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Behavior

Un modello di frammentazione del sonno cronico che utilizza il rotore orbitale vibrante per indurre deficit cognitivo e comportamento simile all'ansia nei giovani topi di tipo selvaggio

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61531
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000, China, 2Key Laboratory of Neurological Diseases of Chinese Ministry of Education, The School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000,China, 3Department of Pharmacology, School of Basic Medical Science; State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institutes of Brain Science and Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University, Shanghai 200032, China

Summary

Presentato qui è un protocollo per il modello di frammentazione cronica del sonno (CSF) raggiunto da un rotore orbitale controllato elettricamente, che potrebbe indurre un deficit cognitivo confermato e un comportamento simile all'ansia nei giovani topi di tipo selvatico. Questo modello può essere applicato per esplorare la patogenesi del disturbo cronico del sonno e dei disturbi correlati.

Abstract

Il disturbo del sonno è generalmente comune nelle popolazioni come malattia cronica o evento lamentato. Si propone che il disturbo cronico del sonno sia strettamente collegato alla patogenesi delle malattie, in particolare delle malattie neurodegenerative. Recentemente abbiamo scoperto che 2 mesi di frammentazione del sonno hanno iniziato cambiamenti comportamentali e patologici simili al morbo di Alzheimer (AD) nei giovani topi di tipo selvatico. Qui presentiamo un protocollo standardizzato per ottenere la frammentazione cronica del sonno (CSF). In breve, csf è stato indotto da un rotore orbitale che vibra a 110 giri/min e opera con un ciclo ripetitivo di 10 s-on, 110 s-off, durante la fase light-ON (8:00-20:00) continuamente per un massimo di 2 mesi. Le menomazioni dell'apprendimento spaziale e della memoria, comportamento simile all'ansia ma non alla depressione nei topi come conseguenze della modellazione CSF, sono state valutate con il labirinto d'acqua morris (MWM), il riconoscimento di nuovi oggetti (NOR), il test open field (OFT) e il test di nuoto forzato (FST). Rispetto ad altre manipolazioni del sonno, questo protocollo riduce al minimo le fatiche di movimentazione e massimizza l'efficienza di modellazione. Produce fenotipi stabili in giovani topi di tipo selvatico e può essere potenzialmente generato per una varietà di scopi di ricerca.

Introduction

Il disturbo del sonno è sempre più comune sia nei pazienti con condizioni di disturbo del sonno che nelle persone sane con eventi che disturbano il sonno. È stato osservato che i pazienti con malattie neurodegenerative, dolore cronico, stress emotivo, malattie del sistema respiratorio, malattie del sistema urinario, ecc., di solito si lamentano di spiacevoliesperienze di sonno 1,2,3,4,5. Apnea ostruttiva del sonno (OSA), movimenti periodici degli arti nel sonno (PLMS), insonnia di mantenimento del sonno tra gli altri disturbi del sonno sono le cause più comuni, che induconola frammentazione del sonno 6,7. Nei paesi sviluppati, l'OSA ha una prevalenza superiore al 5-9% nella popolazione adulta e il 2% nella popolazioneinfantile 8,9,10. Nel frattempo, c'è una percentuale crescente della popolazione sana che sperimenta disturbi del sonno a causa dell'uso eccessivo di smartphone, abitudini di sonno irregolari, rumori fastidiosi e doveri di lavoro, come i turni notturni per gli operatori sanitari. Il sonno è riconosciuto come importante per lo sdoganamentodei rifiuti cerebrali 11,12,consolidamentodella memoria 13,14,equilibriometabolico 15,16, tra molti altri processi fisiologici. Tuttavia, rimane ancora in gran parte sconosciuto se il disturbo del sonno a lungo termine dia luogo a alterazioni irreversibili della patogenesi negli esseri umani sani e se sia l'eziologia o un fattore che contribuisce allo sviluppo di malattie del sistema nervoso centrale, come le malattie neurodegenerative in un paio d'anni lungo la strada. Il nostro obiettivo è quello di segnalare un modello sperimentale che genera deficit cognitivo stabile ed evidente e comportamento simile all'ansia nei giovani topi di tipo selvaggio dopo un trattamento di frammentazione del sonno di 2 mesi. Questo modello sarebbe applicato per rispondere alle domande scientifiche sopra elencate.

