Summary
Denne protokol beskriver brugen af flowcytometri til at identificere ændringerne i immuncellesammensætning, cytokinprofil og kemokinprofil i lungemiljøet efter forbigående mellem cerebral arterieokklusion, en murinmodel af iskæmisk slagtilfælde.
Abstract
Immuncelleudvidelse, aktivering og handel med lungerne, som styres ved ekspression af flere cytokiner og kemokiner, kan ændres ved alvorlig hjerneskade. Dette fremgår af, at lungebetændelse er en væsentlig årsag til dødelighed hos patienter, der har lidt af iskæmisk slagtilfælde. Målet med denne protokol er at beskrive brugen af flerfarvet flowcytometrisk analyse til at identificere 13 typer immunceller i lungerne hos mus, herunder alveolære makrofager, interstitielle makrofager, CD103+ eller CD11b+ dendritiske celler (DC'er), plasmacytoid DC'er, eosinofiler, monocytter / monocytafledte celler, neutrofiler, lymfoidafledte T- og B-celler, NK-celler og NKT-celler efter iskæmisk slagtilfælde induktion ved forbigående mellem cerebral arterieokklusion. Desuden beskriver vi fremstillingen af lungehomogenater ved anvendelse af en perlehomogeniseringsmetode til bestemmelse af ekspressionsniveauer for 13 forskellige cytokiner eller kemokiner samtidigt ved multiplexperlearrays kombineret med flowcytometrisk analyse. Denne protokol kan også bruges til at undersøge det pulmonale immunrespons i andre sygdomsindstillinger, såsom infektiøs lungesygdom eller allergisk sygdom.
Introduction
Lungerne er et barriereorgan, der udsættes for det ydre miljø og derfor konstant modtager immunologiske udfordringer som patogener og allergener1. Aktiveringen af lungeboende immunceller og infiltration af immunceller fra periferien er nødvendig for at fjerne patogener fra lungemiljøet. Derudover opretholder lungeboende immunceller tolerance over for kommensale bakterier, hvilket tyder på, at disse celler spiller en rolle i patogenclearance og opretholder homeostase1. Alveolære og interstitielle makrofager er blandt de lunge-residente sentinelimmunceller, der sanser patogener via mønstergenkendelsesreceptorer og rydder disse patogener ved fagocytose2. Lunge-residente dendritiske celler bygger bro over det medfødte og adaptive immunrespons gennem antigenpræsentation3. Derudover producerer aktiverede lokale medfødte immunceller cytokiner og kemokiner, der forstærker det inflammatoriske respons og stimulerer infiltrationen af immunceller såsom monocytter, neutrofiler og lymfocytter i lungerne1. Iskæmisk slagtilfælde har vist sig at ændre systemisk immunitet og føre til øget modtagelighed for lungeinfektion; få undersøgelser har dog evalueret lungerummet efter iskæmisk slagtilfælde, selvom nogle undersøgelser har undersøgt det under inflammatoriske tilstande 4,5,6,7,8,9. Målet med de metoder, der er beskrevet heri, er samtidig at bestemme lungepatologi, immuncellesammensætning og niveauerne af cytokin og kemokinekspression i lungerne for at evaluere ændringer i lungerummet og vurdere potentielle ændringer i det pulmonale immunrespons efter iskæmisk angreb.
Beskrevet her er en protokol til opnåelse af enkeltcellesuspensioner fra musenes lunger for at identificere 13 typer immunceller. Denne protokol er baseret på vævsfordøjelse med collagenase D uden behov for en automatiseret vævsdissociator. Derudover udviklede vi en protokol til fremstilling af vævshomogenater, der kan bruges til at bestemme ekspressionsniveauer for 13 forskellige cytokiner eller kemokiner ved hjælp af flowcytometribaserede multiplexperlearrays. Denne protokol blev med succes brugt til at undersøge virkningerne af iskæmisk slagtilfælde på lungeimmunitet og kan også bruges i andre sygdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller og procedurer, der blev udført, blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved West Virginia University. Musene blev anbragt under specifikke patogenfrie forhold i vivarium ved West Virginia University.
