Summary
Bu protokol, iskemik inmenin bir murin modeli olan geçici orta serebral arter tıkanıklığını takiben pulmoner ortamda immün hücre kompozisyonu, sitokin profili ve kemokin profilindeki değişiklikleri tanımlamak için flow sitometrinin kullanımını açıklamaktadır.
Abstract
Çoklu sitokinlerin ve kemokinlerin ekspresyonu ile kontrol edilen immün hücre genişlemesi, aktivasyonu ve akciğerlere kaçakçılığı, ciddi beyin hasarı ile değiştirilebilir. Bu, pnömoninin iskemik inme geçiren hastalarda mortalitenin önemli bir nedeni olduğu gerçeğiyle kanıtlanmaktadır. Bu protokolün amacı, farelerin akciğerlerinde alveoler makrofajlar, interstisyel makrofajlar, CD103 + veya CD11b + dendritik hücreler (DC'ler), plazmasitoid DC'ler, eozinofiller, monositler / monosit kaynaklı hücreler, nötrofiller, lenfoid kaynaklı T ve B hücreleri, NK hücreleri ve NKT hücreleri dahil olmak üzere 13 tip immün hücreyi tanımlamak için çok renkli akış sitometrik analizinin kullanımını tanımlamaktır. Ayrıca, akış sitometrik analizi ile birleştirilmiş multipleks boncuk dizileri ile aynı anda 13 farklı sitokin veya kemokinin ekspresyon seviyelerini belirlemek için bir boncuk homojenizasyon yöntemi kullanarak akciğer homojenatlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Bu protokol, bulaşıcı akciğer hastalığı veya alerjik hastalık gibi diğer hastalık ortamlarında pulmoner immün yanıtı araştırmak için de kullanılabilir.
Introduction
Akciğerler dış çevreye maruz kalan bir bariyer organıdır ve bu nedenle patojenler ve alerjenler gibi sürekli olarak immünolojik zorluklarla karşılaşırlar1. Akciğerde yerleşik bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu ve bağışıklık hücrelerinin periferden infiltrasyonu, patojenleri pulmoner ortamdan temizlemek için gereklidir. Ek olarak, akciğerde yerleşik bağışıklık hücreleri komensal bakterilere karşı toleransı korur, bu da bu hücrelerin patojen klirensinde ve homeostazın korunmasında rol oynadığını düşündürmektedir1. Alveoler ve interstisyel makrofajlar, patern tanıma reseptörleri aracılığıyla patojenleri algılayan ve bu patojenleri fagositoz2 ile temizleyen akciğerde yerleşik sentinel immün hücreler arasındadır. Akciğerde yerleşik dendritik hücreler, doğuştan gelen ve adaptif immün yanıtı antijen sunumu yoluylaköprülemektedir 3. Ek olarak, aktive edilmiş lokal doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, enflamatuar yanıtı artıran ve monositler, nötrofiller ve lenfositler gibi bağışıklık hücrelerinin akciğerlere sızmasını uyaran sitokinler ve kemokinler üretir1. İskemik inmenin sistemik bağışıklığı modifiye ettiği ve akciğer enfeksiyonuna duyarlılığın artmasına yol açtığı gösterilmiştir; Bununla birlikte, az sayıda çalışma iskemik inme sonrası pulmoner kompartmanı değerlendirmiştir, ancak bazı çalışmalar enflamatuarkoşullar 4,5,6,7,8,9 sırasında incelemiştir. Burada açıklanan yöntemlerin amacı, akciğer patolojisini, immün hücre kompozisyonunu ve akciğerlerdeki sitokin ve kemokin ekspresyon düzeylerini aynı anda belirlemek, pulmoner kompartmandaki değişiklikleri değerlendirmek ve iskemik atak sonrası pulmoner immün yanıttaki potansiyel değişiklikleri değerlendirmektir.
Burada açıklanan, 13 tip bağışıklık hücresini tanımlamak için farelerin akciğerlerinden tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için bir protokoldür. Bu protokol, otomatik bir doku ayrışıcısına ihtiyaç duymadan kollajenaz D ile doku sindirimine dayanır. Ek olarak, akış sitometrisi tabanlı multipleks boncuk dizileri kullanarak 13 farklı sitokin veya kemokinin ekspresyon seviyelerini belirlemek için kullanılabilecek doku homojenatları hazırlamak için bir protokol geliştirdik. Bu protokol, iskemik inmenin pulmoner immünite üzerindeki etkilerini araştırmak için başarıyla kullanılmıştır ve diğer hastalık modellerinde de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yapılan tüm protokoller ve prosedürler Batı Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Fareler, West Virginia Üniversitesi'ndeki vivaryumda spesifik patojensiz koşullar altında barındırıldı.
