Summary
Presenteras här är ett protokoll för kronisk sömn fragmentering (CSF) modell uppnås av en elektriskt kontrollerad orbital rotor, som kan inducera bekräftade kognitiva underskott och ångest-liknande beteende hos unga vilda möss. Denna modell kan tillämpas för att utforska patogenesen vid kronisk sömnstörningar och relaterade störningar.
Abstract
Sömnstörningar är i allmänhet vanliga i populationer som en kronisk sjukdom eller en klagade händelse. Kronisk sömnstörning föreslås vara nära kopplad till patogenesen vid sjukdomar, särskilt neurodegenerativa sjukdomar. Vi fann nyligen att 2 månader av sömnfragmentering initierade Alzheimers sjukdom (AD)-liknande beteendemässiga och patologiska förändringar hos unga vilda möss. Häri presenterar vi ett standardiserat protokoll för att uppnå kronisk sömnfragmentering (CSF). Kortfattat inducerades CSF av en orbital rotor vibrerande vid 110 rpm och fungerar med en repetitiv cykel av 10 s-on, 110 s-off, under light-ON fas (8:00 AM-8:00 PM) kontinuerligt i upp till 2 månader. Försämringar av rumsligt lärande och minne, ångestliknande men inte depressionsliknande beteende hos möss som konsekvenser av CSF-modellering, utvärderades med Morris vattenlabyrint (MWM), Novel object recognition (NOR), Open field test (OFT) och Forced swimming test (FST). I jämförelse med andra sömnmanipulationer minimerar detta protokoll hanterings arbetet och maximerar modellerings effektiviteten. Det producerar stabila fenotyper hos unga vilda möss och kan potentiellt genereras för en mängd olika forskningsändamål.
Introduction
Sömnstörningar blir allt vanligare både hos patienter med sömnstörningar och friska personer med sömnstörningar. Det har observerats att patienter med neurodegenerativa sjukdomar, kronisk smärta, känslomässig stress, andningsorganens sjukdomar, urinvägssjukdomar etc., vanligtvis klagar på obehagligasömnupplevelser 1,2,3,4,5. Obstruktiv sömnapné (OSA), periodiska lemrörelser i sömn (PLMS), sömnunderhåll sömnlöshet bland andra sömnstörningar är de vanligaste orsakerna, vilket inducerar sömnfragmentering6,7. I utvecklade länder har OSA över 5% till 9% prevalens i vuxen befolkning och 2% ibarnpopulation 8,9,10. Samtidigt finns det en ökande andel av den friska befolkningen som upplever sömnstörningar på grund av överanvändning av smarta telefoner, oregelbundna sömnvanor, irriterande ljud och arbetsuppgifter, till exempel nattskift för vårdgivare. Sömn anses vara viktigt för hjärnans avfallsrensning11,12, minneskonsolidering13,14, metabolisk balans15,16, bland många andra fysiologiska processer. Ändå är det fortfarande i stort sett okänt om långvariga sömnstörningar ger upphov till irreversibla patogenesförändringar hos friska människor, och om det är etiologin eller en bidragande faktor för att utveckla sjukdomar i centrala nervsystemet, såsom neurodegenerativa sjukdomar om ett par år. Vårt mål är att rapportera en experimentell modell som genererar stabilt och uppenbart kognitivt underskott och ångestliknande beteende hos unga vilda möss efter en 2-månaders sömnfragmenteringsbehandling. Denna modell skulle tillämpas för att besvara de vetenskapliga frågor som anges ovan.
Sömnstörningar listas som en potentiell riskfaktor för att utveckla Alzheimers sjukdom (AD) eller demens. Kang et al. först hittade och beskrev förvärring av AD patologi av 6 h akut sömnbrist17. Därefter rapporterade många andra studier att sömnbrist eller fragmentering kan förvärra patogenes i transgena AD-mössmodeller18,19,20. Men mycket få forskare har studerat konsekvenserna av sömnstörningar hos unga vilda möss; det vill säga om sömnstörningar ger upphov till AD-liknande beteende eller patologiska förändringar hos unga vilda möss. I vår senaste publikation rapporterade vi att 2 månader av sömnfragmentering inducerade uppenbara rumsliga minnesunderskott och ångestliknande beteende, liksom ökad intracellulär Amyloid-β (Aβ) ackumulering både i cortex och hippocampus i 2-3 månader gamla vilda möss21. Vi observerade också ändrade uttrycksnivåer av endosom-autophagosome-lysosom utbildningsavsnitt markörer och microglia aktivering, som liknade de patologiska förändringar som rapporterats i APP/PS1 möss21,22.
