Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Durchflusszytometrie, um die Veränderungen der Immunzellzusammensetzung, des Zytokinprofils und des Chemokinprofils in der pulmonalen Umgebung nach einem vorübergehenden mittleren Hirnarterienverschluss, einem murinen Modell des ischämischen Schlaganfalls, zu identifizieren.
Abstract
Die Expansion, Aktivierung und der Transport von Immunzellen in die Lunge, die durch die Expression mehrerer Zytokine und Chemokine gesteuert werden, können durch schwere Hirnverletzungen verändert werden. Dies wird durch die Tatsache belegt, dass Lungenentzündung eine der Haupttodesursachen bei Patienten ist, die einen ischämischen Schlaganfall erlitten haben. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Verwendung der mehrfarbigen Durchflusszytometrie zu beschreiben, um 13 Arten von Immunzellen in der Lunge von Mäusen zu identifizieren, einschließlich alveolärer Makrophagen, interstitieller Makrophagen, CD103+ oder CD11b + dendritische Zellen (DCs), plasmazytoide DCs, Eosinophile, Monozyten / Monozyten-abgeleitete Zellen, Neutrophile, lymphoide T- und B-Zellen, NK-Zellen und NKT-Zellen, nach ischämischer Schlaganfallinduktion durch vorübergehenden mittleren Hirnarterienverschluss. Darüber hinaus beschreiben wir die Herstellung von Lungenhomogenaten unter Verwendung einer Perlenhomogenisierungsmethode, um die Expressionsniveaus von 13 verschiedenen Zytokinen oder Chemokinen gleichzeitig durch Multiplex-Bead-Arrays gekoppelt mit durchflusszytometrischer Analyse zu bestimmen. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die pulmonale Immunantwort in anderen Krankheitssituationen wie infektiösen Lungenerkrankungen oder allergischen Erkrankungen zu untersuchen.
Introduction
Die Lunge ist ein Barriereorgan, das der äußeren Umgebung ausgesetzt ist und daher ständig immunologischen Herausforderungen wie Krankheitserregern und Allergenen ausgesetzt ist1. Die Aktivierung lungenresidenter Immunzellen und die Infiltration von Immunzellen aus der Peripherie sind erforderlich, um Krankheitserreger aus der pulmonalen Umgebung zu entfernen. Darüber hinaus halten lungenresidente Immunzellen die Toleranz gegenüber kommensalen Bakterien aufrecht, was darauf hindeutet, dass diese Zellen eine Rolle bei der Pathogenentfernung und der Aufrechterhaltung der Homöostase spielen1. Alveoläre und interstitielle Makrophagen gehören zu den lungenresidenten Sentinel-Immunzellen, die Krankheitserreger über Mustererkennungsrezeptoren wahrnehmen und durch Phagozytosebeseitigen 2. Lungenansässige dendritische Zellen überbrücken die angeborene und adaptive Immunantwort durch Antigenpräsentation3. Darüber hinaus produzieren aktivierte lokale angeborene Immunzellen Zytokine und Chemokine, die die Entzündungsreaktion verstärken und die Infiltration von Immunzellen wie Monozyten, Neutrophilen und Lymphozyten in die Lunge stimulieren1. Es wurde gezeigt, dass ein ischämischer Schlaganfall die systemische Immunität verändert und zu einer erhöhten Anfälligkeit für Lungeninfektionen führt. Allerdings haben nur wenige Studien das Lungenkompartiment nach einem ischämischen Schlaganfall untersucht, obwohl einige Studien es bei entzündlichen Zuständenuntersucht haben 4,5,6,7,8,9. Das Ziel der hierin beschriebenen Verfahren ist es, gleichzeitig die Lungenpathologie, die Immunzellzusammensetzung und die Zytokin- und Chemokinexpression in der Lunge zu bestimmen, um Veränderungen am Lungenkompartiment zu bewerten und mögliche Veränderungen der pulmonalen Immunantwort nach einer ischämischen Attacke zu bewerten.
Hier wird ein Protokoll zur Gewinnung von Einzelzellsuspensionen aus den Lungen der Mäuse beschrieben, um 13 Arten von Immunzellen zu identifizieren. Dieses Protokoll basiert auf der Gewebeverdauung mit Kollagenase D, ohne dass ein automatisierter Gewebedissoziator erforderlich ist. Darüber hinaus haben wir ein Protokoll zur Herstellung von Gewebehomogenaten entwickelt, mit dem die Expressionsniveaus von 13 verschiedenen Zytokinen oder Chemokinen mithilfe von Durchflusszytometrie-basierten Multiplex-Bead-Arrays bestimmt werden können. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um die Auswirkungen eines ischämischen Schlaganfalls auf die pulmonale Immunität zu untersuchen und kann auch in anderen Krankheitsmodellen verwendet werden.
