Summary
Hier wird ein Protokoll für das Modell der chronischen Schlaffragmentierung (CSF) vorgestellt, das durch einen elektrisch gesteuerten Orbitalrotor erreicht wird, der bei jungen Wildtypmäusen bestätigtes kognitives Defizit und angstähnliches Verhalten auslösen könnte. Dieses Modell kann angewendet werden, um die Pathogenese chronischer Schlafstörungen und damit verbundener Störungen zu erforschen.
Abstract
Schlafstörungen sind in der Regel in Derpopulationen als chronische Krankheit oder als beklagtes Ereignis weit verbreitet. Chronische Schlafstörungen sollen eng mit der Pathogenese von Krankheiten, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen, in Verbindung gebracht werden. Kürzlich fanden wir heraus, dass 2 Monate Schlaffragmentierung die Alzheimer-Krankheit (AD) -ähnliche verhaltens- und pathologische Veränderungen bei jungen Wildtyp-Mäusen einleitete. Hierbei stellen wir ein standardisiertes Protokoll zur Erreichung einer chronischen Schlaffragmentierung (CSF) vor. Kurz gesagt, CSF wurde durch einen Orbitalrotor induziert, der bei 110 Umdrehungen pro Minute vibrierte und mit einem sich wiederholenden Zyklus von 10 s-on, 110 s-off, während der Light-ON-Phase (8:00 AM–8:00 PM) kontinuierlich für bis zu 2 Monate arbeitet. Beeinträchtigungen des räumlichen Lernens und Gedächtnisses, angstartiges, aber nicht depressives Verhalten bei Mäusen als Folgen der CSF-Modellierung wurden mit Morris Wasserlabyrinth (MWM), Novel Object Recognition (NOR), Open field test (OFT) und Forced swimming test (FST) bewertet. Im Vergleich zu anderen Schlafmanipulationen minimiert dieses Protokoll die Handhabungsarbeiten und maximiert die Modellierungseffizienz. Es produziert stabile Phänotypen bei jungen Wildtyp-Mäusen und kann potenziell für eine Vielzahl von Forschungszwecken erzeugt werden.
Introduction
Schlafstörungen sind zunehmend sowohl bei Patienten mit schlafstörenden Bedingungen als auch bei gesunden Menschen mit schlafstörenden Ereignissen häufig. Es wurde beobachtet, dass Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen, chronischen Schmerzen, emotionalem Stress, Erkrankungen des Atmungssystems, Erkrankungen des Harnsystems usw. in der Regel über unangenehme Schlaferfahrungen klagen1,2,3,4,5. Obstruktive Schlafapnoe (OSA), periodische Gliedmaßenbewegungen im Schlaf (PLMS), SchlaferhaltungSchlaflosigkeit unter anderen Schlafstörungen sind die häufigsten Ursachen, die Schlaffragmentierung induzieren6,7. In den Industrieländern hat OSA eine Prävalenz von über 5% bis 9% bei der erwachsenen Bevölkerung und 2% in der Kinderbevölkerung8,9,10. Unterdessen gibt es einen wachsenden Anteil der gesunden Bevölkerung, die aufgrund der übermäßigen Nutzung von Smartphones, unregelmäßigen Schlafgewohnheiten, lästigen Geräuschen und Arbeitsaufgaben wie Nachtschichten für Pflegekräfte Schlafstörungen erleben. Schlaf ist anerkannt, wichtig für Die Hirnabfallclearance11,12, Speicherkonsolidierung13,14, metabolisches Gleichgewicht15,16, unter vielen anderen physiologischen Prozessen. Dennoch ist noch weitgehend unbekannt, ob langfristige Schlafstörungen zu irreversiblen Pathogenese-Veränderungen bei gesunden Menschen führen und ob es sich um die Ätiologie oder einen Faktor bei der Entwicklung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie neurodegenerativen Erkrankungen in ein paar Jahren handelt. Unser Ziel ist es, ein experimentelles Modell zu berichten, das stabiles und offensichtliches kognitives Defizit und angstähnliches Verhalten bei jungen Wildtyp-Mäusen nach einer 2-monatigen Schlaffragmentierungsbehandlung erzeugt. Dieses Modell würde zur Beantwortung der oben aufgeführten wissenschaftlichen Fragen angewendet.