1. Fremstilling af opløsninger
- Forbered perfusionsbuffer (phosphatbufferet saltvand, PBS). Brug ca. to 10 ml alikvoter iskold PBS pr. mus.
- Forbered lungecelle medium / FACS buffer. FACS-buffer indeholder PBS suppleret med 1 % føtalt bovint serum (FBS). Hold mediet koldt for hele processen med lungeudskæring og overførsel. Forbered ca. 8 ml pr. Lungeprøve. Forbered frisk medium/FACS-buffer forud for forsøgene.
- Forbered dissociationsbuffer til enkeltcelleisolering. Buffer indeholder 1 mg/ml collagenase D og 200 μg/ml DNase I i Hanks bufferopløsning (HBSS). Der fremstilles frisk fra stamopløsningen (100 mg/ml collagenase D og 10 mg/ml DNase I) inden forsøgene. Der er behov for ca. 6 ml pr. lungeprøve. Sørg for, at bufferen når stuetemperatur inden brug.
- Forbered homogeniseringsbuffer til homogenisering af lungevæv. Buffer indeholder PBS og 1x proteinase og fosfatasehæmmer cocktail (lager = 100x). Frisk forbered dig inden forsøgene. Hold bufferen kold under hele homogeniseringsprocessen. Ca. 200 μL af bufferen er tilstrækkelig til homogenisering af en enkelt højre lobe af lungerne.
2. Forbigående mellem cerebral arterie okklusion (tMCAO)
BEMÆRK: Procedurer for tMCAO via monofilamentindsættelse i den midterste cerebrale arterie blev dokumenteret detaljeret tidligere10. I disse forsøg blev der anvendt 8- til 12 uger gamle C57BL/6J-hanmus, der vejer 25-30 g.
- Kort sagt, subkutant administrere 2 mg / kg meloxicam til musene før operationen. Bedøv musene dybt i et induktionskammer ved hjælp af 5% isofluran. Bekræft dyb bedøvelse ved hjælp af tåspidsmetoden. Oprethold anæstesi med 1-2% isofluran under operationen ved hjælp af en næsekegle. Hold kropstemperaturen på 36,5 - 38 °C under hele proceduren ved at placere et varmt tæppe under musene. Alle kirurgiske værktøjer skal autoklavesiliseres en dag før operationen.
- Barber og forbered huden på den ventrale hals ved hjælp af 70% ethanol efterfulgt af klorhexidinskrubbe. Subkutant administrere 2 mg/kg bupivacain over snitområdet, før det første snit foretages. Brug øjensalve til at dække øjnene for at forhindre tørhed. Lav et midterlinje halssnit. Træk forsigtigt blødt væv til side omkring luftrøret.
- Identificer den venstre almindelige halspulsåre og den eksterne halspulsåre.
- Påfør en midlertidig sutur (størrelse 6/0) på den fælles halspulsåre for at dæmme op for blodstrømmen. Lav et snit i den ydre halspulsåre.
- Indsæt et silikonegummibelagt monofilament (størrelse 6-0) i den ydre halspulsåre, og skub derefter monofilamentet til den midterste cerebrale arterie. Lad monofilamentet være i den midterste cerebrale arterie i 60 minutter (okklusion).
- Overvåg blodgennemstrømningen ved hjælp af Laser Doppler Flowmetry. En reduktion i strømningshastigheden til den midterste cerebrale arterie, der er > 80%, indikerer en vellykket okklusion.
- Efter 60 minutters okklusion skal du fjerne monofilamentet for at give mulighed for, at reperfusionen kan forekomme. Luk snittet.
- I skin-opererede mus skal du udføre trin 2.1-2.6 uden indsættelse af monofilamentet. I disse mus skal blodgennemstrømningen forblive stabil under hele proceduren.
- Overvåg musene dagligt og mål de neurologiske underskud ved hjælp af standard scoringskriterier11. 0 – intet neurologisk underskud; 1 - trækker kontralateral forpote, når den løftes af halen; 2- cirkler til det kontralaterale, når de løftes af halen; 3- falder til det kontralaterale, mens du går; 4 – går ikke spontant eller er komatøs; 5 – død.
- Giv subkutane injektioner af normalt saltvand og smertestillende middel (meloxicam, 2 mg/kg) hver 24. time i 3 dage efter operationen.
