Summary
Este protocolo descreve o uso de citometria de fluxo para identificar as alterações na composição das células imunes, perfil de citocina e perfil de quimiocina no ambiente pulmonar após a oclusão da artéria cerebral média transitória, um modelo murino de derrame isquêmico.
Abstract
A expansão, ativação e tráfico de células imunes aos pulmões, que são controladas pela expressão de múltiplas citocinas e quimiocinas, podem ser alteradas por lesões cerebrais graves. Isso é evidenciado pelo fato de que a pneumonia é uma das principais causas de mortalidade em pacientes que sofreram de AVC isquêmico. O objetivo deste protocolo é descrever o uso de análises citométricas de fluxo multicolorido para identificar 13 tipos de células imunes nos pulmões de camundongos, incluindo macrófagos alveolares, macrófagos intersticiciais, células dendríticas CD103+ ou CD11b+ (DCs), DCs plasmacitoides, eosinófilos, monocitos/células derivadas de monocitos, neutrófilos, células T e B derivadas de linfoides, células NK e NKT, após indução de derrame isquêmico por oclusão de artéria cerebral média transitória. Além disso, descrevemos a preparação de homogeneizadores pulmonares utilizando um método de homogeneização de contas, para determinar os níveis de expressão de 13 citocinas diferentes ou quimiocinas simultaneamente por matrizes multiplex de contas acopladas à análise citométrica de fluxo. Este protocolo também pode ser usado para investigar a resposta imune pulmonar em outros ambientes da doença, como doença pulmonar infecciosa ou doença alérgica.
Introduction
Os pulmões são um órgão de barreira, exposto ao ambiente externo e, portanto, estão constantemente recebendo desafios imunológicos, como patógenos e alérgenos1. A ativação de células imunes residentes no pulmão e a infiltração de células imunes da periferia são necessárias para limpar patógenos do ambiente pulmonar. Além disso, as células imunes residentes no pulmão mantêm a tolerância às bactérias commensais, sugerindo que essas células desempenham um papel no desembaraço do patógeno e na manutenção da homeostase1. Macrófagos alveolares e intersticiais estão entre as células imunes sentinelas residentes no pulmão que sentem patógenos através de receptores de reconhecimento de padrões e limpam esses patógenos por fagocitose2. Células dendríticas residentes no pulmão conectam a resposta imune inata e adaptativa através da apresentação de antígeno3. Além disso, células imunes inatas locais ativadas produzem citocinas e quimioterapias que amplificam a resposta inflamatória e estimulam a infiltração de células imunes como monócitos, neutrófilos e linfócitos nos pulmões1. O AVC isquêmico mostrou-se modificar a imunidade sistêmica e levar ao aumento da suscetibilidade à infecção pulmonar; no entanto, poucos estudos avaliaram o compartimento pulmonar após o acidente vascular cerebral isquêmico, embora alguns estudos o tenham examinado durante as condições inflamatórias 4,5,6,7,8,9. O objetivo dos métodos descritos aqui é determinar simultaneamente a patologia pulmonar, a composição das células imunes e os níveis de citocina e expressão de quimiocina nos pulmões para avaliar alterações no compartimento pulmonar e avaliar possíveis alterações na resposta imune pulmonar após ataque isquêmico.
Descrito aqui é um protocolo para obter suspensões de células únicas dos pulmões dos camundongos para identificar 13 tipos de células imunes. Este protocolo é baseado na digestão tecidual com colagemnase D sem a necessidade de um dissociador de tecido automatizado. Além disso, desenvolvemos um protocolo para preparar homogeneizadores teciduais que podem ser usados para determinar os níveis de expressão de 13 citocinas diferentes ou quimiocinas usando matrizes de contas multiplex baseadas em cytometria de fluxo. Este protocolo foi usado com sucesso para investigar os efeitos do derrame isquêmico na imunidade pulmonar e também pode ser usado em outros modelos de doenças.
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Protocol
Todos os protocolos e procedimentos realizados foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Virgínia Ocidental. Os camundongos foram alojados sob condições específicas sem patógenos no vivarium da Universidade da Virgínia Ocidental.