Detta presenterade sömn fragmentering (SF) protokollet validerades av Sinton et al.23 och ändras av Li et al.24. Kort sagt avbryter en orbital rotor som vibrerar vid 110 varv/min sömnen i 10 s varannan minut under ljus-ON-fasen (8:00-20:00). Sömnstrukturförändring i denna modell har tidigare karakteriserats med elektrofysiologiska sömninspelningar och rapporterats av Li et al.24, vilket indikerar en signifikant ökning av vakentiden och minskning av snabb ögonrörelse (REM) sömn under light-ON-fasen, med den totala sömnen och väckningstiderna (på 24 timmar) opåverkade efter mer än 4 veckors modellering24. För närvarande är total sömn eller partiell sömnbrist de vanligaste sömnmanipulationsmodellerna. Total sömnbrist utförs vanligtvis genom ihållande skonsam hantering eller utsätta djuret för nya föremål, alternativt genom att kontinuerligt rotera en bar eller ett löpande löpband25,26,27,28,29. På grund av etiska skäl är den totala sömnbristen vanligtvis kortare än 24 timmar. Den vanligaste partiella sömnbristmodellen är vattenplattformsmetoden, som främst brinner REM-sömn30,31,32. Andra tillvägagångssätt med antingen ett löpband eller en bar som sveper längs botten av buret, kan inducera sömnfragmentering när den sätts på med fastaintervall 33,34,35,36,37,38. Det är anmärkningsvärt att SF avbryter sömnen och periodvis orsakar upphetsning över alla sömnstadier24. En av de framträdande fördelarna med denna CSF-modell som applicerar orbitalrotor är att den kan utföras kontinuerligt i månader automatiskt kontrolleras av maskiner, vilket undviker frekvent bearbetningsarbete dagligen förutom regelbunden övervakning. Dessutom skulle apparaten göra det möjligt att samtidigt modellera flera burar av möss under enhetliga ingrepp. Under hela modelleringssessioner är möss inhysta i sina hemburar med vanliga sängkläder och häckningsmaterial, medan vissa andra metoder kräver exponering för diversifierade miljöer och oundviklig stress.
Sömn fragmentering var tidigare kännetecknas av sömn manipulation metoden, som efterliknar täta upphetsningar under sömn fasen och betydande sömn rebound under vakna fasen. I vissa litteraturer betraktades CSF som djurmodellen för OSA39,40. I denna studie är logiken hos den valda frekvensen av upphetsning att vara 30 gånger per timme baserad på observation av upphetsning index hos patienter med måttlig till svår sömnapné. det observerades att 4 veckors sömn fragmentering avsevärt ökade hypercapnic upphetsning latens och den taktila upphetsning tröskelvärdet, som kunde åtminstone pågå 2 veckor efteråterhämtning 24. Denna fenotyp förklarades av avslöjande c-fos aktivering minskning i noradrenergic, orexinergic, histaminergic och kolinerergisk vakna-aktiva nervceller som svar på hyperkapni, samt minskad kateolaminergic och orexinergic projektioner i cingulate cortex24. Det är dock nödvändigt att notera att den viktigaste funktionen i OSA är hypoxi orsakad av luftvägsobstruktion, vilket resulterar isömnstörningar 41,42. Sömnstörningar och repetitiv hypoxi interagerar ömsesidigt med varandra i OSA patogenes. Därför kanske sömnfragmentering ensam inte fullt ut kan visa alla viktiga egenskaper hos OSA hos möss.
Häri presenterar vi ett standardiserat protokoll för att modellera kronisk sömnfragmentering hos unga vilda möss. Kognitivt underskott och ångestliknande samt depressionsliknande beteenden efter CSF-behandling utvärderades av Morris vattenlabyrint, Ny objektigenkänning, Öppet fälttest och Påtvingat simtest. Det är viktigt att notera att denna modell bör tas som en helhet som genererar fenotyper av dysregulerat sömnmönster, kognitivt underskott och ångestliknande beteende. Den nuvarande modellen skulle potentiellt kunna tillämpas, men inte begränsas, till följande ändamål: 1) Ytterligare undersöka de funktionella eller molekylära patogenesmekanismer som induceras av kronisk sömnstörningar hos unga möss utan genetisk predisposition. 2) Identifiera den direkta vägen som leder till neurodegeneration initierad av sömnstörningar, 3) Utforska de terapier för att förbättra fenotyper som induceras av kronisk sömnstörning, 4) Studera de inneboende skyddande / kompensatoriska mekanismerna hos vilda möss vid kronisk sömnstörning, 5) Att tillämpas för att studera sömn-vakna reglering och statliga övergångsmekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee of Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology.
1. Screening och förberedelse av möss inför försöket
- Välj vuxna (8–10 veckor gamla) hanmöss med en vikt på 20–28 g för hela försöket.
OBS: Vilda C57BL/6 möss erhålls från Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, Kina. - Tilldela slumpmässigt alla möss till CSF och kontrollgruppen. Hus 3-5 möss i varje bur för att undvika social isolering stress. Antalet möss som finns i kontrollburarna matchas med det som finns i de parade CSF-burarna.
OBS: Möss i samma gruppburar slås samman för att utföra uppföljande beteendeexperiment. - Leta reda på kontrollburarna i samma rum som CSF-burarna för att hålla den omgivande miljön och arbetseffekterna identiska.
- Numrera och markera mössen i varje grupp på öronen med hjälp av en öronmärke för övervakning.
