Behavior

使用振动轨道转子诱导年轻野生型小鼠认知缺陷和焦虑样行为的慢性睡眠碎片模型

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61531

Yi Xie¹, Sai-Yue Deng¹, Si-Miao Chen¹, Xue-Jiao Chen¹, Wen-Wen Lai¹, Li-Fang Huang¹, Li Ba¹, Wei Wang^1,2, Feng-Fei Ding^1,3

¹Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000, China, ²Key Laboratory of Neurological Diseases of Chinese Ministry of Education, The School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000,China, ³Department of Pharmacology, School of Basic Medical Science; State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institutes of Brain Science and Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University, Shanghai 200032, China

Summary

这里介绍的是一个由电控轨道转子实现的慢性睡眠碎片（CSF）模型的协议，它可以诱导年轻野生型小鼠的认知缺陷和类似焦虑的行为。该模型可用于探索慢性睡眠障碍和相关疾病的发病机制。

Abstract

睡眠障碍通常作为慢性疾病或投诉事件在人群中很常见。慢性睡眠障碍建议与疾病的发病机制密切相关，特别是神经退行性疾病。我们最近发现，2个月的睡眠分裂引发了老年痴呆症（AD）样的行为和病理变化的年轻野生型小鼠。在这里，我们提出了一个标准化的协议，以实现慢性睡眠分裂（CSF）。简言之，CSF 是由轨道转子在 110 rpm 时振动引起的，在光打开阶段（上午 8：00-晚上 8：00）连续运行长达 2 个月，重复周期为 10 s 开，110 s-off。空间学习和记忆的损伤，焦虑样，但不是抑郁症样的行为，在小鼠作为CSF建模的后果，被评估与莫里斯水迷宫（MWM），新颖的对象识别（NOR），开放领域测试（OFT）和强迫游泳测试（FST）。与其他睡眠操作相比，此协议最大限度地减少了处理工作，并最大限度地提高了建模效率。它在年轻的野生型小鼠中产生稳定的表型，并有可能产生用于各种研究目的。

Introduction

睡眠障碍在睡眠干扰状况患者和有睡眠干扰事件的健康人中越来越常见。据观察，患有神经退行性疾病、慢性疼痛、情绪压力、呼吸系统疾病、泌尿系统疾病等的患者，通常抱怨睡眠不愉快的经历^{1、2、3、4、5。}阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）、睡眠中的周期性肢体运动（PLMS）、睡眠维持失眠等睡眠障碍是最常见的原因，诱发睡眠分裂^6、7。在发达国家，OSA在成人人口中的患病率超过5%至9%，在^8、9、10岁儿童中患病率超过2%。同时，由于智能手机的过度使用、不规则的睡眠习惯、恼人的噪音和工作职责（如照顾者的夜班）而遭受睡眠障碍的健康人群比例越来越大。睡眠被认为是重要的脑废物清除^11，12，记忆巩固^13，14，代谢平衡15，16，许多其他生理过程。然而，长期睡眠障碍是否会导致健康人不可逆转的发病机制变化，以及它是未来几年内发展中枢神经系统疾病（如神经退行性疾病）的病因还是促成因素，仍在很大程度上还不得而知。我们的目标是报告一个实验模型，在经过2个月的睡眠分裂治疗后，在年轻的野生小鼠中产生稳定和明显的认知缺陷和焦虑样的行为。此模型将用于回答上述科学问题。

睡眠障碍被列为发展阿尔茨海默氏症（AD）或痴呆症的潜在危险因素。康等人首次发现并描述了AD病理学恶化6小时急性睡眠剥夺^17。此后，许多其他研究报告说，睡眠不足或分裂可能加剧转基因AD小鼠模型^18，19，20的发病机理。然而，很少有研究人员研究过幼小野鼠睡眠障碍的后果：即睡眠障碍是否会引起年轻野性小鼠的AD样行为或病理变化。在我们最近的出版物中，我们报告说，2个月的睡眠分裂导致明显的空间记忆缺陷和焦虑样的行为，以及增加细胞内淀粉样β（A+）积累在皮层和海马在2-3个月大的野生型小鼠^21。我们还观察到内体-自噬体溶酶体通路标记和微胶质活化的表达水平改变，这与APP/PS1小鼠^21、22中报告的病理变化相似。

