Summary
Этот протокол описывает использование проточной цитометрии для выявления изменений в составе иммунных клеток, профиле цитокинов и хемокиновом профиле в легочной среде после транзиторной окклюзии средней мозговой артерии, мышиной модели ишемического инсульта.
Abstract
Расширение, активация и перемещение иммунных клеток в легкие, которые контролируются экспрессией нескольких цитокинов и хемокинов, могут быть изменены тяжелой черепно-мозговой травмой. Об этом свидетельствует тот факт, что пневмония является основной причиной смертности у пациентов, перенесших ишемический инсульт. Целью этого протокола является описание использования многоцветного проточного цитометрического анализа для идентификации 13 типов иммунных клеток в легких мышей, включая альвеолярные макрофаги, интерстициальные макрофаги, дендритные клетки CD103+ или CD11b+ (DC), плазмацитоидные ДК, эозинофилы, моноциты / клетки, полученные из моноцитов, нейтрофилы, лимфоидные Т- и В-клетки, NK-клетки и клетки NKT, после индукции ишемического инсульта путем транзиторной окклюзии средней мозговой артерии. Кроме того, описано получение гомогенатов легких методом гомогенизации шариков для определения уровней экспрессии 13 различных цитокинов или хемокинов одновременно с помощью мультиплексных шариковых массивов в сочетании с проточным цитометрическим анализом. Этот протокол также может быть использован для исследования легочного иммунного ответа в других условиях заболевания, таких как инфекционное заболевание легких или аллергическое заболевание.
Introduction
Легкие являются барьерным органом, подвергаются воздействию внешней среды и, следовательно, постоянно получают иммунологические проблемы, такие как патогены и аллергены1. Активация легочно-резидентных иммунных клеток и инфильтрация иммунных клеток с периферии необходимы для очистки патогенов из легочной среды. Кроме того, иммунные клетки-резиденты легких поддерживают толерантность к комменсальным бактериям, предполагая, что эти клетки играют роль в клиренсе патогенов и поддержании гомеостаза1. Альвеолярные и интерстициальные макрофаги входят в число легочных дозорных иммунных клеток, которые воспринимают патогены через рецепторы распознавания образов и очищают эти патогены фагоцитозом2. Легочно-резидентные дендритные клетки соединяют врожденный и адаптивный иммунный ответ через презентацию антигена3. Кроме того, активированные местные врожденные иммунные клетки продуцируют цитокины и хемокины, которые усиливают воспалительную реакцию и стимулируют инфильтрацию иммунных клеток, таких как моноциты, нейтрофилы и лимфоциты, в легкие1. Было показано, что ишемический инсульт модифицирует системный иммунитет и приводит к повышенной восприимчивости к легочной инфекции; тем не менее, немногие исследования оценивали легочный компартмент после ишемического инсульта, хотя некоторые исследования изучали его во время воспалительных состояний 4,5,6,7,8,9. Целью способов, описанных в настоящем описании, является одновременное определение патологии легких, состава иммунных клеток и уровней экспрессии цитокинов и хемокинов в легких для оценки изменений в легочном компартменте и оценки потенциальных изменений легочного иммунного ответа после ишемической атаки.
Здесь описан протокол получения одноклеточных суспензий из легких мышей для идентификации 13 типов иммунных клеток. Этот протокол основан на переваривании тканей коллагеназой D без необходимости автоматизированного тканевого диссоциатора. Кроме того, мы разработали протокол для получения тканевых гомогенатов, которые можно использовать для определения уровней экспрессии 13 различных цитокинов или хемокинов с использованием мультиплексных шариковых массивов на основе проточной цитометрии. Этот протокол был успешно использован для исследования влияния ишемического инсульта на легочный иммунитет и может быть использован и в других моделях заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все выполненные протоколы и процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Западной Вирджинии. Мыши были размещены в условиях, свободных от специфических патогенов, в виварии в Университете Западной Вирджинии.
1. Приготовление растворов
- Готовят перфузионный буфер (фосфатный буферизованный физиологический раствор, PBS). Используйте примерно две аликвоты по 10 мл ледяного PBS на мышь.