- Håll omgivningstemperaturen och luftfuktigheten mellan 21–23 °C och 35–60 %.
- Underhåll omgivningen i 12-timmars ljus-mörk cykel (08:00-20:00 ljus-PÅ, 20:00-08:00 ljus-OFF), för att undvika partisk effekt på normal sömnrytm hos möss.
- Minimera buller och störningar medan forskaren är närvarande i modellrummet.
- Ge möss tillräckligt med mat och vatten. Använd långa munstycken med kulventilspetsar på vattenflaskor för att förhindra vattenläckage på plattformens rörelser. Fäst vattenflaskan ovanpå buret med en fjäder för att undvika att flaskan förskjuts under rotorlöpning.
2. Förberedelse och inställning av orbitalrotorn
- Förbered en elektriskt styrd orbitalrotor med förstorad plattform (67 cm x 110 cm), på vilken högst 10 burar kan placeras.
- Sätt på omloppsrotorn under light-ON-fasen (08:00–20:00) som styrs av en program timer, vilket är den tid då möss uppvisar större delen av sin dagliga sömn.
- Ställ in orbitalrotorn med en hastighet av 110 varv/min och en repetitiv cykel på 10 s-on, 110 s-off styrd med en solid state timer.
OBS: Plattformens lastkapacitet är 50 kg. Den fasta amplituden i rotorns horisontvibrerande är 2,5 cm. - Fäst CSF-burarna ovanpå rotorns plattform med tjocka fjädrar för att förhindra förskjutning av burar vid plattformsrotationer.
3. Kronisk sömnfragmentering modellering och övervakning
- Placera CSF:s burar och kontrollmössen i modellrummet i en vecka före experimenten för att låta möss anpassa sig till omgivningen.
- I början av modellering, se till att alla möss har fri tillgång till mat och vatten under omloppsrotationer.
- Observera minst 1 timme i början av modellering för att säkerställa att orbitalrotorn arbetar i växel.
- Under modelleringsperioden, kontrollera att orbitalrotorn fungerar korrekt och mössförhållanden varannan dag för att säkerställa att möss har tillräckligt med mat och vatten. Byt sängkläder av burar varje vecka.
- Under modellperioden, väg mössen varje vecka klockan 8:00 när du byter sängkläder. Ta bort mössen med betydande viktminskning från modellering, och även från de experimentella grupperna.
OBS: Signifikant viktminskning definieras som vägning mindre än 20 g som varar i 2 veckor. - Under hela modelleringssessionerna tar du bort angriparen, om någon, från buret och även från de experimentella grupperna.
- Efter avslutad modellering, fortsätt att underhålla och mata mössen i det ursprungliga rummet.
4. Morris vattenlabyrint (MWM) test
- Förberedelse för testet
- Förbered apparaten på en cirkulär tank fylld med varmt vatten (20–23 °C).
- Häng upp fyra skyltar med olika former och färger på gardinen som omger tanken i fyra kvadrantriktningar som referens för avlägsen sikt. Gör att vattnet verkar ogenomskinligt genom tillsats av mjölkpulver.
- Hitta en plattform mitt i sydvästkvadranten.
- Utbildningsprovet
- Underkasta möss fyra på varandra följande försök mellan 08:00 och 12:00 varje dag under en 5-dagars träningsperiod.
- Släpp varje mus i vattnet som vetter mot sidoväggen vid en av fyra kvadranter i fyra försök. I varje försök, låt musen simma i 60-talet för att hitta plattformen. Om musen inte kan komma fram till plattformen inom 60 s, styr den till plattformen och stanna där i 15 s.
- Använd ett videospårningssystem för att automatiskt spela in mössens flyktfördröjning för att hitta den dolda plattformen.
- Sondtestet
- Utför sondtestet den sjätte dagen efter 5 träningsdagar.
- Ta bort plattformen. Släpp varje mus från den nordöstra kvadranten och låt den simma i 60 s
- Använd ett videospårningssystem för att automatiskt spela in mössens spårdata.
5. Nytt objektigenkänningstest (NOR)
- Den välbekanta fasen
- Placera möss i en tank (längd 30 cm, bredd 28 cm, höjd 35 cm) i följd, som innehåller två kopior av objekt (A1 och A2). Låt mössen utforska fritt (10 min per försök).
- Använd ett videospårningssystem för att automatiskt spela in mössens spårdata.
- Testfasen
- Utför testförsöket efter en 1 timmes fördröjning av den välbekanta fasen. Byt ut ett av de ursprungliga objekten mot ett nytt objekt ("roman") i tanken som håller det andra oförändrat. Sätt tillbaka mössen i tanken och låt den utforska i 5 minuter per försök.
- Använd ett videospårningssystem för att automatiskt registrera den tid som varje mus tillsätter i utforskningen av varje objekt.
OBS: Utforskningen av objektet bestäms genom att slicka, sniffa, tugga eller flytta vibrissae medan du orienterar näsan mot och mindre än 1 cm från objektet. Diskrimineringsindex (DI) beräknas med ekvationen (TN − TF)/(TN + TF), där TN = tid som spenderas på att utforska det "nya" objektet och TF = tid som spenderas på att utforska det "välbekanta" objektet.