Il disturbo del sonno è elencato come un potenziale fattore di rischio per lo sviluppo del morbo di Alzheimer (AD) o della demenza. Kang et al. Successivamente, molti altri studi hanno riferito che la privazione o la frammentazione del sonno potrebbero aggravare la patogenesi nei modelli transgenici di topi AD18,19,20. Tuttavia, pochissimi ricercatori hanno studiato la conseguenza del disturbo del sonno nei giovani topi di tipo selvatico; cioè, se il disturbo del sonno dà origine a comportamenti simili ad AD o cambiamenti patologici nei giovani topi di tipo selvatico. Nella nostra recente pubblicazione, abbiamo riferito che 2 mesi di frammentazione del sonno hanno indotto evidente deficit di memoria spaziale e comportamento simile all'ansia, così come l'aumento dell'accumulo intracellulare di amiloide-β (Aβ) sia in corteccia che in ippocampo in topi di tipo selvatico di 2-3 mesi21. Abbiamo anche osservato livelli di espressione alterati di marcatori di percorso endosome-autofagosome-lisosomio e attivazione di microglia, che era simile ai cambiamenti patologici riportati nei topi APP/ PS121,22.

Questo protocollo diframmentazione del sonno (SF) presentato è stato convalidato da Sinton etal. In breve, un rotore orbitale che vibra a 110 giri/min interrompe il sonno per 10 s ogni 2 minuti durante la fase light-ON (8:00-20:00). L'alterazione della struttura del sonno in questo modello è stata precedentemente caratterizzata da registrazioni elettrofisiofisioiche del sonno e riportata da Li etal. Attualmente, il sonno totale o la privazione parziale del sonno sono i modelli di manipolazione del sonno più comunemente usati. La privazione totale del sonno viene solitamente eseguita con una manipolazione delicata sostenuta o esponendo l'animale a nuovi oggetti, in alternativa ruotando continuamente una barra o un tapis roulantin esecuzione 25,26,27,28,29. Per motivi etici, la privazione totale del sonno è di solito inferiore a 24 ore. Il modello di privazione parziale del sonno più comunemente applicato è il metodo della piattaforma dell'acqua, che principalmente ablare il sonno REM30,31,32. Altri approcci che utilizzano un tapis roulant o una barra che spazza lungo il fondo della gabbia, potrebbero indurre la frammentazione del sonno se impostati a intervallifissi 33,34,35,36,37,38. È interessante notare che SF interrompe il sonno e provoca eccitazioni intermittenti in tutte le fasi del sonno24. Uno dei principali vantaggi di questo modello CSF che applica il rotore orbitale è che può essere eseguito continuamente per mesi controllati automaticamente dalle macchine, il che evita frequenti lavorazioni giornaliere ad eccezione del monitoraggio regolare. Inoltre, l'apparecchio consentirebbe di modellare contemporaneamente più gabbie di topi sotto interventi uniformi. Durante intere sessioni di modellazione, i topi sono alloggiati nelle loro gabbie di casa con soliti materiali di lettiera e nidificazione, mentre alcuni altri metodi richiedono esposizione ad ambienti diversificati e stress inevitabile.