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Protocol
Alle durchgeführten Protokolle und Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der West Virginia University genehmigt. Die Mäuse wurden unter spezifisch-pathogenfreien Bedingungen im Vivarium der West Virginia University untergebracht.
1. Vorbereitung von Lösungen
- Perfusionspuffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS) vorbereiten. Verwenden Sie ungefähr zwei 10-ml-Aliquots eiskaltes PBS pro Maus.
- Lungenzellenmedium/FACS-Puffer vorbereiten. FACS-Puffer enthält PBS, ergänzt mit 1% fetalem Rinderserum (FBS). Halten Sie das Medium für den gesamten Prozess der Lungenexzision und -übertragung kalt. Bereiten Sie ungefähr 8 ml pro Lungenprobe vor. Bereiten Sie vor den Experimenten einen frischen Medium/FACS-Puffer vor.
- Bereiten Sie den Dissoziationspuffer für die Einzelzellisolierung vor. Der Puffer enthält 1 mg/ml Kollagenase D und 200 μg/ml DNase I in Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS). Vor den Versuchen frisch aus der Stammlösung (100 mg/ml Kollagenase D und 10 mg/ml DNase I) zubereiten. Pro Lungenprobe werden ca. 6 ml benötigt. Stellen Sie sicher, dass der Puffer vor der Verwendung Raumtemperatur erreicht.
- Bereiten Sie den Homogenisierungspuffer für die Homogenisierung des Lungengewebes vor. Puffer enthält PBS und 1x Proteinase und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (Bestand = 100x). Vor den Experimenten frisch zubereiten. Halten Sie den Puffer während des gesamten Homogenisierungsprozesses kalt. Etwa 200 μL des Puffers reichen aus, um einen einzelnen rechten Lungenlappen zu homogenisieren.
2. Transienter mittlerer Hirnarterienverschluss (tMCAO)
HINWEIS: Verfahren für tMCAO durch Monofilament-Insertion in die mittlere Hirnarterie wurden zuvor ausführlich dokumentiert10. In diesen Experimenten wurden 8- bis 12 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 25-30 g verwendet.
- Kurz gesagt, verabreichen Sie den Mäusen vor der Operation subkutan 2 mg/kg Meloxicam. Betäuben Sie die Mäuse in einer Induktionskammer mit 5% Isofluran tief. Bestätigen Sie die Tiefenanästhesie mit der Zehenklemmmethode. Halten Sie die Anästhesie mit 1-2% Isofluran während der Operation mit einem Nasenkegel aufrecht. Halten Sie die Körpertemperatur während des gesamten Eingriffs bei 36,5 - 38 °C, indem Sie eine warme Decke unter die Mäuse legen. Alle chirurgischen Instrumente sollten einen Tag vor der Operation autoklavisch sterilisiert werden.
- Rasieren und bereiten Sie die Haut am Bauchhals mit 70% Ethanol vor, gefolgt von einem Chlorhexidin-Peeling. Subkutan 2 mg/kg Bupivacain über den Inzisionsbereich verabreichen, bevor der erste Schnitt gemacht wird. Verwenden Sie Augensalbe, um die Augen zu bedecken, um Trockenheit zu verhindern. Machen Sie einen Mittellinien-Halsschnitt. Ziehen Sie die Weichteile um die Luftröhre vorsichtig beiseite.
- Identifizieren Sie die linke gemeinsame Halsschlagader und die äußere Halsschlagader.
- Tragen Sie eine provisorische Naht (Größe 6/0) auf die gemeinsame Halsschlagader auf, um den Blutfluss einzudämmen. Machen Sie einen Schnitt in der äußeren Halsschlagader.
- Führen Sie ein silikongummibeschichtetes Monofilament (Größe 6-0) in die äußere Halsschlagader ein und schieben Sie das Monofilament dann zur mittleren Hirnarterie. Lassen Sie das Monofilament in der mittleren Hirnarterie für 60 min (Okklusion).
- Überwachen Sie die Blutflussrate mit der Laser-Doppler-Durchflussmessung. Eine Verringerung der Flussrate zur mittleren Hirnarterie um > 80% deutet auf einen erfolgreichen Verschluss hin.
- Entfernen Sie nach der 60-minütigen Okklusion das Monofilament, damit die Reperfusion stattfinden kann. Schließen Sie den Einschnitt.
- Führen Sie bei scheinbetriebenen Mäusen die Schritte 2.1-2.6 ohne Einführen des Monofilaments durch. Bei diesen Mäusen sollte die Durchblutungsrate während des gesamten Verfahrens konstant bleiben.
- Überwachen Sie die Mäuse täglich und messen Sie die neurologischen Defizite anhand des Standard-Scoring-Kriteriums11. 0 – kein neurologisches Defizit; 1 – zieht kontralaterale Vorderpfote zurück, wenn sie vom Schwanz angehoben wird; 2- Kreise zum kontralateralen, wenn sie vom Schwanz angehoben werden; 3- beim Gehen auf das kontralaterale fallen; 4 – geht nicht spontan oder ist komatös; 5 – tot.
