Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van flowcytometrie om de veranderingen in de samenstelling van immuuncellen, het cytokineprofiel en het chemokineprofiel in de pulmonale omgeving te identificeren na voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader, een muizenmodel van ischemische beroerte.
Abstract
Immuuncelexpansie, activering en handel naar de longen, die worden gecontroleerd door de expressie van meerdere cytokines en chemokines, kunnen worden veranderd door ernstig hersenletsel. Dit blijkt uit het feit dat longontsteking een belangrijke doodsoorzaak is bij patiënten die hebben geleden aan ischemische beroerte. Het doel van dit protocol is om het gebruik van multicolor flowcytometrische analyse te beschrijven om 13 soorten immuuncellen in de longen van muizen te identificeren, waaronder alveolaire macrofagen, interstitiële macrofagen, CD103 + of CD11b + dendritische cellen (DC's), plasmacytoïde DC's, eosinofielen, monocyten / monocyten-afgeleide cellen, neutrofielen, lymfoïde afgeleide T- en B-cellen, NK-cellen en NKT-cellen, na ischemische beroerte-inductie door voorbijgaande midden cerebrale arterie occlusie. Bovendien beschrijven we de bereiding van longhomogenaten met behulp van een kraalhomogenisatiemethode, om de expressieniveaus van 13 verschillende cytokines of chemokines tegelijkertijd te bepalen door multiplex kralenarrays in combinatie met flowcytometrische analyse. Dit protocol kan ook worden gebruikt om de pulmonale immuunrespons in andere ziekte-instellingen te onderzoeken, zoals infectieuze longziekte of allergische ziekte.
Introduction
De longen zijn een barrièreorgaan, blootgesteld aan de externe omgeving en worden daarom voortdurend geconfronteerd met immunologische uitdagingen zoals pathogenen en allergenen1. De activering van long-residente immuuncellen en de infiltratie van immuuncellen uit de periferie zijn nodig om pathogenen uit de pulmonale omgeving te verwijderen. Bovendien behouden long-residente immuuncellen tolerantie voor commensale bacteriën, wat suggereert dat deze cellen een rol spelen bij de klaring van pathogenen en het handhaven van homeostase1. Alveolaire en interstitiële macrofagen behoren tot de long-residente schildwachtcellen die pathogenen detecteren via patroonherkenningsreceptoren en deze pathogenen verwijderen door fagocytose2. Long-residente dendritische cellen overbruggen de aangeboren en adaptieve immuunrespons door middel van antigeenpresentatie3. Bovendien produceren geactiveerde lokale aangeboren immuuncellen cytokines en chemokines die de ontstekingsreactie versterken en de infiltratie van immuuncellen zoals monocyten, neutrofielen en lymfocyten in de longen stimuleren1. Van ischemische beroerte is aangetoond dat het de systemische immuniteit wijzigt en leidt tot een verhoogde gevoeligheid voor longinfectie; weinig studies hebben echter het pulmonale compartiment geëvalueerd na ischemische beroerte, hoewel sommige studies het hebben onderzocht tijdens ontstekingsaandoeningen 4,5,6,7,8,9. Het doel van de hierin beschreven methoden is om tegelijkertijd de longpathologie, de samenstelling van immuuncellen en de niveaus van cytokine- en chemokine-expressie in de longen te bepalen om veranderingen in het pulmonale compartiment te evalueren en mogelijke veranderingen in de pulmonale immuunrespons na ischemische aanval te beoordelen.
Hier beschreven is een protocol voor het verkrijgen van eencellige suspensies uit de longen van de muizen om 13 soorten immuuncellen te identificeren. Dit protocol is gebaseerd op weefselvertering met collagenase D zonder de noodzaak van een geautomatiseerde weefseldissociator. Daarnaast hebben we een protocol ontwikkeld om weefselhomogenaten te bereiden die kunnen worden gebruikt om de expressieniveaus van 13 verschillende cytokines of chemokines te bepalen met behulp van op flowcytometrie gebaseerde multiplex kralenarrays. Dit protocol werd met succes gebruikt om de effecten van ischemische beroerte op pulmonale immuniteit te onderzoeken en kan ook in andere ziektemodellen worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle uitgevoerde protocollen en procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de West Virginia University. De muizen werden gehuisvest onder specifiek-pathogeenvrije omstandigheden in het vivarium aan de West Virginia University.
