiner eller kemokiner samtidigt genom multiplexpärlmatriser i kombination med flödescytometrisk analys. Detta protokoll kan också användas för att undersöka lungimmunsvaret i andra sjukdomsinställningar, såsom infektiös lungsjukdom eller allergisk sjukdom.
Introduction
Lungorna är ett barriärorgan som utsätts för den yttre miljön och får därför ständigt immunologiska utmaningar som patogener och allergener1. Aktiveringen av lungboende immunceller och infiltration av immunceller från periferin krävs för att rensa patogener från lungmiljön. Dessutom upprätthåller lungboende immunceller tolerans mot kommensala bakterier, vilket tyder på att dessa celler spelar en roll i patogenclearance och upprätthåller homeostas1. Alveolära och interstitiella makrofager är bland de lungboende sentinelimmuncellerna som känner av patogener via mönsterigenkänningsreceptorer och rensar dessa patogener genom fagocytos2. Lungboende dendritiska celler överbryggar det medfödda och adaptiva immunsvaret genom antigenpresentation3. Dessutom producerar aktiverade lokala medfödda immunceller cytokiner och kemokiner som förstärker det inflammatoriska svaret och stimulerar infiltrationen av immunceller såsom monocyter, neutrofiler och lymfocyter i lungorna1. Ischemisk stroke har visat sig modifiera systemisk immunitet och leda till ökad mottaglighet för lunginfektion; få studier har dock utvärderat lungfacket efter ischemisk stroke, även om vissa studier har undersökt det under inflammatoriska tillstånd 4,5,6,7,8,9. Målet med de metoder som beskrivs häri är att samtidigt bestämma lungpatologi, immuncellsammansättning och nivåerna av cytokin- och kemokinuttryck i lungorna för att utvärdera förändringar i lungfacket och bedöma potentiella förändringar i lungimmunsvaret efter ischemisk attack.
Här beskrivs ett protokoll för att erhålla encellssuspensioner från mössens lungor för att identifiera 13 typer av immunceller. Detta protokoll är baserat på vävnadssmältning med kollagenas D utan behov av en automatiserad vävnadsdissociator. Dessutom utvecklade vi ett protokoll för att förbereda vävnadshomogenater som kan användas för att bestämma uttrycksnivåerna för 13 olika cytokiner eller kemokiner med hjälp av flödescytometribaserade multiplexpärlmatriser. Detta protokoll användes framgångsrikt för att undersöka effekterna av ischemisk stroke på lungimmunitet och kan också användas i andra sjukdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll och procedurer som utfördes godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid West Virginia University. Mössen var inrymda under specifika patogenfria förhållanden i vivarium vid West Virginia University.
1. Beredning av lösningar
- Förbered perfusionsbuffert (fosfatbuffrad saltlösning, PBS). Använd cirka två 10 ml alikvoter av iskall PBS per mus.
- Förbered lungcellsmedium/FACS-buffert. FACS-buffert innehåller PBS kompletterat med 1% fetalt bovint serum (FBS). Håll mediet kallt under hela processen med lungexcision och överföring. Förbered cirka 8 ml per lungprov. Förbered färsk medium/FACS-buffert före experimenten.
- Förbered dissociationsbuffert för isolering av en cell. Buffer innehåller 1 mg/ml kollagenas D och 200 μg/ml DNas I i Hanks buffrade saltlösning (HBSS). Bered färskt från stamlösningen (100 mg/ml kollagenas D och 10 mg/ml DNas I) före experimenten. Cirka 6 ml per lungprov behövs. Se till att bufferten når rumstemperatur före användning.
- Förbered homogeniseringsbuffert för homogenisering av lungvävnad. Buffer innehåller PBS och 1x proteinas och fosfatashämmare cocktail (lager = 100x). Nyförbered dig före experimenten. Håll bufferten kall under hela homogeniseringsprocessen. Cirka 200 μL av bufferten är tillräcklig för att homogenisera en enda höger lob i lungorna.