- Geben Sie subkutane Injektionen von normaler Kochsalzlösung und Analgetikum (Meloxicam, 2 mg / kg) alle 24 Stunden für 3 Tage nach der Operation.
- Isolieren Sie die Lungen 24 und 72 h nach tMCAO für die nachgeschaltete Analyse.
3. Entnahme des Lungengewebes
- Betäuben Sie die Maus tief durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin. Bestätigen Sie die Tiefenanästhesie mit der Zehenklemmmethode.
- Um die Ganzkörper-Transkardperfusion12 durchzuführen, heften Sie die Maus an die chirurgische Plattform und das nasse Fell mit 70% Ethanol, um die Fellverteilung in die Körperhöhle zu reduzieren. Verwenden Sie eine feine Dissektionsschere, um einen Querschnitt im Schwanzabdomen und dann einen Mittellinienschnitt des Peritoneums zu machen, der an der Brusthöhle stoppt, bevor das Zwerchfell durchbohrt wird.
- Schneiden Sie nicht durch den Muskel / verstecken Sie sich in die Peritonealhöhle und setzen Sie den Schnitt nicht über den Bauch hinaus fort.
- Stoppen Sie den Einschnitt, sobald die Brusthöhle erreicht ist, bevor Sie das Zwerchfell punktieren. Achten Sie darauf, Herz und Lunge nicht zu schädigen, was die Perfusionsqualität oder die Zellerholung beeinträchtigen kann
- Mit einer feinen Dissektionsschere machen Sie einen Mittellinienschnitt des Peritoneums, der an der Brusthöhle stoppt, bevor das Zwerchfell durchbohrt wird.
- Fassen Sie die Maus am distalen Ende des Brustbeins mit einer Pinzette und heben Sie sie nach oben, während Sie das Zwerchfell durchschneiden, um sicherzustellen, dass Herz, Lunge oder Gefäßsystem nicht beschädigt werden. Sobald die Organe sichtbar sind, machen Sie einen Schnitt durch den Brustkorb und trennen und stecken Sie das Rippengehäuse zurück, so dass Herz und Lunge vollständig freigelegt sind.
- Machen Sie vorsichtig einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof in der Nähe des Aortenbogens. Dies dient als Abfluss für die Perfusion.
- Führen Sie unmittelbar danach vorsichtig eine 25 G x 5/8-Nadel ein, die an einer mit 10 ml kaltem PBS gefüllten Spritze befestigt ist, in die distale obere Oberfläche des linken Ventrikels. Achten Sie darauf, nicht durch die Ventrikelscheidewand in den rechten Ventrikel einzuführen. Die Nadel sollte kaum in den linken Ventrikel eingeführt werden.
HINWEIS: Wenn das Ventrikelseptum durchstochen wird, strömt Flüssigkeit aus der Nase der Maus. Dies verringert die Perfusionsqualität und führt zu Zellverlust. - Falls gewünscht, kann eine Klemme verwendet werden, um die Nadel während der Perfusion sicher im linken Ventrikel zu halten.
- Drücken Sie gleichmäßig, aber sanft 10 ml kaltes PBS in das Herz. Mausgewebe sollte beginnen zu durchbluten und das Blut zu entfernen, wenn Flüssigkeit aus dem rechten Vorhof austritt.
- Drücken Sie ein zweites Aliquot von 10 ml PBS, bis eine ausreichende Blutclearance eingetreten ist. Die Leber wird ein hellbraunes Aussehen haben und die Lungen werden von einem rötlichen Rosa zu meist weiß übergehen.
- Entfernen Sie mit einer Pinzette und einer feinen Dissektionsschere vorsichtig alle umliegenden Gewebe, einschließlich Herz, Luftröhre, Speiseröhre, Thymus, Bindegewebe, Lymphknoten und große Bronchiale.
- Trennen Sie einzelne Lungenlappen und legen Sie die Lappen in eine Petrischale auf Eis, die ein Aliquot von 1-2 ml kaltem Lungenzellmedium enthält.
4. Homogenisierung von Lungengewebe für Multiplex-Bead-Arrays mit Bead-Homogenisator
- Kühlen Sie ein 2-ml-konisches Schraubverschlussrohr mit 3 sterilen 2,3-mm-Zirkonoxid-/Kieselsäurekügelchen vor. Geben Sie 200 μL kalten Homogenisierungspuffer in das Röhrchen.
- Wiegen Sie den Lappen, geben Sie den Lappen in das vorgekühlte konische Rohr, das die Perlen und den Homogenisierungspuffer enthält.
HINWEIS: Etwa 50-100 mg homogenisiertes Gewebe in 200 μL Puffer reichen aus, um die Zytokin- und Chemokinexpression in der Probe nachzuweisen.- Homogenisieren Sie den Lappen mit einem perlenbasierten Homogenisator (siehe Materialtabelle) bei 4.000 U/min für 2 min.
- Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig homogenisiert ist. Erhöhen Sie die Zeit bei Bedarf.
- Nach der Homogenisierung zentrifugieren Sie das Röhrchen in einer vorgekühlten (4 °C) Mikrozentrifuge bei 15.870 x g für 3 min.
- Die Überstände werden in ein vorgekühltes 1,5 ml Mikroröhrchen überführt.
- Legen Sie die Probe zur sofortigen Verwendung direkt auf Eis oder lagern Sie die Probe bei -80 °C für die zukünftige Verwendung. Vermeiden Sie mehrere Gefrier-Tau-Zyklen.
5. Lungengewebedissoziation und Einzelzellisolierung
- Gießen Sie das Lungenzellmedium von den verbleibenden Lungenlappen ab, um eine Verdünnung des Dissoziationspuffers zu vermeiden. Führen Sie dann vorsichtig eine 1-ml-Spritze mit 25G und 5/8-Nadel mit 1 ml des Dissoziationspuffers in das Lungengewebe ein.
- Injizieren Sie kleine Fraktionen (ca. 1/4 bis 1 /5th) des Dissoziationspuffers in jeden Lungenlappen und blasen Sie ihn sanft auf.
HINWEIS: Der größte Teil des Puffers wird kurz nach dem Aufblasen herauseilen, wenn der Lappen herausgeschnitten wurde. - Wiederholen Sie die Injektion des Dissoziationspuffers 1-2x.
- Die Lungenlappen mit Dissoziationspuffer für 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Die Lungenlappen mit einer feinen Präparationsschere fein zerkleinern.
- Die gehackten Lungenstücke mit dem Dissoziationspuffer in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführen. Ergänzung mit zusätzlichem Dissoziationspuffer auf insgesamt 6 ml. Wirbeln kräftig für 1 min.
- Die Probe 45 min bei 37 °C inkubieren. Wirbel kräftig alle 7-8 min.
- Nach 45 Minuten Inkubation die Probe 1 Minute lang kräftig durchziehen, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
- Dissoziieren Sie die Probe weiter, indem Sie durch ein 100-μm-Zellsieb gehen, um verbleibendes, unerwünschtes Bindegewebe und interstitielles Gewebe zu entfernen.
- Zentrifugieren Sie die Probe für 10 min bei 380 x g, verwerfen Sie den Überstand.
- Geben Sie 5 ml kaltes Lungenzellenmedium in die Probe. Resuspendieren Sie das Zellpellet durch sanftes Wirbeln.
- Zentrifugieren Sie die Probe für 10 min bei 380 x g, verwerfen Sie den Überstand.
- Fügen Sie 1 ml kaltes Lungenzellenmedium hinzu. Resuspendieren Sie das Zellpellet durch sanftes Wirbeln.
- Gehen Sie durch ein 100-μm-Zellsieb und zählen Sie die Zellen.
6. Durchflusszytometrische Analyse für die Lungenimmunzellnische
- Samen 1-2 x 106 Zellen/Antikörper in eine 96 gut abgerundete Bodenplatte (insgesamt 3 Sets). Zentrifugieren Sie die Zellen für 3 min bei 830 x g. Überstände verwerfen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 50 μL kaltem PBS, das einen fixierbaren lebenden/toten Fleck enthält. Bereiten Sie den Fleck gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C für 20 min vor Licht geschützt. Zentrifugieren Sie die Zellen für 3 min bei 830 x g. Überstände verwerfen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 25 μL kaltem FACS-Puffer, der 5 μg/ml Anti-Maus-CD16/32-Antikörper enthält. Bei 4 °C 10-15 min inkubieren.
- Geben Sie 25 μL kalten FACS-Puffer, der die in Tabelle 1 aufgeführten Antikörperkombinationen enthält, in die Zellen ein. Durch vorsichtiges Pipettieren mischen.
HINWEIS: Das Gesamtvolumen des FACS-Puffers für die Antikörperfärbung beträgt 50 μL. Daher sollte bei der Herstellung einer Mastermischung von Antikörpern in 25 μL die Konzentration der Antikörper doppelt so hoch sein wie die Endkonzentration. - Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C für 20 min vor Licht geschützt. Zentrifugieren Sie die Zellen für 3 min bei 830 x g. Überstände verwerfen.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 100 μL kaltem FACS-Puffer. Zentrifugieren Sie die Zellen für 3 min bei 830 x g. Überstände verwerfen.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 100 μL kaltem FACS-Puffer. Transfer in ein 5-ml-FACS-Röhrchen mit rundem Boden aus Polystyrol, das 150 μL zusätzlichen FAC-Puffer enthält. Analysieren Sie die Probe sofort mit einem Durchflusszytometer.