1. Preparação de soluções
- Prepare o tampão de perfusão (salina tampão fosfato, PBS). Use aproximadamente duas alíquotas de 10 mL de PBS geladas por mouse.
- Prepare o tampão médio/FACS da célula pulmonar. O tampão FACS contém PBS suplementado com 1% de soro bovino fetal (FBS). Mantenha o meio frio durante todo o processo de excisão pulmonar e transferência. Prepare aproximadamente 8 mL por amostra de pulmão. Prepare um buffer médio/FACS fresco antes dos experimentos.
- Prepare o tampão de dissociação para o isolamento de célula única. O buffer contém 1 mg/mL de colagenase D e 200 μg/mL DNase I na solução de sal tampão da Hank (HBSS). Prepare-se fresco da solução de estoque (100 mg/mL colagenase D e 10 mg/mL DNase I) antes dos experimentos. Aproximadamente 6 mL por amostra de pulmão é necessário. Certifique-se de que o buffer atinja a temperatura ambiente antes do uso.
- Prepare o tampão de homogeneização para homogeneização do tecido pulmonar. O buffer contém PBS e 1x proteinase e coquetel inibidor de fosfatase (estoque = 100x). Prepare-se recentemente antes dos experimentos. Mantenha o tampão frio durante todo o processo de homogeneização. Aproximadamente 200 μL do buffer é suficiente para homogeneizar um único lobo direito dos pulmões.
2. Oclusão da artéria média transitória (tMCAO)
NOTA: Os procedimentos para tMCAO via inserção de monofilamento na artéria cerebral média foram documentados em detalhes anteriormente10. Nestes experimentos, foram utilizados camundongos C57BL/6J masculinos de 8 a 12 semanas, pesando 25-30 g.
- Resumindo, subcutâneamente administre 2 mg/kg de meloxicam nos camundongos antes da cirurgia. Anestesiar profundamente os ratos em uma câmara de indução usando 5% de isoflurane. Confirme a anestesia profunda usando o método de aperto do dedo do dedo do dedo. Mantenha a anestesia com isoflurano de 1 a 2% durante a cirurgia usando um cone no nariz. Mantenha a temperatura corporal em 36,5 - 38 °C durante todo o procedimento, colocando um cobertor quente sob os ratos. Todas as ferramentas cirúrgicas devem ser esterilizadas automaticamente um dia antes da cirurgia.
- Raspe e prepare a pele no pescoço ventral usando 70% de etanol seguido de esfoliante de clorexidina. Administrously administrou 2 mg/kg de bupivacaína sobre a área de incisão antes de fazer a primeira incisão. Use pomada para cobrir os olhos para evitar o ressecamento. Faça uma incisão no pescoço. Puxe suavemente os tecidos moles ao redor da traqueia.
- Identifique a artéria carótida comum esquerda e a artéria carótida externa.
- Aplique uma sutura temporária (tamanho 6/0) na artéria carótida comum para conter o fluxo do sangue. Faça uma incisão na artéria carótida externa.
- Insira um monofilamento revestido de borracha de silicone (tamanho 6-0) na artéria carótida externa e, em seguida, avance o monofilamento para a artéria cerebral média. Deixe o monofilamento na artéria cerebral média por 60 minutos (oclusão).
- Monitore a taxa de fluxo sanguíneo usando laser Doppler Flowmetry. Uma redução da vazão para a artéria cerebral média que é > 80% indica uma oclusão bem sucedida.
- Após os 60 minutos de oclusão, remova o monofilamento para permitir que a reperfusão ocorra. Feche a incisão.
- Em camundongos operados por farsa, realize as etapas 2.1-2.6 sem a inserção do monofilamento. Nestes camundongos, a taxa de fluxo sanguíneo deve permanecer estável durante todo o procedimento.
- Monitore os camundongos diariamente e meça os déficits neurológicos usando critérios de pontuação padrão11. 0 – sem déficit neurológico; 1 – retrai a prenéus contralateral quando levantada pela cauda; 2- círculos para o contralateral quando levantados pela cauda; 3- cair para o contralateral enquanto caminhava; 4 – não anda espontaneamente ou está em coma; 5 – morto.