这份提交的睡眠碎片（SF）协议经辛顿等人^23日验证，并经李等人^24日修改。简言之，在110 rpm的轨道转子振动，在光打开阶段（上午8：00-晚上8：00）每2分钟中断睡眠10秒。该模型中的睡眠结构变化以前以电生理睡眠记录为特征，由Li等人^报告，表明在光上阶段的唤醒时间显著增加，快速眼动（REM）睡眠减少，总睡眠和唤醒时间（在24小时内）在4周以上的建模²⁴后不受影响。目前，总睡眠或部分睡眠剥夺是最常用的睡眠操纵模型。完全睡眠不足通常通过持续温和的处理或使动物接触新事物，或者通过连续旋转一个酒吧或跑步机25，26，27，28，29进行。由于道德原因，完全睡眠不足通常短于24小时。最常用的部分睡眠剥夺模型是水平台方法，它主要消融REM睡眠30，31，32。其他方法使用跑步机或酒吧，沿着笼子的底部扫，可能会诱发睡眠碎片时，设置在固定间隔33，34，35，36，37，38。值得注意的是，SF中断睡眠，断断续续地导致所有睡眠阶段的唤醒^24。应用轨道转子的CSF模型的一个突出优点是，它可以连续运行几个月自动由机器控制，避免每天频繁处理劳动，除了定期监测。此外，该仪器将允许在军警干预下同时对多个老鼠笼子进行建模。在整个建模过程中，老鼠被安置在家庭笼子里，有通常的床上用品和筑巢材料，而其他一些方法则需要暴露在多样化的环境和不可避免的压力中。

睡眠分裂以前的特点是睡眠操纵方法，它模仿睡眠阶段频繁的觉醒和唤醒阶段的大量睡眠反弹。在一些文献中，CSF被认为是OSA^39，40的动物模型。在这项研究中，选择的唤醒频率为每小时30次的原理是基于对中度至重度睡眠呼吸暂停患者的唤醒指数的观察。据观察，4周的睡眠分裂显著增加了超胶囊唤醒延迟和触觉唤醒阈值，这至少可以持续2周后恢复^24。这种表型的解释是揭示c-fos活化减少诺拉迪纳吉奇，奥里辛热，组胺，和胆碱唤醒活性神经元，以回应高气喘，以及减少的儿茶酚胺和奥里辛ergic投影到结晶皮层^24。然而，有必要指出，OSA最重要的特点是气道阻塞引起的缺氧，导致睡眠中断^41，42。睡眠障碍和重复性缺氧在OSA发病机制中相互相互作用。因此，单靠睡眠分裂可能无法充分证明小鼠OSA的所有关键特征。

在此，我们提出了一个标准化的协议，以模拟年轻野生型小鼠的慢性睡眠分裂。在CSF治疗后，由莫里斯水迷宫、新奇物体识别、开放领域测试和强迫游泳测试评估了认知缺陷、焦虑和抑郁样行为。值得注意的是，这个模型应该作为一个整体，产生表型的调节不良的睡眠模式，认知缺陷，和焦虑般的行为。目前的模型可能适用于以下目的，但不限于以下目的：1）进一步研究在没有遗传倾向的幼鼠慢性睡眠障碍引起的功能或分子发病机制， 2）确定睡眠障碍引起的神经退化的直接途径，3）探索改善慢性睡眠障碍诱发的表型的治疗方法，4）研究野生型小鼠在慢性睡眠障碍下的内在保护/补偿机制，5）应用于研究睡眠唤醒调节和状态过渡机制。