2. Övergående mellersta cerebral artär ocklusion (tMCAO)
OBS: Procedurer för tMCAO via monofilamentinsättning till den mellersta cerebrala artären dokumenterades i detalj tidigare10. I dessa experiment användes 8- till 12 veckor gamla manliga C57BL/6J-möss, som väger 25-30 g.
- I korthet, administrera subkutant 2 mg/kg meloxikam till mössen före operation. Bedöva mössen djupt i en induktionskammare med 5% isofluran. Bekräfta djup bedövning med tå-nypa-metoden. Behåll anestesi med 1-2% isofluran under operationen med en näskotte. Håll kroppstemperaturen vid 36,5 - 38 °C under hela proceduren genom att placera en varm filt under mössen. Alla kirurgiska verktyg ska autoklavsteriliseras en dag före operationen.
- Raka och förbered huden på den ventrala halsen med 70% etanol följt av klorhexidinskrubba. Administrera subkutant 2 mg/kg bupivakain över snittområdet innan det första snittet görs. Använd ögonsalva för att täcka ögonen för att förhindra torrhet. Gör ett snitt i midline nacke. Dra försiktigt undan mjuka vävnader runt luftstrupen.
- Identifiera den vänstra gemensamma halspulsådern och den yttre halspulsådern.
- Applicera en tillfällig sutur (storlek 6/0) på den gemensamma halspulsådern för att hejda blodflödet. Gör ett snitt i den yttre halspulsådern.
- Sätt in ett silikongummibelagt monofilament (storlek 6-0) i den yttre halspulsådern och för sedan monofilamentet till den mellersta cerebrala artären. Lämna monofilamentet i den mellersta cerebrala artären i 60 min (ocklusion).
- Övervaka blodflödeshastigheten med laserdopplerflödesmetri. En minskning av flödeshastigheten till den mellersta cerebrala artären som är > 80% indikerar en framgångsrik ocklusion.
- Efter 60 minuters ocklusion, ta bort monofilamentet så att reperfusionen kan ske. Stäng snittet.
- I skenstyrda möss, utför steg 2.1-2.6 utan att sätta in monofilamentet. I dessa möss bör blodflödet förbli stabilt under hela proceduren.
- Övervaka mössen dagligen och mät de neurologiska underskotten med hjälp av standardpoängkriterier11. 0 - inget neurologiskt underskott; 1 – drar tillbaka kontralateral forepaw när den lyfts av svansen; 2- cirklar till kontralateralen när den lyfts av svansen; 3- faller till kontralateralt medan du går; 4 - går inte spontant eller är komatös; 5 - död.
- Ge subkutana injektioner av normal saltlösning och smärtstillande medel (meloxikam, 2 mg/kg) var 24: e timme i 3 dagar efter operationen.
- Isolera lungorna 24 och 72 timmar efter tMCAO för nedströmsanalys.
3. Skörda lungvävnaderna
- Bedöva musen djupt genom intraperitoneal (i.p.) injektion av 100 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xylazin. Bekräfta djup bedövning med tå-nypa-metoden.
- För att utföra hela kroppens transkardiella perfusion12, fäst musen på den kirurgiska plattformen och våt päls med 70% etanol för att minska pälsfördelningen i kroppshålan. Använd fin dissektionssax för att göra ett tvärgående snitt i den kaudala buken och sedan ett mittlinjesnitt i bukhinnan, stoppa vid brösthålan innan du genomborrar membranet.
- Skär inte igenom muskeln/göm dig in i bukhålan och fortsätt inte snittet förbi buken.
- Stoppa snittet så snart brösthålan har nåtts innan du punkterar membranet. Var försiktig så att du inte skadar hjärtat och lungorna som kan äventyra perfusionskvaliteten eller cellåtervinningen
- Med hjälp av fin dissektionssax gör ett mittlinjesnitt av bukhinnan som stannar vid brösthålan innan du genomborrar membranet.