- Lungerne isoleres 24 og 72 timer efter tMCAO til downstream-analysen.
3. Høst af lungevæv
- Bedøv musen dybt ved intraperitoneal (i.p.) injektion af 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin. Bekræft dyb bedøvelse ved hjælp af tåspidsmetoden.
- For at udføre hele kroppens transkardieperfusion12 skal du fastgøre musen til den kirurgiske platform og våd pels med 70% ethanol for at reducere pelsfordelingen i kropshulen. Brug fin dissektionssaks til at lave et tværgående snit i den kaudale mave og derefter et midterlinjesnit i peritoneum, der stopper ved brysthulen, inden membranen gennembores.
- Skær ikke gennem musklen / skjul ind i bughulen og fortsæt ikke snit forbi maven.
- Stop snittet, så snart brysthulen er nået, før membranen punkteres. Pas på ikke at beskadige hjerte og lunger, hvilket kan kompromittere perfusionskvaliteten eller cellegendannelsen
- Brug af fine dissektionssakse gør et midterlinje snit af peritoneum stopper ved brysthulen før piercing membranen.
- Tag fat i musen ved den distale ende af brystbenet ved hjælp af tang og løft opad, mens du skærer gennem membranen, hvilket er sikkert ikke at beskadige hjertet, lungerne eller vaskulaturen. Når organerne er synlige, foretages et snit gennem brystkassen og adskilles og fastgøres ribbenkassen, så hjertet og lungerne er helt udsatte.
- Lav forsigtigt et lille snit i højre atrium nær aortabuen. Dette vil tjene som udstrømningen for perfusionen.
- Umiddelbart efter indsættes forsigtigt en 25 G x 5/8 nål fastgjort til en sprøjte fyldt med 10 ml kold PBS i den distale overlegne overflade af venstre ventrikel. Pas på ikke at indsætte gennem ventrikulær septum i højre ventrikel. Nålen skal næppe indsættes i venstre ventrikel.
BEMÆRK: Hvis ventrikulær septum er gennemboret, vil væske skynde sig ud fra musens næse. Dette vil reducere perfusionskvaliteten og resultere i celletab. - Hvis det ønskes, kan en klemme bruges til at holde nålen sikkert på plads i venstre ventrikel under perfusionen.
- Skub støt, men forsigtigt 10 ml kold PBS ind i hjertet. Musevæv skal begynde at gennemstå og rydde blodet, når væske kommer ud fra højre atrium.
- Skub en anden aliquot på 10 ml PBS, indtil der er sket tilstrækkelig blodclearance. Leveren vil have et lysebrunt udseende, og lungerne vil overgå fra en rødlig pink til for det meste hvid i farve.
- Brug pincet og fin dissektionssaks til forsigtigt at fjerne alle omgivende væv, herunder hjerte, luftrør, spiserør, thymus, bindevæv, lymfeknuder og store bronchialer.
- Adskil individuelle lungelober og læg lapperne i en petriskål på is indeholdende en 1-2 ml aliquot koldt lungecellemedium.
4. Homogenisering af lungevæv til multiplexperlearrays ved hjælp af perlehomogenisator
- Forkøl et 2 ml konisk skruelågrør indeholdende 3 sterile 2,3 mm zirkonia/silicaperler. Der tilsættes 200 μL kold homogeniseringsbuffer til røret.
- Vej loben, overfør loben til det forkølede koniske rør indeholdende perlerne og homogeniseringsbufferen.
BEMÆRK: Ca. 50-100 mg væv homogeniseret i 200 μL buffer vil være tilstrækkeligt til påvisning af cytokin og kemokinekspression i prøven.- Homogeniser loben ved hjælp af en perlebaseret homogenisator (se materialetabel) ved 4.000 o / min i 2 min.
- Sørg for, at vævet er fuldstændigt homogeniseret. Forøg tiden, hvis det er nødvendigt.
- Efter homogenisering centrifugeres røret i en forkølet mikrocentrifuge (4 °C) ved 15.870 x g i 3 minutter.
- Overfør supernatanterne til et forkølet 1,5 ml mikrorør.