HINWEIS: Durch die Zellfixierung mit den folgenden Schritten können Proben später analysiert werden. - Nach Schritt 6.7 wird die Probe mit 100 μL 1% Paraformaldehyd in PBS resuspendiert.
- Die Probe bei 4 °C 15 min lichtgeschützt inkubieren. Zentrifugieren Sie die Zellen für 3 min bei 830 x g. Überstände verwerfen.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 100 μL kaltem FACS-Puffer. Zentrifugieren Sie die Zellen für 3 min bei 830 x g. Überstände verwerfen.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 100 μL kaltem FACS-Puffer. Lagern Sie die Zellen lichtgeschützt bei 4 °C. Analysieren Sie die Probe innerhalb von 72 Stunden.
7. Multiplex-Bead-Arrays für den Nachweis von Zytokinen und Chemokinen
HINWEIS: Kommerziell erhältliche proinflammatorische Chemokin- und Entzündungsmultiplex-Panels (siehe Materialtabelle) wurden verwendet, um die Expression von Chemokinen und Zytokinen in der Lunge nach tMCAO-Induktion gemäß Herstellerprotokoll zu bestimmen, das im Detail13 beschrieben wurde.
- Kurz gesagt, tauen Sie die Analyten auf Eis auf, wenn sie nach der Gewebehomogenisierung bei -80 °C gelagert wurden. Zentrifugieren Sie die Probe bei 590 x g für 2 min bei 4 °C vor Gebrauch, um restliches Gewebe zu entfernen.
- Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie den Standardcocktail (C7), der eine bekannte Konzentration von 10 ng / ml aufweist, seriell in 7 Standards (C1-6) verdünnen, wobei der letzte Standard der Assay-Puffer allein (C0) ist.
- Sobald alle Reagenzien auf Raumtemperatur erwärmt sind, fügen Sie 25 μL jedes Standards und 25 μL Assay-Puffer zu einer V-Bodenplatte 96 hinzu.
- Zu jeder Probenmulde werden 25 μL Lungenhomogenat (Analyt) und 25 μL Assay-Puffer zu einer V-Bodenplatte mit 96-Vertiefung hinzugefügt.
- Wirbeln Sie die vorbeschichteten Perlen kräftig aus und fügen Sie dann 25 μL vorbeschichtete Perlen in jede der Standard- und Probenmulden hinzu.
- Verschließen Sie die Platte und schützen Sie sie vor Licht, indem Sie sie mit Folie abdecken. Schütteln Sie die Platte bei 110 U/min für 2 h bei Raumtemperatur.
- Zentrifugieren bei 230 x g für 5 min. Fügen Sie 200 μL Waschpuffer zu 1x hinzu (Stammlösung ist 20x, verdünnen Sie auf 1x mit Wasser). 1 min inkubieren.
- Zentrifugieren bei 230 x g für 5 min. Resuspendieren Sie den Standard und die Probe mit 25 μL Nachweisantikörpern.
- Versiegeln und abdecken Sie die Platte, um den Inhalt vor Licht zu schützen. Schütteln Sie die Platte bei 110 U/min für 1 h bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 25 μL Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE) zu jedem Standard hinzu und nehmen Sie eine gute Probe.
- Versiegeln und abdecken Sie die Platte, um den Inhalt vor Licht zu schützen. Bei 110 U/min 30 min bei Raumtemperatur schütteln.
- Drehen Sie die Platte bei 230 x g für 5 min. Standard und Proben in 1x Waschpuffer resuspendieren.
- In ein gut beschriftetes 5 mL FACS-Röhrchen mit rundem Boden aus Polystyrol überführt, das zusätzliche 150 μL 1x Waschpuffer enthält.
- Bestimmung der PE-Signalfluoreszenzintensität für die Standards und Proben mit einem Durchflusszytometer.
- Erstellen Sie eine Standardkurve für jedes Chemokin und Zytokin unter Verwendung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von PE gegen die vorbestimmten Konzentrationen.
- Bestimmen Sie die Konzentration jedes Chemokins und Zytokins unter Verwendung der Standardkurve und des MFI aus jeder Probe. Das Multiplex-Panel bietet eine Datenanalysesoftware, mit der die Konzentration jedes Analyten bestimmt werden kann. Das Gewicht des apikalen / oberen Lappens wird verwendet, um die Konzentration von Zytokinen oder Chemokin pro Milligramm Gewebe zu bestimmen.
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Representative Results
Wir berichteten kürzlich, dass die ischämische Schlaganfallinduktion bei Mäusen die Immunzellzusammensetzung der Lunge verändert11. Insbesondere erhöhte die vorübergehende zerebrale Ischämie den Prozentsatz der alveolären Makrophagen, Neutrophilen und CD11b + DCs, während die Prozentsätze von CD4 + T-Zellen, CD8 + T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Eosinophilen im Lungenkompartiment abnahmen. Darüber hinaus entsprach die zelluläre Veränderung signifikant verminderten Konzentrationen multipler Chemokine in der Lunge. Hier wird eine Methode zur Isolierung und Identifizierung verschiedener Immunzellpopulationen im Lungenkompartiment beschrieben. Repräsentative Ergebnisse, die hier gezeigt wurden, stammten von Mäusen, die sich einer tMCAO-Induktion und einer Scheinoperation unterzogen hatten.