- Fornecer injeções subcutâneas de soro fisiológico normal e analgésico (meloxicam, 2 mg/kg) a cada 24 horas durante 3 dias após a cirurgia.
- Isole os pulmões 24 e 72 h após a tMCAO para a análise a jusante.
3. Colhendo os tecidos pulmonares
- Anestesia profundamente o camundongo por injeção intraperitoneal (i.p.) de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina. Confirme a anestesia profunda usando o método de aperto do dedo do dedo do dedo.
- Para realizar toda a perfusão transcárdiado corpo 12, fixe o rato na plataforma cirúrgica e pele molhada com 70% de etanol para reduzir a distribuição de peles na cavidade corporal. Use uma tesoura de dissecção fina para fazer uma incisão transversal no abdômen caudal e, em seguida, uma incisão midline do peritônio, parando na cavidade torácica antes de perfurar o diafragma.
- Não corte o músculo/se esconda na cavidade peritoneal e não continue a incisão após o abdômen.
- Pare a incisão assim que a cavidade torácica for alcançada antes de perfurar o diafragma. Tome cuidado para não danificar o coração e os pulmões que podem comprometer a qualidade da perfusão ou a recuperação celular
- O uso de uma tesoura de dissecção fina faz uma incisão midline do peritônio parar na cavidade torácica antes de perfurar o diafragma.
- Segure o rato pela extremidade distal do esterno usando fórceps e levante para cima enquanto corta o diafragma sendo certo para não danificar o coração, pulmões ou vasculatura. Uma vez que os órgãos são visíveis faça uma incisão através da caixa torácica e separe e fixe a caixa da costela para que o coração e os pulmões sejam totalmente expostos.
- Faça cuidadosamente uma pequena incisão no átrio direito perto do arco aórtico. Isso servirá como saída para a perfusão.
- Imediatamente depois, insira suavemente uma agulha de 25 G x 5/8 presa a uma seringa cheia de 10 mL de PBS frio na superfície superior distal do ventrículo esquerdo. Use cuidado para não inserir através do septo ventricular no ventrículo direito. A agulha mal deve ser inserida no ventrículo esquerdo.
NOTA: Se o septo ventricular for perfurado, o fluido sairá correndo do nariz do rato. Isso diminuirá a qualidade da perfusão e resultará em perda celular. - Se desejar, um grampo pode ser usado para segurar a agulha firmemente no lugar no ventrículo esquerdo durante a perfusão.
- De forma constante, mas suavemente, empurre 10 mL de PBS frio para o coração. O tecido do rato deve começar a perusumar e limpar o sangue à medida que o fluido sai do átrio direito.
- Empurre uma segunda alíquota de 10 mL de PBS até que tenha ocorrido uma liberação sanguínea suficiente. O fígado terá uma aparência marrom clara e os pulmões passarão de um rosa avermelhado para a cor mais branca.
- Usando fórceps e tesouras de dissecção fina, remova cuidadosamente todos os tecidos circundantes, incluindo o coração, traqueia, esôfago, timo, tecido conjuntivo, linfonodos e brônquios grandes.
- Separe os lóbulos pulmonares individuais e coloque os lóbulos em uma placa de Petri no gelo contendo uma alíquota de 1-2 mL de meio de célula pulmonar fria.
4. Homogeneização do tecido pulmonar para matrizes de contas multiplex usando homogeneizador de contas
- Pré-esfrie um tubo de tampa cônica de 2 mL contendo 3 contas estéreis de 2,3 mm de zircônia/sílica. Adicione 200 μL de tampão de homogeneização a frio ao tubo.
- Pesar o lóbulo, transferir o lobo para o tubo cônico pré-refrigerado contendo as contas e o tampão de homogeneização.
NOTA: Aproximadamente 50-100 mgs de tecido homogeneizado em 200 μL de tampão serão suficientes para detectar citocinas e expressão de quimiocina na amostra.- Homogeneize o lobo usando um homogeneizador à base de contas (ver Tabela de Materiais) a 4.000 rpm por 2 min.