- Ta tag i musen i den distala änden av bröstbenet med hjälp av tång och lyft uppåt medan du skär genom membranet och var säker på att inte skada hjärtat, lungorna eller kärlen. När organen är synliga gör du ett snitt genom bröstkorgen och separerar och fäster tillbaka revbensfodralet så att hjärtat och lungorna är helt exponerade.
- Gör försiktigt ett litet snitt i det högra atriumet nära aortabågen. Detta kommer att fungera som utflödet för perfusionen.
- Omedelbart efter, sätt försiktigt in en 25 G x 5/8 nål fäst vid en spruta fylld med 10 ml kall PBS i den distala överlägsna ytan på vänster kammare. Var försiktig så att du inte sätter in genom ventrikulär septum i höger kammare. Nålen ska knappt sättas in i vänster kammare.
OBS: Om ventrikulär septum är genomborrad kommer vätska att rusa ut från musens näsa. Detta kommer att minska perfusionskvaliteten och resultera i cellförlust. - Om så önskas kan en klämma användas för att hålla nålen säkert på plats i vänster kammare under perfusionen.
- Tryck stadigt men försiktigt in 10 ml kall PBS i hjärtat. Musvävnad bör börja perfusa och rensa bort blodet när vätska går ut från det högra förmaket.
- Tryck på en andra alikvot på 10 ml PBS tills tillräcklig blodclearance har inträffat. Lever kommer att ha ett ljusbrunt utseende och lungorna kommer att övergå från en rödrosa till mestadels vit i färg.
- Använd pincett och fin dissektionsax, ta försiktigt bort alla omgivande vävnader inklusive hjärta, luftstrupen, matstrupen, tymus, bindväv, lymfkörtlar och stora bronkialer.
- Separera enskilda lunglober och placera loberna i en petriskål på is som innehåller en alikvot på 1-2 ml kallt lungcellsmedium.
4. Homogenisering av lungvävnad för multiplexa pärlmatriser med användning av pärlhomogenisator
- Förkyl ett 2 ml koniskt skruvlockrör som innehåller 3 sterila 2,3 mm zirkoniumoxid/kiseldioxidpärlor. Tillsätt 200 μl kallhomogeniseringsbuffert till röret.
- Väg loben, överför loben till det förkylda koniska röret som innehåller pärlorna och homogeniseringsbufferten.
OBS: Cirka 50-100 mg vävnad homogeniserad i 200 μL buffert kommer att räcka för att detektera cytokin- och kemokinuttryck i provet.- Homogenisera loben med en pärlbaserad homogenisator (se materialtabell) vid 4 000 rpm i 2 minuter.
- Se till att vävnaden är helt homogeniserad. Öka tiden om det behövs.
- Efter homogenisering centrifugerar du röret i en förkyld (4 °C) mikrocentrifug vid 15 870 x g i 3 minuter.
- Överför supernatanterna till ett förkylt 1,5 ml mikrorör.
- Lägg provet direkt på is för omedelbar användning eller förvara provet vid -80 °C för framtida bruk. Undvik flera frys-tina cykler.
5. Lungvävnadsdissociation och isolering av enstaka celler
- Häll av lungcellsmediet från de återstående lungloberna för att undvika utspädning av dissociationsbufferten. Sätt sedan försiktigt in en 1 ml spruta med 25G och 5/8 nål som innehåller 1 ml av dissociationsbufferten i lungvävnaden.
- Injicera små fraktioner (ungefär 1/4till 1/5th) av dissociationsbufferten i varje lunglob och blås försiktigt upp.
OBS: Det mesta av bufferten kommer att rusa ut strax efter uppblåsthet eftersom loben har skurits ut. - Upprepa injektionen av dissociationsbuffert 1-2x.
- Inkubera lungloberna med dissociationsbuffert i 2 min vid rumstemperatur.