- Prøven anbringes direkte på is til øjeblikkelig brug, eller prøven opbevares ved -80 °C med henblik på fremtidig brug. Undgå flere fryse-optøningscyklusser.
5. Lungevævsdissociation og enkeltcelleisolering
- Hæld lungecellemediet af de resterende lungelober for at undgå fortynding af dissociationsbufferen. Indsæt derefter forsigtigt en 1 ml sprøjte med 25G og 5/8 nål indeholdende 1 ml dissociationsbuffer i lungevæv.
- Injicer små fraktioner (ca. 1/4th til 1/5th) af dissociationsbufferen i hver lungelap og oppust forsigtigt.
BEMÆRK: Det meste af bufferen skynder sig ud kort efter oppustning, da loben er blevet udskåret. - Gentag injektionen af dissociationsbuffer 1-2x.
- Inkuber lungeloberne med dissociationsbuffer i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Hak lungelapperne fint i små stykker ved hjælp af fine dissektionssakse.
- Overfør de hakkede lungestykker med dissociationsbufferen til et 15 ml centrifugerør. Suppler med yderligere dissociationsbuffer til i alt 6 ml. Vortex kraftigt i 1 min.
- Prøven inkuberes i 45 minutter ved 37 °C. Vortex kraftigt hvert 7-8 min.
- Efter 45 minutters inkubation hvirvel prøven kraftigt i 1 minut for optimale resultater.
- Yderligere dissociere prøven ved at passere gennem en 100 μm cellesi for at fjerne resterende, uønsket bindevæv og interstitielt væv.
- Prøven centrifugeres i 10 minutter ved 380 x g, og supernatanten kasseres.
- Der tilsættes 5 ml koldt lungecellemedium til prøven. Resuspend cellepillen ved blid hvirvelning.
- Prøven centrifugeres i 10 minutter ved 380 x g, og supernatanten kasseres.
- Tilsæt 1 ml koldt lungecellemedium. Resuspend cellepillen ved blid hvirvelning.
- Pass gennem en 100 μm cellesi, og tæl celler.
6. Flowcytometrisk analyse for lungeimmuncelleniche
- Frø 1-2 x 106 celler/antistof sat i en 96 godt rund bundplade (3 sæt i alt). Cellerne centrifugeres i 3 minutter ved 830 x g. Kassér supernatanter.
- Cellepillen resuspenderes i 50 μL kold PBS indeholdende fikserbar levende/død plet. Forbered pletten i henhold til producentens anvisninger.
- Cellerne inkuberes ved 4 °C i 20 minutter beskyttet mod lys. Cellerne centrifugeres i 3 minutter ved 830 x g. Kassér supernatanter.
- Cellepillen resuspenderes med 25 μL kold FACS-buffer indeholdende 5 μg/ml antimuse-CD16/32-antistof. Inkuberes ved 4 °C i 10-15 min.
- Der tilsættes 25 μL kold FACS-buffer indeholdende antistofkombinationer, der er anført i tabel 1 , til cellerne. Bland ved blid pipettering.
BEMÆRK: Det samlede volumen af FACS-buffer til antistoffarvningen er 50 μL. Derfor bør koncentrationen af antistoffer være dobbelt så stor som den endelige koncentration, når der fremstilles en masterblanding af antistoffer i 25 μL. - Cellerne inkuberes ved 4 °C i 20 minutter beskyttet mod lys. Cellerne centrifugeres i 3 minutter ved 830 x g. Kassér supernatanter.
- Resuspender cellerne med 100 μL kold FACS-buffer. Cellerne centrifugeres i 3 minutter ved 830 x g. Kassér supernatanter.
- Resuspender cellerne med 100 μL kold FACS-buffer. Overfør til et polystyren rundbundet 5 ml FACS-rør indeholdende 150 μL yderligere FACS-buffer. Analyser prøven straks ved hjælp af et flowcytometer.
BEMÆRK: Cellefiksering ved hjælp af følgende trin gør det muligt at analysere prøver senere. - Efter trin 6.7 resuspenderes prøven med 100 μL 1% paraformaldehyd i PBS.
- Prøven inkuberes ved 4 °C i 15 minutter beskyttet mod lys. Cellerne centrifugeres i 3 minutter ved 830 x g. Kassér supernatanter.