6. Öppet fälttest (OFT)
- Förbered apparaten på en tank (30 cm x 28 cm x 35 cm).
- Under testet placerar du varje mus i mitten av tanken och låter den utforska fritt i 5 minuter. Rengör tanken med 75% etanol efter varje försök för att undvika de överblivna effekterna av föregående mus.
- Använd ett videospårningssystem för att automatiskt spela in mössens spårdata.
7. Påtvingat simtest (FST)
- Förbered apparaten på ett öppet cylindriskt kärl, som innehåller vatten (20–23 °C) som är 15 cm djupt.
- Under testet placerar du varje mus i cylindern och låter den stanna där i 6 minuter.
- Använd ett videospårsystem för att automatiskt spela in orörlighetstiden under de sista 4 minuterna av testet med varje mus.
OBS: Musen är fast besluten att vara orörlig när den slutar kämpa och flyter i vattnet, vilket bara gör rörelser som är nödvändiga för att hålla huvudet ovanför vattnet.
8. Dataanalys
- Analysera data med hjälp av statistisk analysprogramvara (t.ex. GraphPad Prism 6.0).
- Uttryck alla data som medelvärde ± SEM.
- Jämför utrymningsfördröjningen i MWM-testet mellan två grupper med tvåvägs ANOVA med upprepade mått följt av Bonferroni-posttester. Andra jämförelser mellan GSR och kontrollgrupperna bestäms genom oparmade t-tester.
- Tänk på skillnader som är signifikanta om P < 0,05 i alla tester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alla representativa resultat och siffror återgavs från vår senaste publikation21. Återanvändningen av siffrorna tilläts av den ursprungliga tidskriften.
Hela den experimentella designen illustreras i tidsordning, vilket indikerar tidpunkten för CSF-modellering, beteendetester av MWM, NOR, OFT och FST (Figur 1A). Vi fick vikter av möss varje vecka från CSF och kontrollgrupperna, för att övervaka deras allmänna förhållanden under modelleringssessionerna. Ingen uppenbar skillnad hittades i viktökningen hos möss mellan två grupper under modellering (figur 1B).
För att utvärdera effekterna av CSF på rumslig inlärning och minnesprestanda genomförde vi MWM beteendestudie43,44. CSF-gruppen uppvisade sämre escape-kapacitet för att hitta plattformen under 5 utbildningsdagar jämfört med kontrollgruppen (figur 2A). I sondtestet tillbringade CSF-mössen betydligt mindre tid i den riktade kvadranten och korsade den tidigare plattformsplatsen med färre gånger (figur 2B,C), utan simhastighetsskillnad (figur 2D). Dessa ovanstående resultat anges att rumsliga lärande och minne hämtning kapacitet hos möss försämrades efter CSF.
Vi genomförde också NOR-test för att bedöma objektigenkänning och korttidsarbetsminne efter CSF45. I den välbekanta fasen fanns det ingen signifikant skillnad i den totala prospekteringstiden mellan GSR och kontrollgruppen (figur 3A). På motsvarande sätt hittades inga skillnader i prospekteringstiden mellan objekten A1 respektive A2 i två grupper (figur 3B). Ovanstående resultat garanterade att det inte fanns några skillnader i mössens förmåga till utforskning och preferenser för plats. I testfasen sänktes CSF-mössens diskrimineringsindex (DI) avsevärt jämfört med kontroller (figur 3C), vilket uppenbarligen indikerade brister i objektigenkänning och korttidsarbetsminne efter GSR.
Vi utförde vidare OFT och FST, respektive för att undersöka ångestliknande och depressionsliknande beteenden hos möss46,47. Intressant nog, i OFT, konstaterades det att CSF-gruppen tillbringade mindre tid i den centrala zonen än kontrollgruppen (Figur 4A), vilket illustrerade att sömnfragmentering kunde inducera ångestliknande beteende i viss utsträckning. Dessutom uppvisade CSF-möss längre total sträcka flyttad i tanken (Figur 4B), vilket tyder på ökad spontan aktivitet efter modellering. Denna CSF-modellering kunde dock inte inducera depressionsliknande beteende, verifierat av icke-signifikant skillnad i orörlighetstiden mellan två grupper som utsätts för FST (figur 4C).