- Finhacka lungloberna i små bitar med fin dissektionsax.
- Överför de malet lungbitarna med dissociationsbufferten till ett 15 ml centrifugrör. Komplettera med ytterligare dissociationsbuffert till totalt 6 ml. Virvel kraftigt i 1 min.
- Inkubera provet i 45 minuter vid 37 °C. Virvel kraftigt var 7-8 min.
- Efter 45 minuters inkubation virvlar provet kraftigt i 1 min för optimalt resultat.
- Dissociera provet ytterligare genom att passera genom en 100 μm cellsil för att avlägsna kvarvarande, oönskad bindväv och interstitiell vävnad.
- Centrifugera provet i 10 min vid 380 x g, kassera supernatanten.
- Tillsätt 5 ml kallt lungcellsmedium till provet. Återsuspendera cellpelleten genom försiktig virvel.
- Centrifugera provet i 10 min vid 380 x g, kassera supernatanten.
- Tillsätt 1 ml kallt lungcellsmedium. Återsuspendera cellpelleten genom försiktig virvel.
- Passera genom en 100 μm cellsil och räkna celler.
6. Flödescytometrisk analys för lungimmuncellnischen
- Frö 1-2 x 106 celler/antikroppar till en 96 väl rund bottenplatta (totalt 3 uppsättningar). Centrifugera cellerna i 3 min vid 830 x g. Kassera supernatanter.
- Återsuspendera cellpelleten i 50 μl kall PBS som innehåller fixerbar levande/död fläck. Förbered fläcken enligt tillverkarens instruktioner.
- Inkubera cellerna vid 4 °C i 20 minuter skyddade mot ljus. Centrifugera cellerna i 3 min vid 830 x g. Kassera supernatanter.
- Återsuspendera cellpelleten med 25 μL kall FACS-buffert innehållande 5 μg/ml antimus-CD16/32-antikropp. Inkubera vid 4 °C i 10–15 minuter.
- Tillsätt 25 μl kall FACS-buffert som innehåller antikroppskombinationer som anges i tabell 1 till cellerna. Blanda med mild pipettering.
OBS: Total volym FACS-buffert för antikroppsfärgningen är 50 μL. Därför, vid framställning av en masterblandning av antikroppar i 25 μl, bör koncentrationen av antikroppar vara dubbelt så hög som den slutliga koncentrationen. - Inkubera cellerna vid 4 °C i 20 minuter skyddade mot ljus. Centrifugera cellerna i 3 min vid 830 x g. Kassera supernatanter.
- Återsuspendera cellerna med 100 μl kall FACS-buffert. Centrifugera cellerna i 3 min vid 830 x g. Kassera supernatanter.
- Återsuspendera cellerna med 100 μl kall FACS-buffert. Överför till ett polystyren rundbotten 5 ml FACS-rör som innehåller 150 μL ytterligare FACs-buffert. Analysera provet omedelbart med hjälp av en flödescytometer.
OBS: Cellfixering med hjälp av följande steg gör att prover kan analyseras senare. - Efter steg 6.7, återsuspendera provet med 100 μl 1% paraformaldehyd i PBS.
- Inkubera provet vid 4 °C i 15 minuter skyddat mot ljus. Centrifugera cellerna i 3 min vid 830 x g. Kassera supernatanter.
- Återsuspendera cellerna med 100 μl kall FACS-buffert. Centrifugera cellerna i 3 min vid 830 x g. Kassera supernatanter.
- Återsuspendera cellerna med 100 μl kall FACS-buffert. Förvara cellerna vid 4 °C, skyddade från ljus. Analysera provet inom 72 timmar.
7. Multiplex pärlmatriser för cytokin- och kemokindetektering
OBS: Kommersiellt tillgängliga proinflammatoriska kemokin- och inflammationsmultiplexpaneler (se materialtabell) användes för att bestämma uttrycket av kemokiner och cytokiner i lungorna efter tMCAO-induktion enligt tillverkarens protokoll, som har beskrivits i detalj13.