Schlafstörungen werden als potenzieller Risikofaktor für die Entwicklung von Alzheimer (AD) oder Demenz aufgeführt. Kang et al. fanden und beschrieben zuerst die Exazerbation der AD-Pathologie um 6 h akuten Schlafentzug17. Danach berichteten viele andere Studien, dass Schlafentzug oder Fragmentierung die Pathogenese in transgenen AD-Mäusemodellen18,19,20verschlimmern könnte. Allerdings haben nur sehr wenige Forscher die Folgen von Schlafstörungen bei jungen Wildtyp-Mäusen untersucht; das heißt, ob Schlafstörungen zu AD-ähnlichem Verhalten oder pathologischen Veränderungen bei jungen Wildtypmäusen führen. In unserer jüngsten Veröffentlichung berichteten wir, dass 2 Monate Schlaffragmentierung ein offensichtliches räumliches Gedächtnisdefizit und angstähnliches Verhalten induzierten, sowie eine erhöhte intrazelluläre Amyloid-β (A) Akkumulation sowohl im Kortex als auch im Hippocampus bei 2-3 Monate alten Wildtypmäusen21. Wir beobachteten auch veränderte Expressionsniveaus von Endosome-Autophagosome-Lysosom-Signalsignalen und Mikroglia-Aktivierung, die den pathologischen Veränderungen ähnelte, die bei APP/PS1-Mäusen21,22berichtet wurden.
Dieses vorgestellte Schlaffragmentierungsprotokoll (SF) wurde von Sinton et al.23 validiert und von Li et al.24modifiziert. Kurz gesagt, ein Orbitalrotor, der bei 110 Umdrehungen pro Minute vibriert, unterbricht den Schlaf für 10 s alle 2 min während der Light-ON-Phase (8:00 Uhr–20:00 Uhr). Die Veränderung der Schlafstruktur in diesem Modell wurde zuvor durch elektrophysiologische Schlafaufzeichnungen charakterisiert und von Li et al.24berichtet, was auf eine signifikante Zunahme der Wachzeit und eine Abnahme des schnellen Augenbewegungsschlafes (REM) während der Light-ON-Phase hindeutet, wobei die Gesamten schlaf- und Wachzeiten (in 24 Stunden) nach mehr als 4 Wochen Modellierung24unbeeinflusst blieben. Derzeit sind Gesamtschlaf oder teilweiseSchlafentzug die am häufigsten verwendeten Schlafmanipulationsmodelle. Der gesamte Schlafentzug wird in der Regel durch eine anhaltende schonende Handhabung oder die Exposition des Tieres gegenüber neuartigen Objekten durchgeführt, alternativ durch kontinuierliches Drehen eines Balkens oder eines laufenden Laufbandes25,26,27,28,29. Aus ethischen Gründen ist die Gesamtschlafentzug in der Regel kürzer als 24 h. Das am häufigsten angewandte Modell für partielle Schlafentzug ist die Wasserplattformmethode, die in erster Linie REM-Schlaf30,31,32abtut. Andere Ansätze, die entweder ein Laufband oder einen Balken verwenden, der entlang der Unterseite des Käfigs fegt, könnten Schlaffragmentierung auslösen, wenn sie in festen Intervallen eingestellt werden33,34,35,36,37,38. Es ist bemerkenswert, dass SF den Schlaf unterbricht und zeitweise für Erregung in allen Schlafstadien24führt. Einer der herausragenden Vorteile dieses CSF-Modells, das Orbitalrotor aufträgt, ist, dass es kontinuierlich für Monate durchgeführt werden kann, automatisch von Maschinen gesteuert, was häufige Verarbeitungsarbeiten täglich außer bei regelmäßiger Überwachung vermeidet. Darüber hinaus würde das Gerät erlauben, mehrere Käfige von Mäusen unter uniformierten Eingriffen gleichzeitig zu modellieren. Während der gesamten Modellierungssitzungen werden Mäuse in ihren Hauskäfigen mit üblichen Einstreu- und Nistmaterialien untergebracht, während einige andere Methoden eine Exposition gegenüber diversifizierten Umgebungen und unvermeidlichem Stress erfordern.
Die Schlaffragmentierung war zuvor durch die Schlafmanipulationsmethode gekennzeichnet, die häufige Erregungen während der Schlafphase und einen erheblichen Schlafrückpris während der Wachphase nachahmt. In einigen Literaturen wurde CSF als Tiermodell für OSA39,40angesehen. In dieser Studie basiert die Begründung der gewählten Häufigkeit der Erregung 30 Mal pro Stunde auf der Beobachtung von Erregungsindizes bei Patienten mit mittelschwerer bis schwerer Schlafapnoe. Es wurde beobachtet, dass 4 Wochen Schlaffragmentierung signifikant erhöhte hyperkapnische Erregung Latenz und die taktile ErregungSchwelle, die mindestens 2 Wochen nach der Genesung dauern könnte24. Dieser Phänotyp wurde durch die aufdeckende aktivierungsreduktion von c-fos bei noradrenergen, orexinergen, histaminergen und cholinergen Wake-aktiven Neuronen als Reaktion auf Hyperkapnien sowie reduzierte katecholaminerge und orexinerge Projektionen in den cingulat cortex24erklärt. Es ist jedoch notwendig zu beachten, dass das wichtigste Merkmal in OSA Hypoxie durch Atemwegsverstopfung verursacht ist, die zu Schlafstörungen41,42führt. Schlafstörungen und sich wiederholende Hypoxie interagieren bei OSA-Pathogenese wechselseitig miteinander. Daher ist die Schlaffragmentierung allein möglicherweise nicht in der Lage, alle wichtigen Funktionen von OSA bei Mäusen vollständig zu demonstrieren.