1. Bereiding van oplossingen
- Bereid perfusiebuffer (fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS). Gebruik ongeveer twee 10 ml aliquots ijskoude PBS per muis.
- Bereid longcelmedium/FACS-buffer voor. FACS-buffer bevat PBS aangevuld met 1% foetaal runderserum (FBS). Houd het medium koud gedurende het hele proces van longexcisie en -overdracht. Bereid ongeveer 8 ml per longmonster. Bereid verse medium/FACS-buffer voorafgaand aan de experimenten.
- Bereid dissociatiebuffer voor voor eencellige isolatie. Buffer bevat 1 mg/ml collagenase D en 200 μg/ml DNase I in hanks gebufferde zoutoplossing (HBSS). Bereid vers uit de stamoplossing (100 mg/ml collagenase D en 10 mg/ml DNase I) voorafgaand aan de experimenten. Ongeveer 6 ml per longmonster is nodig. Zorg ervoor dat de buffer voorafgaand aan het gebruik op kamertemperatuur komt.
- Bereid homogenisatiebuffer voor longweefselhomogenisatie voor. Buffer bevat PBS en 1x proteïnase en fosfataseremmer cocktail (voorraad = 100x). Bereid je fris voor op de experimenten. Houd de buffer koud tijdens het gehele homogenisatieproces. Ongeveer 200 μL van de buffer is voldoende voor het homogeniseren van een enkele rechterkwab van de longen.
2. Voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader (tMCAO)
OPMERKING: Procedures voor tMCAO via monofilamentinbrenging in de middelste hersenslagader werden eerder in detail gedocumenteerd10. In deze experimenten werden 8- tot 12 weken oude mannelijke C57BL / 6J-muizen, met een gewicht van 25-30 g, gebruikt.
- Kortom, subcutaan 2 mg/kg meloxicam toedienen aan de muizen vóór de operatie. Verdoof de muizen diep in een inductiekamer met behulp van 5% isofluraan. Bevestig diepe verdoving met behulp van de teenknijpmethode. Onderhoud anesthesie met 1-2% isofluraan tijdens de operatie met behulp van een neuskegel. Houd de lichaamstemperatuur gedurende de hele procedure op 36,5 - 38 °C door een warme deken onder de muizen te leggen. Alle chirurgische hulpmiddelen moeten een dag voorafgaand aan de operatie worden gesteriliseerd.
- Scheer en bereid de huid in de ventrale nek voor met 70% ethanol gevolgd door chloorhexidine scrub. Dien subcutaan 2 mg/kg bupivacaïne toe over het incisiegebied voordat de eerste incisie wordt gemaakt. Gebruik oogzalf om de ogen te bedekken om uitdroging te voorkomen. Maak een middenlijn nek incisie. Trek zachte weefsels voorzichtig opzij rond de luchtpijp.
- Identificeer de linker gemeenschappelijke halsslagader en de externe halsslagader.
- Breng een tijdelijke hechting (maat 6/0) aan op de gemeenschappelijke halsslagader om de bloedstroom te stoppen. Maak een incisie in de uitwendige halsslagader.
- Steek een met siliconenrubber gecoat monofilament (maat 6-0) in de externe halsslagader en breng het monofilament naar de middelste hersenslagader. Laat het monofilament gedurende 60 minuten in de middelste hersenslagader (occlusie).
- Controleer de snelheid van de bloedstroom met behulp van Laser Doppler Flowmetry. Een vermindering van de stroomsnelheid naar de middelste hersenslagader die > 80% is, duidt op een succesvolle occlusie.
- Verwijder na de 60 minuten occlusie het monofilament om de reperfusie te laten plaatsvinden. Sluit de incisie.
- Voer bij schijnmuizen stap 2.1-2.6 uit zonder het monofilament in te brengen. Bij deze muizen moet de bloedstroom tijdens de hele procedure stabiel blijven.
- Controleer de muizen dagelijks en meet de neurologische tekorten met behulp van standaard scoringscriteria11. 0 – geen neurologisch tekort; 1 – trekt contralaterale voorepaw in wanneer deze door de staart wordt opgetild; 2- cirkels naar de contralaterale wanneer opgetild door de staart; 3- vallen naar de contralaterale tijdens het lopen; 4 – loopt niet spontaan of is comateus; 5 – dood.
- Geef subcutane injecties van normale zoutoplossing en pijnstillend (meloxicam, 2 mg/kg) om de 24 uur gedurende 3 dagen na de operatie.