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Protocol

该协议经同济医院、同济医学院、华中科技大学动物护理与使用委员会批准。

1. 老鼠筛选和实验准备

在整个实验中，选择体重为20-28克的野生型成年小鼠（8-10周大）雄性小鼠。
注：野生型C57BL/6小鼠来自中国湖北实验室动物研究中心。
随机将所有小鼠分配给CSF和对照组。每个笼子里住3-5只老鼠，以避免社会隔离压力。控制笼中容纳的老鼠数量与配对CSF笼中的老鼠数量相匹配。
注：同一组笼子中的老鼠被集中起来进行后续行为实验。
将控制笼与CSF笼子放在同一个房间内，以保持周围环境和劳动效果的一致。
使用耳标来标记和标记每组耳朵上的鼠标，用于监测目的。
保持21-23°C至35%-60%之间的环境温度和湿度。
保持环境环境在12小时的光-暗周期（上午8：00-晚上8：00点开灯，晚上8：00-上午8：00光关），以避免对小鼠正常睡眠节奏的偏差影响。
当研究人员在建模室时，尽量减少噪音和干扰。
为老鼠提供充足的食物和水。在水瓶上使用带球阀尖的长喷嘴，防止平台运动时漏水。用弹簧将水瓶固定在笼子顶部，以避免在转子运行过程中瓶子脱位。

2. 轨道转子的准备和设置

准备一个电动控制的轨道转子与扩大的平台（67厘米x110厘米），其中最多可以放置10个笼子。
在由程序计时器控制的光上阶段（上午 8：00-8：00）期间设置轨道转子，此时小鼠将展示其大部分日常睡眠。
设置轨道转子，速度为 110 rpm，重复周期为 10 s-on，110 s-off，由固态定时器控制。
注：平台的负载容量为 50 kg。转子地平线振动的固定振幅为2.5厘米。
用厚厚的弹簧将CSF笼子固定在转子平台顶部，以防止在平台旋转时笼子脱位。

3. 慢性睡眠碎片建模和监测

在实验前将CSF和对照小鼠的笼子放入建模室一周，让小鼠适应环境环境。
在建模开始时，确保所有小鼠在轨道旋转期间都能自由获得食物和水。
在建模开始时，至少观察1小时，以确保轨道转子在齿轮上运行。
在建模期间，检查轨道转子是否正常运行，小鼠每2天进行一次条件检查，以确保小鼠有足够的食物和水。每周更换笼子的床上用品。
在建模期间，更换床上用品时，每周上午 8：00 给小鼠称重。将体重显著减轻的小鼠从建模中取出，也从实验组中取出。
注：显著减肥的定义是体重低于20克持续2周。
在整个建模过程中，将侵略者（如果有的话）从笼子里移走，也从实验组中取出。
建模终止后，继续维持和喂养原房间内的小鼠。

4. 莫里斯水迷宫（MWM）测试

测试准备
1. 准备装满温水（20-23°C）的圆形水箱的装置。
2. 将四个形状和颜色不同的标志悬挂在坦克周围的窗帘上，以四个象限方向作为远视参考。添加奶粉使水显得不透明。
3. 在西南象限的中间定位一个平台。
培训测试
1. 在为期5天的训练期间，每天上午8：00至12：00对小鼠进行连续四次试验。
2. 在四个试验中，将每只鼠标释放到面向侧壁的水中，这是四个象限之一。在每一次试验中，让老鼠游60年代才能找到平台。如果鼠标在 60 年代内无法到达平台，则引导它到平台，并在那里停留 15 s。
3. 使用视频跟踪系统自动记录小鼠的逃生延迟，以查找隐藏的平台。
探头测试
1. 经过5天的训练后，于第六天进行探针测试。
2. 删除平台。从东北象限释放每只鼠标，并允许它游泳60s
3. 使用视频跟踪系统自动记录小鼠的跟踪数据。