Hierin präsentieren wir ein standardisiertes Protokoll zur Modellierung der chronischen Schlaffragmentierung bei jungen Wildtypmäusen. Kognitives Defizit und Angst-ähnliche sowie depressionsähnliche Verhaltensweisen nach der CSF-Behandlung wurden von Morris Wasserlabyrinth, Neuartige Objekterkennung, Open Field Test und Erzwungener Schwimmtest bewertet. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Modell als Ganzes genommen werden sollte, die Phänotypen von dysregulierten Schlafmuster erzeugt, kognitives Defizit, und Angst-ähnlicheverhalten. Das aktuelle Modell könnte möglicherweise angewendet werden, 2) Weitere Untersuchung der funktionellen oder molekularen Pathogenese-Mechanismen, die durch chronische Schlafstörungen bei jungen Mäusen ohne genetische Veranlagung induziert werden, 2) Ermittlung des direkten Weges, der zu neurodegeneration durch Schlafstörungen führt, 3) Erforschung der Therapeutika zur Verbesserung der durch chronische Schlafstörungen induzierten Phänotypen, 4) Untersuchung der intrinsischen Schutz-/Ausgleichsmechanismen bei Wildtyp-Mäusen bei chronischer Schlafstörung, 5)
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Protocol
Dieses Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology genehmigt.
1. Mäuse-Screening und Vorbereitung für das Experiment
- Wählen Sie wildtypisierte Erwachsene (8–10 Wochen alt) männliche Mäuse mit einem Gewicht von 20–28 g für das gesamte Experiment aus.
HINWEIS: Wildtyp C57BL/6 Mäuse werden vom Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, China, gewonnen. - Weisen Sie alle Mäuse dem CSF und der Kontrollgruppe zu. Haus 3–5 Mäuse in jedem Käfig, um sozialen Isolationstress zu vermeiden. Die Anzahl der Mäuse, die in den Kontrollkäfigen untergebracht sind, wird mit der Anzahl der Mäuse in den gekoppelten CSF-Käfigen abgeglichen.
HINWEIS: Mäuse in denselben Gruppenkäfigen werden gepoolt, um Verhaltensexperimente durchzuführen. - Suchen Sie die Kontrollkäfige im selben Raum mit den CSF-Käfigen, um die Umgebung und die Arbeitseffekte identisch zu halten.
- Nummerieren und markieren Sie die Mäuse in jeder Gruppe auf ihren Ohren mit einem Ohrschild für Überwachungszwecke.
- Halten Sie Umgebungstemperatur und Luftfeuchtigkeit zwischen 21–23 °C und 35 %–60 % aufrecht.
- Erhalten Sie die Umgebung im 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus (8:00 Uhr– 20:00 Uhr Light-ON, 20:00 Uhr–8:00 Uhr Light-OFF), um eine verzerrte Wirkung auf den normalen Schlafrhythmus bei Mäusen zu vermeiden.
- Minimieren Sie das Rauschen und die Interferenzen, während der Forscher im Modellierungsraum anwesend ist.
- Stellen Sie Mäusen ausreichend Nahrung und Wasser zur Verfügung. Verwenden Sie lange Düsen mit Kugelhahnspitzen auf Wasserflaschen, um Wasseraustritte auf den Plattformbewegungen zu verhindern. Befestigen Sie die Wasserflasche auf dem Käfig mit einer Feder, um die Verwerfung der Flasche während des Rotorlaufs zu vermeiden.
2. Vorbereitung und Einstellung des Orbitalrotors
- Bereiten Sie einen elektrisch gesteuerten Orbitalrotor mit vergrößerter Plattform (67 cm x 110 cm) vor, auf dem höchstens 10 Käfige platziert werden können.
- Stellen Sie den Orbitalrotor während der Light-ON-Phase (8:00 Uhr–20:00 Uhr) ein, der von einem Programmtimer gesteuert wird, d. h. der Zeit, in der Mäuse den Großteil ihres täglichen Schlafes aufweisen.
- Stellen Sie den Orbitalrotor mit einer Drehzahl von 110 Umdrehungen pro Minute und einem sich wiederholenden Zyklus von 10 s-on, 110 s-off gesteuert mit einem Solid-State-Timer.
HINWEIS: Die Tragfähigkeit der Plattform beträgt 50 kg. Die feste Amplitude des Rotorhorizonts vibriert 2,5 cm. - Befestigen Sie die CSF-Käfige auf der Rotorplattform durch dicke Federn, um eine Verwerfung von Käfigen bei Plattformdrehungen zu verhindern.
3. Chronische Schlaffragmentierung Modellierung und Überwachung
- Legen Sie Käfige des CSF und der Kontrollmäuse vor den Experimenten für eine Woche in den Modellierungsraum, damit sich Mäuse an die Umgebung anpassen können.