- Подготовьте среду клеток легких/буфер FACS. Буфер FACS содержит PBS, дополненный 1% фетальной бычьей сывороткой (FBS). Держите средний холод на протяжении всего процесса иссечения и переноса легких. Приготовьте примерно 8 мл на образец легкого. Подготовьте свежую среду/буфер FACS перед экспериментами.
- Подготовьте буфер диссоциации для изоляции одной клетки. Буфер содержит 1 мг/мл коллагеназы D и 200 мкг/мл ДНКазы I в буферном солевом растворе Хэнка (HBSS). До экспериментов готовят свежий из исходного раствора (100 мг/мл коллагеназы D и 10 мг/мл ДНКазы I). Требуется приблизительно 6 мл на образец легкого. Убедитесь, что буфер достигает комнатной температуры перед использованием.
- Подготовьте буфер гомогенизации для гомогенизации легочной ткани. Буфер содержит PBS и 1x коктейль ингибиторов протеиназы и фосфатазы (запас = 100x). Заново подготовьтесь перед экспериментами. Держите буфер холодным в течение всего процесса гомогенизации. Приблизительно 200 мкл буфера достаточно для гомогенизации одной правой доли легких.
2. Транзиторная окклюзия средней мозговой артерии (tMCAO)
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры tMCAO через введение монофиламента в среднюю мозговую артерию были подробно задокументированы ранее10. В этих экспериментах использовались самцы мышей C57BL/6J в возрасте от 8 до 12 недель весом 25-30 г.
- Короче говоря, подкожно вводят 2 мг/кг мелоксикама мышам перед операцией. Глубоко обезболивайте мышей в индукционной камере, используя 5% изофлурана. Подтвердите глубокую анестезию методом toe-pinch. Поддерживайте анестезию 1-2% изофлураном во время операции с помощью носового конуса. Поддерживайте температуру тела на уровне 36,5 - 38 °C на протяжении всей процедуры, помещая теплое одеяло под мышей. Все хирургические инструменты должны быть автоклавно-стерилизованы за день до операции.
- Побрейте и подготовьте кожу на вентральной шее, используя 70% этанола, а затем скраб с хлоргексидином. Подкожно вводят 2 мг/кг бупивакаина в область разреза перед тем, как сделать первый разрез. Используйте глазную мазь, чтобы покрыть глаза, чтобы предотвратить сухость. Сделайте разрез шеи по средней линии. Аккуратно отведите в сторону мягкие ткани вокруг трахеи.
- Определите левую общую сонную артерию и наружную сонную артерию.
- Наложите временный шов (размер 6/0) на общую сонную артерию, чтобы остановить поток крови. Сделайте разрез в наружной сонной артерии.
- Вставьте монониту с силиконовым покрытием (размер 6-0) в наружную сонную артерию, затем переместите монониту в среднюю мозговую артерию. Оставьте мононить в средней мозговой артерии на 60 мин (окклюзия).
- Контролируйте скорость кровотока с помощью лазерной допплеровской флоуметрии. Снижение скорости потока к средней мозговой артерии, которая составляет > 80%, свидетельствует об успешной окклюзии.
- После 60 мин окклюзии удалите мононить, чтобы произошла реперфузия. Закройте разрез.
- У фиктивных мышей выполните шаги 2.1-2.6 без введения монофиламента. У этих мышей скорость кровотока должна оставаться стабильной в течение всей процедуры.
- Ежедневно наблюдайте за мышами и измеряйте неврологический дефицит, используя стандартные критерииоценки 11. 0 – отсутствие неврологического дефицита; 1 – втягивает контралатеральную переднюю лапу при поднятии хвостом; 2- круги к контралатеральному при поднятии хвостом; 3- падение на контралатеральное во время ходьбы; 4 – не ходит самопроизвольно или находится в коме; 5 – мертвый.
- Обеспечивают подкожные инъекции обычного физиологического раствора и анальгетика (мелоксикам, 2 мг/кг) каждые 24 часа в течение 3 дней после операции.
- Выделяют легкие через 24 и 72 ч после tMCAO для последующего анализа.