5. 新颖对象识别（NOR）测试

熟悉的阶段
1. 将小鼠按顺序放置在一个水箱中（长30厘米，宽28厘米，高35厘米），其中包含两个副本的物体（A1和A2）。让小鼠自由探索（每次试验10分钟）。
2. 使用视频跟踪系统自动记录小鼠的跟踪数据。
测试阶段
1. 在熟悉阶段延迟 1 小时后进行测试试验。将其中一个原始对象替换为油箱中的新对象（"小说"），使另一个对象保持不变。将小鼠送回水箱，每次试用5分钟。
2. 使用视频跟踪系统自动记录每个鼠标在探索每个对象时花费的时间。
  注：物体的探索是由舔、嗅、咀嚼或移动振动决定的，同时将鼻子朝向物体，距离物体不到1厘米。歧视索引（DI）是用方程（TN + TF） / （TN + TF）计算的，其中 TN = 探索"新颖"对象的时间和 TF = 探索"熟悉"对象所花费的时间。

6. 开放式现场测试（OFT）

准备坦克的装置（30厘米×28厘米×35厘米）。
在测试期间，将每个鼠标放入油箱中心，并允许它自由探索 5 分钟。每次试验后用 75% 的乙醇清洁油箱，以避免前一个鼠标的剩余效果。
使用视频跟踪系统自动记录小鼠的跟踪数据。

7. 强迫游泳测试（FST）

准备一个开放的圆柱形容器的仪器，其中包含水（20-23°C）是15厘米深。
在测试期间，将每个鼠标放入气缸中，并允许其在那里停留 6 分钟。
使用视频跟踪系统自动记录每个鼠标测试的最后 4 分钟的不动时间。
注：当老鼠停止挣扎和漂浮在水中时，它决心不动，只做必要的运动，以保持它的头在水面上。

8. 数据分析

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Representative Results

所有有代表性的结果和数字均由我们最近出版的^第21期转载。原期刊允许重复使用这些数字。

整个实验设计按时间顺序进行说明，表示CSF建模的时间、MWM、NOR、OFT和FST（图1A）的行为测试。我们每周从CSF和对照组获得老鼠的重量，以监测它们在建模过程中的一般情况。在建模过程中，两组小鼠的体重增加没有明显差异（图1B）。

为了评估CSF对空间学习和记忆性能的影响，我们进行了MWM行为试验^43，44。与对照组（图2A）相比，CSF组在5个训练日内发现平台的逃生能力较差。在探针测试中，CSF小鼠在目标象限中花费的时间比例显著降低，并且通过之前平台位置的时间更少（图2B，C），没有游泳速度差异（图2D）。以上结果表明，CSF后小鼠的空间学习和记忆检索能力受到损害。

我们还进行了NOR测试，以评估CSF⁴⁵之后的对象识别和短期工作记忆。在熟悉的阶段，CSF与对照组（图3A）的总勘探时间没有显著差异。相应地，在A1和A2两组（图3B）的探测时间中未发现差异。上述结果保证了小鼠的探索能力和对位置的偏好没有差异。在测试阶段，与对照组（图3C）相比，CSF小鼠的歧视指数（DI）显著降低，这明显表明CSF之后的对象识别和短期工作记忆存在缺陷。

我们进一步执行了 OFT 和 FST，分别检查了^46、47小鼠的焦虑和抑郁行为。有趣的是，在 OFT 中，发现CSF组在中心区域的时间比对照组（图4A）少，这表明睡眠分裂可以在一定程度上诱发类似焦虑的行为。此外，CSF小鼠在水箱中移动的总距离更长（图4B），表明建模后自发活动增加。然而，这种CSF建模不能诱发抑郁症样的行为，验证了受FST（图4C）的两组之间的不动时间的非显著差异。

图1：实验设计程序的流程图。（A）指示CSF建模和行为测试时间的实验设计程序（即MWM、NOR、OFT和FST）。（B） CSF模型建立后的第一个月，CSF和对照小鼠的体重曲线。这个数字已经从谢等人^修改了21请点击这里查看这个数字的较大版本。