- Certifique-se de que o tecido está completamente homogeneizado. Aumente o tempo, se necessário.
- Após a homogeneização, centrifugar o tubo em uma micro centrífuga pré-refrigerada (4 °C) a 15.870 x g por 3 min.
- Transfira os supernantes para um microtubo pré-refrigerado de 1,5 mL.
- Coloque a amostra diretamente no gelo para uso imediato ou armazene a amostra a -80 °C para uso futuro. Evite vários ciclos de congelamento.
5. Dissociação do tecido pulmonar e isolamento de células únicas
- Despeje o meio da célula pulmonar fora dos lóbulos pulmonares restantes para evitar a diluição do tampão de dissociação. Em seguida, insira cuidadosamente uma seringa de 1 mL com agulha 25G e 5/8 contendo 1 mL do tampão de dissociação no tecido pulmonar.
- Injete pequenas frações (aproximadamente 1/4 a 1/5) do tampão de dissociação em cada lobo pulmonar e infle suavemente.
NOTA: A maior parte do buffer sairá logo após inflar, pois o lobo foi extirpado. - Repita a injeção de tampão de dissociação 1-2x.
- Incubar os lóbulos pulmonares com tampão de dissociação por 2 minutos à temperatura ambiente.
- Pique finamente os lóbulos pulmonares em pequenos pedaços usando uma tesoura de dissecção fina.
- Transfira as peças pulmonares picadas com o tampão de dissociação para um tubo centrífuga de 15 mL. Suplementar com tampão de dissociação adicional para um total de 6 mL. Vórtice vigorosamente por 1 min.
- Incubar a amostra por 45 min a 37 °C. Vórtice vigorosamente a cada 7-8 minutos.
- Após 45 minutos de incubação, vórtice a amostra vigorosamente por 1 min para resultados ideais.
- Dissocia ainda mais a amostra passando por um coador de células de 100 μm para remover tecido conjuntivo residual, indesejado e intersticial.
- Centrifugar a amostra por 10 min a 380 x g, descarte o supernaspe.
- Adicione 5 mL de meio de célula pulmonar fria à amostra. Resuspend a pelota celular com vórtice suave.
- Centrifugar a amostra por 10 min a 380 x g, descarte o supernaspe.
- Adicione 1 mL de meio de célula pulmonar fria. Resuspend a pelota celular com vórtice suave.
- Passe por um coador de células de 100 μm e conte células.
6. Análise citométrica de fluxo para o nicho de células imunes pulmonares
- Semente 1-2 x 106 células/anticorpos definidos em uma placa inferior bem redonda de 96 (3 conjuntos no total). Centrifugar as células por 3 min a 830 x g. Descarte supernantes.
- Resuspenja a pelota de célula em 50 μL de PBS frio contendo mancha viva/morta fixa. Prepare a mancha de acordo com as instruções do fabricante.
- Incubar as células a 4 °C por 20 min protegidas da luz. Centrifugar as células por 3 min a 830 x g. Descarte supernantes.
- Resuspenha a pelota celular com 25 μL de tampão FACS frio contendo 5 μg/mL de anticorpo cd16/32 anti-rato. Incubar a 4 °C por 10-15 min.
- Adicione 25 μL de tampão FACS frio contendo combinações de anticorpos listados na Tabela 1 às células. Misture por pipetação suave.
NOTA: O volume total do tampão FACS para a coloração do anticorpo é de 50 μL. Portanto, ao preparar uma mistura mestre de anticorpos em 25 μL, a concentração de anticorpos deve ser o dobro da concentração final. - Incubar as células a 4 °C por 20 min protegidas da luz. Centrifugar as células por 3 min a 830 x g. Descarte supernantes.
- Resuspenda as células com 100 μL de tampão FACS frio. Centrifugar as células por 3 min a 830 x g. Descarte supernantes.
- Resuspenda as células com 100 μL de tampão FACS frio. Transfira para um tubo de 5 mL FACS de fundo redondo de poliestireno contendo 150 μL de buffer adicional de FACs. Analise a amostra imediatamente usando um citômetro de fluxo.