1. Çözeltilerin hazırlanması
- Perfüzyon tamponu hazırlayın (fosfat tamponlu salin, PBS). Fare başına yaklaşık iki adet 10 mL buz gibi soğuk PBS kullanın.
- Akciğer hücresi ortamı / FACS tamponunu hazırlayın. FACS tamponu,% 1 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş PBS içerir. Tüm akciğer eksizyonu ve transferi süreci boyunca orta soğukta tutun. Akciğer örneği başına yaklaşık 8 mL hazırlayın. Deneylerden önce taze ortam/FACS tamponu hazırlayın.
- Tek hücre izolasyonu için ayrışma tamponunu hazırlayın. Tampon, Hank'in tamponlanmış tuz çözeltisinde (HBSS) 1 mg / mL kollajenaz D ve 200 μg / mL DNaz I içerir. Deneylerden önce stok çözeltisinden (100 mg / mL kollajenaz D ve 10 mg / mL DNaz I) taze olarak hazırlayın. Akciğer örneği başına yaklaşık 6 mL gereklidir. Kullanmadan önce tamponun oda sıcaklığına ulaştığından emin olun.
- Akciğer dokusu homojenizasyonu için homojenizasyon tamponu hazırlayın. Tampon PBS ve 1x proteinaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli içerir (stok = 100x). Deneylerden önce taze hazırlanın. Tüm homojenizasyon prosesi boyunca tamponu soğuk tutun. Tamponun yaklaşık 200 μL'si, akciğerlerin tek bir sağ lobunu homojenize etmek için yeterlidir.
2. Geçici orta serebral arter tıkanıklığı (tMCAO)
NOT: Orta serebral artere monofilament yerleştirme yoluyla tMCAO prosedürleri daha önce10 ayrıntılı olarak belgelenmiştir. Bu deneylerde, 25-30 g ağırlığında 8-12 haftalık erkek C57BL / 6J fareler kullanılmıştır.
- Kısacası, ameliyattan önce farelere deri altından 2 mg / kg meloksikam uygulayın. % 5 izofluran kullanarak bir indüksiyon odasındaki fareleri derinlemesine anestezi altına alın. Ayak parmağını sıkıştırma yöntemini kullanarak derin anesteziyi onaylayın. Burun konisi kullanarak ameliyat sırasında% 1-2 izofluran ile anesteziyi sürdürün. Farelerin altına ılık bir battaniye yerleştirerek işlem boyunca vücut ısısını 36.5 - 38 ° C'de tutun. Tüm cerrahi aletler ameliyattan bir gün önce otoklev sterilize edilmelidir.
- % 70 etanol kullanarak ventral boyundaki cildi tıraş edin ve hazırlayın, ardından klorheksidin ovma uygulayın. İlk insizyonu yapmadan önce insizyon bölgesine deri altından 2 mg/kg büpivakain uygulanır. Kuruluğu önlemek için gözleri örtmek için göz merhemi kullanın. Orta hat boyun kesisi yapın. Trakeanın etrafındaki yumuşak dokuları yavaşça bir kenara çekin.
- Sol ortak karotis arteri ve eksternal karotis arteri tanımlayın.
- Kan akışını durdurmak için ortak karotis artere geçici bir dikiş (boyut 6/0) uygulayın. Dış karotis arterde bir kesi yapın.
- Dış karotis artere silikon kauçuk kaplı bir monofilament (boyut 6-0) yerleştirin, ardından monofilamenti orta serebral artere ilerletin. Monofilamenti orta serebral arterde 60 dakika (tıkanıklık) bırakın.
- Lazer Doppler Flowmetry kullanarak kan akış hızını izleyin. Orta serebral artere akış hızının %80 > azalması başarılı bir oklüzyonu gösterir.
- 60 dakikalık tıkanıklığın ardından, reperfüzyonun oluşmasına izin vermek için monofilamenti çıkarın. Kesini kapatın.
- Sahte olarak çalıştırılan farelerde, monofilamentin yerleştirilmesi olmadan 2.1-2.6 adımlarını uygulayın. Bu farelerde, kan akışı hızı tüm prosedür boyunca sabit kalmalıdır.
- Fareleri günlük olarak izleyin ve standart puanlama kriterleri11'i kullanarak nörolojik defisitleri ölçün. 0 – nörolojik defisit yok; 1 – kuyruk tarafından kaldırıldığında kontralateral ön pençeyi geri çeker; 2- kuyruk tarafından kaldırıldığında kontralateral daireler; 3- Yürürken kontralateral düşmek; 4 – kendiliğinden yürümez veya komada olur; 5 – öldü.
- Ameliyattan sonraki 3 gün boyunca her 24 saatte bir normal salin ve analjezik (meloksikam, 2 mg / kg) deri altı enjeksiyonları sağlayın.