Figur 1: Flödesschemat för experimentell designprocedur. a)Det experimentella designförfarande som anger tidpunkten för CSF-modellering och beteendetester (dvs. MWM, NOR, OFT och FST). B)CSF:s och kontrollmössens kroppsviktskurvor under den första månaden efter det att CSF-modellen fastställdes. Denna siffra har ändrats från Xie et al.21Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: CSF nedsatt rumslig inlärning och minnesförmågor utvärderade genom MWM-test. A)CSF-mössen utförde längre utrymningsfördröjning jämfört med kontrollmössen under 5-dagars träningstestet. **p < 0,01. B)I sondtestet uppvisade CSF-mössen mindre procentuell tid i plattformskvadranten i motsats till kontrollmössen. Den övre panelen visar representativa spårningar av två grupper. p < 0.0001. C)I sondtestet utförde CSF-gruppen färre gånger för att korsa plattformsplatsen jämfört med kontrollgruppen. *p < 0,05. D)Simhastigheten för två grupper i sondtestet. n.s. indikerar att förändringarna mellan olika grupper inte var betydande. Data presenterades alla som ± SEM. n = 10 per grupp. Denna siffra har ändrats från Xie et al.21Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: CSF-nedsatt objektigenkänning och korttidsarbetsminne utvärderat genom NOR-test. a)Den totala prospekteringstiden mellan GSR och kontrollmössen i den välbekanta fasen, n.s. indikerar inga betydande förändringar mellan olika grupper. B)Prospekteringstiden för objekt A1 respektive A2 mellan två grupper i den välbekanta fasen. n.s. indikerar inga betydande förändringar mellan olika grupper. C)I testfasen minskade CSF-gruppens diskrimineringsindex (DI) betydligt jämfört med kontrollgruppens. *p < 0,05. Data presenterades alla som ± SEM. n = 10 per grupp. Denna siffra har ändrats från Xie et al.21Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: CSF förvärrade ångestliknande men inte depressionsliknande beteende utvärderat av OFT och FST. a)CSF-mössen tillbringade mindre tid i den centrala zonen under de observerade 5 min jämfört med kontrollmössen i OFT. *p < 0,05. (B) CSF-gruppen uppvisade längre total sträcka som flyttats i tanken jämfört med kontrollgruppen i OFT. *p < 0,05. C)Orörlighetstiden mellan GSR och kontrollgrupperna i FST. n.s. indikerar inga betydande förändringar mellan olika grupper. Data presenterades alla som ± SEM. n = 10 per grupp. Denna siffra har ändrats från Xie et al.21Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i det nuvarande protokollet inkluderar att ställa in sömnfragmenteringsmaskiner med de optimerade parametrarna enligt studiesyftet och att upprätthålla mössen i bekväm och tyst livsmiljö under hela modelleringssessionerna. Det är också viktigt att bestämma rätt tidpunkt för att avbryta eller stoppa sömnfragmentering och ordna beteendetester för dessa möss. Liksom andra sömnmanipulationsmodeller är det viktigt att utföra protokollet i ett dedikerat rum med kontrollerade ljuscykler och utan alla möjliga onödiga störningar. Ansträngningar bör göras för att undvika att framkalla buller och minimera den driftstid som forskarna har genomfört för att kontrollera, fylla på mat och vattenförsörjning, byta sängkläder etc. I sällsynta fall finns det angripare som attackerar kullkamraterna, särskilt vid initieringen av obekväma sömnstörningssessioner. Angriparen när den är närvarande bör avlägsnas från hemburarna såväl som de experimentella grupperna. De flesta försöksdjur förutom några få till vår erfarenhet, skulle anpassa sig till behandlingen och lyckas komma åt vattnet och maten efter behov. Möss med inneboende problem, såsom deformerade tänder, undervikt och hudsår kan orsaka viktminskning eller svaghet. De måste också undvikas att användas för modellering. Eftersom detta protokoll potentiellt kan inducera kronisk stress och metabolisk dysreglering, är det viktigt att använda möss som screenas med enhetliga kriterier, såsom kroppsvikt, för modellering och experiment.
I det beskrivna protokollet skulle orbitalrotorn aktiveras automatiskt under 8:00-20:00 (ljus-ON) dagligen, vilket är den tid då möss uppvisar större delen av sitt dagliga liv. Rotorn var inställd på en repetitiv cykel på 10 s-on, 110 s-off under light-ON fas för att inducera frekventa upphetsningar. Olika modellering varaktigheter skulle ge upphov till olika fenotyper. Akut sömnfragmentering kan leda till absolut minskning av sömnvaraktigheten, ökade sympatiska nervsystemet aktiviteter, såsom förhöjda kortisonnivåer och nedsatt insulin känslighet23,24. Kronisk sömnfragmentering visade dock opåverkade kortisonnivåer och balanserad total sömntid24. Alla ändringar baserade på det aktuella protokollet, såsom ljuscykler, matchade vibrerande inställningar (hastighet, amplitud, repetitiv cykel etc.) och modelleringstid, kan potentiellt ändra fenotyperna. Det är nödvändigt att genomföra sömninspelning och sömnstrukturanalys under olika modelleringsinställningar för att identifiera sömn fenotyperna. Det kan också leda till distinkta beteendemässiga och patologiska förändringar. När vi utforskade det kognitiva underskottet efter långsiktiga snarare än en natt sömn fragmentering och tenderade att undvika de partiska effekterna av intermittent sömn fragmentering på möss beteenden i MWM och NOR, utförde vi dessa två beteendemässiga tester efter att ha avslutat CSF protokollet på dag 60. Effekten av återhämtningssömn hos möss kan dock oundvikligen ha förvirrat resultaten för MWM och NOR visat.