NOTA: A fixação celular usando as seguintes etapas permite que as amostras sejam analisadas posteriormente. - Seguindo o passo 6.7., resuspenque a amostra com 100 μL de 1% de paraformaldeído na PBS.
- Incubar a amostra a 4 °C por 15 min protegido da luz. Centrifugar as células por 3 min a 830 x g. Descarte supernantes.
- Resuspenda as células com 100 μL de tampão FACS frio. Centrifugar as células por 3 min a 830 x g. Descarte supernantes.
- Resuspenda as células com 100 μL de tampão FACS frio. Armazene as células a 4 °C, protegidas contra a luz. Analise a amostra dentro de 72 h.
7. Matrizes de contas multiplex para citocina e detecção de quimiocina
NOTA: Os painéis de quimiocina proinflamatória disponíveis comercialmente e os painéis multiplex de inflamação (ver Tabela de Materiais) foram utilizados para determinar a expressão de quimiocinas e citocinas nos pulmões após a indução de tMCAO de acordo com o protocolo do fabricante, que foi descrito no detalhe13.
- Em suma, descongele os analitos no gelo se forem armazenados a -80 °C após a homogeneização do tecido. Centrifugar a amostra a 590 x g por 2 min a 4 °C antes de usar para remover qualquer tecido residual.
- Gere uma curva padrão diluindo serialmente o coquetel padrão (C7) que está em uma concentração conhecida de 10 ng/mL em 7 padrões (C1-6) com o último padrão sendo tampão de ensaio sozinho (C0).
- Uma vez que todos os reagentes tenham aquecido à temperatura ambiente, adicione 25 μL de cada padrão e 25 μL de tampão de ensaio a uma placa de poço V inferior 96.
- Para cada amostra bem, adicione 25 μL de homogeneizar pulmonar (analito) e 25 μL de tampão de ensaio a uma placa de poço fundo V 96
- Vórtice as contas pré-revestidas vigorosamente, em seguida, adicionar 25 μL de contas pré-revestidas a cada um dos poços padrão e amostra.
- Sele a placa e proteja da luz cobrindo com papel alumínio. Agite a placa a 110 rpm por 2h em temperatura ambiente.
- Centrifugar a 230 x g por 5 min. Adicione 200 μL de tampão de lavagem em 1x (a solução de estoque é de 20x, diluída a 1x com água). Incubar por 1 min.
- Centrifugar a 230 x g por 5 min. Resuspenda o padrão e a amostra com anticorpos de detecção de 25 μL.
- Veda e cubra a placa para proteger da luz. Agitar a placa a 110 rpm por 1h em temperatura ambiente.
- Adicione 25 μL de streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) a cada padrão e prove bem.
- Veda e cubra a placa para proteger da luz. Agite a 110 rpm por 30 min à temperatura ambiente.
- Gire a placa a 230 x g por 5 min. Resuspenda o padrão e as amostras em 1x tampão de lavagem.
- Transfira para um tubo de lavagem de poliestireno bem rotulado de 5 mL FACS contendo um adicional de 150 μL de tampão de lavagem 1x.
- Determine a intensidade de fluorescência do sinal PE para os padrões e amostras usando um citômetro de fluxo.
- Construa uma curva padrão para cada quimiocina e citocina usando a intensidade média de fluorescência (IMC) de PE contra as concentrações pré-determinadas.
- Determine a concentração de cada quimiocina e citocina usando a curva padrão e o MFI de cada amostra. O painel multiplex fornece software de análise de dados que pode ser usado para determinar a concentração de cada analito. O peso do lobo apical/superior é usado para determinar a concentração de citocinas ou quimiocinas por miligrama de tecido.
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Representative Results
Recentemente, relatamos que a indução de derrame isquêmico em camundongos altera a composição celular imune dos pulmões11. Especificamente, isquemia cerebral transitória aumentou percentuais de macrófagos alveolares, neutrófilos e DCs CD11b+, enquanto diminuiu percentuais de células T CD4+, células T CD8+, células B, células NK e eosinófilos no compartimento pulmonar. Além disso, a alteração celular correspondeu a níveis significativamente reduzidos de quimiocinas múltiplas nos pulmões. Descrito aqui é um método para o isolamento e identificação de diferentes populações de células imunes no compartimento pulmonar. Os resultados representativos aqui foram de ratos que sofreram indução de TMCAO e uma operação falsa.