- Aşağı akış analizi için akciğerleri tMCAO'yu takip ederek 24 ve 72 saat izole edin.
3. Akciğer dokularının toplanması
- 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile fareyi derinlemesine anestezi altına alın. Ayak parmağını sıkıştırma yöntemini kullanarak derin anesteziyi onaylayın.
- Tüm vücut transkardiyal perfüzyonunu gerçekleştirmek için12, fareyi cerrahi platforma sabitleyin ve kürkün vücut boşluğuna dağılımını azaltmak için% 70 etanol ile ıslak kürk yapın. Kaudal karın bölgesinde enine bir kesi yapmak için ince diseksiyon makası kullanın ve daha sonra diyaframı delmeden önce göğüs boşluğunda durarak periton orta hat insizyonu yapın.
- Kasları kesmeyin/periton boşluğuna saklanmayın ve karın bölgesinden sonra kesiye devam etmeyin.
- Diyaframı delmeden önce göğüs boşluğuna ulaşılır ulaşılmaz insizyonu durdurun. Perfüzyon kalitesini veya hücre iyileşmesini tehlikeye atabilecek kalbe ve akciğerlere zarar vermemeye özen gösterin
- İnce diseksiyon makası kullanarak, diyaframı delmeden önce göğüs boşluğunda duran periton orta hat insizyonu yapar.
- Forseps kullanarak fareyi sternumun distal ucundan tutun ve diyaframı keserken kalbe, akciğerlere veya vaskülatüre zarar vermeyeceğinden emin olarak yukarı doğru kaldırın. Organlar görünür olduktan sonra göğüs kafesinden bir kesi yapın ve kaburga kasasını ayırın ve geri sabitleyin, böylece kalp ve akciğerler tamamen açığa çıkar.
- Aort kemerinin yakınındaki sağ atriyumda dikkatlice küçük bir kesi yapın. Bu, perfüzyon için çıkış görevi görecektir.
- Hemen sonra, 10 mL soğuk PBS ile doldurulmuş bir şırıngaya tutturulmuş 25 G x 5/8 iğneyi sol ventrikülün distal üst yüzeyine yavaşça yerleştirin. Ventriküler septumdan sağ ventriküle sokmamaya özen gösterin. İğne sol ventriküle zar zor yerleştirilmelidir.
NOT: Ventriküler septum delinirse, sıvı farenin burnundan dışarı fırlayacaktır. Bu, perfüzyon kalitesini düşürecek ve hücre kaybına neden olacaktır. - İstenirse, perfüzyon sırasında iğneyi sol ventrikülde güvenli bir şekilde yerinde tutmak için bir kelepçe kullanılabilir.
- Sürekli ama nazikçe 10 mL soğuk PBS'yi kalbe itin. Fare dokusu, sıvı sağ atriyumdan çıktıkça kanı delmeye ve temizlemeye başlamalıdır.
- Yeterli kan temizliği gerçekleşene kadar 10 mL PBS'lik ikinci bir aliquot'u itin. Karaciğer açık kahverengi bir görünüme sahip olacak ve akciğerler kırmızımsı pembeden çoğunlukla beyaz renge geçecektir.
- Forseps ve ince diseksiyon makası kullanarak, kalp, trakea, yemek borusu, timus, bağ dokusu, lenf düğümleri ve büyük bronşiyaller dahil olmak üzere çevredeki tüm dokuları dikkatlice çıkarın.
- Bireysel akciğer loblarını ayırın ve lobları, 1-2 mL'lik bir soğuk akciğer hücresi ortamı içeren buz üzerindeki bir Petri kabına yerleştirin.
4. Boncuk homojenizatörü kullanılarak multipleks boncuk dizileri için akciğer dokusunun homojenizasyonu
- 3 steril 2,3 mm zirkonya/silika boncuk içeren 2 mL konik vidalı kapak tüpünü önceden soğutun. Tüpe 200 μL soğuk homojenizasyon tamponu ekleyin.
- Lobu tartın, lobu boncukları ve homojenizasyon tamponunu içeren önceden soğutulmuş konik tüpe aktarın.
NOT: 200 μL tamponda homojenize edilmiş yaklaşık 50-100 mg doku, numunedeki sitokin ve kemokin ekspresyonunu tespit etmek için yeterli olacaktır.- Boncuk bazlı bir homojenizatör kullanarak lobun homojenize edilmesi (bkz. Malzeme Tablosu) 2 dakika boyunca 4.000 rpm'de homojenize edin.
- Dokunun tamamen homojenize edildiğinden emin olun. Gerekirse zamanı artırın.
- Homojenizasyonu takiben, tüpü 3 dakika boyunca 15.870 x g'de önceden soğutulmuş (4 °C) bir mikro santrifüjde santrifüj yapın.
- Süpernatantları önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrotüpe aktarın.