- Resuspender cellerne med 100 μL kold FACS-buffer. Cellerne centrifugeres i 3 minutter ved 830 x g. Kassér supernatanter.
- Resuspender cellerne med 100 μL kold FACS-buffer. Cellerne opbevares ved 4 °C, beskyttet mod lys. Analyser prøven inden for 72 timer.
7. Multiplex perlearrays til cytokin- og kemokindetektion
BEMÆRK: Kommercielt tilgængelige proinflammatoriske kemokin- og inflammationsmultiplexpaneler (se materialetabel) blev brugt til at bestemme ekspressionen af kemokiner og cytokiner i lungerne efter tMCAO-induktion i henhold til producentens protokol, som er beskrevet detaljeret13.
- Kort sagt optø analytterne på is, hvis de blev opbevaret ved -80 °C efter vævshomogenisering. Prøven centrifugeres ved 590 x g i 2 minutter ved 4 °C, inden den anvendes til at fjerne eventuelt resterende væv.
- Generer en standardkurve ved seriel fortynding af standardcocktailen (C7), som er ved en kendt koncentration på 10 ng / ml i 7 standarder (C1-6), hvor den sidste standard er analysebuffer alene (C0).
- Når alle reagenser er opvarmet til stuetemperatur, tilsættes 25 μL af hver standard og 25 μL assaybuffer til en V-bund 96 brøndplade.
- Til hver prøvebrønd tilsættes 25 μL lungehomogenat (analyt) og 25 μL assaybuffer til en V-bund 96 brøndplade
- Vortex de forbelagte perler kraftigt, og tilsæt derefter 25 μL forbelagte perler til hver af standard- og prøvebrøndene.
- Forsegl pladen og beskyt mod lys ved at dække med folie. Ryst pladen ved 110 o / min i 2 timer ved stuetemperatur.
- Centrifuger ved 230 x g i 5 min. Tilsæt 200 μL vaskebuffer ved 1x (stamopløsning er 20x, fortynd til 1x med vand). Inkuberes i 1 min.
- Centrifuger ved 230 x g i 5 min. Resuspend standarden og prøven med 25 μL detektionsantistoffer.
- Forsegl og dæk pladen for at beskytte mod lys. Rystpladen ved 110 o / min i 1 time ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 25 μL streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) til hver standard og prøvebrønd.
- Forsegl og dæk pladen for at beskytte mod lys. Ryst ved 110 o / min i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Drej pladen ved 230 x g i 5 min. Resuspend standarden og prøverne i 1x vaskebuffer.
- Overfør til et velmærket polystyren rundbundet 5 ml FACS-rør indeholdende yderligere 150 μL 1x vaskebuffer.
- Bestem PE-signalfluorescensintensiteten for standarderne og prøverne ved hjælp af et flowcytometer.
- Konstruer en standardkurve for hvert kemokin og cytokin ved hjælp af den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af PE mod de forudbestemte koncentrationer.
- Koncentrationen af hvert kemokin og cytokin bestemmes ved hjælp af standardkurven og MFI'en fra hver prøve. Multiplexpanelet leverer dataanalysesoftware, der kan bruges til at bestemme koncentrationen af hver analyt. Vægten af den apikale / overlegne lobe bruges til at bestemme koncentrationen af cytokiner eller kemokin pr. Milligram væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi rapporterede for nylig, at induktion af iskæmisk slagtilfælde hos mus ændrer immuncellesammensætningen i lungerne11. Specifikt øgede forbigående cerebral iskæmi procentdele af alveolære makrofager, neutrofiler og CD11b + DC'er, mens faldende procentdele af CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler, NK-celler og eosinofiler i lungerummet. Desuden svarede cellulær ændring til signifikant formindskede niveauer af flere kemokiner i lungerne. Beskrevet her er en metode til isolering og identifikation af forskellige immuncellepopulationer i lungerummet. Repræsentative resultater vist her var fra mus, der havde gennemgået tMCAO induktion og en falsk operation.