Identificamos 13 populações diferentes de células imunes nos pulmões (L1-L13) usando 3 conjuntos de combinações de anticorpos com cada conjunto contendo 5-7 anticorpos (Figura 1). As células mortas foram excluídas usando uma mancha LIVE/DEAD em cada conjunto. Anticorpos e marcadores para distinguir diferentes tipos de células imunes estão listados na Tabela 1. Macrófagos alveolares e intersticiais, CD103+ DCs, CD11b+ DCs e eosinófilos foram identificados no Conjunto 1 (Figura 1A,B). Monocitos proinflamatórios e neutrófilos foram identificados no Conjunto 2 (Figura 1C). Durante as respostas inflamatórias, os monócitos migram para o local da inflamação, onde essas células se diferenciam em antígenos derivados de monócitos que apresentam células (mo-APCs)14. A baixa regulação do Ly6C e da CCR2 são características da diferenciação de monocitos, que podem ser avaliadas utilizando o Conjunto 215. Células T CD4+, células T CD8+, células B, DCs plasmacitóides, células NK e células NKT foram identificadas usando o Conjunto 3 (Figura 1D).
Para determinar a qualidade do nosso protocolo de isolamento celular único, comparamos o número de células viáveis e células imunes CD45+ isoladas usando o método manual com as células isoladas usando um dissociador de tecido comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais), que é frequentemente usado para isolar células de tecidos 16,17,18,19,20 . Neste último protocolo, os lobos pulmonares foram transferidos para um tubo específico do dissociador (ver Tabela de Materiais) após a injeção do tampão de dissociação, e o tecido foi digerido usando o programa 37C_m_LDK_1. O número total de células viáveis, a porcentagem de células CD45+ e o número total de células CD45+ obtidas foram comparáveis entre os dois métodos (Figura 2A-C). A porcentagem de morte celular entre células CD45+ usando ambos os protocolos foi de ~ 10% (Figura 2D). Esses resultados sugerem que o protocolo aqui apresentado permite a recuperação celular com alto rendimento e qualidade sem o auxílio de um dissociador de tecido automatizado.
Utilizou-se um ensaio multiplex comercialmente disponível juntamente com a análise citométrica de fluxo para determinar a concentração de 13 quimiócias utilizando 25 μL de amostra (Figura 3). Dois tamanhos diferentes de contas foram identificados pela primeira vez pelo FSC/SSC (Figura 3A). Cada esfera é revestida com anticorpos primários de 6-7, que poderiam ser distinguidos pela intensidade de fluorescência no canal APC (Figura 3B). O nível de quimiocinas na amostra é proporcional à intensidade da fluorescência no canal PE, que poderia ser determinada por PPI (Figura 3C). Comparando o valor de ECT de cada quimiocina com a curva padrão construída com concentrações conhecidas de quimiocina, a concentração na amostra (por mg de tecido) pode ser determinada.