Wir identifizierten 13 verschiedene Populationen von Immunzellen in der Lunge (L1-L13) mit 3 Sätzen von Antikörperkombinationen, wobei jeder Satz 5-7 Antikörper enthielt (Abbildung 1). Tote Zellen wurden mit einem LIVE/DEAD-Färbung in jedem Set ausgeschlossen. Antikörper und Marker zur Unterscheidung verschiedener Immunzelltypen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Alveoläre und interstitielle Makrophagen, CD103+ DCs, CD11b+ DCs und Eosinophile wurden in Set 1 identifiziert (Abbildung 1A,B). Proinflammatorische Monozyten und Neutrophile wurden in Set 2 identifiziert (Abbildung 1C). Während der Entzündungsreaktionen wandern Monozyten zum Ort der Entzündung, wo sich diese Zellen in monozytenabgeleitete Antigen-präsentierende Zellen (mo-APCs) differenzieren14. Die Herunterregulierung von Ly6C und CCR2 ist charakteristisch für die Monozytendifferenzierung, die mit Set 215 bewertet werden kann. CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen, plasmazytoide DCs, NK-Zellen und NKT-Zellen wurden mit Set 3 identifiziert (Abbildung 1D).
Um die Qualität unseres Einzelzellisolierungsprotokolls zu bestimmen, verglichen wir die Anzahl der lebensfähigen Zellen und CD45+ Immunzellen, die mit der manuellen Methode isoliert wurden, mit den Zellen, die mit einem kommerziell erhältlichen Gewebedissoziator isoliert wurden (siehe Materialtabelle), der häufig verwendet wird, um Zellen aus Geweben zu isolieren 16,17,18,19,20 . Im letztgenannten Protokoll wurden die Lungenlappen nach Injektion des Dissoziationspuffers in einen dissoziatorspezifischen Schlauch (siehe Materialtabelle) überführt und das Gewebe mit dem 37C_m_LDK_1-Programm verdaut. Die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen, der Prozentsatz der CD45+-Zellen und die Gesamtzahl der erhaltenen CD45+-Zellen waren zwischen den beiden Methoden vergleichbar (Abbildung 2A-C). Der Prozentsatz des Zelltods unter CD45+-Zellen unter Verwendung beider Protokolle betrug ~ 10% (Abbildung 2D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das hier vorgestellte Protokoll eine Zellerholung mit hoher Ausbeute und Qualität ohne die Hilfe eines automatisierten Gewebedissoziators ermöglicht.
Ein kommerziell erhältlicher Multiplex-Assay in Verbindung mit einer durchflusszytometrischen Analyse wurde verwendet, um die Konzentration von 13 Chemokinen unter Verwendung von 25 μL Probe zu bestimmen (Abbildung 3). Zwei verschiedene Perlengrößen wurden zuerst durch FSC/SSC identifiziert (Abbildung 3A). Jede Perle ist mit 6-7 primären Antikörpern beschichtet, die durch die Fluoreszenzintensität im APC-Kanal unterschieden werden können (Abbildung 3B). Der Gehalt an Chemokinen in der Probe ist proportional zur Fluoreszenzintensität im PE-Kanal, die durch MFI bestimmt werden konnte (Abbildung 3C). Durch Vergleich des MFI-Wertes jedes Chemokins mit der Standardkurve, die mit bekannten Chemokinkonzentrationen konstruiert wurde, kann die Konzentration in der Probe (pro mg Gewebe) bestimmt werden.