图3：由NOR测试评估的CSF受损对象识别和短时间工作记忆。（A） CSF 与对照小鼠在熟悉阶段的总探索时间，n.s. 表示不同组之间没有显著变化。（B）在熟悉阶段，两组物体A1和A2的探测时间。n.s.表示不同组之间没有显著变化。（C）在测试阶段，CSF组的歧视指数（DI）较对照组显著下降。*p和lt：0.05。数据均以平均± SEM. n = 每组 10 表示。这个数字已经从谢等人^修改了21请点击这里查看这个数字的较大版本。

图4：CSF加剧了由 OFT 和 FST 评估的类似焦虑但并非抑郁的行为。（A）与 OFT 中的对照小鼠相比，CSF 小鼠在观察到的 5 分钟内在中心区域的时间更少。*p和lt：0.05。（B） CSF 组显示在坦克中移动的总距离较长，而控制组在 OFT 中移动。*p和lt：0.05。（C） CSF 与 FST 控制组之间的固定时间。n.s.表示不同组之间没有显著变化。数据均以平均± SEM. n = 每组 10 表示。这个数字已经从谢等人^修改了21请点击这里查看这个数字的较大版本。

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Discussion

当前协议中的关键步骤包括根据研究目的设置具有优化参数的睡眠碎裂机，并在整个建模过程中保持小鼠在舒适和安静的生活环境中。决定适当的时间来中断或停止睡眠分裂，并为这些小鼠安排行为测试也是至关重要的。与其他睡眠操作模型一样，在具有受控光周期且没有所有可能的不必要干扰的专用房间执行协议非常重要。应努力避免引起噪音，尽量减少研究人员检查、补充食物和供水、更换床上用品等操作时间。在极少数情况下，有侵略者攻击垃圾，特别是在开始不舒服的睡眠中断会议。侵略者在场时应从家庭笼子和实验组中取出。大多数实验动物，除了一些我们的经验，将适应治疗，并设法获得水和食物，根据需要。有内在问题的老鼠，如牙齿变形、体重不足和皮肤伤口，可能导致体重减轻或虚弱。它们还需要避免用于建模。由于此协议可能会诱发慢性压力和代谢性调节不良，因此有必要使用采用统一标准（如体重）筛选的小鼠进行建模和实验。

在所述协议中，轨道转子将在每天上午8：00-晚上8：00（光-ON）期间自动打开，此时是小鼠展示其大部分日常生活的时间。转子设置在光打开阶段的 10 s-on、110 s-off 的重复循环中运行，以诱发频繁的唤醒。不同的建模持续时间会产生不同的表型。急性睡眠分裂可能导致睡眠时间的绝对缩短，交感神经系统活动增加，如皮质松水平升高和胰岛素敏感性受损^23，24。然而，慢性睡眠分裂显示未受影响的皮质松水平，并平衡总睡眠时间^24。基于当前协议的任何修改（如光周期、匹配振动设置（速度、振幅、重复周期等）和建模持续时间都可能更改表型。需要在不同的建模设置下进行睡眠记录和睡眠结构分析，以确定睡眠表型。它也可能导致独特的行为和病理变化。当我们探索长期而不是一夜睡眠分裂后的认知缺陷，并倾向于避免间歇性睡眠分裂对MWM和NOR小鼠行为的偏颇影响时，我们在第60天终止CSF协议后进行了这两个行为测试。然而，不可避免的是，恢复睡眠对小鼠的影响可能混淆了MWM和NOR显示的结果。

虽然这种模型有权使用睡眠碎片模型，但它实际上由光开阶段的零碎睡眠模式、昼夜节律的调节不良以及光关闭阶段的补偿性睡眠反弹组成。这种协议不仅能诱发睡眠模式的改变，还能引起大量的神经炎症、代谢失衡、免疫系统紊乱等^{21、23、24。}所有这些病理过程都可能相互作用，并像管弦乐队一样调停表型。这个模型应该作为一个整体来产生小鼠与表型的调节不良的睡眠模式，认知缺陷，和焦虑般的行为在年轻的野生类型的小鼠。如上一节所述，由于缺乏重复性缺氧，此模型并不完全反映OSA。另一个限制是，很难在同一只小鼠中产生准确的病理变化和睡眠表型。广泛应用的EEG/EMG电极植入睡眠记录不可避免地诱发严重胶质病在皮层^48。近年来，基于人工智能的视频监控和图像分析技术应用于睡眠研究，可收集精确的睡眠信息，无需植入侵入性电极49、50、51。