Figura 1: Identificação de 13 tipos de células imunes dos pulmões após digestão tecidual com colagenase D após derrame isquêmico. Os tecidos pulmonares foram extirpados 24 h após a operação tMCAO ou falsa, as células imunes nos pulmões foram analisadas por citometria de fluxo, definida por marcadores superficiais listados na Tabela 1. (A) No conjunto de anticorpos 1, as células viáveis CD45+ (*) foram primeiramente fechadas no Siglec F e CD11b para identificar os macrófagos alveolares (L1), que expressavam CD11c e MHC II, e eosinófilos (L2), que não expressavam CD11c e MHC II. (B) As células dentro da população Siglec F (**) em A foram então fechadas para determinar a expressão de CD103 e CD11b. CD103+ CD11b- (***). As células foram ainda fechadas para determinar a expressão de CD11c e MHC II. Os DCs CD103+ expressaram CD11c e MHC II (L3), mas não expressaram CD64. A população de oi CD11b (****) foi ainda mais fechada para determinar a expressão de CD64 e MHC II. Os DCs CD11b+ expressaram MHC II, mas não CD64 (L4), enquanto macrófagos intersticiais (L5) expressaram ambos os marcadores. (C) No conjunto de anticorpos 2, as células viáveis CD45+ em A foram fechadas para determinar a expressão de CD11b e Ly6C. As células de oi Ly6C (*) representavam os monócitos indiferenciados que mantinham um alto nível de expressão CCR2 (L6, parcela média), enquanto as células baixas ly6C (**) continham uma população mista de monócitos diferenciadores que eram Ly6G- (L6, enredo direito) e ly6G+ neutrófilos (L7). (D) No conjunto de anticorpos 3, as células viáveis CD45+ em A foram fechadas para determinar a expressão de CD11c e B220 para identificar células B (L8) e DCs plasmacitóides (L9). A população CD11c e B220 (*) foi então fechada para determinar a expressão de células CD4 e CD8 para identificar células CD4+ T (L10) e células CD8+ T (L11). A população CD4-CD8 (**) foi ainda mais fechada para determinar a expressão das células NK1.1 e TCRb para identificar células NK (L12) e NKT (L13). São mostrados lotes representativos de 12 ratos C57BL/6J após a operação tMCAO e sham. Partes da figura foram reimpressas da literatura publicada anteriormente11 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comparação entre o método de dissociação manual e o uso de dissociador de tecido para isolar células únicas dos pulmões. (A-C) O número total de células, a porcentagem de células CD45+ e o número total de células CD45+ foram comparados. Mostrados são resultados combinados de 3 experimentos independentes. NS: não estatisticamente significante. (D) Parcelas representativas para determinar a porcentagem de células CD45+ mortas após o isolamento. São mostrados lotes representativos de 3 experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O derrame isquêmico suprime a produção de múltiplas quimiocinas nos pulmões. (A-C) Tramas representativas mostrando a determinação do nível de 13 quimiocinas nos pulmões por multiplex matriz de contas. (A) O portão FSC/SSC foi utilizado para identificar contas A e B com tamanhos diferentes. (B) Anticorpos primários revestidos nas contas podem ser distinguidos pela intensidade de fluorescência no canal APC. (C) O nível de quimiocinas na amostra foi proporcional à intensidade da fluorescência no canal pe. São mostrados lotes representativos de 12 ratos C57BL/6J após a operação falsa. (D) Os tecidos pulmonares foram homogeneizados 24 h após tMCAO ou sham operatio. O nível de 13 quimiócinas nos pulmões de animais individuais foi determinado por multiplex matriz de contas. Os dados apresentados são resultados combinados de três experimentos independentes com n = 11-12 animais por grupo. *, P < 0,05; **, P < 0,01; , P < 0,001. NS, não estatisticamente diferente. Partes da figura foram reimpressas da literatura publicada anteriormente11 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Anticorpo | Clone | Tipo de célula imune | População | Expressão do marcador de superfície |
| CD45-FITC | 30-F11 | Macrófagos alveloares | L1 | CD45+ Siglec F+ CD11b- |
| Siglec F-PE | E50-2440 | Eosinófilos | L2 | CD45+ Siglec F+ CD11b+ |
| CD11c-Percp/Cy5.5 | N418 | CD103+ DCs | L3 | CD45+ Siglec F- CD11b- CD103+ CD11c+ MHC II+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 | CD11b+ DCs | L4 | CD45+ Siglec F- CD11b hi CD103- CD64- MHC II+ |
| CD64-APC | X54-5/7.1 | Macrófagos intersticiais | L5 | CD45+ Siglec F- CD11b hi CD103- CD64+ MHC II+ |
| CD103-BV421 | 2E7 | |||
| MHC II-BV510 | M5/114.15.2 | |||
| Ao vivo/morto-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | Monócitos/moDCs | L8 | CD45+ CD11b hi Ly6C hi/int CCR2+/- Ly6G- |
| Ly6C-PE | HK1.4 | Neutrófilos | L9 | CD45+ CD11b oi Ly6C int CCR2- Ly6G+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 | |||
| CCR2-BV421 | SA203G11 | |||
| Ly6G-BV510 | 1A8 | |||
| Ao vivo/morto-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | DCs plasmacitóides | L6 | CD45+ B220+ CD11c+ |
| CD8-PE | 53-6.7 | Células B | L7 | CD45+ B220+ CD11c- |
| NK1.1-Percp/Cy5.5 | PK136 | Células CD4+ T | L10 | CD45+ B220- CD11c- CD4+ CD8- |
| CD11c-PE/Cy7 | N418 | Células CD8+ T | L11 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8+ |
| APC-B220 | RA3-6B2 | Células NK | L12 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb- |
| CD4-BV421 | GK1.5 | Células NKT | L13 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb+ |
| TCRb-BV510 | H57-597 | |||
| Ao vivo/morto-APC/Cy7 |
Tabela 1: Marcadores de superfície e combinações de anticorpos para determinar células imunes isoladas dos pulmões após o tMCAO.