3. Сбор легочных тканей
- Глубоко обезболивают мышь внутрибрюшинной (в т..) инъекцией 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина. Подтвердите глубокую анестезию методом toe-pinch.
- Чтобы выполнить транскардиальную перфузию12 всего тела, прикрепите мышь к хирургической платформе и смочите мех 70% этанолом, чтобы уменьшить распределение меха в полости тела. Используйте тонкие ножницы для рассечения, чтобы сделать поперечный разрез в каудальном животе, а затем разрез средней линии брюшины, останавливаясь в грудной полости перед прокалыванием диафрагмы.
- Не разрезайте мышцу/не прячьтесь в брюшную полость и не продолжайте разрез мимо живота.
- Остановите разрез, как только грудная полость будет достигнута, прежде чем проколоть диафрагму. Позаботьтесь о том, чтобы не повредить сердце и легкие, что может поставить под угрозу качество перфузии или восстановление клеток
- С помощью тонких рассеченных ножниц делают разрез средней линии брюшины, останавливаясь на грудной полости перед проколом диафрагмы.
- Схватите мышь за дистальный конец грудины с помощью щипцов и поднимите вверх, разрезая диафрагму, будучи уверенным, что не повредит сердце, легкие или сосудистую систему. Как только органы будут видны, сделайте разрез через грудную клетку и отделите и закрепите реберный корпус, чтобы сердце и легкие были полностью обнажены.
- Осторожно сделайте небольшой разрез в правом предсердии возле дуги аорты. Это послужит оттоком для перфузии.
- Сразу после этого аккуратно вставьте иглу размером 25 Г х 5/8, прикрепленную к шприцу, заполненному 10 мл холодного PBS, в дистальную верхнюю поверхность левого желудочка. Соблюдайте осторожность, чтобы не вставлять через желудочковую перегородку в правый желудочек. Иглу следует с трудом вводить в левый желудочек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если проколоть желудочковую перегородку, жидкость будет вырываться из носа мыши. Это снизит качество перфузии и приведет к потере клеток. - При желании можно использовать зажим для надежного удержания иглы на месте в левом желудочке во время перфузии.
- Неуклонно, но осторожно протолкните 10 мл холодного PBS в сердце. Ткани мыши должны начать перфузировать и очищать кровь по мере выхода жидкости из правого предсердия.
- Нажимайте вторую аликвоту в 10 мл PBS до тех пор, пока не произойдет достаточный клиренс крови. Печень будет иметь светло-коричневый вид, а легкие перейдут от красновато-розового к преимущественно белому цвету.
- Используя щипцы и тонкие ножницы для рассечения, осторожно удалите все окружающие ткани, включая сердце, трахею, пищевод, тимус, соединительную ткань, лимфатические узлы и крупные бронхи.
- Отделите отдельные доли легких и поместите доли в чашку Петри на льду, содержащую 1-2 мл аликвоты холодной легочной клеточной среды.
4. Гомогенизация легочной ткани для мультиплексных шариковых массивов с использованием гомогенизатора бусин
- Предварительно охладите 2 мл конической винтовой колпачковой трубки, содержащей 3 стерильных шарика циркония/кремнезема толщиной 2,3 мм. Добавьте в трубку 200 мкл буфера холодной гомогенизации.
- Взвесьте долю, перенесите долю в предварительно охлажденную коническую трубку, содержащую шарики и буфер гомогенизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 50-100 мг ткани, гомогенизированной в 200 мкл буфера, будет достаточно для обнаружения экспрессии цитокинов и хемокинов в образце.- Гомогенизировать долю с помощью гомогенизатора на основе шариков (см. Таблицу материалов) при 4000 об/мин в течение 2 мин.
- Убедитесь, что ткань полностью гомогенизирована. При необходимости увеличьте время.
- После гомогенизации центрифугируют трубку в предварительно охлажденной (4 °C) микроцентрифуге при 15 870 х г в течение 3 мин.
- Перенесите супернатанты в предварительно охлажденную микропробирку объемом 1,5 мл.
- Поместите образец непосредственно на лед для немедленного использования или храните образец при -80 °C для будущего использования. Избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания.
5. Диссоциация легочной ткани и изоляция одиночных клеток
- Вылейте среду легочных клеток из оставшихся долей легких, чтобы избежать разбавления буфера диссоциации. Затем осторожно вставьте в легочную ткань шприц объемом 1 мл с иглой 25G и 5/8, содержащей 1 мл диссоциационного буфера.
- Вводят мелкие фракции (примерно от 1/4до 1/5) диссоциационного буфера в каждую долю легкого и осторожно раздувают.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большая часть буфера вырвется вскоре после раздувания, так как доля была иссечена. - Повторите инъекцию буфера диссоциации 1-2х.
- Инкубируют доли легких с буфером диссоциации в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Мелко измельчите доли легких на мелкие кусочки с помощью тонких ножниц для рассечения.
- Переложите измельченные кусочки легких с буфером диссоциации в центрифужную трубку объемом 15 мл. Добавка с дополнительным буфером диссоциации в общей сложности до 6 мл. Вихрь энергично в течение 1 мин.
- Инкубируйте образец в течение 45 мин при 37 °C. Вихрь энергично каждые 7-8 мин.
- После 45 мин инкубации энергично вращайте образец в течение 1 мин для достижения оптимальных результатов.
- Далее диссоциируют образец, проходя через клеточный сетчатый фильтр 100 мкм для удаления остаточной, нежелательной соединительной и интерстициальной ткани.
- Центрифугируйте образец в течение 10 мин при 380 х г, выбросьте надосадочный материал.
- Добавьте к образцу 5 мл холодной легочной клеточной среды. Повторное суспендирование клеточной гранулы путем мягкого вихря.
- Центрифугируйте образец в течение 10 мин при 380 х г, выбросьте надосадочный материал.
- Добавьте 1 мл холодной легочной клеточной среды. Повторное суспендирование клеточной гранулы путем мягкого вихря.
- Пройдите через клеточный сетчатый фильтр 100 мкм и подсчитайте клетки.
6. Проточный цитометрический анализ для ниши иммунных клеток легких
- Семена 1-2 х 106 клеток/антител, установленных в 96 лунок круглого дна пластины (всего 3 набора). Центрифугируйте ячейки в течение 3 мин при 830 х г. Выбросьте супернатанты.
- Повторно суспендируйте ячейку гранулы в 50 мкл холодного PBS, содержащего поправимое живое/мертвое пятно. Подготовьте пятно в соответствии с инструкциями производителя.
- Инкубировать клетки при 4 °C в течение 20 мин, защищенных от света. Центрифугируйте ячейки в течение 3 мин при 830 х г. Выбросьте супернатанты.
- Повторно суспендировать клеточную гранулу 25 мкл холодного буфера FACS, содержащего 5 мкг/мл антимышечного антитела CD16/32. Инкубировать при 4 °C в течение 10-15 мин.
- Добавьте к клеткам 25 мкл холодного буфера FACS, содержащего комбинации антител, перечисленные в таблице 1 . Перемешать путем бережного пипетирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем буфера FACS для окрашивания антител составляет 50 мкл. Поэтому при приготовлении мастер-микса антител в 25 мкл концентрация антител должна быть вдвое больше конечной концентрации. - Инкубировать клетки при 4 °C в течение 20 мин, защищенных от света. Центрифугируйте ячейки в течение 3 мин при 830 х г. Выбросьте супернатанты.
- Повторное суспендирование клеток 100 мкл холодного буфера FACS. Центрифугируйте ячейки в течение 3 мин при 830 х г. Выбросьте супернатанты.
- Повторное суспендирование клеток 100 мкл холодного буфера FACS. Переложить в полистирольную трубку с круглым дном 5 мл FACS, содержащую 150 мкл дополнительного буфера FAC. Немедленно проанализируйте образец с помощью проточного цитометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация клеток с помощью следующих шагов позволяет проанализировать образцы позже. - Следуя шагу 6.7., повторно суспендируйте образец со 100 мкл 1% параформальдегида в PBS.