- Numuneyi hemen kullanmak üzere doğrudan buzun üzerine yerleştirin veya ileride kullanmak üzere numuneyi -80 °C'de saklayın. Birden fazla donma-çözülme döngüsünden kaçının.
5. Akciğer dokusunun ayrışması ve tek hücre izolasyonu
- Ayrışma tamponunun seyreltilmesini önlemek için kalan akciğer loblarının akciğer hücresi ortamını dökün. Daha sonra, 1 mL ayrışma tamponu içeren 25G ve 5/8 iğneli 1 mL'lik bir şırıngayı akciğer dokusuna dikkatlice yerleştirin.
- Ayrışma tamponunun küçük fraksiyonlarını (yaklaşık 1/4 ila 1 /5th) her akciğer lobuna enjekte edin ve hafifçe şişirin.
NOT: Lob eksize edildiğinden tamponun çoğu şişirildikten kısa bir süre sonra dışarı fırlayacaktır. - Ayrışma tamponu enjeksiyonunu 1-2x tekrarlayın.
- Akciğer loblarını oda sıcaklığında 2 dakika boyunca ayrışma tamponu ile inkübe edin.
- İnce diseksiyon makası kullanarak akciğer loblarını ince ince parçalara ayırın.
- Kıyılmış akciğer parçalarını ayrışma tamponu ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Toplam 6 mL'ye kadar ek ayrışma tamponu ile takviye edin. Vorteksi 1 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde yapın.
- Numuneyi 37 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin. Her 7-8 dakikada bir kuvvetli bir şekilde vorteks.
- 45 dakikalık inkübasyondan sonra, optimum sonuçlar için numuneyi 1 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde vorteksleyin.
- Kalıntı, istenmeyen bağ ve interstisyel dokuyu çıkarmak için 100 μm'lik bir hücre süzgecinden geçerek numuneyi daha da ayırın.
- Numuneyi 380 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatanı atın.
- Numuneye 5 mL soğuk akciğer hücresi ortamı ekleyin. Hücre peletini nazik vorteks ile yeniden askıya alın.
- Numuneyi 380 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatanı atın.
- 1 mL soğuk akciğer hücresi ortamı ekleyin. Hücre peletini nazik vorteks ile yeniden askıya alın.
- 100 μm'lik bir hücre süzgecinden geçin ve hücreleri sayın.
6. Akciğer immün hücre nişi için akış sitometrik analizi
- Tohum 1-2 x 106 hücre/antikor 96 kuyu yuvarlatılmış bir alt plakaya yerleştirilir (toplamda 3 set). Hücreleri 830 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın. Süper nantantları atın.
- Hücre peletini sabitlenebilir canlı/ölü leke içeren 50 μL soğuk PBS'de yeniden askıya alın. Lekeyi üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
- Hücreleri ışıktan korunan 20 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Hücreleri 830 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın. Süper nantantları atın.
- Hücre peletini, 5 μg/mL anti-fare CD16/32 antikoru içeren 25 μL soğuk FACS tamponu ile yeniden askıya alın. 10-15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Hücrelere Tablo 1'de listelenen antikor kombinasyonlarını içeren 25 μL soğuk FACS tamponu ekleyin. Nazik pipetleme ile karıştırın.
NOT: Antikor boyama için toplam FACS tamponu hacmi 50 μL'dir. Bu nedenle, 25 μL'de bir ana antikor karışımı hazırlarken, antikorların konsantrasyonu nihai konsantrasyonun iki katı olmalıdır. - Hücreleri ışıktan korunan 20 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Hücreleri 830 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın. Süper nantantları atın.
- Hücreleri 100 μL soğuk FACS tamponu ile yeniden askıya alın. Hücreleri 830 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın. Süper nantantları atın.
- Hücreleri 100 μL soğuk FACS tamponu ile yeniden askıya alın. 150 μL ek FAC tamponu içeren polistiren yuvarlak tabanlı 5 mL FACS tüpüne aktarın. Bir akış sitometresi kullanarak numuneyi hemen analiz edin.
NOT: Aşağıdaki adımları kullanarak hücre sabitleme, örneklerin daha sonra analiz edilmesini sağlar. - Adım 6.7.'yi takiben, PBS'de numuneyi 100 μL% 1 paraformaldehit ile yeniden askıya alın.
- Numuneyi ışıktan korunan 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Hücreleri 830 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın. Süper nantantları atın.
- Hücreleri 100 μL soğuk FACS tamponu ile yeniden askıya alın. Hücreleri 830 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın. Süper nantantları atın.
- Hücreleri 100 μL soğuk FACS tamponu ile yeniden askıya alın. Hücreleri ışıktan korunan 4 °C'de saklayın. Numuneyi 72 saat içinde analiz edin.