Abbildung 1: Identifizierung von 13 Immunzelltypen aus der Lunge nach Gewebeverdauung mit Kollagenase D nach ischämischem Schlaganfall. Lungengewebe wurde 24 h nach tMCAO oder Scheinoperation herausgeschnitten, Immunzellen in der Lunge wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert, definiert durch Oberflächenmarker in Tabelle 1. (A) Im Antikörperset 1 wurden CD45+ lebensfähige Zellen (*) zunächst auf Siglec F und CD11b gattiert, um die alveolären Makrophagen (L1) zu identifizieren, die CD11c und MHC II exprimierten, und Eosinophile (L2), die CD11c und MHC II nicht exprimierten. (B) Zellen innerhalb der Siglec F-Population (**) in A wurden dann gated , um die Expression von CD103 und CD11b zu bestimmen. CD103+ CD11b- (***). Die Zellen wurden weiter kontrolliert, um die Expression von CD11c und MHC II zu bestimmen. CD103+ DCs exprimierten sowohl CD11c als auch MHC II (L3), aber nicht CD64. Die CD11b hi-Population (****) wurde weiter kontrolliert, um die Expression von CD64 und MHC II zu bestimmen. CD11b+ DCs exprimierten MHC II, aber nicht CD64 (L4), während interstitielle Makrophagen (L5) beide Marker exprimierten. (C) Im Antikörperset 2 wurden CD45+ lebensfähige Zellen in A gated , um die Expression von CD11b und Ly6C zu bestimmen. Ly6C-hi-Zellen (*) repräsentierten die undifferenzierten Monozyten, die ein hohes Maß an CCR2-Expression aufrechterhielten (L6, mittlerer Plot), während Ly6C-Zellen (**) eine gemischte Population differenzierender Monozyten enthielten, die Ly6G- (L6, rechter Plot) und Ly6G + -Neutrophile (L7) waren. (D) In Antikörperset 3 wurden CD45+ lebensfähige Zellen in A kontrolliert, um die Expression von CD11c und B220 zu bestimmen, um B-Zellen (L8) und plasmazytoide DCs (L9) zu identifizieren. Die CD11c- und B220-Population (*) wurde dann kontrolliert, um die Expression von CD4 und CD8 zu bestimmen, um CD4+ T-Zellen (L10) und CD8+ T-Zellen (L11) zu identifizieren. Die CD4-CD8-Population (**) wurde weiter kontrolliert, um die Expression von NK1.1 und TCRb zur Identifizierung von NK-Zellen (L12) und NKT-Zellen (L13) zu bestimmen. Gezeigt sind repräsentative Diagramme von 12 C57BL/6J-Mäusen nach tMCAO und Scheinbetrieb. Teile der Abbildung wurden mit Genehmigung aus der zuvor veröffentlichten Literatur11 nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vergleich zwischen manueller Dissoziationsmethode und der Verwendung von Gewebedissoziator zur Isolierung einzelner Zellen aus der Lunge. (A-C) Die Gesamtzahl der Zellen, der Prozentsatz der CD45+ Zellen und die Gesamtzahl der CD45+ Zellen wurden verglichen. Gezeigt werden kombinierte Ergebnisse aus 3 unabhängigen Experimenten. NS: nicht statistisch signifikant. (D) Repräsentative Diagramme zur Bestimmung des Prozentsatzes toter CD45+-Zellen nach Isolierung. Gezeigt werden repräsentative Plots aus 3 unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Ischämischer Schlaganfall unterdrückt die Produktion mehrerer Chemokine in der Lunge. (A-C) Repräsentative Diagramme, die die Bestimmung des Spiegels von 13 Chemokinen in der Lunge durch Multiplex-Bead-Array zeigen. (A) FSC/SSC-Gate wurde verwendet, um Perlen A und B mit unterschiedlicher Größe zu identifizieren. (B) Primäre Antikörper, die auf den Beads beschichtet waren, konnten durch die Fluoreszenzintensität im APC-Kanal unterschieden werden. (C) Der Chemokingehalt in der Probe war proportional zur Fluoreszenzintensität im PE-Kanal. Dargestellt sind repräsentative Diagramme von 12 C57BL/6J-Mäusen nach Scheinoperation. (D) Lungengewebe wurde 24 h nach tMCAO oder Scheinoperatio homogenisiert. Der Gehalt an 13 Chemokinen in den Lungen einzelner Tiere wurde mittels Multiplex-Perlenarray bestimmt. Die gezeigten Daten sind kombinierte Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten mit n = 11-12 Tieren pro Gruppe. *, P < 0,05; **, P < 0,01; , P < 0,001. NS, statistisch nicht anders. Teile der Abbildung wurden mit Genehmigung aus der zuvor veröffentlichten Literatur11 nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Antikörper | Klonen | Immunzelltyp | Bevölkerung | Ausdruck der Oberflächenmarkierung |
| CD45-FITC | 30-F11 | Alveloare Makrophagen | L1 | CD45+ Siglec F+ CD11b- |
| Siglec F-PE | E50-2440 | Eosinophile | L2 | CD45+ Siglec F+ CD11b+ |
| CD11c-Percp/Cy5.5 | N418 | CD103+ DCs | L3 | CD45+ Siglec F- CD11b- CD103+ CD11c+ MHC II+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 | CD11b+ DCs | L4 | CD45+ Siglec F- CD11b hallo CD103- CD64- MHC II+ |
| CD64-APC | X54-5/7.1 | Interstitielle Makrophagen | L5 | CD45+ Siglec F- CD11b hallo CD103- CD64+ MHC II+ |
| CD103-BV421 | 2E7 | |||
| MHC II-BV510 | M5/114.15.2 | |||
| Live/Dead-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | Monozyten/moDCs | L8 | CD45+ CD11b hallo Ly6C hallo/int CCR2+/- Ly6G- |
| Ly6C-PE | HK1,4 | Neutrophilen | L9 | CD45+ CD11b hallo Ly6C int CCR2- Ly6G+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 | |||
| CCR2-BV421 | SA203G11 | |||
| Ly6G-BV510 | 1A8 | |||
| Live/Dead-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | Plasmazytoide DCs | L6 | CD45+ B220+ CD11c+ |
| CD8-PE | 53-6.7 | B-Zellen | L7 | CD45+ B220+ CD11c- |
| NK1.1-Percp/Cy5.5 | PK136 | CD4+ T-Zellen | L10 | CD45+ B220- CD11c- CD4+ CD8- |
| CD11c-PE/Cy7 | N418 | CD8+ T-Zellen | L11 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8+ |
| APC-B220 | RA3-6B2 | NK-Zellen | L12 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb- |
| CD4-BV421 | GK1,5 | NKT-Zellen | L13 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb+ |
| TCRb-BV510 | H57-597 | |||
| Live/Dead-APC/Cy7 |
Tabelle 1: Oberflächenmarker und Antikörperkombinationen zur Bestimmung von Immunzellen, die nach tMCAO aus der Lunge isoliert wurden.