- I korthet, tina analyterna på is om de förvarades vid -80 °C efter vävnadshomogenisering. Centrifugera provet vid 590 x g i 2 minuter vid 4 °C före användning för att avlägsna eventuell kvarvarande vävnad.
- Generera en standardkurva genom att seriellt späda ut standardcocktailen (C7) som har en känd koncentration på 10 ng/ml till 7 standarder (C1-6) där den sista standarden är analysbuffert ensam (C0).
- När alla reagenser har värmts till rumstemperatur, tillsätt 25 μL av varje standard och 25 μL analysbuffert till en V-botten 96-brunnsplatta.
- Tillsätt 25 μL lunghomogenat (analyt) och 25 μL analysbuffert till en brunnsplatta med botten 96 till varje provbrunnsbrunn till varje provbrunnsbrunn.
- Vortex de förbelagda pärlorna kraftigt, tillsätt sedan 25 μL förbelagda pärlor till var och en av standard- och provbrunnarna.
- Försegla plattan och skydda mot ljus genom att täcka med folie. Skaka plattan vid 110 rpm i 2 h vid rumstemperatur.
- Centrifugera vid 230 x g i 5 min. Tillsätt 200 μl tvättbuffert vid 1x (stamlösningen är 20x, späd till 1x med vatten). Inkubera i 1 min.
- Centrifugera vid 230 x g i 5 min. Återsuspendera standarden och provet med 25 μL detektionsantikroppar.
- Försegla och täck plattan för att skydda mot ljus. Skaka plattan vid 110 rpm i 1 h vid rumstemperatur.
- Tillsätt 25 μl streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) till varje standard och prov väl.
- Försegla och täck plattan för att skydda mot ljus. Skaka vid 110 rpm i 30 min vid rumstemperatur.
- Snurra plattan på 230 x g i 5 min. Återsuspendera standarden och proverna i 1x tvättbuffert.
- Överför till ett välmärkt polystyren rundbotten 5 ml FACS-rör som innehåller ytterligare 150 μL 1x tvättbuffert.
- Bestäm PE-signalfluorescensintensiteten för standarderna och proverna med hjälp av en flödescytometer.
- Konstruera en standardkurva för varje kemokin och cytokin med hjälp av den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) för PE mot de förutbestämda koncentrationerna.
- Bestäm koncentrationen av varje kemokin och cytokin med hjälp av standardkurvan och MFI från varje prov. Multiplexpanelen tillhandahåller dataanalysprogramvara som kan användas för att bestämma koncentrationen av varje analyt. Vikten av den apikala/överlägsna loben används för att bestämma koncentrationen av cytokiner eller kemokin per milligram vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi rapporterade nyligen att ischemisk strokeinduktion hos möss förändrar immuncellsammansättningen i lungorna11. Specifikt ökade övergående cerebral ischemi procentandelar av alveolära makrofager, neutrofiler och CD11b + DC, samtidigt som procentandelarna av CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler, NK-celler och eosinofiler i lungfacket minskade. Dessutom motsvarade cellförändringar signifikant minskade nivåer av flera kemokiner i lungorna. Här beskrivs en metod för isolering och identifiering av olika immuncellspopulationer i lungfacket. Representativa resultat som visas här var från möss som hade genomgått tMCAO-induktion och en skenoperation.