7. Sitokin ve kemokin tespiti için multipleks boncuk dizileri
NOT: Ticari olarak temin edilebilen proinflamatuar kemokin ve inflamasyon multipleks paneller (bakınız Malzeme Tablosu), ayrıntılı olarak tarif edilen üretici protokolüne göre tMCAO indüksiyonunu takiben akciğerlerde kemokinlerin ve sitokinlerin ekspresyonunu belirlemek için kullanılmıştır13.
- Kısacası, doku homojenizasyonundan sonra -80 ° C'de depolanmış analitleri buz üzerinde çözün. Herhangi bir kalıntı dokuyu çıkarmak için kullanmadan önce numuneyi 590 x g'de 4 ° C'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Bilinen 10 ng/mL konsantrasyonda bulunan standart kokteyli (C7) seri olarak 7 standarda (C1-6) seyrelterek standart bir eğri oluşturun ve son standart tek başına tahlil tamponudur (C0).
- Tüm reaktifler oda sıcaklığına ısındıktan sonra, V alt 96 kuyu plakasına her standarttan 25 μL ve 25 μL tahlil tamponu ekleyin.
- Her numune kuyusuna, V alt 96 kuyu plakasına 25 μL akciğer homojenatı (analit) ve 25 μL tahlil tamponu ekleyin
- Önceden kaplanmış boncukları kuvvetlice vorteksleyin, ardından standart ve numune kuyularının her birine 25 μL önceden kaplanmış boncuk ekleyin.
- Plakayı kapatın ve folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun. Plakayı oda sıcaklığında 2 saat boyunca 110 rpm'de sallayın.
- 5 dakika boyunca 230 x g'de santrifüj. 1x'te 200 μL yıkama tamponu ekleyin (stok çözeltisi 20x'tir, su ile 1x'e kadar seyreltin). 1 dakika boyunca inkübe edin.
- 5 dakika boyunca 230 x g'de santrifüj. Standardı ve numuneyi 25 μL tespit antikorları ile yeniden askıya alın.
- Işıktan korumak için plakayı kapatın ve örtün. Plakayı oda sıcaklığında 1 saat boyunca 110 rpm'de sallayın.
- Her standarda 25 μL streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) ekleyin ve iyice numune alın.
- Işıktan korumak için plakayı kapatın ve örtün. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 110 rpm'de çalkalayın.
- Plakayı 5 dakika boyunca 230 x g'de döndürün. Standardı ve numuneleri 1x yıkama tamponunda yeniden askıya alın.
- Ek 150 μL 1x yıkama tamponu içeren iyi etiketlenmiş polistiren yuvarlak tabanlı 5 mL FACS tüpüne aktarın.
- Bir akış sitometresi kullanarak standartlar ve numuneler için PE sinyal floresan yoğunluğunu belirleyin.
- Önceden belirlenmiş konsantrasyonlara karşı PE'nin ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) kullanarak her kemokin ve sitokin için standart bir eğri oluşturun.
- Standart eğriyi ve her numuneden MFI'yi kullanarak her kemokin ve sitokinin konsantrasyonunu belirleyin. Multipleks panel, her analitin konsantrasyonunu belirlemek için kullanılabilecek veri analiz yazılımı sağlar. Apikal/superior lobun ağırlığı, miligram doku başına sitokin veya kemokin konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Son zamanlarda farelerde iskemik indüksiyonun akciğerlerin immün hücre kompozisyonunu değiştirdiğini bildirmiştik11. Spesifik olarak, geçici serebral iskemi, alveoler makrofajların, nötrofillerin ve CD11b + DC'lerin yüzdelerini arttırırken, CD4 + T hücrelerinin, CD8 + T hücrelerinin, B hücrelerinin, NK hücrelerinin ve pulmoner bölmedeki eozinofillerin yüzdelerini azaltmıştır. Dahası, hücresel değişiklik, akciğerlerdeki çoklu kemokinlerin önemli ölçüde azalmış seviyelerine karşılık geldi. Burada tarif edilen, pulmoner kompartmandaki farklı immün hücre popülasyonlarının izolasyonu ve tanımlanması için bir yöntemdir. Burada gösterilen temsili sonuçlar, tMCAO indüksiyonu ve sahte bir operasyon geçiren farelerdendi.