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Discussion
Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die Identifizierung von Lungenimmunzelltypen und die Expression von Chemokinen oder Zytokinen in derselben Maus. Wenn eine histopathologische Untersuchung gewünscht wird, kann ein einzelner Lappen zu diesem Zweck entfernt und fixiert werden, bevor mit den Einzelzellisolierungsschritten fortgefahren wird. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass dieser Ansatz in einigen Krankheitssituationen möglicherweise nicht geeignet ist, wenn die Veränderung der Immunzellzusammensetzung und die Expression von Chemokinen und / oder Zytokinen voraussichtlich ungleichmäßig zwischen verschiedenen Lungenlappen verteilt sind. Zum Beispiel zeigen einige Bakterien, wie Mycobacterium tuberculosis, eine Vorliebe für die Infektion bestimmter Lungenlappen21. In diesem Fall kann ein Vergleich zwischen Lappen erforderlich sein.
Die Konzentration, Inkubationszeit und Temperatur des Einzelzellisolierungsprotokolls aus der Lunge beeinflussen entscheidend die Erholung der Immunzellen aus der Lunge. Die Qualität der Kollagenase D ist entscheidend für die Erzielung optimaler Ergebnisse und sollte getestet werden, wenn eine andere Kollagenase-D-Quelle verwendet wird. Überverdauung der Gewebe führt zu einer Zunahme des Zelltods; während eine Unterverdauung der Gewebe eine geringe Ausbeute an Immunzellen, insbesondere Makrophagen und DCs, verursacht.
Wir verwendeten 3 Antikörperkombinationen, um 13 Immunzellpopulationen in der Lunge zu bestimmen, wobei jeder Satz 5-7 Antikörper und eine LIVE/DEAD-Färbung enthielt. Antikörper in jedem Satz können kombiniert werden, wenn die Anzahl der aus den Proben gewonnenen Zellen begrenzt ist. Ein großes Problem, das sich jedoch ergibt, wenn die Anzahl der Antikörper erhöht wird, ist, dass die Kompensation des Fluoreszenzsignals auf dem Durchflusszytometer eine Herausforderung darstellen kann, insbesondere bei der Unterscheidung von Zellen aus myeloischer Auskleidung unter entzündlichen Bedingungen. Zusätzliche Antikörpercocktails können verwendet werden, um andere angeborene Immunzellen innerhalb der Einzelzellsuspension zu identifizieren, wie angeborene lymphatische Zellen und γδ-T-Zellen, die zur Immunantwort in der Lunge beitragen22,23. Da ein Lungenlappen für das Multiplex-Array genommen wird, kann die genaue Anzahl jedes Zelltyps in der Lunge nicht endgültig bestimmt und verglichen werden, was eine Einschränkung dieser Methode darstellt. Um dies zu beheben, kann eine definierte Anzahl von Zellen aus der Lunge von Schein- und tMCAO-induzierten Mäusen isoliert werden. In diesem Fall kann die absolute Anzahl jedes Immunzelltyps zwischen den beiden Gruppen genau verglichen werden. Zudem lässt sich mit dieser Methode die Lokalisation der Immunzellen in der Lunge nicht bestimmen. Dies kann durch Immunhistochemie an Lungenabschnitten erreicht werden.
Zusammenfassend wurde dieses Protokoll verwendet, um die Wirkung eines ischämischen Schlaganfalls auf die pulmonale Immunität zu untersuchen, aber es kann auch verwendet werden, um andere Krankheitsmodelle wie Infektionen und Allergien zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss P20 GM109098 und das Innovation Award Program von Praespero an Edwin Wan unterstützt. Durchflusszytometrie-Experimente wurden in der WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility durchgeführt, die durch die NIH-Zuschüsse S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 und P20 GM103434 unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
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