- Isoleer de longen 24 en 72 uur na tMCAO voor de stroomafwaartse analyse.
3. Het oogsten van de longweefsels
- Verdoof de muis diep door intraperitoneale (i.p.) injectie van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine. Bevestig diepe verdoving met behulp van de teenknijpmethode.
- Om de transcardiale perfusie van het hele lichaam uit te voeren12, pint u de muis vast aan het chirurgische platform en natte vacht met 70% ethanol om de bontverdeling in de lichaamsholte te verminderen. Gebruik een fijne dissectieschaar om een transversale incisie in de caudale buik te maken en vervolgens een middellijnincisie van het peritoneum, stoppend bij de thoracale holte voordat het diafragma wordt doorboord.
- Snijd niet door de spier/verberg je in de peritoneale holte en ga niet verder met incisiëren voorbij de buik.
- Stop de incisie zodra de thoracale holte is bereikt voordat het diafragma wordt doorboord. Zorg ervoor dat u het hart en de longen niet beschadigt, wat de perfusiekwaliteit of het celherstel in gevaar kan brengen
- Maak met behulp van een fijne dissectieschaar een middellijnincisie van het peritoneum die stopt bij de thoracale holte voordat het diafragma wordt doorboord.
- Grijp de muis bij het distale uiteinde van het borstbeen met behulp van een tang en til omhoog terwijl je door het middenrif snijdt, zeker dat het hart, de longen of de vasculatuur niet worden beschadigd. Zodra organen zichtbaar zijn, maakt u een incisie door de ribbenkast en scheidt u de ribcase en pint u deze terug, zodat het hart en de longen volledig worden blootgesteld.
- Maak voorzichtig een kleine incisie in het rechter atrium bij de aortaboog. Dit zal dienen als de uitstroom voor de perfusie.
- Plaats onmiddellijk daarna voorzichtig een naald van 25 G x 5/8 die is bevestigd aan een spuit gevuld met 10 ml koude PBS in het distale superieure oppervlak van de linker ventrikel. Zorg ervoor dat u niet via het ventrikelseptum in de rechterkamer inbrengt. Naald moet nauwelijks in de linker ventrikel worden ingebracht.
OPMERKING: Als ventrikelseptum wordt doorboord, zal vloeistof uit de neus van de muis stromen. Dit zal de perfusiekwaliteit verminderen en resulteren in celverlies. - Indien gewenst kan een klem worden gebruikt om de naald tijdens de perfusie stevig op zijn plaats te houden in de linker ventrikel.
- Duw gestaag maar voorzichtig 10 ml koude PBS in het hart. Muizenweefsel moet beginnen te doordringen en het bloed verwijderen als vloeistof uit het rechteratrium komt.
- Duw een tweede aliquot van 10 ml PBS totdat voldoende bloedklaring is opgetreden. Lever zal een lichtbruin uiterlijk hebben en longen zullen overgaan van een roodachtig roze naar meestal wit van kleur.
- Verwijder met behulp van een tang en een fijne dissectieschaar zorgvuldig alle omliggende weefsels, waaronder het hart, de luchtpijp, de slokdarm, de thymus, het bindweefsel, de lymfeklieren en de grote bronchialen.
- Scheid individuele longlobben en plaats de lobben in een petrischaal op ijs met een aliquot van 1-2 ml koud longcelmedium.
4. Homogenisatie van longweefsel voor multiplex kralenarrays met behulp van kraalhomogenisator
- Koel een conische schroefdopbuis van 2 ml met 3 steriele 2,3 mm zirkonia/silica kralen voor. Voeg 200 μL koude homogenisatiebuffer toe aan de buis.
- Weeg de lob, breng de lob over naar de voorgekoelde conische buis met de kralen en homogenisatiebuffer.
OPMERKING: Ongeveer 50-100 mg weefsel gehomogeniseerd in 200 μL buffer is voldoende voor het detecteren van cytokine- en chemokine-expressie in het monster.- Homogeniseer de lob met behulp van een op kralen gebaseerde homogenisator (zie Materiaaltabel) bij 4.000 tpm gedurende 2 minuten.
- Zorg ervoor dat het weefsel volledig gehomogeniseerd is. Verhoog de tijd indien nodig.
