Detta protokoll beskriver användningen av flödescytometri för att identifiera förändringarna i immuncellkomposition, cytokinprofil och kemokinprofil i lungmiljön efter övergående mellersta cerebral artärocklusion, en murin modell av ischemisk stroke.
Immuncellsutvidgning, aktivering och handel med lungorna, som styrs av uttrycket av flera cytokiner och kemokiner, kan förändras av allvarlig hjärnskada. Detta framgår av det faktum att lunginflammation är en viktig orsak till dödlighet hos patienter som har drabbats av ischemisk stroke. Målet med detta protokoll är att beskriva användningen av flerfärgad flödescytometrisk analys för att identifiera 13 typer av immunceller i lungorna hos möss, inklusive alveolära makrofager, interstitiella makrofager, CD103 + eller CD11b + dendritiska celler (DC), plasmacytoid DC, eosinofiler, monocyter / monocyt-härledda celler, neutrofiler, lymfoid-härledda T- och B-celler, NK-celler och NKT-celler, efter ischemisk strokeinduktion genom övergående mellersta cerebral artärocklusion. Dessutom beskriver vi beredningen av lunghomogenater med användning av en pärlhomogeniseringsmetod för att bestämma uttrycksnivåerna för 13 olika cytokiner eller kemokiner samtidigt genom multiplexpärlmatriser i kombination med flödescytometrisk analys. Detta protokoll kan också användas för att undersöka lungimmunsvaret i andra sjukdomsinställningar, såsom infektiös lungsjukdom eller allergisk sjukdom.
Lungorna är ett barriärorgan som utsätts för den yttre miljön och får därför ständigt immunologiska utmaningar som patogener och allergener1. Aktiveringen av lungboende immunceller och infiltration av immunceller från periferin krävs för att rensa patogener från lungmiljön. Dessutom upprätthåller lungboende immunceller tolerans mot kommensala bakterier, vilket tyder på att dessa celler spelar en roll i patogenclearance och upprätthåller homeostas1. Alveolära och interstitiella makrofager är bland de lungboende sentinelimmuncellerna som känner av patogener via mönsterigenkänningsreceptorer och rensar dessa patogener genom fagocytos2. Lungboende dendritiska celler överbryggar det medfödda och adaptiva immunsvaret genom antigenpresentation3. Dessutom producerar aktiverade lokala medfödda immunceller cytokiner och kemokiner som förstärker det inflammatoriska svaret och stimulerar infiltrationen av immunceller såsom monocyter, neutrofiler och lymfocyter i lungorna1. Ischemisk stroke har visat sig modifiera systemisk immunitet och leda till ökad mottaglighet för lunginfektion; få studier har dock utvärderat lungfacket efter ischemisk stroke, även om vissa studier har undersökt det under inflammatoriska tillstånd 4,5,6,7,8,9. Målet med de metoder som beskrivs häri är att samtidigt bestämma lungpatologi, immuncellsammansättning och nivåerna av cytokin- och kemokinuttryck i lungorna för att utvärdera förändringar i lungfacket och bedöma potentiella förändringar i lungimmunsvaret efter ischemisk attack.
Här beskrivs ett protokoll för att erhålla encellssuspensioner från mössens lungor för att identifiera 13 typer av immunceller. Detta protokoll är baserat på vävnadssmältning med kollagenas D utan behov av en automatiserad vävnadsdissociator. Dessutom utvecklade vi ett protokoll för att förbereda vävnadshomogenater som kan användas för att bestämma uttrycksnivåerna för 13 olika cytokiner eller kemokiner med hjälp av flödescytometribaserade multiplexpärlmatriser. Detta protokoll användes framgångsrikt för att undersöka effekterna av ischemisk stroke på lungimmunitet och kan också användas i andra sjukdomsmodeller.
Protokollen som beskrivs här möjliggör identifiering av lungimmuncelltyper och uttryck av kemokiner eller cytokiner i samma mus. Om en histopatologisk studie önskas kan en enskild lob avlägsnas och fixeras för detta ändamål innan man fortsätter till isoleringsstegen för en cell. En begränsning med denna metod är att detta tillvägagångssätt kanske inte är lämpligt i vissa sjukdomsinställningar om förändringen i immuncellsammansättningen och uttrycket av kemokiner och / eller cytokiner förväntas vara…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag P20 GM109098 och Innovation Award-programmet från Praespero till Edwin Wan. Flödescytometriexperiment utfördes i WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, som stöds av NIH-bidrag S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 och P20 GM103434.
B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |