Pulmoner Ortamda İmmün Hücrelerin ve Proinflamatuar Mediatörlerin Karakterizasyonu
Summary
Bu protokol, iskemik inmenin bir murin modeli olan geçici orta serebral arter tıkanıklığını takiben pulmoner ortamda immün hücre kompozisyonu, sitokin profili ve kemokin profilindeki değişiklikleri tanımlamak için flow sitometrinin kullanımını açıklamaktadır.
Abstract
Çoklu sitokinlerin ve kemokinlerin ekspresyonu ile kontrol edilen immün hücre genişlemesi, aktivasyonu ve akciğerlere kaçakçılığı, ciddi beyin hasarı ile değiştirilebilir. Bu, pnömoninin iskemik inme geçiren hastalarda mortalitenin önemli bir nedeni olduğu gerçeğiyle kanıtlanmaktadır. Bu protokolün amacı, farelerin akciğerlerinde alveoler makrofajlar, interstisyel makrofajlar, CD103 + veya CD11b + dendritik hücreler (DC’ler), plazmasitoid DC’ler, eozinofiller, monositler / monosit kaynaklı hücreler, nötrofiller, lenfoid kaynaklı T ve B hücreleri, NK hücreleri ve NKT hücreleri dahil olmak üzere 13 tip immün hücreyi tanımlamak için çok renkli akış sitometrik analizinin kullanımını tanımlamaktır. Ayrıca, akış sitometrik analizi ile birleştirilmiş multipleks boncuk dizileri ile aynı anda 13 farklı sitokin veya kemokinin ekspresyon seviyelerini belirlemek için bir boncuk homojenizasyon yöntemi kullanarak akciğer homojenatlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Bu protokol, bulaşıcı akciğer hastalığı veya alerjik hastalık gibi diğer hastalık ortamlarında pulmoner immün yanıtı araştırmak için de kullanılabilir.
Introduction
Akciğerler dış çevreye maruz kalan bir bariyer organıdır ve bu nedenle patojenler ve alerjenler gibi sürekli olarak immünolojik zorluklarla karşılaşırlar1. Akciğerde yerleşik bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu ve bağışıklık hücrelerinin periferden infiltrasyonu, patojenleri pulmoner ortamdan temizlemek için gereklidir. Ek olarak, akciğerde yerleşik bağışıklık hücreleri komensal bakterilere karşı toleransı korur, bu da bu hücrelerin patojen klirensinde ve homeostazın korunmasında rol oynadığını düşündürmektedir1. Alveoler ve interstisyel makrofajlar, patern tanıma reseptörleri aracılığıyla patojenleri algılayan ve bu patojenleri fagositoz2 ile temizleyen akciğerde yerleşik sentinel immün hücreler arasındadır. Akciğerde yerleşik dendritik hücreler, doğuştan gelen ve adaptif immün yanıtı antijen sunumu yoluylaköprülemektedir 3. Ek olarak, aktive edilmiş lokal doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, enflamatuar yanıtı artıran ve monositler, nötrofiller ve lenfositler gibi bağışıklık hücrelerinin akciğerlere sızmasını uyaran sitokinler ve kemokinler üretir1. İskemik inmenin sistemik bağışıklığı modifiye ettiği ve akciğer enfeksiyonuna duyarlılığın artmasına yol açtığı gösterilmiştir; Bununla birlikte, az sayıda çalışma iskemik inme sonrası pulmoner kompartmanı değerlendirmiştir, ancak bazı çalışmalar enflamatuarkoşullar 4,5,6,7,8,9 sırasında incelemiştir. Burada açıklanan yöntemlerin amacı, akciğer patolojisini, immün hücre kompozisyonunu ve akciğerlerdeki sitokin ve kemokin ekspresyon düzeylerini aynı anda belirlemek, pulmoner kompartmandaki değişiklikleri değerlendirmek ve iskemik atak sonrası pulmoner immün yanıttaki potansiyel değişiklikleri değerlendirmektir.
Burada açıklanan, 13 tip bağışıklık hücresini tanımlamak için farelerin akciğerlerinden tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için bir protokoldür. Bu protokol, otomatik bir doku ayrışıcısına ihtiyaç duymadan kollajenaz D ile doku sindirimine dayanır. Ek olarak, akış sitometrisi tabanlı multipleks boncuk dizileri kullanarak 13 farklı sitokin veya kemokinin ekspresyon seviyelerini belirlemek için kullanılabilecek doku homojenatları hazırlamak için bir protokol geliştirdik. Bu protokol, iskemik inmenin pulmoner immünite üzerindeki etkilerini araştırmak için başarıyla kullanılmıştır ve diğer hastalık modellerinde de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokoller, akciğer immün hücre tiplerinin tanımlanmasına ve aynı farede kemokinlerin veya sitokinlerin ekspresyonuna izin verir. Bir histopatoloji çalışması istenirse, tek hücre izolasyon adımlarına geçmeden önce bu amaç için bireysel bir lob çıkarılabilir ve sabitlenebilir. Bu yöntemin bir sınırlaması, bağışıklık hücresi kompozisyonundaki değişimin ve kemokinlerin ve / veya sitokinlerin ekspresyonunun akciğerlerin farklı lobları arasında eşit olmayan bir şekilde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, NIH hibesi P20 GM109098 ve Praespero’dan Edwin Wan’a İnovasyon Ödülü Programı tarafından desteklenmiştir. Akış Sitometrisi deneyleri, NIH hibeleri S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 ve P20 GM103434 tarafından desteklenen WVU Akış Sitometrisi ve Tek Hücreli Çekirdek Tesisi’nde gerçekleştirildi.
Materials
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3′-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