Även om denna modell har rätt till sömnfragmenteringsmodell, består den faktiskt av fragmenterade sömnmönster under ljus-ON-fasen, dysregulering av dycadian rytm och kompensatorisk sömn rebound under light-OFF fasen. Detta protokoll kan inducera inte bara sömnmönsterförändringar, men också betydande neuroinflammation, metabolisk obalans, immunsystemstörning, etc21,23,24. Alla dessa patologiska processer kan interagera med varandra och medla fenotyper som en orkester. Denna modell bör tas som en helhet för att generera mössen med fenotyper av dysregulerat sömnmönster, kognitivt underskott och ångestliknande beteende hos unga vilda möss. Som nämnts i föregående avsnitt speglar denna modell inte exakt OSA på grund av brist på repetitiv hypoxi. En annan begränsning är att det är svårt att generera exakta patologiska förändringar och sömn fenotyper hos samma möss. Den allmänt applicerade EEG/EMG elektrod implantation för sömn registrering oundvikligen inducerad allvarliga gliosis i cortex48. Under de senaste åren har videoövervaknings- och bildanalystekniker baserade på artificiell intelligens tillämpats i sömnstudier, som skulle samla in exakt sömninformation utan invasiv elektrodimplantation49,50,51.
Betydelsen av denna CSF-metod i jämförelse med befintliga metoder inkluderar: 1) Skiljer sig från sömnbristprotokoll som vanligtvis utförs i timmar eller dagar, efterliknar det nuvarande protokollet bättre långsiktiga sömnstörningar hos friska människor. Den kompensatoriska sömnen rebound i sömn fragmenterade möss speglar perfekt dagtid somnolens och retardant arbetsprestanda hos personer med dålig sömnkvalitet under natten52,53. 2) Det är hittills den enda kroniska sömnfragmenteringsmodellen hos unga vilda möss med bekräftat kognitivt underskott och ångestliknande men inte depressionsliknande beteende fenotyper, liksom uppenbara molekylära patologiska förändringar i hjärnvävnad. 3) Denna behandling orsakar mildare irritationer hos möss så att modellering kan pågå i månader, även med möjlighet att utföras under längre tidsperioder. 4) Med rätt inställningar kan denna modell generera stabila fenotyper av sömnstörningar, kognitivt underskott och ångestliknande beteende, som kan användas antingen som sjukdomsmodeller eller interventioner för olika studiedesigner. 5) Vissa sömnbristmodeller kräver full sessionsstörning av forskare för att tillämpa skonsam hantering eller nya föremål. Förutom regelbunden övervakning minimerar denna metod hantering av arbete, vilket också eliminerar den artificiella förspänningen.
Detta CSF-protokoll ger möjlighet att svara på ett antal viktiga vetenskapliga frågor, såsom kronisk sömnstörning orsaken eller konsekvensen av neurodegenerativa sjukdomar? Är kronisk sömnstörning inducerad patogenes under ung ålder reversibel? Varierar kompensationsmekanismerna vid kroniska sömnstörningar mellan unga och äldre, friska människor och patienter? Detta protokoll kan också tillämpas för att utforska terapier genom att bedöma svårighetsgraden och förbättringen av beteendemässiga och molekylära fenotyper. Det skulle också tillämpas för att modellera mössen med kronisk craniectomy, optisk fiber implantation preparat för funktionella inspelningar. Dessutom, Det kan eventuellt användas som interventionell strategi för att inducera eller förvärra fenotyper ovanpå befintliga villkor. Slutligen kan det användas för att studera övergångsmekanismer för sömn-vakna tillstånd. Intressant nog kan den nuvarande CSF-modellen inducera ångestliknande snarare än depressionsliknande beteende hos möss, vilket är i linje med den kliniska observationen att sömnstörningen hos patienter sannolikt skulle associeras mycket mer med ångest än med depression54,55. Det ger en praktisk modell för att studera känslomässiga störningar hos gnagare.
Sammanfattningsvis presenterar vi protokollet om modellering av kronisk sömnfragmentering med hjälp av en vibrerande orbital rotor, som kan producera stabila fenotyper hos unga vilda möss och minimera modelleringsarbete med hög effektivitet. Det kan potentiellt genereras för en mängd olika forskningsändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (61327902-6 till W. Wang och 81801318 till F.F. Ding). Vi bekräftar Dr. Sigrid Veasy för att etablera SF experimentella system och vänligen tillhandahålla tekniska detaljer. Vi bekräftar Dr. Maiken Nedergaard för lärorika kommentarer för relaterade experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Any-maze behavior tracking system | Stoelting,Inc,USA | - | A video-tracking system which was used to record the behavior track of mice. |
| C57BL/6J mice | Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, China. | - | healthy male C57BL/6J mice aged 10-12 weeks were purchased from Hubei Research Center for Laboratory Animals |
| Graphpad Prism 6.0 Software | Graphpad Software,Inc.USA | - | Graphpad Prism 6.0 software was used to draw statistical graphs. |
| Morris water maze system | Shanghai XinRuan Information Technology Co.,Ltd,China | XR-XM101 | The system was used to perform Morris water maze test |
| Orbial rotor | Shanghai ShiPing Laboratory Equipment Co.,Ltd,China | SPH-331 | The orbital rotor was used to establish the chronic sleep fragmentation model |
| Solid state timer | OMRON Corporation, Kyoto, Japan | H3CR-F8-300 | The solid state time was used to control the frequency and time of the rotor running |
| Wooden Lusterless Tank | - | - | length 30 cm, width 28 cm, height 35 cm The tank was used to perform open field test and novel object recognition test |
References
- Peter-Derex, L., Yammine, P., Bastuji, H., Croisile, B. Sleep and Alzheimer's disease. Sleep Medicine Reviews. 19, 29-38 (2015).