Vi identificerede 13 forskellige populationer af immunceller i lungerne (L1-L13) ved hjælp af 3 sæt antistofkombinationer, hvor hvert sæt indeholdt 5-7 antistoffer (figur 1). Døde celler blev udelukket ved hjælp af en LIVE/DEAD-plet i hvert sæt. Antistoffer og markører til skelnen mellem forskellige immuncelletyper er anført i tabel 1. Alveolære og interstitielle makrofager, CD103+ DC'er, CD11b+ DC'er og eosinofiler blev identificeret i sæt 1 (figur 1A, B). Proinflammatoriske monocytter og neutrofiler blev identificeret i sæt 2 (figur 1C). Under inflammatoriske reaktioner migrerer monocytter til inflammationsstedet, hvor disse celler differentierer sig til monocytafledte antigenpræsenterende celler (mo-APC'er)14. Nedregulering af Ly6C og CCR2 er karakteristiske for monocytdifferentiering, som kan evalueres ved hjælp af sæt 215. CD4+ T-celler, CD8+ T-celler, B-celler, plasmacytoide DC'er, NK-celler og NKT-celler blev identificeret ved hjælp af sæt 3 (figur 1D).
For at bestemme kvaliteten af vores enkeltcelleisoleringsprotokol sammenlignede vi antallet af levedygtige celler og CD45+ immunceller isoleret ved hjælp af den manuelle metode med cellerne isoleret ved hjælp af en kommercielt tilgængelig vævsdissociator (se materialetabel), som ofte bruges til at isolere celler fra væv 16,17,18,19,20 . I sidstnævnte protokol blev lungelober overført til et dissociatorspecifikt rør (se materialetabel) efter injektion af dissociationsbufferen, og vævet blev fordøjet ved hjælp af 37C_m_LDK_1-programmet. Det samlede antal levedygtige celler, procentdelen af CD45+ celler og det samlede antal opnåede CD45+ celler var sammenlignelige mellem de to metoder (figur 2AC). Procentdelen af celledød blandt CD45+ celler ved hjælp af begge protokoller var ~ 10% (figur 2D). Disse resultater tyder på, at protokollen, der præsenteres her, tillader cellegendannelse med højt udbytte og kvalitet uden hjælp fra en automatiseret vævsdissociator.
Et kommercielt tilgængeligt multiplexassay kombineret med flowcytometrisk analyse blev anvendt til at bestemme koncentrationen af 13 kemokiner under anvendelse af 25 μL prøve (figur 3). To forskellige størrelser af perler blev først identificeret af FSC/SSC (figur 3A). Hver perle er belagt med 6-7 primære antistoffer, som kunne skelnes ved fluorescensintensitet i APC-kanalen (figur 3B). Niveauet af kemokiner i prøven er proportionalt med fluorescensintensiteten i PE-kanalen, som kunne bestemmes af MFI (figur 3C). Ved at sammenligne MFI-værdien for hver kemokin med standardkurven konstrueret med kendte koncentrationer af kemokin kan koncentrationen i prøven (pr. mg væv) bestemmes.
Figur 1: Identifikation af 13 immuncelletyper fra lungerne efter vævsfordøjelse med collagenase D efter iskæmisk slagtilfælde. Lungevæv blev udskåret 24 timer efter tMCAO eller sham operation, immunceller i lungerne blev analyseret ved flowcytometri, defineret af overflademarkører opført på tabel 1. (A) I antistofsæt 1 blev CD45+ levedygtige celler (*) først gated på Siglec F og CD11b for at identificere de alveolære makrofager (L1), som udtrykte CD11c og MHC II, og eosinofiler (L2), som ikke udtrykte CD11c og MHC II. (B) Celler inden for Siglec F-populationen (**) i A blev derefter lukket for at bestemme ekspressionen af CD103 og CD11b. CD103 + CD11b- (***). Celler blev yderligere lukket for at bestemme ekspressionen af CD11c og MHC II. CD103+ DC'er udtrykte både CD11c og MHC II (L3), men udtrykte ikke CD64. CD11b hi populationen (****) blev yderligere gated for at bestemme ekspressionen af CD64 og MHC II. CD11b+ DC'er udtrykte MHC II, men ikke CD64 (L4), mens interstitielle makrofager (L5) udtrykte begge markører. (C) I