Vi identifierade 13 olika populationer av immunceller i lungorna (L1-L13) med hjälp av 3 uppsättningar antikroppskombinationer där varje uppsättning innehöll 5-7 antikroppar (figur 1). Döda celler uteslöts med hjälp av en LIVE/DEAD-fläck i varje uppsättning. Antikroppar och markörer för att särskilja olika immuncellstyper listas i tabell 1. Alveolära och interstitiella makrofager, CD103 + DCs, CD11b + DC och eosinofiler identifierades i set 1 (figur 1A, B). Proinflammatoriska monocyter och neutrofiler identifierades i set 2 (figur 1C). Under inflammatoriska svar migrerar monocyter till inflammationsstället, där dessa celler differentieras till monocyt-härledda antigenpresenterande celler (mo-APC)14. Nedreglering av Ly6C och CCR2 är karakteristiska för monocytdifferentiering, som kan utvärderas med användning av Set 215. CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler, plasmacytoid-DC, NK-celler och NKT-celler identifierades med hjälp av Set 3 (Figur 1D).
För att bestämma kvaliteten på vårt encellsisoleringsprotokoll jämförde vi antalet livskraftiga celler och CD45 + immunceller isolerade med den manuella metoden med cellerna isolerade med hjälp av en kommersiellt tillgänglig vävnadsdissociator (se Materialförteckning), som ofta används för att isolera celler från vävnader 16,17,18,19,20 . I det senare protokollet överfördes lunglober till ett dissociatorspecifikt rör (se materialtabell) efter injektion av dissociationsbufferten, och vävnaden smältes med hjälp av 37C_m_LDK_1-programmet. Det totala antalet viabla celler, procentandelen CD45+ celler och det totala antalet erhållna CD45+-celler var jämförbara mellan de två metoderna (figur 2A-C). Andelen celldöd bland CD45 + -celler som använde båda protokollen var ~ 10% (Figur 2D). Dessa resultat tyder på att protokollet som presenteras här möjliggör cellåtervinning med högt utbyte och kvalitet utan hjälp av en automatiserad vävnadsdissociator.
En kommersiellt tillgänglig multiplexanalys i kombination med flödescytometrisk analys användes för att bestämma koncentrationen av 13 kemokiner med användning av 25 μL prov (figur 3). Två olika storlekar på pärlor identifierades först av FSC/SSC (figur 3A). Varje pärla är belagd med 6-7 primära antikroppar, som kan särskiljas genom fluorescensintensitet i APC-kanalen (figur 3B). Nivån av kemokiner i provet är proportionell mot fluorescensintensiteten i PE-kanalen, som kan bestämmas av MFI (figur 3C). Genom att jämföra MFI-värdet för varje kemokin med standardkurvan konstruerad med kända koncentrationer av kemokin kan koncentrationen i provet (per mg vävnad) bestämmas.
Figur 1: Identifiering av 13 immuncelltyper från lungorna efter vävnadssmältning med kollagenas D efter ischemisk stroke. Lungvävnader skars ut 24 timmar efter tMCAO eller skenoperation, immunceller i lungorna analyserades med flödescytometri, definierad av ytmarkörer listade i tabell 1. (A) I antikroppsuppsättning 1 gated CD45 + livskraftiga celler (*) först på Siglec F och CD11b för att identifiera de alveolära makrofagerna (L1), som uttryckte CD11c och MHC II, och eosinofiler (L2), som inte uttryckte CD11c och MHC II. (B) Celler inom Siglec F-populationen (**) i A gated sedan för att bestämma uttrycket av CD103 och CD11b. CD103 + CD11b- (***). Celler gated ytterligare för att bestämma uttrycket av CD11c och MHC II. CD103+ DCs uttryckte både CD11c och MHC II (L3) men uttryckte inte CD64. CD11b hi-populationen (****) gated ytterligare för att bestämma uttrycket av CD64 och MHC II. CD11b+ DC uttryckte MHC II men inte CD64 (L4), medan interstitiella makrofager (L5) uttryckte båda markörerna. (C) I