- Mathias, J. L., Cant, M. L., Burke, A. L. J. Sleep disturbances and sleep disorders in adults living with chronic pain: a meta-analysis. Sleep Medicine. 52, 198-210 (2018).
- Murphy, M. J., Peterson, M. J. Sleep Disturbances in Depression. Sleep Medicine Clinics. 10 (1), 17-23 (2015).
- Walter, L. M., et al. Sleep disturbance in pre-school children with obstructive sleep apnoea syndrome. Sleep Medicine. 12 (9), 880-886 (2011).
- Helfand, B. T., et al. The relationship between lower urinary tract symptom severity and sleep disturbance in the CAMUS trial. Journal of Urology. 185 (6), 2223-2228 (2011).
- Kimoff, R. J. Sleep fragmentation in obstructive sleep apnea. Sleep. 19 (9), Suppl 61-66 (1996).
- Dhondt, K., et al. Sleep fragmentation and periodic limb movements in children with monosymptomatic nocturnal enuresis and polyuria. Pediatric Nephrology. 30 (7), Berlin, Germany. 1157-1162 (2015).
- Young, T., Peppard, P. E., Gottlieb, D. J. Epidemiology of obstructive sleep apnea: a population health perspective. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (9), 1217-1239 (2002).
- Peppard, P. E., et al. Increased prevalence of sleep-disordered breathing in adults. American Journal of Epidemiology. 177 (9), 1006-1014 (2013).
- Marcus, C. L., et al. Diagnosis and management of childhood obstructive sleep apnea syndrome. Pediatrics. 130 (3), 714-755 (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), New York, N.Y. 373-377 (2013).
- Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. 65 (2), 106-119 (2019).
- Stickgold, R., Walker, M. P. Memory consolidation and reconsolidation: what is the role of sleep. Trends in Neurosciences. 28 (8), 408-415 (2005).
- Stickgold, R. Sleep-dependent memory consolidation. Nature. 437 (7063), 1272-1278 (2005).
- Aalling, N. N., Nedergaard, M., DiNuzzo, M. Cerebral Metabolic Changes During Sleep. Current Neurology and Neuroscience Reports. 18 (9), 57 (2018).
- Rempe, M. J., Wisor, J. P. Cerebral lactate dynamics across sleep/wake cycles. Frontiers in Computational Neuroscience. 8, 174 (2014).
- Kang, J. E., et al. Amyloid-beta dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (5955), New York, N.Y. 1005-1007 (2009).
- Minakawa, E. N., et al. Chronic sleep fragmentation exacerbates amyloid beta deposition in Alzheimer's disease model mice. Neuroscience Letters. 653, 362-369 (2017).
- Qiu, H., et al. Chronic Sleep Deprivation Exacerbates Learning-Memory Disability and Alzheimer's Disease-Like Pathologies in AβPP(swe)/PS1(ΔE9) Mice. Journal of Alzheimer's Disease : JAD. 50 (3), 669-685 (2016).
- Holth, J. K., et al. The sleep-wake cycle regulates brain interstitial fluid tau in mice and CSF tau in humans. Science. 363 (6429), New York, N.Y. 880-884 (2019).
- Xie, Y., et al. Chronic sleep fragmentation shares similar pathogenesis with neurodegenerative diseases: Endosome-autophagosome-lysosome pathway dysfunction and microglia-mediated neuroinflammation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 26 (2), 215-227 (2020).
- Ba, L., et al. Distinct Rab7-related Endosomal-Autophagic-Lysosomal Dysregulation Observed in Cortex and Hippocampus in APPswe/PSEN1dE9 Mouse Model of Alzheimer's Disease. Chinese Medical Journal (England). 130 (24), 2941-2950 (2017).
- Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
- Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
- Misrani, A., et al. Differential effects of citalopram on sleep-deprivation-induced depressive-like behavior and memory impairments in mice. Progress Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 88, 102-111 (2019).
- Xu, A., et al. Roles of hypothalamic subgroup histamine and orexin neurons on behavioral responses to sleep deprivation induced by the treadmill method in adolescent rats. Journal of Pharmacological Sciences. 114 (4), 444-453 (2010).
- Saito, L. P., et al. Acute total sleep deprivation potentiates amphetamine-induced locomotor-stimulant effects and behavioral sensitization in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 117, 7-16 (2014).