- Na homogenisatie centrifugeert u de buis in een voorgekoelde (4 °C) microcentrifuge bij 15.870 x g gedurende 3 minuten.
- Breng de supernatanten over in een voorgekoelde microbuis van 1,5 ml.
- Plaats het monster direct op ijs voor onmiddellijk gebruik of bewaar het monster bij -80 °C voor toekomstig gebruik. Vermijd meerdere vries-dooicycli.
5. Dissociatie van longweefsel en eencellige isolatie
- Giet het longcelmedium af van de resterende longlobben om verdunning van de dissociatiebuffer te voorkomen. Steek vervolgens voorzichtig een spuit van 1 ml met 25 G en 5/8 naald met 1 ml van de dissociatiebuffer in het longweefsel.
- Injecteer kleine fracties (ongeveer 1/4th tot 1/5th) van de dissociatiebuffer in elke longkwab en blaas voorzichtig op.
OPMERKING: Het grootste deel van de buffer zal snel na het opblazen naar buiten stromen omdat de lob is weggesneden. - Herhaal de injectie van dissociatiebuffer 1-2x.
- Incubeer de longlobben met dissociatiebuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Hak de longlobben fijn in kleine stukjes met een fijne dissectieschaar.
- Breng de gehakte longstukken met de dissociatiebuffer over in een centrifugebuis van 15 ml. Vul aan met extra dissociatiebuffer tot een totaal van 6 ml. Vortex krachtig gedurende 1 min.
- Incubeer het monster gedurende 45 minuten bij 37 °C. Vortex krachtig elke 7-8 min.
- Na 45 minuten incubatie, vortex het monster krachtig gedurende 1 min voor optimale resultaten.
- Dissocieer het monster verder door een celzeef van 100 μm te passeren om resterend, ongewenst bindweefsel en interstitieel weefsel te verwijderen.
- Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 380 x g en gooi het supernatant weg.
- Voeg 5 ml koud longcelmedium toe aan het monster. Resuspendeer de celpellet door zachte vortexing.
- Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 380 x g en gooi het supernatant weg.
- Voeg 1 ml koud longcelmedium toe. Resuspendeer de celpellet door zachte vortexing.
- Ga door een celzeef van 100 μm en tel cellen.
6. Flowcytometrische analyse voor de niche van de longimmuuncel
- Zaad 1-2 x 106 cellen/antilichaam in een 96 goed ronde bodemplaat (3 sets in totaal). Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 830 x g. Gooi supernatanten weg.
- Resuspendeer de celpellet in 50 μL koude PBS met fixeerbare levende/dode vlek. Bereid de vlek voor volgens de instructies van de fabrikant.
- Incubeer de cellen bij 4 °C gedurende 20 minuten beschermd tegen licht. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 830 x g. Gooi supernatanten weg.
- Resuspendeer de celpellet met 25 μL koude FACS-buffer met 5 μg/ml antimuis CD16/32-antilichaam. Incubeer bij 4 °C gedurende 10-15 min.
- Voeg 25 μL koude FACS-buffer met antilichaamcombinaties vermeld in tabel 1 toe aan de cellen. Meng door zachtjes te pipetteren.
OPMERKING: Het totale volume van de FACS-buffer voor de antilichaamkleuring is 50 μL. Daarom moet bij het bereiden van een hoofdmix van antilichamen in 25 μL de concentratie antilichamen het dubbele zijn van de uiteindelijke concentratie. - Incubeer de cellen bij 4 °C gedurende 20 minuten beschermd tegen licht. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 830 x g. Gooi supernatanten weg.
- Resuspendeer de cellen met 100 μL koude FACS-buffer. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 830 x g. Gooi supernatanten weg.
- Resuspendeer de cellen met 100 μL koude FACS-buffer. Breng over naar een polystyreen facs-buis met ronde bodem van 5 ml met 150 μL extra FACs-buffer. Analyseer het monster onmiddellijk met behulp van een flowcytometer.
OPMERKING: Met celfixatie met behulp van de volgende stappen kunnen monsters later worden geanalyseerd. - Na stap 6.7 resuspensie het monster met 100 μL 1% paraformaldehyde in PBS.
- Incubeer het monster bij 4 °C gedurende 15 minuten beschermd tegen licht. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 830 x g. Gooi supernatanten weg.
- Resuspendeer de cellen met 100 μL koude FACS-buffer. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 830 x g. Gooi supernatanten weg.