Her biri 5-7 antikor içeren 3 set antikor kombinasyonu kullanarak akciğerlerde (L1-L13) 13 farklı immün hücre popülasyonu tanımladık (Şekil 1). Ölü hücreler her sette bir LIVE/DEAD boyası kullanılarak dışlandı. Farklı immün hücre tiplerini ayırt etmek için kullanılan antikorlar ve belirteçler Tablo 1'de listelenmiştir. Set 1'de alveoler ve interstisyel makrofajlar, CD103+ DC'ler, CD11b+ DC'ler ve eozinofiller saptandı (Şekil 1A,B). Proinflamatuar monositler ve nötrofiller Set 2'de tanımlandı (Şekil 1C). Enflamatuar yanıtlar sırasında, monositler inflamasyon bölgesine göç eder, burada bu hücreler monosit kaynaklı antijen sunan hücrelere (mo-APC'ler) farklılaşır14. Ly6C ve CCR2'nin downregülasyonu, Set 215 kullanılarak değerlendirilebilen monosit farklılaşmasının karakteristiğidir. CD4+ T hücreleri, CD8+ T hücreleri, B hücreleri, plazmasitoid DC'ler, NK hücreleri ve NKT hücreleri Set 3 kullanılarak tanımlandı (Şekil 1D).
Tek hücreli izolasyon protokolümüzün kalitesini belirlemek için, manuel yöntem kullanılarak izole edilen canlı hücrelerin ve CD45 + bağışıklık hücrelerinin sayısını, ticari olarak temin edilebilen bir doku ayrışıcısı kullanılarak izole edilen hücrelerle karşılaştırdık (bkz. . İkinci protokolde, akciğer lobları, ayrışma tamponunun enjeksiyonunu takiben dissosiyatöre özgü bir tüpe (bakınız Malzeme Tablosu) aktarıldı ve doku 37C_m_LDK_1 programı kullanılarak sindirildi. Toplam canlı hücre sayısı, CD45+ hücrelerinin yüzdesi ve elde edilen CD45+ hücrelerinin toplam sayısı iki yöntem arasında karşılaştırılabilir düzeydeydi (Şekil 2A-C). Her iki protokolü kullanan CD45 + hücreleri arasındaki hücre ölümü yüzdesi ~% 10 idi (Şekil 2D). Bu sonuçlar, burada sunulan protokolün, otomatik bir doku ayrıştırıcısının yardımı olmadan yüksek verim ve kalitede hücre geri kazanımına izin verdiğini göstermektedir.
25 μL numune kullanılarak 13 kemokinin konsantrasyonunu belirlemek için akış sitometrik analizi ile birleştirilmiş ticari olarak temin edilebilen bir multipleks tahlil kullanılmıştır (Şekil 3). İki farklı boncuk boyutu ilk olarak FSC/SSC tarafından tanımlanmıştır (Şekil 3A). Her boncuk, APC kanalındaki floresan yoğunluğu ile ayırt edilebilen 6-7 primer antikor ile kaplanmıştır (Şekil 3B). Numunedeki kemokin seviyesi, MFI tarafından belirlenebilen PE kanalındaki floresan yoğunluğu ile orantılıdır (Şekil 3C). Her bir kemokinin MFI değerini, bilinen kemokin konsantrasyonlarıyla oluşturulan standart eğri ile karşılaştırarak, numunedeki konsantrasyon (mg doku başına) belirlenebilir.
Şekil 1: İskemik inme sonrası kollajenaz D ile doku sindirimini takiben akciğerlerden 13 immün hücre tipinin tanımlanması. Akciğer dokuları tMCAO veya sahte operasyonu takiben 24 saat eksize edildi, akciğerlerdeki bağışıklık hücreleri, Tablo 1'de listelenen yüzey belirteçleri ile tanımlanan akış sitometrisi ile analiz edildi. (A) Antikor seti 1'de, CD45+ canlı hücreler (*) ilk olarak CD11c ve MHC II'yi eksprese eden alveoler makrofajları (L1) ve CD11c ve MHC II'yi eksprese etmeyen eozinofilleri (L2) tanımlamak için Siglec F ve CD11b üzerine kapatıldı. (B) A'daki Siglec F- popülasyonu (**) içindeki hücreler daha sonra CD103 ve CD11b'nin ekspresyonunu belirlemek için kapılandırıldı. CD103 + CD11b- (***). CD11c ve MHC II ekspresyonunu belirlemek için hücreler daha da kapatıldı. CD103+ DC'ler hem CD11c hem de MHC II'yi (L3) ifade etti, ancak CD64'ü ifade etmedi. CD11b hi popülasyonu (****) CD64 ve MHC II'nin ekspresyonunu belirlemek için daha da kapatıldı. CD11b + DC'ler MHC II'yi eksprese etti, ancak CD64 (L4) değil, interstisyel makrofajlar (L5) her iki belirteci de ifade etti. (C) Antikor seti 2'de, CD11b ve Ly6C'nin ekspresyonunu belirlemek için A'daki CD45+ canlı hücreler kapatıldı. Ly6C hi hücreleri (*) yüksek düzeyde CCR2 ekspresyonunu (L6, orta