- Stellen Sie zu Beginn der Modellierung sicher, dass alle Mäuse während der Orbitalrotationen freien Zugang zu Nahrung und Wasser haben.
- Beachten Sie zu Beginn der Modellierung mindestens 1 h, um sicherzustellen, dass der Orbitalrotor im Getriebe arbeitet.
- Während der Modellierungsphase überprüfen Sie, ob der Orbitalrotor ordnungsgemäß funktioniert und Mäuse alle 2 Tage, um sicherzustellen, dass Mäuse genügend Nahrung und Wasser haben. Wechseln Sie die Bettung der Käfige wöchentlich.
- Während der Modellierungszeit wiegen Sie die Mäuse wöchentlich um 8:00 Uhr, wenn Sie die Bettwäsche wechseln. Entfernen Sie die Mäuse mit signifikantem Gewichtsverlust aus der Modellierung, und auch aus den experimentellen Gruppen.
HINWEIS: Signifikanter Gewichtsverlust ist definiert als mit einem Gewicht von weniger als 20 g dauert für 2 Wochen. - Entfernen Sie während der gesamten Modellierungssitzungen den Aggressor, falls vorhanden, aus dem Käfig und auch aus den experimentellen Gruppen.
- Nach Beendigung der Modellierung, weiterhin pflegen und füttern die Mäuse im ursprünglichen Raum.
4. Morris Wasserlabyrinth (MWM) Test
- Vorbereitung auf den Test
- Bereiten Sie das Gerät eines kreisförmigen Tanks mit warmem Wasser (20–23 °C) gefüllt.
- Hängen Sie vier Zeichen mit verschiedenen Formen und Farben auf dem Vorhang um den Tank in vier Quadranten Richtungen als Fernsichtreferenz. Lassen Sie das Wasser durch Zugabe von Milchpulver undurchsichtig erscheinen.
- Finden Sie eine Plattform in der Mitte des südwestlichen Quadranten.
- Der Trainingstest
- Untervorbehalt von Mäusen zwischen 8:00 Uhr und 12:00 Uhr jeden Tag über einen 5-tägigen Trainingszeitraum.
- Lassen Sie jede Maus in das Wasser mit Blick auf die Seitenwand an einem von vier Quadranten in vier Versuchen. Lassen Sie die Maus in jeder Testversion 60 s schwimmen, um die Plattform zu finden. Wenn die Maus nicht in der Lage ist, auf dem Bahnsteig innerhalb von 60 s zu erreichen, führen Sie es auf die Plattform und dort für 15 s zu bleiben.
- Verwenden Sie ein Video-Tracking-System, um automatisch die Escape-Latenz von Mäusen aufzuzeichnen, um die versteckte Plattform zu finden.
- Der Sondentest
- Führen Sie den Sondentest am sechsten Tag nach 5 Trainingstage durch.
- Entfernen Sie die Plattform. Lassen Sie jede Maus aus dem nordöstlichen Quadranten und lassen Sie es für 60 s schwimmen
- Verwenden Sie ein Video-Tracking-System, um die Track-Daten von Mäusen automatisch aufzuzeichnen.
5. Neuartiger Objekterkennungstest (NOR)
- Die vertraute Phase
- Legen Sie Mäuse in einen Tank (Länge 30 cm, Breite 28 cm, Höhe 35 cm) nacheinander, die zwei Kopien von Objekten (A1 und A2) enthält. Lassen Sie die Mäuse frei erforschen (10 min pro Versuch).
- Verwenden Sie ein Video-Tracking-System, um die Track-Daten von Mäusen automatisch aufzuzeichnen.
- Die Testphase
- Führen Sie die Testprüfung nach einer Verzögerung von 1 h der vertrauten Phase durch. Ersetzen Sie eines der Originalobjekte durch ein neuartiges Objekt ("Roman") im Tank, bei dem das andere Objekt unverändert bleibt. Bringen Sie die Mäuse in den Tank zurück und lassen Sie sie 5 min pro Versuch erforschen.
- Verwenden Sie ein Video-Tracking-System, um automatisch die Zeit aufzuzeichnen, die für die Erkundung jedes Objekts durch jede Maus aufgewendet wird.
HINWEIS: Die Erkundung des Objekts wird durch Lecken, Schnüffeln, Kauen oder Bewegen von Vibrissae bestimmt, während die Nase auf das Objekt und weniger als 1 cm vom Objekt ausgerichtet wird. Der Diskriminierungsindex (DI) wird mit der Gleichung (TN - TF)/(TN + TF) berechnet, wobei TN = Zeit für die Erforschung des "neuen" Objekts und TF = Zeit, die für die Erkundung des "vertrauten" Objekts aufgewendet wird.
6. Offener Feldtest (OFT)
- Bereiten Sie das Gerät eines Tanks (30 cm x 28 cm x 35 cm) vor.
- Legen Sie während des Tests jede Maus in die Mitte des Tanks und lassen Sie sie 5 min frei erkunden. Reinigen Sie den Tank nach jeder Studie mit 75% Ethanol, um die Resteffekte der vorherigen Maus zu vermeiden.
- Verwenden Sie ein Video-Tracking-System, um die Track-Daten von Mäusen automatisch aufzuzeichnen.
7. Erzwungener Schwimmtest (FST)
- Bereiten Sie das Gerät eines offenen zylindrischen Gefäßes vor, das Wasser (20–23 °C) enthält, das 15 cm tief ist.
- Legen Sie während des Tests jede Maus in den Zylinder und lassen Sie sie dort für 6 min bleiben.
- Verwenden Sie ein Videospursystem, um die Immobilitätszeit während der letzten 4 min des Tests mit jeder Maus automatisch aufzuzeichnen.
HINWEIS: Die Maus ist entschlossen, unbeweglich zu sein, wenn sie aufhört zu kämpfen und im Wasser schwimmt, so dass nur Bewegungen, die notwendig sind, um ihren Kopf über Wasser zu halten.
8. Datenanalyse
- Analysieren Sie Daten mit statistischer Analysesoftware (z. B. GraphPad Prism 6.0).
- Geben Sie alle Daten als mittels dem ± SEM aus.
- Vergleichen Sie die Escape-Latenz im MWM-Test zwischen zwei Gruppen mit zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Maßnahmen gefolgt von Bonferroni-Posttests. Andere Vergleiche zwischen dem GFK und den Kontrollgruppen werden durch nicht gepaarte t-Tests bestimmt.
- Berücksichtigen Sie die Unterschiede signifikant, wenn P < 0,05 in allen Tests.
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Representative Results
Alle repräsentativen Ergebnisse und Zahlen wurden aus unserer aktuellen Publikation21wiedergegeben. Die Wiederverwendung der Zahlen wurde von der ursprünglichen Zeitschrift zugelassen.
Das gesamte experimentelle Design wird in der Reihenfolge der Zeit dargestellt, die das Timing der CSF-Modellierung, Verhaltenstests von MWM, NOR, OFT und FST angibt (Abbildung 1A). Wir erhielten jede Woche Gewichte von Mäusen aus dem CSF und den Kontrollgruppen, um deren allgemeine Bedingungen während der Modellierungssitzungen zu überwachen. Bei der Gewichtszunahme bei Mäusen zwischen zwei Gruppen während der Modellierung wurde kein offensichtlicher Unterschied festgestellt (Abbildung 1B).
Um die Auswirkungen von CSF auf das räumliche Lernen und die Gedächtnisleistung zu bewerten, haben wir die MWM-Verhaltensstudie43,44durchgeführt. Die CSF-Gruppe zeigte schlechtere Fluchtkapazitäten, um die Plattform während 5 Trainingstage im Vergleich zur Kontrollgruppe zu finden (Abbildung 2A). Im Sondentest verbrachten die CSF-Mäuse deutlich weniger Zeitanteil im Zielquadranten und überquerten den bisherigen Plattformstandort um weniger Male (Abbildung 2B,C), ohne Schwimmgeschwindigkeitsdifferenz ( Abbildung2D). Diese obigen Ergebnisse zeigten, dass die räumlichen Lern- und Gedächtnisabruffähigkeiten von Mäusen nach CSF beeinträchtigt wurden.
Wir haben auch NOR-Tests durchgeführt, um die Objekterkennung und das Kurzzeitarbeitsgedächtnis nach CSF45zu bewerten. In der vertrauten Phase gab es keinen signifikanten Unterschied in der gesamten Explorationszeit zwischen dem GFK und der Kontrollgruppe (Abbildung 3A). Entsprechend wurden in der Explorationszeit zwischen den Objekten A1 und A2 bzw. in zwei Gruppen keine Unterschiede festgestellt (Abbildung 3B). Die obigen Ergebnisse garantierten, dass es keine Unterschiede in den Fähigkeiten der Mäuse für die Exploration und Präferenzen für den Standort gab. In der Testphase wurde der Diskriminierungsindex (DI) der CSF-Mäuse im Vergleich zu Kontrollen(Abbildung 3C) signifikant reduziert, was offensichtlich auf Defizite bei der Objekterkennung und dem kurzfristigen Arbeitsgedächtnis nach CSF hindeutete.
Wir führten weiterhin OFT und FST durch, bzw. um angst- bzw. depressionsähnliche Verhaltensweisen von Mäusen zu untersuchen46,47. Interessanterweise wurde in der OFT festgestellt, dass die CSF-Gruppe weniger Zeit in der zentralen Zone verbrachte als die Kontrollgruppe (Abbildung 4A), die veranschaulichte, dass Schlaffragmentierung bis zu einem gewissen Grad angstähnliches Verhalten auslösen könnte. Darüber hinaus zeigten CSF-Mäuse eine längere Gesamtdistanz, die im Tank bewegt wurde(Abbildung 4B), was auf eine erhöhte spontane Aktivität nach der Modellierung hindeutet. Dennoch konnte diese CSF-Modellierung kein depressives Verhalten hervorrufen, das durch einen nicht signifikanten Unterschied in der Immobilitätszeit zwischen zwei Gruppen, die dem FST unterworfen sind, überprüft wurde (Abbildung 4C).
Abbildung 1: Das Flussdiagramm des experimentellen Entwurfsverfahrens. (A) Das experimentelle Entwurfsverfahren, das den Zeitpunkt der CSF-Modellierung und Verhaltenstests angibt (d. h. MWM, NOR, OFT und FST). (B) Körpergewichtskurven des CSF und der Kontrollmäuse im ersten Monat nach der Einrichtung des CSF-Modells. Diese Abbildung wurde von Xie et al.21geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: CSF beeinträchtigte räumlicheS Lernen und Gedächtnisfähigkeiten durch MWM-Test bewertet. (A) Die CSF-Mäuse führten während des 5-tägigen Trainingstests eine längere Escapelatenz im Vergleich zu den Kontrollmäusen durch. **p < 0,01. (B) Im Sondentest wiesen die CSF-Mäuse im Gegensatz zu den Kontrollmäusen weniger prozentuale Zeit im Plattformquadranten auf. Das obere Panel zeigt repräsentative Nachverfolgungen zweier Gruppen. p < 0,0001. (C) Im Prüfversuch führte die CSF-Gruppe weniger Zeiten beim Überqueren der Plattformposition im Vergleich zur Kontrollgruppe durch. *p < 0,05. (D) Die Schwimmgeschwindigkeit von zwei Gruppen im Sondentest. n.s. weist darauf hin, dass die Veränderungen zwischen den verschiedenen Gruppen nicht signifikant waren. Die Daten wurden alle als Mittelwert ± SEM. n = 10 pro Gruppe dargestellt. Diese Abbildung wurde von Xie et al.21geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: CSF beeinträchtigte Objekterkennung und Kurzarbeitsspeicher, der durch den NOR-Test ausgewertet wird. (A) Die gesamte Explorationszeit zwischen dem CSF und den Kontrollmäusen in der vertrauten Phase, n.s. zeigt keine signifikanten Veränderungen zwischen verschiedenen Gruppen an. (B) Die Erkundungszeit für die Objekte A1 bzw. A2 zwischen zwei Gruppen in der vertrauten Phase. n.s. weist auf keine signifikanten Veränderungen zwischen verschiedenen Gruppen hin. (C) In der Testphase wurde der Diskriminierungsindex (DI) der CSF-Gruppe im Vergleich zu dem der Kontrollgruppe erheblich verringert. *p < 0,05. Die Daten wurden alle als Mittelwert ± SEM. n = 10 pro Gruppe dargestellt. Diese Abbildung wurde von Xie et al.21geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: CSF verschlimmerte Angst-ähnliches, aber nicht depressionsähnliches Verhalten, das von OFT und FST bewertet wurde. (A) Die CSF-Mäuse verbrachten während der beobachteten 5 min weniger Zeit in der zentralen Zone als die Kontrollmäuse in OFT. *p < 0,05. (B) Die CSF-Gruppe zeigte eine längere Gesamtentfernung an, die im Tank verschoben wurde, im Vergleich zur Steuerungsgruppe in OFT. *p < 0,05. (C) Die Immobilitätszeit zwischen dem GFK und den Kontrollgruppen in FST. n.s. weist auf keine signifikanten Veränderungen zwischen verschiedenen Gruppen hin. Die Daten wurden alle als Mittelwert ± SEM. n = 10 pro Gruppe dargestellt. Diese Abbildung wurde von Xie et al.21geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Zu den kritischen Schritten des aktuellen Protokolls gehören die Einrichtung von Schlaffragmentierungsmaschinen mit den optimierten Parametern entsprechend dem Studienzweck und die Aufrechterhaltung der Mäuse in komfortablen und ruhigen Lebensbedingungen während der gesamten Modellierungssitzungen. Es ist auch wichtig, das richtige Timing zu entscheiden, um die Schlaffragmentierung zu unterbrechen oder zu stoppen und Verhaltenstests für diese Mäuse zu arrangieren. Wie andere Schlafmanipulationsmodelle ist es wichtig, das Protokoll in einem dedizierten Raum mit kontrollierten Lichtzyklen und ohne alle möglichen unnötigen Interferenzen durchzuführen. Es sollten Anstrengungen unternommen werden, um Lärm zu vermeiden und die von den Forschern durchgeführte Betriebszeit für die Kontrolle, das Nachfüllen von Lebensmitteln und die Wasserversorgung, den Wechsel der Bettwäsche usw. zu minimieren. In seltenen Fällen gibt es Aggressoren, die die Littermates angreifen, vor allem bei der Einleitung von unangenehmen Schlafstörungen. Der Angreifer, wenn vorhanden, sollte aus den heimischen Käfigen sowie den Versuchsgruppen entfernt werden. Die meisten Versuchstiere, mit Ausnahme einiger weniger unserer Erfahrung, würden sich an die Behandlung anpassen und es schaffen, nach Bedarf Zugang zu Wasser und Nahrung zu erhalten. Mäuse mit intrinsischen Problemen, wie deformierte Zähne, Untergewicht und Hautwunden können Gewichtsverlust oder Schwäche verursachen. Sie müssen auch vermieden werden, für die Modellierung verwendet zu werden. Da dieses Protokoll potenziell chronischen Stress und metabolische Dysregulation induzieren könnte, ist es wichtig, Mäuse zu verwenden, die mit uniformierten Kriterien wie Körpergewicht gescreent werden, für Modellierung und Experimente.
Im beschriebenen Protokoll würde der Orbitalrotor täglich automatisch von 8:00 Uhr bis 20:00 Uhr (light-ON) eingeschaltet, also in der Zeit, in der Mäuse den größten Teil ihres täglichen Lebens zeigen. Der Rotor wurde auf einem sich wiederholenden Zyklus von 10 s-on, 110 s-off während der Light-ON-Phase eingestellt, um häufige Erregungen zu verursachen. Verschiedene Modellierungsdauern würden zu unterschiedlichen Phänotypen führen. Akute Schlaffragmentierung könnte zu einer absoluten Verringerung der Schlafdauer, erhöhte sympathische Aktivitäten des Nervensystems, wie erhöhte Kortisonspiegel und beeinträchtigte Insulinempfindlichkeitführen 23,24. Jedoch, chronische Schlaffragmentierung zeigte unbeeinflusste Kortisonspiegel, und ausgewogene Gesamtschlafzeit24. Alle Änderungen, die auf dem aktuellen Protokoll basieren, wie Z. B. Lichtzyklen, übereinstimmende Vibrierende Einstellungen (Geschwindigkeit, Amplitude, Repetitive Cycle usw.) und Modellierungsdauern, könnten die Phänotypen möglicherweise verändern. Es ist erforderlich, Schlafaufzeichnung und Schlafstrukturanalyse unter verschiedenen Modellierungseinstellungen durchzuführen, um die Schlafphänotypen zu identifizieren. Es kann auch zu ausgeprägten Verhaltens- und pathologischen Veränderungen führen. Als wir das kognitive Defizit nach langfristiger statt einer Nacht Schlaffragmentierung untersuchten und dazu neigten, die verzerrten Auswirkungen intermittierender Schlaffragmentierung auf das Verhalten von Mäusen in MWM und NOR zu vermeiden, führten wir diese beiden Verhaltenstests durch, nachdem wir das CSF-Protokoll am 60. Tag beendet hatten. Jedoch, unweigerlich, die Wirkung der Erholung Schlaf bei Mäusen könnte die Ergebnisse für MWM und NOR gezeigt verwirrt haben.
Obwohl dieses Modell mit Schlaffragmentierungsmodell betitelt ist, besteht es tatsächlich aus fragmentierten Schlafmustern während der Light-ON-Phase, Dysregulation des zirkadianen Rhythmus und kompensatorischem Schlafrebound während der Light-OFF-Phase. Dieses Protokoll könnte nicht nur Schlafmusterveränderungen induzieren, sondern auch erhebliche Neuroinflammation, metabolisches Ungleichgewicht, Störungen des Immunsystems, etc21,23,24. Alle diese pathologischen Prozesse können miteinander interagieren und Phänotypen wie ein Orchester vermitteln. Dieses Modell sollte als Ganzes genommen werden, um die Mäuse mit Phänotypen von dysreguliertem Schlafmuster, kognitivem Defizit und Angst-ähnlichem Verhalten bei jungen Wildtyp-Mäusen zu erzeugen. Wie im vorherigen Abschnitt erwähnt, spiegelt dieses Modell OSA aufgrund des Mangels an sich wiederholender Hypoxie nicht genau. Eine weitere Einschränkung ist, dass es schwierig ist, genaue pathologische Veränderungen und Schlaf-Phänotypen bei den gleichen Mäusen zu erzeugen. Die weit verbreitete EEG/EMG Elektrodenimplantation zur Schlafaufzeichnung induzierte unweigerlich schwere Gliose im Kortex48. In den letzten Jahren wurden Videoüberwachungs- und Bildanalysetechniken auf Basis künstlicher Intelligenz in Schlafstudien eingesetzt, die präzise Schlafinformationen ohne invasive Elektrodenimplantation49,50,51sammeln würden.