- Resuspendeer de cellen met 100 μL koude FACS-buffer. Bewaar de cellen bij 4 °C, beschermd tegen licht. Analyseer het monster binnen 72 uur.
7. Multiplex kralenarrays voor cytokine- en chemokinedetectie
OPMERKING: Commercieel verkrijgbare pro-inflammatoire chemokine- en ontstekingsmultiplexpanelen (zie tabel met materialen) werden gebruikt om de expressie van chemokines en cytokines in de longen te bepalen na tMCAO-inductie volgens het fabrikantprotocol, dat in detail is beschreven13.
- Kortom, ontdooi de analyten op ijs als ze na weefselhomogenisatie bij -80 °C zijn bewaard. Centrifugeer het monster bij 590 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C voor gebruik om eventueel achtergebleven weefsel te verwijderen.
- Genereer een standaardcurve door de standaardcocktail (C7) met een bekende concentratie van 10 ng / ml serieel te verdunnen in 7 normen (C1-6), waarbij de laatste standaard alleen de testbuffer (C0) is.
- Zodra alle reagentia tot kamertemperatuur zijn opgewarmd, voegt u 25 μL van elke standaard en 25 μL testbuffer toe aan een V-bodemplaat van 96 put.
- Voeg aan elke monsterput 25 μL longhomogenaat (analyt) en 25 μL testbuffer toe aan een V-bodemplaat van 96 put
- Vortex de voorgecoate kralen krachtig en voeg vervolgens 25 μL voorgecoate kralen toe aan elk van de standaard- en monsterputten.
- Sluit de plaat af en bescherm tegen licht door af te dekken met folie. Schud de plaat op 110 rpm gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer bij 230 x g gedurende 5 min. Voeg 200 μL wasbuffer toe bij 1x (stockoplossing is 20x, verdun tot 1x met water). Incubeer gedurende 1 min.
- Centrifugeer bij 230 x g gedurende 5 min. Resuspendeer de standaard en het monster met 25 μL detectieantistoffen.
- Sluit de plaat af en bedek deze om te beschermen tegen licht. Schud de plaat bij 110 tpm gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Voeg 25 μL streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) toe aan elke standaard en monster goed.
- Sluit de plaat af en bedek deze om te beschermen tegen licht. Schud bij 110 rpm gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
- Draai de plaat op 230 x g gedurende 5 min. Resuspendeer de standaard en monsters in 1x wasbuffer.
- Breng over in een goed gelabelde polystyreen ronde bodem FACS-buis met een extra 150 μL 1x wasbuffer.
- Bepaal de fluorescentie-intensiteit van het PE-signaal voor de normen en monsters met behulp van een flowcytometer.
- Construeer een standaardcurve voor elke chemokine en cytokine met behulp van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van PE tegen de vooraf bepaalde concentraties.
- Bepaal de concentratie van elke chemokine en cytokine met behulp van de standaardcurve en de MFI van elk monster. Het multiplexpaneel biedt data-analysesoftware die kan worden gebruikt om de concentratie van elke analyt te bepalen. Het gewicht van de apicale/superieure kwab wordt gebruikt om de concentratie cytokines of chemokine per milligram weefsel te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben onlangs gemeld dat ischemische beroerte-inductie bij muizen de immuuncelsamenstelling van de longen verandert11. In het bijzonder verhoogde voorbijgaande cerebrale ischemie de percentages van alveolaire macrofagen, neutrofielen en CD11b + DC's, terwijl de percentages CD4 + T-cellen, CD8 + T-cellen, B-cellen, NK-cellen en eosinofielen in het pulmonale compartiment afnamen. Bovendien kwam cellulaire verandering overeen met significant verminderde niveaus van meerdere chemokines in de longen. Hier wordt een methode beschreven voor de isolatie en identificatie van verschillende immuuncelpopulaties in het pulmonale compartiment. Representatieve resultaten die hier werden getoond, waren van muizen die tMCAO-inductie en een schijnoperatie hadden ondergaan.