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Discussion
Os protocolos aqui descritos permitem a identificação de tipos de células imunes pulmonares e a expressão de quimiocinas ou citocinas no mesmo rato. Se um estudo de histopatologia for desejado, um lobo individual pode ser removido e fixado para esse fim antes de prosseguir para as etapas de isolamento de célula única. Uma limitação deste método é que essa abordagem pode não ser adequada em alguns cenários da doença se a mudança na composição das células imunes e a expressão de quimiocinas e/ou citocinas forem previstas para serem distribuídas de forma desigual entre diferentes lobos dos pulmões. Por exemplo, algumas bactérias, como mycobacterium tuberculosis, mostram uma predileção por infectar certos lóbulos do pulmão21. Neste caso, pode ser necessária uma comparação entre lóbulos.
A concentração, o tempo de incubação e a temperatura do protocolo de isolamento de células únicas dos pulmões impactam criticamente a recuperação das células imunes dos pulmões. A qualidade da colagemnase D é fundamental para obter resultados ideais e deve ser testada se uma fonte diferente de colagemnase D for usada. A super digestão dos tecidos resulta em aumento da morte celular; que, a sub digestão dos tecidos causa baixo rendimento das células imunes, especialmente macrófagos e DCs.
Usamos 3 combinações de anticorpos para determinar 13 populações de células imunes nos pulmões, com cada conjunto contendo 5-7 anticorpos e uma mancha VIVA/MORTA. Anticorpos em cada conjunto podem ser combinados se o número de células obtidas das amostras for limitado. No entanto, uma questão importante que surge quando o número de anticorpos é aumentado é que a compensação do sinal de fluorescência no citómetro de fluxo pode ser desafiadora, especialmente quando distingue células da linhagem mieloide sob condições inflamatórias. Coquetéis de anticorpos adicionais podem ser usados para identificar outras células imunes inatas dentro da suspensão unicelular, como células linfoides inatas e células γδ T, que contribuem para a resposta imune nos pulmões22,23. Uma vez que um lóbulo do pulmão é tomado para a matriz multiplex, o número exato de cada tipo de célula nos pulmões não pode ser definitivamente determinado e comparado, e isso constitui uma limitação deste método. Para lidar com isso, um número definido de células pode ser isolado dos pulmões de camundongos induzidos por sham e tMCAO. Neste caso, o número absoluto de cada tipo de célula imune pode ser comparado com precisão entre os dois grupos. Além disso, este método não permite determinar a localização das células imunes no pulmão. Isso pode ser feito realizando imunohistoquímica em seções pulmonares.
Em conclusão, este protocolo foi utilizado para investigar o efeito do AVC isquêmico na imunidade pulmonar, mas também pode ser usado para estudar outros modelos de doenças, como infecção e alergias.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela concessão do NIH P20 GM109098 e pelo Programa de Prêmio de Inovação da Praespero a Edwin Wan. Os experimentos de Citometria de Fluxo foram realizados no WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, que é suportado pelas bolsas NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 e P20 GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