antikroppssats 2 gated CD45 + livskraftiga celler i A för att bestämma uttrycket av CD11b och Ly6C. Ly6C hi-celler (*) representerade de odifferentierade monocyterna som upprätthöll en hög nivå av CCR2-uttryck (L6, mittdiagram), medan Ly6C-låga celler (**) innehöll en blandad population av differentierande monocyter som var Ly6G- (L6, höger plot) och Ly6G + neutrofiler (L7). (D) I antikroppssats 3 gated CD45 + livskraftiga celler i A för att bestämma uttrycket av CD11c och B220 för att identifiera B-celler (L8) och plasmacytoid DC (L9). CD11c- och B220-populationen (*) gated var sedan gated för att bestämma uttrycket av CD4 och CD8 för att identifiera CD4 + T-celler (L10) och CD8 + T-celler (L11). CD4-CD8-populationen (**) gated ytterligare för att bestämma uttrycket av NK1.1 och TCRb för att identifiera NK-celler (L12) och NKT-celler (L13). Visas är representativa tomter från 12 C57BL/6J möss efter tMCAO och skenoperation. Delar av figuren har tryckts om från tidigare publicerad litteratur11 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Jämförelse mellan manuell dissociationsmetod och användning av vävnadsdissociator för att isolera enstaka celler från lungorna. (AC) Det totala antalet celler, procentandelen CD45+-celler och det totala antalet CD45+-celler jämfördes. Visas är kombinerade resultat från 3 oberoende experiment. NS: inte statistiskt signifikant. (D) Representativa diagram för att bestämma procentandelen döda CD45+-celler efter isolering. Visas är representativa tomter från 3 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ischemisk stroke undertrycker produktionen av flera kemokiner i lungorna. (AC) Representativa diagram som visar bestämningen av nivån av 13 kemokiner i lungorna med multiplexpärlmatris. (A) FSC/SSC-grinden användes för att identifiera pärlorna A och B med olika storlek. (B) Primära antikroppar belagda på pärlorna kan särskiljas genom fluorescensintensitet i APC-kanalen. (C) Nivån av kemokiner i provet var proportionell mot fluorescensintensiteten i PE-kanalen. Visas är representativa tomter från 12 C57BL/6J möss efter skenoperation. (D) Lungvävnader homogeniserades 24 timmar efter tMCAO eller sham operatio. Nivån av 13 kemokiner i lungorna hos enskilda djur bestämdes av multiplexpärlmatris. Data som visas är kombinerade resultat från tre oberoende experiment med n = 11-12 djur per grupp. *, P < 0,05; **, P < 0,01; , P < 0,001. NS, inte statistiskt olika. Delar av figuren har tryckts om från tidigare publicerad litteratur11 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antikropp | Klon | Immuncelltyp | Befolkning | Ytmarköruttryck |
| CD45-FITC | 30-F11 | Alveloara makrofager | L1 | CD45 + Siglec F + CD11b- |
| Siglec F-PE | E50-2440 | Eosinofiler | L2 | CD45 + Siglec F + CD11b + |
| CD11c-Percp/Cy5.5 | N418 | CD103+ DC-enheter | L3 | CD45 + Siglec F- CD11b- CD103 + CD11c + MHC II + |
| CD11b-PE/CY7 | M1/70 | CD11b+ DC-enheter | L4 | CD45 + Siglec F- CD11b hej CD103- CD64- MHC II + |
| CD64-APC | X54-5/7.1 | Interstitiella makrofager | L5 | CD45 + Siglec F- CD11b hej CD103- CD64 + MHC II + |
| CD103-BV421 | 2E7 | |||
| MHC II-BV510 | M5/114.15.2 | |||
| Live/död-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | Monocyter/moDCs | L8 | CD45 + CD11b hej Ly6C hi / int CCR2 +/- Ly6G- |
| Ly6C-PE | HK1.4 | Neutrofiler | L9 | CD45 + CD11b hej Ly6C int CCR2- Ly6G + |
| CD11b-PE/CY7 | M1/70 | |||
| CCR2-BV421 | SA203G11 | |||
| Ly6G-BV510 | 1A8 | |||
| Live/död-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | Plasmacytoid DC | L6 | CD45 + B220 + CD11c + |
| CD8-PE | 53-6.7 | B-celler | L7 | CD45 + B220 + CD11c- |