Die Bedeutung dieser CSF-Methode im Vergleich zu bestehenden Methoden sind: 1) Anders als Schlafentzugsprotokolle, die in der Regel stunden- oder tagelang durchgeführt werden, imitiert das aktuelle Protokoll langzeitliche Schlafstörungen bei gesunden Menschen besser. Der ausgleichende Schlaf-Rebound in schlaffragmentierten Mäusen spiegelt perfekt die Tagesmüdigkeit und die verzögerungsbehene Arbeitsleistung bei Menschen mit schlechter Schlafqualität in der Nacht52,53wider. 2) Es ist bisher das einzige chronische Schlaffragmentierungsmodell bei jungen Wildtyp-Mäusen mit bestätigtem kognitivem Defizit und angstähnlichen, aber nicht depressiven Verhaltensphänotypen sowie offensichtlichen molekularen pathologischen Veränderungen im Hirngewebe. 3) Diese Behandlung verursacht mildere Reizungen bei Mäusen, so dass die Modellierung monatelang dauern kann, auch mit der Möglichkeit, in längeren Zeiträumen durchgeführt zu werden. 4) Mit den richtigen Einstellungen, Dieses Modell kann stabile Phänotypen von Schlafstörungen erzeugen, kognitives Defizit, und Angst-ähnliche Verhalten, die entweder als Krankheitsmodelle oder Interventionen für verschiedene Studiendesigns verwendet werden können. 5) Einige Schlafentzugsmodelle erfordern eine vollständige Sitzungsinterferenz von Forschern, um sanfte Handhabung oder neuartige Objekte anzuwenden. Mit Ausnahme der regelmäßigen Überwachung minimiert diese Methode die Handhabung von Arbeitsaufgaben, wodurch auch die künstliche Verzerrung beseitigt wird.
Dieses CSF-Protokoll bietet die Möglichkeit, eine Reihe wichtiger wissenschaftlicher Fragen zu beantworten, wie z. B. ist chronische Schlafstörung die Ursache oder Folge neurodegenerativer Erkrankungen? Ist chronische Schlafstörung induzierte Pathogenese in jungen Jahren reversibel? Unterscheiden die Kompensationsmechanismen bei chronischen Schlafstörungen zwischen jungen und älteren Menschen, gesunden Menschen und Patienten? Dieses Protokoll kann auch angewendet werden, um Therapeutika zu erforschen, indem die Schwere und Verbesserung der Verhaltens- und molekularen Phänotypen bewertet werden. Es würde auch angewendet werden, um die Mäuse mit chronischer Kraniektomie, Optische Faserimplantation Präparate für funktionelle Aufnahmen zu modellieren. Darüber hinaus kann es möglicherweise als interventionelle Strategie verwendet werden, um Phänotypen zusätzlich zu bereits bestehenden Bedingungen zu induzieren oder zu verschlimmern. Schließlich kann es für das Studium der Schlaf-Wach-Zustand Übergangsmechanismen verwendet werden. Interessanterweise könnte das aktuelle CSF-Modell eher angstartiges als ein depressionsähnliches Verhalten bei Mäusen induzieren, was der klinischen Beobachtung entspricht, dass die Schlafstörung bei Patienten wahrscheinlich viel mehr mit Angst zu tun hätte als mitDepressionen 54,55. Es bietet ein praktisches Modell, um emotionale Störungen bei Nagetieren zu studieren.
Zusammenfassend stellen wir das Protokoll zur Modellierung der chronischen Schlaffragmentierung durch verwendung eines vibrierenden Orbitalrotors vor, der stabile Phänotypen bei jungen Wildtypmäusen erzeugen und die Modellierungsarbeiten mit hoher Effizienz minimieren könnte. Es kann potenziell für eine Vielzahl von Forschungszwecken generiert werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (61327902-6 an W. Wang und 81801318 an F.F. Ding) unterstützt. Wir würdigen Dr. Sigrid Veasy für die Einrichtung des SF-Experimentalsystems und die freundliche Bereitstellung technischer Details. Wir würdigen Dr. Maiken Nedergaard für lehrreiche Kommentare für verwandte Experimente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Any-maze behavior tracking system | Stoelting,Inc,USA | - | A video-tracking system which was used to record the behavior track of mice. |
| C57BL/6J mice | Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, China. | - | healthy male C57BL/6J mice aged 10-12 weeks were purchased from Hubei Research Center for Laboratory Animals |
| Graphpad Prism 6.0 Software | Graphpad Software,Inc.USA | - | Graphpad Prism 6.0 software was used to draw statistical graphs. |
| Morris water maze system | Shanghai XinRuan Information Technology Co.,Ltd,China | XR-XM101 | The system was used to perform Morris water maze test |
| Orbial rotor | Shanghai ShiPing Laboratory Equipment Co.,Ltd,China | SPH-331 | The orbital rotor was used to establish the chronic sleep fragmentation model |
| Solid state timer | OMRON Corporation, Kyoto, Japan | H3CR-F8-300 | The solid state time was used to control the frequency and time of the rotor running |
| Wooden Lusterless Tank | - | - | length 30 cm, width 28 cm, height 35 cm The tank was used to perform open field test and novel object recognition test |
References
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