grafik) koruyan farklılaşmamış monositleri temsil ederken, Ly6C düşük hücreleri (**), Ly6G- (L6, sağ grafik) ve Ly6G + nötrofiller (L7) olan farklılaştırıcı monositlerin karışık bir popülasyonunu içeriyordu. (D) Antikor seti 3'te, A'daki CD45 + canlı hücreler, B hücrelerini (L8) ve plazmasitoid DC'leri (L9) tanımlamak için CD11c ve B220 ekspresyonunu belirlemek için kapılıydı. CD11c ve B220- popülasyonu (*) daha sonra CD4 + T hücrelerini (L10) ve CD8 + T hücrelerini (L11) tanımlamak için CD4 ve CD8 ekspresyonunu belirlemek için kapılandırıldı. CD4- CD8- popülasyonu (**), NK hücrelerini (L12) ve NKT hücrelerini (L13) tanımlamak için NK1.1 ve TCRb ekspresyonunu belirlemek için daha da kapatıldı. Gösterilenler, tMCAO ve sahte operasyonu takiben 12 C57BL / 6J fareden temsili grafiklerdir. Şeklin bazı kısımları daha önce yayınlanmış literatür11'den izin alınarak yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Manuel ayrışma yöntemi ile akciğerlerden tek hücrelerin izole edilmesinde doku ayrıştırıcısının kullanımı arasındaki karşılaştırma. (A-C) Toplam hücre sayısı, CD45+ hücrelerinin yüzdesi ve CD45+ hücrelerinin toplam sayısı karşılaştırıldı. Gösterilen 3 bağımsız deneyin birleştirilmiş sonuçlarıdır. NS: İstatistiksel olarak anlamlı değil. (D) İzolasyonu takiben ölü CD45+ hücrelerinin yüzdesini belirlemek için temsili grafikler. Gösterilenler, 3 bağımsız deneyden temsili grafiklerdir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İskemik inme akciğerlerde çoklu kemokin üretimini baskılar. (A-C) Akciğerlerdeki 13 kemokin seviyesinin multipleks boncuk dizisi ile belirlenmesini gösteren temsili grafikler. (A) FSC/SSC kapısı, farklı boyuttaki A ve B boncuklarını tanımlamak için kullanılmıştır. (B) Boncuklar üzerine kaplanmış birincil antikorlar, APC kanalındaki floresan yoğunluğu ile ayırt edilebilir. (C) Numunedeki kemokin seviyesi, PE kanalındaki floresan yoğunluğu ile orantılıydı. Sahte operasyonu takiben 12 C57BL / 6J fareden temsili grafikler gösterilmektedir. (D) Akciğer dokuları tMCAO veya sahte operatio'yu takiben 24 saat homojenize edildi. Bireysel hayvanların akciğerlerindeki 13 kemokin seviyesi, multipleks boncuk dizisi ile belirlendi. Gösterilen veriler, grup başına n = 11-12 hayvanla yapılan üç bağımsız deneyin birleştirilmiş sonuçlarıdır. *, P < 0,05; **, P < 0,01; , P 0.001 <. NS, istatistiksel olarak farklı değil. Şeklin bazı kısımları daha önce yayınlanmış literatür11'den izin alınarak yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Antikor | Klon | İmmün Hücre Tipi | Nüfus | Yüzey İşaretleyici İfadesi |
| CD45-FITC | 30-F11 | Alveloar makrofajlar | L1 | CD45+ Siglec F+ CD11b- |
| Siglec F-PE | E50-2440 Serisi | Eozinofiller | L2 | CD45+ Siglec F+ CD11b+ |
| CD11c-Percp/Cy5.5 | N418 Serisi | CD103+ DC'ler | L3 Serisi | CD45+ Siglec F- CD11b- CD103+ CD11c+ MHC II+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 Serisi | CD11b+ DC'ler | L4 Serisi | CD45+ Siglec F- CD11b hi CD103- CD64- MHC II+ |
| CD64-APC | X54-5/7,1 | İnterstisyel makrofajlar | L5 Serisi | CD45+ Siglec F- CD11b hi CD103- CD64+ MHC II+ |
| CD103-BV421 | 2E7 | |||
| MHC II-BV510 | M5/114.15.2 | |||
| Canlı/ölü-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | Monositler/moDC'ler | L8 Serisi | CD45 + CD11b hi Ly6C hi / int CCR2 + / - Ly6G- |
| Ly6C-PE | HK1.4 | Nötrofil | L9 Serisi | CD45+ CD11b hi Ly6C int CCR2- Ly6G+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 Serisi | |||
| CCR2-BV421 Serisi | SA203G11 Serisi | |||
| Ly6G-BV510 Serisi | 1A8 | |||
| Canlı/ölü-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | Plazmasitoid DC'ler | L6 Serisi | CD45+ B220+ CD11c+ |
| CD8-PE | 53-6.7 | B hücreleri | L7 Serisi | CD45+ B220+ CD11c- |
| NK1.1-Percp/Cy5.5 | PK136 | CD4+ T hücreleri | L10 Serisi | CD45+ B220- CD11c- CD4+ CD8- |