We identificeerden 13 verschillende populaties van immuuncellen in de longen (L1-L13) met behulp van 3 sets antilichaamcombinaties waarbij elke set 5-7 antilichamen bevatte (figuur 1). Dode cellen werden uitgesloten met behulp van een LIVE /DEAD-vlek in elke set. Antilichamen en markers voor het onderscheiden van verschillende immuunceltypen zijn vermeld in tabel 1. Alveolaire en interstitiële macrofagen, CD103+ DC's, CD11b+ DC's en eosinofielen werden geïdentificeerd in Set 1 (Figuur 1A,B). Pro-inflammatoire monocyten en neutrofielen werden geïdentificeerd in set 2 (figuur 1C). Tijdens ontstekingsreacties migreren monocyten naar de plaats van ontsteking, waar deze cellen differentiëren in van monocyten afgeleide antigeen presenterende cellen (mo-APC's)14. Downregulatie van Ly6C en CCR2 zijn kenmerkend voor monocytendifferentiatie, die kan worden geëvalueerd met behulp van Set 215. CD4+ T-cellen, CD8+ T-cellen, B-cellen, plasmacytoïde DC's, NK-cellen en NKT-cellen werden geïdentificeerd met behulp van Set 3 (figuur 1D).
Om de kwaliteit van ons eencellige isolatieprotocol te bepalen, vergeleken we het aantal levensvatbare cellen en CD45+ immuuncellen geïsoleerd met behulp van de handmatige methode met de cellen geïsoleerd met behulp van een in de handel verkrijgbare weefseldissociator (zie Tabel van materialen), die vaak wordt gebruikt om cellen te isoleren uit weefsels 16,17,18,19,20 . In het laatste protocol werden longlobben overgebracht naar een dissociatorspecifieke buis (zie Tabel van materialen) na injectie van de dissociatiebuffer en werd het weefsel verteerd met behulp van het 37C_m_LDK_1-programma. Het totale aantal levensvatbare cellen, het percentage CD45+-cellen en het totale aantal verkregen CD45+-cellen waren vergelijkbaar tussen de twee methoden (figuur 2A-C). Het percentage celdood onder CD45+ cellen met beide protocollen was ~ 10% (figuur 2D). Deze resultaten suggereren dat het hier gepresenteerde protocol celherstel met een hoge opbrengst en kwaliteit mogelijk maakt zonder de hulp van een geautomatiseerde weefseldissociator.
Een in de handel verkrijgbare multiplextest in combinatie met flowcytometrische analyse werd gebruikt om de concentratie van 13 chemokines te bepalen met behulp van 25 μL monster (figuur 3). Twee verschillende maten kralen werden voor het eerst geïdentificeerd door FSC/SSC (figuur 3A). Elke kraal is bedekt met 6-7 primaire antilichamen, die kunnen worden onderscheiden door fluorescentie-intensiteit in het APC-kanaal (figuur 3B). Het niveau van chemokines in het monster is evenredig met de fluorescentie-intensiteit in het PE-kanaal, die kan worden bepaald door MFI (figuur 3C). Door de MFI-waarde van elke chemokine te vergelijken met de standaardcurve geconstrueerd met bekende concentraties chemokine, kan de concentratie in het monster (per mg weefsel) worden bepaald.
Figuur 1: Identificatie van 13 immuunceltypen uit de longen na weefselvertering met collagenase D na ischemische beroerte. Longweefsels werden 24 uur na tMCAO of schijnoperatie weggesneden, immuuncellen in de longen werden geanalyseerd met flowcytometrie, gedefinieerd door oppervlaktemarkers vermeld in tabel 1. (A) In antilichaamset 1 werden CD45+ levensvatbare cellen (*) eerst op Siglec F en CD11b geplaatst om de alveolaire macrofagen (L1) te identificeren, die CD11c en MHC II tot expressie brachten, en eosinofielen (L2), die geen CD11c en MHC II tot expressie brachten. (B) Cellen binnen de Siglec F-populatie (**) in A werden vervolgens afgesloten om de expressie van CD103 en CD11b te bepalen. CD103+ CD11b- (***). Cellen werden verder afgeschermd om de expressie van CD11c en MHC II te bepalen. CD103+ DC's drukten zowel CD11c als MHC II (L3) uit, maar drukten CD64 niet uit. De CD11b hi populatie (****) werd verder afgesloten om de expressie van CD64 en MHC II te bepalen. CD11b+ DC's drukten MHC II uit, maar niet CD64 (L4), terwijl interstitiële macrofagen (L5) beide