| NK1.1-Percp/Cy5.5 | PK136 | CD4+ T-celler | L10 | CD45 + B220- CD11c- CD4 + CD8- |
| CD11c-PE/CY7 | N418 | CD8+ T-celler | L11 | CD45 + B220- CD11c- CD4- CD8 + |
| APC-B220 | RA3-6B2 | NK-celler | L12 | CD45 + B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1 + TCRb- |
| CD4-BV421 | GK1,5 | NKT-celler | L13 | CD45 + B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1 + TCRb + |
| TCRb-BV510 | H57-597 | |||
| Live/död-APC/Cy7 |
Tabell 1: Ytmarkörer och antikroppskombinationer för bestämning av immunceller isolerade från lungorna efter tMCAO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som beskrivs här möjliggör identifiering av lungimmuncelltyper och uttryck av kemokiner eller cytokiner i samma mus. Om en histopatologisk studie önskas kan en enskild lob avlägsnas och fixeras för detta ändamål innan man fortsätter till isoleringsstegen för en cell. En begränsning med denna metod är att detta tillvägagångssätt kanske inte är lämpligt i vissa sjukdomsinställningar om förändringen i immuncellsammansättningen och uttrycket av kemokiner och / eller cytokiner förväntas vara ojämnt fördelade mellan olika lober i lungorna. Till exempel visar vissa bakterier, såsom Mycobacterium tuberculosis, en förkärlek för att infektera vissa lober i lungan21. I detta fall kan en jämförelse mellan lober krävas.
Koncentrationen, inkubationstiden och temperaturen i encellsisoleringsprotokollet från lungorna påverkar kritiskt återhämtningen av immuncellerna från lungorna. Kvaliteten på kollagenas D är avgörande för att uppnå optimala resultat och bör testas om en annan källa till kollagenas D används. Översmältning av vävnaderna resulterar i en ökning av celldöd; medan undersmältning av vävnaderna orsakar lågt utbyte av immunceller, särskilt makrofager och DC.
Vi använde 3 antikroppskombinationer för att bestämma 13 immuncellpopulationer i lungorna, där varje uppsättning innehöll 5-7 antikroppar och en LEVANDE / DÖD fläck. Antikroppar i varje uppsättning kan kombineras om antalet celler som erhållits från proverna är begränsat. En viktig fråga som uppstår när antalet antikroppar ökas är dock att kompensationen av fluorescenssignalen på flödescytometern kan vara utmanande, särskilt när man skiljer celler från myeloida linage under inflammatoriska tillstånd. Ytterligare antikroppscocktails kan användas för att identifiera andra medfödda immunceller i encellssuspensionen, såsom medfödda lymfoida celler och γδ T-celler, som bidrar till immunsvaret i lungorna22,23. Eftersom en lunglob tas för multiplexmatrisen kan det exakta antalet av varje celltyp i lungorna inte bestämmas och jämföras definitivt, och detta utgör en begränsning av denna metod. För att ta itu med detta kan ett definierat antal celler isoleras från lungorna hos bluff- och tMCAO-inducerade möss. I detta fall kan det absoluta antalet av varje immuncelltyp jämföras exakt mellan de två grupperna. Dessutom tillåter denna metod inte lokalisering av immuncellerna i lungan att bestämmas. Detta kan åstadkommas genom att utföra immunhistokemi på lungsektioner.
Sammanfattningsvis användes detta protokoll för att undersöka effekten av ischemisk stroke i lungimmunitet, men det kan också användas för att studera andra sjukdomsmodeller, såsom infektion och allergier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag P20 GM109098 och Innovation Award-programmet från Praespero till Edwin Wan. Flödescytometriexperiment utfördes i WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, som stöds av NIH-bidrag S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 och P20 GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