- Spano, G. M., et al. Sleep Deprivation by Exposure to Novel Objects Increases Synapse Density and Axon-Spine Interface in the Hippocampal CA1 Region of Adolescent Mice. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (34), 6613-6625 (2019).
- Morrow, J. D., Opp, M. R. Sleep-wake behavior and responses of interleukin-6-deficient mice to sleep deprivation. Brain, Behavior, and Immunity. 19 (1), 28-39 (2005).
- Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
- Aleisa, A. M., Alzoubi, K. H., Alkadhi, K. A. Post-learning REM sleep deprivation impairs long-term memory: reversal by acute nicotine treatment. Neuroscience Letters. 499 (1), 28-31 (2011).
- Zagaar, M., Dao, A., Alhaider, I., Alkadhi, K. Regular treadmill exercise prevents sleep deprivation-induced disruption of synaptic plasticity and associated signaling cascade in the dentate gyrus. Molecular and Cellular Neurosciences. 56, 375-383 (2013).
- McKenna, J. T., et al. Sleep fragmentation elevates behavioral, electrographic and neurochemical measures of sleepiness. Neuroscience. 146 (4), 1462-1473 (2007).
- Tartar, J. L., et al. Hippocampal synaptic plasticity and spatial learning are impaired in a rat model of sleep fragmentation. The European Journal of Neuroscience. 23 (10), 2739-2748 (2006).
- Guzman-Marin, R., Bashir, T., Suntsova, N., Szymusiak, R., McGinty, D. Hippocampal neurogenesis is reduced by sleep fragmentation in the adult rat. Neuroscience. 148 (1), 325-333 (2007).
- Nair, D., et al. Sleep fragmentation induces cognitive deficits via nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-dependent pathways in mouse. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (11), 1305-1312 (2011).
- McCoy, J. G., et al. Experimental sleep fragmentation impairs attentional set-shifting in rats. Sleep. 30 (1), 52-60 (2007).
- Dumaine, J. E., Ashley, N. T. Acute sleep fragmentation induces tissue-specific changes in cytokine gene expression and increases serum corticosterone concentration. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (12), 1062-1069 (2015).
- Carreras, A., et al. Chronic sleep fragmentation induces endothelial dysfunction and structural vascular changes in mice. Sleep. 37 (11), 1817-1824 (2014).
- Khalyfa, A., et al. Circulating exosomes potentiate tumor malignant properties in a mouse model of chronic sleep fragmentation. Oncotarget. 7 (34), 54676-54690 (2016).
- Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
- Tripathi, A., et al. Intermittent Hypoxia and Hypercapnia, a Hallmark of Obstructive Sleep Apnea, Alters the Gut Microbiome and Metabolome. mSystems. 3 (3), (2018).
- D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research. Brain Research Reviews. 36 (1), 60-90 (2001).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Vogel-Ciernia, A., Wood, M. A. Examining object location and object recognition memory in mice. Current Protocols in Neuroscience. 69, 1-17 (2014).
- Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The Open Field Test for Measuring Locomotor Activity and Anxiety-Like Behavior. Methods in Molecular Biology. 1916, Clifton, N.J. 99-103 (2019).
- Porsolt, R. D., Bertin, A., Blavet, N., Deniel, M., Jalfre, M. Immobility induced by forced swimming in rats: effects of agents which modify central catecholamine and serotonin activity. European Journal of Pharmacology. 57 (2-3), 201-210 (1979).
- Hauglund, N. L., Kusk, P., Kornum, B. R., Nedergaard, M. Meningeal Lymphangiogenesis and Enhanced Glymphatic Activity in Mice with Chronically Implanted EEG Electrodes. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- Nguyen-Michel, V. H., et al. Rapid eye movement sleep behavior disorder or epileptic seizure during sleep? A video analysis of motor events. Seizure. 58, 1-5 (2018).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31 (11), 1587-1598 (2008).
- Abad, J., et al. Automatic Video Analysis for Obstructive Sleep Apnea Diagnosis. Sleep. 39 (8), 1507-1515 (2016).
- Sandlund, C., Hetta, J., Nilsson, G. H., Ekstedt, M., Westman, J. Impact of group treatment for insomnia on daytime symptomatology: Analyses from a randomized controlled trial in primary care. International Journal of Nursing Studies. 85, 126-135 (2018).
- Shekleton, J. A., Rogers, N. L., Rajaratnam, S. M. Searching for the daytime impairments of primary insomnia. Sleep Medicine Reviews. 14 (1), 47-60 (2010).
- Dixon, L. J., Lee, A. A., Gratz, K. L., Tull, M. T. Anxiety sensitivity and sleep disturbance: Investigating associations among patients with co-occurring anxiety and substance use disorders. Journal of Anxiety Disorders. 53, 9-15 (2018).
- Press, Y., Punchik, B., Freud, T. The association between subjectively impaired sleep and symptoms of depression and anxiety in a frail elderly population. Aging Clinical and Experimental Research. 30 (7), 755-765 (2018).