- Инкубируйте образец при 4 °C в течение 15 мин, защищенных от света. Центрифугируйте ячейки в течение 3 мин при 830 х г. Выбросьте супернатанты.
- Повторное суспендирование клеток 100 мкл холодного буфера FACS. Центрифугируйте ячейки в течение 3 мин при 830 х г. Выбросьте супернатанты.
- Повторное суспендирование клеток 100 мкл холодного буфера FACS. Храните ячейки при температуре 4 °C, защищенные от света. Проанализируйте образец в течение 72 ч.
7. Мультиплексные шариковые массивы для обнаружения цитокинов и хемокинов
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступные провоспалительные хемокиновые и воспалительные мультиплексные панели (см. Таблицу материалов) использовались для определения экспрессии хемокинов и цитокинов в легких после индукции tMCAO в соответствии с протоколом производителя, который был подробно описан13.
- Короче говоря, разморозьте аналиты на льду, если они хранились при -80 °C после гомогенизации тканей. Центрифугируйте образец при 590 х г в течение 2 мин при 4 °C перед использованием, чтобы удалить любую остаточную ткань.
- Генерация стандартной кривой путем последовательного разбавления стандартного коктейля (С7), который находится в известной концентрации 10 нг/мл, в 7 стандартов (С1-6), причем последним стандартом является только буфер для анализа (С0).
- После того, как все реагенты нагреются до комнатной температуры, добавьте 25 мкл каждого стандарта и 25 мкл буфера для анализа на пластину скважины V bottom 96.
- К каждой пробной скважине добавляют 25 мкл гомогената легких (аналита) и 25 мкл буфера анализа к пластине скважины V нижней 96
- Энергично вихрьте предварительно покрытые бусины, затем добавьте 25 мкл предварительно покрытых бусин в каждый из стандартных и пробных колодцев.
- Запечатайте пластину и защитите от света, накрыв фольгой. Встряхните пластину при 110 об/мин в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Центрифуга при 230 х г в течение 5 мин. Добавить 200 мкл промывочного буфера в 1х (запасной раствор 20х, разбавить до 1х водой). Инкубировать в течение 1 мин.
- Центрифуга при 230 х г в течение 5 мин. Повторное суспендирование стандартного образца с антителами обнаружения 25 мкл.
- Запечатайте и накройте пластину для защиты от света. Встряхните пластину при 110 об/мин в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Добавьте 25 мкл стрептавидина-фикоэритрина (SA-PE) к каждому стандарту и образцу хорошо.
- Запечатайте и накройте пластину для защиты от света. Встряхните при 110 об/мин в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Вращайте пластину при 230 х г в течение 5 мин. Повторное суспендирование стандарта и образцов в 1x буфере промывки.
- Переложить в хорошо маркированную полистирольную трубку с круглым дном 5 мл FACS, содержащую дополнительные 150 мкл 1x промывочного буфера.
- Определите интенсивность флуоресценции сигнала PE для стандартов и образцов с помощью проточного цитометра.
- Построить стандартную кривую для каждого хемокина и цитокина, используя среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) ПЭ по отношению к заранее определенным концентрациям.
- Определите концентрацию каждого хемокина и цитокина, используя стандартную кривую и МФО из каждого образца. Мультиплексная панель предоставляет программное обеспечение для анализа данных, которое можно использовать для определения концентрации каждого анализируемого вещества. Масса апикальной/верхней доли используется для определения концентрации цитокинов или хемокина на миллиграмм ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Недавно мы сообщили, что индукция ишемического инсульта у мышей изменяет иммунный клеточный состав легких11. В частности, транзиторная церебральная ишемия увеличивала процент альвеолярных макрофагов, нейтрофилов и CD11b + DC, одновременно уменьшая процент CD4 + Т-клеток, CD8 + Т-клеток, В-клеток, NK-клеток и эозинофилов в легочном компартменте. Кроме того, клеточные изменения соответствовали значительно сниженным уровням множественных хемокинов в легких. Здесь описан метод выделения и идентификации различных популяций иммунных клеток в легочном компартменте. Репрезентативные результаты, показанные здесь, были получены от мышей, которые подверглись индукции tMCAO и фиктивной операции.
Мы идентифицировали 13 различных популяций иммунных клеток в легких (L1-L13), используя 3 набора комбинаций антител, каждый из которых содержал 5-7 антител (рисунок 1). Мертвые клетки были исключены с использованием пятна LIVE/DEAD в каждом наборе. Антитела и маркеры для различения различных типов иммунных клеток перечислены в таблице 1. Альвеолярные и интерстициальные макрофаги, CD103+ DC, CD11b+ DC и эозинофилы были идентифицированы в наборе 1 (рисунок 1A,B). Провоспалительные моноциты и нейтрофилы были идентифицированы в наборе 2 (рисунок 1С). Во время воспалительных реакций моноциты мигрируют в место воспаления, где эти клетки дифференцируются в моноцитарные антигенпрезентирующие клетки (mo-APC)14. Понижающая регуляция Ly6C и CCR2 характерна для дифференцировки моноцитов, которую можно оценить с помощью набора 215. CD4+ Т-клетки, CD8+ Т-клетки, В-клетки, плазмацитоидные ДК, NK-клетки и NKT-клетки были идентифицированы с использованием набора 3 (рисунок 1D).
Чтобы определить качество нашего протокола изоляции одиночных клеток, мы сравнили количество жизнеспособных клеток и иммунных клеток CD45+, выделенных с помощью ручного метода, с клетками, изолированными с использованием коммерчески доступного тканевого диссоциатора (см. Таблицу материалов), который часто используется для выделения клеток из тканей 16,17,18,19,20 . В последнем протоколе доли легких переносились в специфическую для диссоциатора трубку (см. Таблицу материалов) после инъекции буфера диссоциации, и ткань переваривали с помощью программы 37C_m_LDK_1. Общее количество жизнеспособных клеток, процент клеток CD45+ и общее количество полученных клеток CD45+ были сопоставимы между двумя методами (рисунок 2A-C). Процент гибели клеток среди клеток CD45+, использующих оба протокола, составил ~ 10% (рисунок 2D). Эти результаты свидетельствуют о том, что протокол, представленный здесь, позволяет восстанавливать клетки с высоким выходом и качеством без помощи автоматизированного тканевого диссоциатора.
Коммерчески доступный мультиплексный анализ в сочетании с проточным цитометрическим анализом использовался для определения концентрации 13 хемокинов с использованием 25 мкл образца (рисунок 3). Два разных размера бусин были впервые идентифицированы FSC/SSC (рисунок 3A). Каждая шарик покрыта 6-7 первичными антителами, которые можно отличить по интенсивности флуоресценции в канале APC (рисунок 3B). Уровень хемокинов в образце пропорционален интенсивности флуоресценции в ПЭ-канале, которую можно определить с помощью МФО (рисунок 3С). Сравнивая значение МФО каждого хемокина со стандартной кривой, построенной с известными концентрациями хемокина, можно определить концентрацию в образце (на мг ткани).