markers tot expressie brachten. (C) In antilichaamset 2 werden CD45+ levensvatbare cellen in A afgesloten om de expressie van CD11b en Ly6C te bepalen. Ly6C hi-cellen (*) vertegenwoordigden de ongedifferentieerde monocyten die een hoog niveau van CCR2-expressie handhaafden (L6, middelste plot), terwijl Ly6C-lage cellen (**) een gemengde populatie van differentiërende monocyten bevatten die Ly6G- (L6, rechterplot) en Ly6G + neutrofielen (L7) waren. (D) In antilichaamset 3 werden CD45+ levensvatbare cellen in A afgesloten om de expressie van CD11c en B220 te bepalen om B-cellen (L8) en plasmacytoïde DC's (L9) te identificeren. De CD11c- en B220-populatie (*) werd vervolgens afgesloten om de expressie van CD4 en CD8 te bepalen om CD4+ T-cellen (L10) en CD8+ T-cellen (L11) te identificeren. De CD4-CD8-populatie (**) werd verder afgesloten om de expressie van NK1.1 en TCRb te bepalen om NK-cellen (L12) en NKT-cellen (L13) te identificeren. Getoond zijn representatieve plots van 12 C57BL/6J muizen na tMCAO en sham operatie. Delen van de figuur zijn met toestemming herdrukt uit eerder gepubliceerde literatuur11 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking tussen handmatige dissociatiemethode en het gebruik van weefseldissociator voor het isoleren van afzonderlijke cellen uit de longen. (A-C) Het totale aantal cellen, het percentage CD45+ cellen en het totale aantal CD45+ cellen werden vergeleken. Getoond zijn gecombineerde resultaten van 3 onafhankelijke experimenten. NS: niet statistisch significant. (D) Representatieve waarnemingspunten om het percentage dode CD45+-cellen na isolatie te bepalen. Getoond zijn representatieve plots uit 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Ischemische beroerte onderdrukt de productie van meerdere chemokines in de longen. (A-C) Representatieve percelen die de bepaling van het niveau van 13 chemokines in de longen laten zien door multiplex bead array. (A) FSC/SSC gate werd gebruikt om kralen A en B met verschillende grootte te identificeren. (B) Primaire antilichamen die op de kralen zijn gecoat, kunnen worden onderscheiden door fluorescentie-intensiteit in het APC-kanaal. (C) Het niveau van chemokines in het monster was evenredig met de fluorescentie-intensiteit in het PE-kanaal. Getoond zijn representatieve plots van 12 C57BL/6J muizen na schijnoperatie. (D) Longweefsels werden 24 uur gehomogeniseerd na tMCAO of sham operatio. Het niveau van 13 chemokines in de longen van individuele dieren werd bepaald door multiplex bead array. De getoonde gegevens zijn gecombineerde resultaten van drie onafhankelijke experimenten met n = 11-12 dieren per groep. *, P < 0,05; **, P < 0,01; , P < 0,001. NS, niet statistisch verschillend. Delen van de figuur zijn met toestemming herdrukt uit eerder gepubliceerde literatuur11 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Antistof | Kloon | Immuunceltype | Bevolking | Expressie van oppervlaktemarkeringen |
| CD45-FITC | 30-F11 | Alveloaire macrofagen | L1 | CD45 + Siglec F + CD11b- |
| Siglec F-PE | E50-2440 | Eosinofielen | L2 | CD45 + Siglec F + CD11b + |
| CD11C-Percp/Cy5.5 | N418 | CD103+ DC's | L3 | CD45 + Siglec F- CD11b- CD103 + CD11C + MHC II + |
| CD11B-PE/Cy7 | m1/70 | CD11b+ DC's | L4 | CD45 + Siglec F- CD11b hi CD103- CD64- MHC II + |
| CD64-APC | x54-5/7.1 | Interstitiële macrofagen | L5 | CD45 + Siglec F- CD11b hi CD103- CD64 + MHC II + |
| cd103-bv421 | 2e7 | |||
| MHC II-BV510 | m5/114,15,2 | |||
| Levend/dood-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | Monocyten/moDC's | L8 | CD45 + CD11b hi Ly6C hi / int CCR2 + / - Ly6G- |
| Ly6C-PE | HK1,4 | Neutrofielen | L9 | CD45 + CD11b hi Ly6C int CCR2- Ly6G + |
| CD11B-PE/Cy7 | m1/70 | |||
| CCR2-BV421 | SA203G11 | |||
| Ly6G-BV510 | 1a8 | |||
| Levend/dood-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | Plasmacytoïde DC's | L6 | CD45 + B220 + CD11C + |
| CD8-PE | 53-6.7 | B-cellen | L7 | CD45 + B220 + CD11C- |