与现有方法相比，这种CSF方法的意义包括：1）与通常执行数小时或数天的睡眠剥夺协议不同，当前协议更好地模拟健康人的长期睡眠障碍。睡眠支离破碎的小鼠的补偿性睡眠反弹完美地反映了睡眠质量差的人在夜间^的清醒和迟钝的工作^表现。2）这是迄今为止唯一的慢性睡眠分裂模型，在年轻的野生类型的小鼠与确认的认知缺陷和焦虑样，但不是抑郁症样的行为表型，以及脑组织的明显分子病理变化。3）这种治疗对小鼠造成较轻的刺激，使建模可以持续数月，即使有可能在较长时间内进行。4）有了适当的设置，这个模型可以产生稳定的表型睡眠障碍，认知缺陷和焦虑样的行为，这可以用作疾病模型或干预不同的研究设计。5）一些睡眠剥夺模型需要研究人员的全会话干扰来应用温和的处理或新颖的对象。除了定期监测外，这种方法最大限度地减少了处理劳动，也消除了人为的偏差。

此CSF协议提供了回答一些关键科学问题的机会，例如，慢性睡眠障碍是神经退行性疾病的原因或后果吗？慢性睡眠障碍是否在年轻时诱发发病原体可逆？慢性睡眠障碍的补偿机制是否因年轻人和老年人、健康人和患者而异？此协议还可用于通过评估行为和分子表型的严重性和改进来探索治疗方法。它还将用于模型与慢性颅骨切除术，光纤植入准备功能记录的小鼠。此外，它可能被用作干预策略，在预先存在的条件下诱导或加重表型。最后，它可用于研究睡眠-觉醒状态过渡机制。有趣的是，目前的CSF模型可以诱发小鼠的焦虑而不是抑郁行为，这与临床观察一致，即患者的睡眠障碍可能与焦虑的关系比与抑郁症^54，55的关系要大得多。它为研究啮齿动物的情绪障碍提供了一个实用的模型。

综上所述，我们提出了利用振动轨道转子对慢性睡眠碎片进行建模的方案，这种转子可以在年轻的野生型小鼠中产生稳定的表型，并高效地最大限度地减少建模工作。它可能被生成用于各种研究目的。

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Disclosures

作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项工作得到了中国国家自然科学基金委员会（61327902-6对W.王和81801318对丁F.）的支持。我们感谢西格丽德·维塞博士建立了SF实验系统，并亲切地提供了技术细节。我们感谢迈肯·内德加德博士对相关实验的启发性评论。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Any-maze behavior tracking system	Stoelting,Inc,USA	-	A video-tracking system which was used to record the behavior track of mice.
C57BL/6J mice	Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, China.	-	healthy male C57BL/6J mice aged 10-12 weeks were purchased from Hubei Research Center for Laboratory Animals
Graphpad Prism 6.0 Software	Graphpad Software,Inc.USA	-	Graphpad Prism 6.0 software was used to draw statistical graphs.
Morris water maze system	Shanghai XinRuan Information Technology Co.,Ltd,China	XR-XM101	The system was used to perform Morris water maze test
Orbial rotor	Shanghai ShiPing Laboratory Equipment Co.,Ltd,China	SPH-331	The orbital rotor was used to establish the chronic sleep fragmentation model
Solid state timer	OMRON Corporation, Kyoto, Japan	H3CR-F8-300	The solid state time was used to control the frequency and time of the rotor running
Wooden Lusterless Tank	-	-	length 30 cm, width 28 cm, height 35 cm The tank was used to perform open field test and novel object recognition test