Рисунок 1: Идентификация 13 типов иммунных клеток из легких после переваривания тканей коллагеназой D после ишемического инсульта. Легочные ткани иссекали через 24 ч после tMCAO или фиктивной операции, иммунные клетки в легких анализировали методом проточной цитометрии, определяемой поверхностными маркерами, перечисленными в таблице 1. (A) В наборе антител 1 жизнеспособные клетки CD45+ (*) были впервые помещены на Siglec F и CD11b для идентификации альвеолярных макрофагов (L1), которые экспрессировали CD11c и MHC II, и эозинофилов (L2), которые не экспрессировали CD11c и MHC II. (B) Затем клетки в популяции Siglec F (**) в A были закрыты для определения экспрессии CD103 и CD11b. CD103+ CD11b- (***). Клетки были дополнительно закрыты для определения экспрессии CD11c и MHC II. CD103+ DC выражали как CD11c, так и MHC II (L3), но не экспрессировали CD64. Популяция CD11b hi (****) была дополнительно ограничена для определения экспрессии CD64 и MHC II. CD11b+ DC экспрессировали MHC II, но не CD64 (L4), тогда как интерстициальные макрофаги (L5) экспрессировали оба маркера. (C) В наборе антител 2 жизнеспособные клетки CD45+ в A были закрыты для определения экспрессии CD11b и Ly6C. Клетки Ly6C (*) представляли собой недифференцированные моноциты, которые поддерживали высокий уровень экспрессии CCR2 (L6, средний график), тогда как низкие клетки Ly6C (**) содержали смешанную популяцию дифференцирующих моноцитов, которые были Ly6G- (L6, правый график) и Ly6G+ нейтрофилами (L7). (D) В наборе антител 3 жизнеспособные клетки CD45+ в А были закрыты для определения экспрессии CD11c и B220 для идентификации В-клеток (L8) и плазмацитоидных ДК (L9). Затем CD11c- и B220-популяция (*) была закрыта для определения экспрессии CD4 и CD8 для идентификации CD4+ Т-клеток (L10) и CD8+ Т-клеток (L11). CD4-CD8-популяция (**) была дополнительно ограничена для определения экспрессии NK1.1 и TCRb для идентификации NK-клеток (L12) и NKT-клеток (L13). Показаны репрезентативные графики от 12 мышей C57BL/6J после tMCAO и фиктивной операции. Части рисунка были перепечатаны из ранее опубликованной литературы11 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сравнение ручного метода диссоциации и использования тканевого диссоциатора для выделения отдельных клеток из легких. (А-С) Сравнивали общее количество клеток, процент клеток CD45+ и общее количество клеток CD45+. Показаны комбинированные результаты 3 независимых экспериментов. НС: статистически не значимый. (D) Репрезентативные графики для определения процентной доли мертвых клеток CD45+ после изоляции. Показаны репрезентативные графики из 3-х независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Ишемический инсульт подавляет выработку множественных хемокинов в легких. (А-С) Репрезентативные графики, показывающие определение уровня 13 хемокинов в легких мультиплексным шариковым массивом. (A) Затвор FSC/SSC использовался для идентификации бусин A и B различного размера. (B) Первичные антитела, покрытые шариками, можно отличить по интенсивности флуоресценции в канале APC. (C) Уровень хемокинов в образце был пропорционален интенсивности флуоресценции в ПЭ-канале. Показаны репрезентативные графики от 12 мышей C57BL/6J после фиктивной операции. (D) Легочные ткани гомогенизировались через 24 ч после tMCAO или фиктивной операции. Уровень 13 хемокинов в легких отдельных животных определяли мультиплексным шариковым массивом. Показанные данные представляют собой комбинированные результаты трех независимых экспериментов с n = 11-12 животными на группу. *, P < 0,05; **, P < 0,01; , P < 0,001. NS, статистически не отличается. Части рисунка были перепечатаны из ранее опубликованной литературы11 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Антитело | Клон | Тип иммунных клеток | Население | Выражение маркера поверхности |
| CD45-FITC | 30-Ф11 | Альвелоарные макрофаги | Л1 | CD45+ Сиглек F+ CD11b- |
| Сиглек F-PE | Э50-2440 | Эозинофилы | Л2 | CD45+ Сиглек F+ CD11b+ |
| CD11c-Перцп/Cy5.5 | Н418 | CD103+ DC | Л3 | CD45+ Сиглек F- CD11b- CD103+ CD11c+ MHC II+ |
| CD11b-PE/Cy7 | М1/70 | CD11b+ DC | Л4 | CD45+ Siglec F- CD11b hi CD103- CD64- MHC II+ |
| CD64-БТР | Х54-5/7.1 | Интерстициальные макрофаги | Л5 | CD45+ Siglec F- CD11b hi CD103- CD64+ MHC II+ |
| CD103-BV421 | 2Э7 | |||
| МХК II-BV510 | М5/114.15.2 | |||