| NK1.1-Percp/Cy5.5 | PK136 | CD4+ T-cellen | L10 | CD45 + B220- CD11C- CD4 + CD8- |
| CD11C-PE/Cy7 | N418 | CD8+ T-cellen | L11 | CD45 + B220- CD11C- CD4- CD8 + |
| APC-B220 | RA3-6B2 | NK-cellen | L12 | CD45 + B220- CD11C- CD4- CD8- NK1.1 + TCRb- |
| cd4-bv421 | GK1,5 | NKT-cellen | L13 | CD45 + B220- CD11C- CD4- CD8- NK1.1 + TCRb + |
| TcRb-BV510 | H57-597 | |||
| Levend/dood-APC/Cy7 |
Tabel 1: Oppervlaktemarkers en antilichaamcombinaties voor het bepalen van immuuncellen geïsoleerd uit de longen na tMCAO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven protocollen maken de identificatie van longimmuunceltypen en de expressie van chemokines of cytokines in dezelfde muis mogelijk. Als een histopathologisch onderzoek gewenst is, kan een individuele kwab voor dat doel worden verwijderd en gefixeerd voordat wordt overgegaan tot de isolatiestappen van één cel. Een beperking van deze methode is dat deze aanpak mogelijk niet geschikt is in sommige ziekteomgevingen als de verandering in de samenstelling van de immuuncellen en de expressie van chemokines en / of cytokines naar verwachting ongelijk verdeeld zijn over verschillende lobben van de longen. Sommige bacteriën, zoals Mycobacterium tuberculosis, vertonen bijvoorbeeld een voorliefde voor het infecteren van bepaalde longlobben21. In dit geval kan een vergelijking tussen lobben nodig zijn.
De concentratie, incubatietijd en temperatuur van het eencellige isolatieprotocol uit de longen hebben een kritische invloed op het herstel van de immuuncellen uit de longen. De kwaliteit van collagenase D is van cruciaal belang voor het verkrijgen van optimale resultaten en moet worden getest als een andere bron van collagenase D wordt gebruikt. Oververtering van de weefsels resulteert in een toename van celdood; terwijl ondervertering van de weefsels een lage opbrengst van immuuncellen veroorzaakt, met name macrofagen en DC's.
We gebruikten 3 antilichaamcombinaties om 13 immuuncelpopulaties in de longen te bepalen, waarbij elke set 5-7 antilichamen en een LIVE / DEAD-vlek bevatte. Antilichamen in elke set kunnen worden gecombineerd als het aantal cellen dat uit de monsters wordt verkregen, beperkt is. Een belangrijk probleem dat zich echter voordoet wanneer het aantal antilichamen wordt verhoogd, is dat de compensatie van het fluorescentiesignaal op de flowcytometer een uitdaging kan zijn, vooral bij het onderscheiden van cellen van myeloïde linage onder inflammatoire omstandigheden. Aanvullende antilichaamcocktails kunnen worden gebruikt om andere aangeboren immuuncellen in de eencellige suspensie te identificeren, zoals aangeboren lymfoïde cellen en γδ T-cellen, die bijdragen aan de immuunrespons in de longen22,23. Aangezien één kwab van de long wordt genomen voor de multiplexarray, kan het exacte aantal van elk celtype in de longen niet definitief worden bepaald en vergeleken, en dit vormt een beperking van deze methode. Om dit aan te pakken, kan een bepaald aantal cellen worden geïsoleerd uit de longen van schijn- en tMCAO-geïnduceerde muizen. In dit geval kan het absolute aantal van elk immuunceltype nauwkeurig worden vergeleken tussen de twee groepen. Bovendien laat deze methode niet toe om de lokalisatie van de immuuncellen in de long te bepalen. Dit kan worden bereikt door immunohistochemie uit te voeren op longsecties.
Kortom, dit protocol werd gebruikt om het effect van ischemische beroerte op pulmonale immuniteit te onderzoeken, maar het kan ook worden gebruikt om andere ziektemodellen te bestuderen, zoals infectie en allergieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie P20 GM109098 en het Innovation Award-programma van Praespero tot Edwin Wan. Flow Cytometry experimenten werden uitgevoerd in de WVU Flow Cytometry &Single Cell Core Facility, die wordt ondersteund door NIH-subsidies S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 en P20 GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