antistofsæt 2 blev CD45+ levedygtige celler i A lukket for at bestemme ekspressionen af CD11b og Ly6C. Ly6C hi-celler (*) repræsenterede de udifferentierede monocytter, der opretholdt et højt niveau af CCR2-ekspression (L6, midterste plot), mens Ly6C-lavceller (**) indeholdt en blandet population af differentierende monocytter, der var Ly6G- (L6, højre plot) og Ly6G + neutrofiler (L7). (D) I antistofsæt 3 blev CD45+ levedygtige celler i A lukket for at bestemme ekspressionen af CD11c og B220 for at identificere B-celler (L8) og plasmacytoide DC'er (L9). CD11c- og B220-populationen (*) blev derefter lukket for at bestemme ekspressionen af CD4 og CD8 for at identificere CD4 + T-celler (L10) og CD8 + T-celler (L11). CD4-CD8-populationen (**) blev yderligere gated for at bestemme ekspressionen af NK1.1 og TCRb for at identificere NK-celler (L12) og NKT-celler (L13). Vist er repræsentative plots fra 12 C57BL / 6J mus efter tMCAO og sham operation. Dele af figuren er genoptrykt fra tidligere udgivet litteratur11 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Sammenligning mellem manuel dissociationsmetode og brugen af vævsdissociator til isolering af enkeltceller fra lungerne. (A-C) Det samlede antal celler, procentdelen af CD45+ celler og det samlede antal CD45+ celler blev sammenlignet. Vist er kombinerede resultater fra 3 uafhængige eksperimenter. NS: ikke statistisk signifikant. (D) Repræsentative plots til bestemmelse af procentdelen af døde CD45+ celler efter isolering. Vist er repræsentative plots fra 3 uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Iskæmisk slagtilfælde undertrykker produktionen af flere kemokiner i lungerne. (A-C) Repræsentative plots, der viser bestemmelsen af niveauet af 13 kemokiner i lungerne ved multiplex perlearray. (A) FSC/SSC gate blev brugt til at identificere perler A og B med forskellig størrelse. (B) Primære antistoffer belagt på perlerne kan skelnes ved fluorescensintensitet i APC-kanalen. (C) Niveauet af kemokiner i prøven var proportionalt med fluorescensintensiteten i PE-kanalen. Vist er repræsentative plots fra 12 C57BL / 6J mus efter sham operation. (D) Lungevæv blev homogeniseret 24 timer efter tMCAO eller sham operatio. Niveauet af 13 kemokiner i lungerne hos individuelle dyr blev bestemt af multiplex perlearray. De viste data er kombinerede resultater fra tre uafhængige forsøg med n = 11-12 dyr pr. gruppe. *, P < 0,05; **, P < 0,01; , P < 0,001. NS, ikke statistisk anderledes. Dele af figuren er genoptrykt fra tidligere udgivet litteratur11 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Antistof | Klon | Immuncelle type | Befolkning | Udtryk for overflademarkør |
| Cd45-Fitc | 30-F11 | Alveloære makrofager | L1 | CD45+ Siglec F+ CD11b- |
| Siglec F-PE | E50-2440 | Eosinofiler | L2 | CD45+ Siglec F+ CD11b+ |
| CD11c-Percp/Cy5.5 | N418 | CD103+ DC'er | L3 | CD45+ Siglec F- CD11b- CD103+ CD11c+ MHC II+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 | CD11b+ DC'er | L4 | CD45+ Siglec F- CD11b hi CD103- CD64- MHC II+ |
| Cd64-APC | X54-5/7.1 | Interstitielle makrofager | L5 | CD45+ Siglec F- CD11b hi CD103- CD64+ MHC II+ |
| Cd103-BV421 | 2E7 | |||
| MHC II-BV510 | M5/114.15.2 | |||
| Levende/døde-APC/Cy7 | ||||
| Cd45-Fitc | 30-F11 | Monocytter/moDC'er | L8 | CD45+ CD11b hi Ly6C hi/int CCR2+/- Ly6G- |
| Ly6C-PE | HK1.4 | Neutrofiler | L9 | CD45+ CD11b hi Ly6C int CCR2- Ly6G+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 | |||
| CCR2-BV421 | Sa203G11 | |||
| Ly6G-BV510 | 1A8 | |||
| Levende/døde-APC/Cy7 | ||||
| Cd45-Fitc | 30-F11 | Plasmacytoid DC'er | L6 | CD45+ B220+ CD11c+ |
| Cd8-PE | 53-6.7 | B-celler | L7 | CD45+ B220+ CD11c- |