| Живой/мертвый БТР/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-Ф11 | Моноциты/моДК | Л8 | CD45+ CD11b hi Ly6C hi/int CCR2+/- Ly6G- |
| Ли6С-ПЭ | ХК1,4 | Нейтрофилов | Л9 | CD45+ CD11b привет Ly6C int CCR2- Ly6G+ |
| CD11b-PE/Cy7 | М1/70 | |||
| CCR2-BV421 | SA203G11 | |||
| Ли6Г-БВ510 | 1А8 | |||
| Живой/мертвый БТР/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-Ф11 | Плазмоцитоидные ДК | Л6 | CD45+ B220+ CD11c+ |
| CD8-PE | 53-6.7 | В-клетки | Л7 | CD45+ B220+ CD11c- |
| NK1.1-Перцп/Cy5.5 | ПК136 | CD4+ Т-клетки | Л10 | CD45+ B220- CD11c- CD4+ CD8- |
| CD11c-PE/Cy7 | Н418 | CD8+ Т-клетки | Л11 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8+ |
| БТР-В220 | РА3-6Б2 | NK-клетки | Л12 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb- |
| CD4-BV421 | ГК1,5 | Ячейки НКТ | Л13 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb+ |
| ТКРб-БВ510 | Н57-597 | |||
| Живой/мертвый БТР/Cy7 |
Таблица 1: Поверхностные маркеры и комбинации антител для определения иммунных клеток, выделенных из легких после tMCAO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протоколы, описанные здесь, позволяют идентифицировать типы иммунных клеток легких и экспрессию хемокинов или цитокинов у одной и той же мыши. Если требуется исследование гистопатологии, индивидуальная доля может быть удалена и зафиксирована для этой цели, прежде чем перейти к этапам изоляции одной клетки. Одним из ограничений этого метода является то, что этот подход может быть неподходящим в некоторых условиях заболевания, если ожидается, что изменение состава иммунных клеток и экспрессии хемокинов и/или цитокинов будет неравномерно распределено между различными долями легких. Например, некоторые бактерии, такие как Mycobacterium tuberculosis, проявляют склонность к заражению определенных долей легкого21. В этом случае может потребоваться сравнение между долями.
Концентрация, время инкубации и температура протокола выделения одной клетки из легких критически влияют на восстановление иммунных клеток из легких. Качество коллагеназы D имеет решающее значение для получения оптимальных результатов и должно быть проверено, если используется другой источник коллагеназы D. Переваривание тканей приводит к увеличению гибели клеток; в то время как недостаточное переваривание тканей вызывает низкий выход иммунных клеток, особенно макрофагов и ДК.
Мы использовали 3 комбинации антител для определения 13 популяций иммунных клеток в легких, причем каждый набор содержал 5-7 антител и пятно LIVE/DEAD. Антитела в каждом наборе могут быть объединены, если количество клеток, полученных из образцов, ограничено. Однако одна из основных проблем, которая возникает при увеличении количества антител, заключается в том, что компенсация флуоресцентного сигнала на проточном цитометре может быть сложной задачей, особенно при различении клеток от миелоидной линии в воспалительных условиях. Дополнительные коктейли антител могут быть использованы для идентификации других врожденных иммунных клеток в одноклеточной суспензии, таких как врожденные лимфоидные клетки и γδ Т-клетки, которые способствуют иммунному ответу в легких22,23. Поскольку для мультиплексного массива берется одна доля легкого, точное количество каждого типа клеток в легких не может быть окончательно определено и сопоставлено, и это представляет собой ограничение этого метода. Чтобы решить эту проблему, определенное количество клеток может быть выделено из легких фиктивных и tMCAO-индуцированных мышей. В этом случае абсолютное число каждого типа иммунных клеток можно точно сравнить между двумя группами. Кроме того, этот метод не позволяет определить локализацию иммунных клеток в легких. Это может быть достигнуто путем выполнения иммуногистохимии на участках легких.
В заключение, этот протокол был использован для исследования влияния ишемического инсульта на легочный иммунитет, но он также может быть использован для изучения других моделей заболеваний, таких как инфекция и аллергия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом NIH P20 GM109098 и Программой премии за инновации от Пресперо до Эдвина Вана. Эксперименты по проточной цитометрии были проведены в WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, который поддерживается грантами NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 и P20 GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