| CD11c-PE/Cy7 | N418 Serisi | CD8+ T hücreleri | L11 Serisi | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8+ |
| APC-B220 Serisi | RA3-6B2 Serisi | NK hücreleri | L12 Serisi | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb- |
| CD4-BV421 | GK1.5 | NKT hücreleri | L13 Serisi | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb+ |
| TCRb-BV510 Serisi | H57-597 | |||
| Canlı/ölü-APC/Cy7 |
Tablo 1: tMCAO'yu takiben akciğerlerden izole edilen bağışıklık hücrelerini belirlemek için yüzey belirteçleri ve antikor kombinasyonları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokoller, akciğer immün hücre tiplerinin tanımlanmasına ve aynı farede kemokinlerin veya sitokinlerin ekspresyonuna izin verir. Bir histopatoloji çalışması istenirse, tek hücre izolasyon adımlarına geçmeden önce bu amaç için bireysel bir lob çıkarılabilir ve sabitlenebilir. Bu yöntemin bir sınırlaması, bağışıklık hücresi kompozisyonundaki değişimin ve kemokinlerin ve / veya sitokinlerin ekspresyonunun akciğerlerin farklı lobları arasında eşit olmayan bir şekilde dağılması bekleniyorsa, bu yaklaşımın bazı hastalık ortamlarında uygun olmayabileceğidir. Örneğin, Mycobacterium tuberculosis gibi bazı bakteriler, akciğerin belirli loblarını enfekte etmek için bir tercih gösterir21. Bu durumda, loblar arasında bir karşılaştırma yapılması gerekebilir.
Akciğerlerden tek hücre izolasyon protokolünün konsantrasyonu, kuluçka süresi ve sıcaklığı, bağışıklık hücrelerinin akciğerlerden geri kazanılmasını kritik derecede etkiler. Kollajenaz D'nin kalitesi, optimal sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir ve farklı bir kolajenaz D kaynağı kullanılıyorsa test edilmelidir. Dokuların aşırı sindirimi, hücre ölümünün artmasına neden olur; oysa dokuların yetersiz sindirimi, bağışıklık hücrelerinin, özellikle makrofajların ve DC'lerin düşük verimine neden olur.
Akciğerlerdeki 13 immün hücre popülasyonunu belirlemek için 3 antikor kombinasyonu kullandık, her set 5-7 antikor ve bir CANLI / ÖLÜ leke içeriyordu. Her setteki antikorlar, örneklerden elde edilen hücre sayısı sınırlıysa birleştirilebilir. Bununla birlikte, antikorların sayısı arttığında ortaya çıkan önemli bir sorun, akış sitometresindeki floresan sinyalinin telafisinin, özellikle enflamatuar koşullar altında hücreleri miyeloid linajdan ayırt ederken zor olabileceğidir. Ek antikor kokteylleri, akciğerlerdeki bağışıklık tepkisine katkıda bulunan doğuştan gelen lenfoid hücreler ve γδ T hücreleri gibi tek hücreli süspansiyon içindeki diğer doğuştan gelen bağışıklık hücrelerini tanımlamak için kullanılabilir22,23. Multipleks dizi için akciğerin bir lobu alındığından, akciğerlerdeki her hücre tipinin tam sayısı kesin olarak belirlenemez ve karşılaştırılamaz ve bu da bu yöntemin bir sınırlamasını oluşturur. Bunu ele almak için, sahte ve tMCAO kaynaklı farelerin akciğerlerinden tanımlanmış sayıda hücre izole edilebilir. Bu durumda, her bir bağışıklık hücresi tipinin mutlak sayısı iki grup arasında doğru bir şekilde karşılaştırılabilir. Ek olarak, bu yöntem akciğerdeki bağışıklık hücrelerinin lokalizasyonunun belirlenmesine izin vermez. Bu, akciğer kesitlerinde immünohistokimya yapılarak gerçekleştirilebilir.
Sonuç olarak, bu protokol iskemik inmenin pulmoner immünitedeki etkisini araştırmak için kullanılmıştır, ancak enfeksiyon ve alerjiler gibi diğer hastalık modellerini incelemek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, NIH hibesi P20 GM109098 ve Praespero'dan Edwin Wan'a İnovasyon Ödülü Programı tarafından desteklenmiştir. Akış Sitometrisi deneyleri, NIH hibeleri S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 ve P20 GM103434 tarafından desteklenen WVU Akış Sitometrisi ve Tek Hücreli Çekirdek Tesisi'nde gerçekleştirildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