| NK1.1-Percp/Cy5.5 | PK136 | CD4+ T-celler | L10 | CD45+ B220- CD11c- CD4+ CD8- |
| CD11c-PE/Cy7 | N418 | CD8+ T-celler | L11 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8+ |
| APC-B220 | Ra3-6B2 | NK-celler | L12 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb- |
| Cd4-BV421 | GK1.5 | NKT-celler | L13 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb+ |
| TCRb-BV510 | H57-597 | |||
| Levende/døde-APC/Cy7 |
Tabel 1: Overflademarkører og antistofkombinationer til bestemmelse af immunceller isoleret fra lungerne efter tMCAO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protokoller, der er beskrevet her, giver mulighed for identifikation af lungeimmuncelletyper og ekspression af kemokiner eller cytokiner i samme mus. Hvis der ønskes en histopatologisk undersøgelse, kan en individuel lap fjernes og fastgøres til dette formål, inden man går videre til enkeltcelleisoleringstrinnene. En begrænsning ved denne metode er, at denne tilgang muligvis ikke er egnet i nogle sygdomsindstillinger, hvis ændringen i immuncellesammensætningen og ekspressionen af kemokiner og / eller cytokiner forventes at være ulige fordelt mellem forskellige lunger. For eksempel viser nogle bakterier, såsom Mycobacterium tuberculosis, en forkærlighed for at inficere visse lunger21. I dette tilfælde kan en sammenligning mellem lobes være påkrævet.
Koncentrationen, inkubationstiden og temperaturen af enkeltcelleisoleringsprotokollen fra lungerne påvirker kritisk genopretningen af immuncellerne fra lungerne. Kvaliteten af collagenase D er afgørende for at opnå optimale resultater og bør testes, hvis der anvendes en anden kilde til collagenase D. Overfordøjelse af vævene resulterer i en stigning i celledød; der henviser til, at underfordøjelse af væv forårsager lavt udbytte af immunceller, især makrofager og DC'er.
Vi brugte 3 antistofkombinationer til at bestemme 13 immuncellepopulationer i lungerne, hvor hvert sæt indeholdt 5-7 antistoffer og en LIVE / DEAD-plet. Antistoffer i hvert sæt kan kombineres, hvis antallet af celler opnået fra prøverne er begrænset. Et stort problem, der opstår, når antallet af antistoffer øges, er imidlertid, at kompensationen af fluorescenssignalet på flowcytometeret kan være udfordrende, især når man skelner celler fra myeloid linage under inflammatoriske tilstande. Yderligere antistofcocktails kan bruges til at identificere andre medfødte immunceller i enkeltcellesuspensionen, såsom medfødte lymfoide celler og γδ T-celler, der bidrager til immunresponset i lungerne22,23. Da en lungelap tages til multiplexarrayet, kan det nøjagtige antal af hver celletype i lungerne ikke bestemmes og sammenlignes endeligt, og dette udgør en begrænsning af denne metode. For at løse dette kan et defineret antal celler isoleres fra lungerne hos falske og tMCAO-inducerede mus. I dette tilfælde kan det absolutte antal af hver immuncelletype sammenlignes nøjagtigt mellem de to grupper. Derudover tillader denne metode ikke lokalisering af immuncellerne i lungen at blive bestemt. Dette kan opnås ved at udføre immunhistokemi på lungeafsnit.
Afslutningsvis blev denne protokol brugt til at undersøge effekten af iskæmisk slagtilfælde i lungeimmunitet, men den kan også bruges til at studere andre sygdomsmodeller, såsom infektion og allergier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH-bevilling P20 GM109098 og Innovation Award-programmet fra Praespero til Edwin Wan. Flowcytometri eksperimenter blev udført i WVU Flow Cytometry &Single Cell Core Facility, som understøttes af NIH tilskud S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 og P20 GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