La frammentazione del sonno era precedentemente caratterizzata dal metodo di manipolazione del sonno, che imita le eccitazioni frequenti durante la fase del sonno e un sostanziale rimbalzo del sonno durante la fase di veglia. In alcune letterature, il QCS è stato considerato il modello animale per OSA39,40. In questo studio, la logica della frequenza di eccitazione scelta per essere 30 volte all'ora si basa sull'osservazione di indici di eccitazione in pazienti con apnea del sonno da moderata a grave. È stato osservato che la frammentazione del sonno di 4 settimane ha aumentato significativamente la latenza dell'eccitazione ipercapnica e la soglia di eccitazione tattile, che potrebbe durare almeno 2 settimane dopoil recupero 24. Questo fenotipo è stato spiegato rivelando la riduzione dell'attivazione dei c-fos nei neuroni noradrenergici, orexinergici, istaminergici e colinergici wake-active in risposta all'ipercapnia, nonché proiezioni catecolaminergiche e orexinergiche ridotte nella corteccia cingolata24. Tuttavia, è necessario notare che la caratteristica più importante in OSA è l'ipossia causata dall'ostruzione delle vie aeree, che si traduce in interruzioni delsonno 41,42. Disturbi del sonno e ipossia ripetitiva interagiscono reciprocamente tra loro nella patogenesi OSA. Pertanto, la frammentazione del sonno da sola potrebbe non essere in grado di dimostrare completamente tutte le caratteristiche chiave dell'OSA nei topi.

Qui presentiamo un protocollo standardizzato per modellare la frammentazione cronica del sonno nei giovani topi di tipo selvatico. Deficit cognitivo e comportamenti simili all'ansia e alla depressione dopo che il trattamento CSF è stato valutato da Morris water laze, riconoscimento di nuovi oggetti, test sul campo aperto e test di nuoto forzato. È importante notare che questo modello dovrebbe essere preso nel suo insieme che genera fenotipi di modello di sonno disregolato, deficit cognitivo e comportamento simile all'ansia. Il modello attuale potrebbe potenzialmente essere applicato, ma non limitato, ai seguenti scopi: 1) Studiare ulteriormente i meccanismi di patogenesi funzionale o molecolare indotti dal disturbo cronico del sonno nei giovani topi senza predisposizione genetica, 2) Identificare la via diretta che porta alla neurodegenerazione iniziata dal disturbo del sonno, 3) Esplorare le terapie per migliorare i fenotipi indotti dal disturbo cronico del sonno, 4) Studiare i meccanismi protettivi/compensatori intrinseci nei topi di tipo selvatico in caso di disturbo cronico del sonno, 5) Da applicare per studiare la regolazione sonno-veglia e i meccanismi di transizione di stato.

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Protocol

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale Tongji, del Tongji Medical College, dell'Università di scienza e tecnologia di Huazhong.

1. Screening e preparazione dei topi per l'esperimento

  1. Seleziona topi maschi adulti di tipo selvatico (8-10 settimane) con un peso di 20-28 g per l'intero esperimento.
    NOTA: I topi C57BL/6 di tipo selvatico sono ottenuti dall'Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, Cina.
  2. Assegnare casualmente tutti i mouse al CSF e al gruppo di controllo. Ospita 3-5 topi in ogni gabbia per evitare lo stress da isolamento sociale. Il numero di topi alloggiati nelle gabbie di controllo è abbinato a quello ospitato nelle gabbie CSF accoppiate.
    NOTA: I topi nelle stesse gabbie di gruppo sono raggruppati per eseguire esperimenti comportamentali di follow-up.
  3. Individuare le gabbie di controllo nella stessa stanza con le gabbie CSF, per mantenere identici l'ambiente circostante e gli effetti del lavoro.
  4. Numera e segna i topi in ogni gruppo sulle orecchie usando un marchio auricolare a scopo di monitoraggio.
  5. Mantenere la temperatura e l'umidità ambiente tra 21-23 °C e 35%-60 %.
  6. Mantenere l'ambiente ambiente in un ciclo chiaro-scuro di 12 ore (8:00-20:00 light-ON, 20:00-8:00 AM light-OFF), per evitare effetti distorti sul normale ritmo del sonno nei topi.
  7. Ridurre al minimo il rumore e le interferenze mentre il ricercatore è presente nella sala di modellazione.
  8. Fornire ai topi cibo e acqua sufficienti. Utilizzare ugelli lunghi con punte della valvola a sfera sulle bottiglie d'acqua, per evitare perdite d'acqua sui movimenti della piattaforma. Fissare la bottiglia d'acqua sopra la gabbia con una molla per evitare la lussazione della bottiglia durante il funzionamento del rotore.

2. Preparazione e impostazione del rotore orbitale

  1. Preparare un rotore orbitale a controllo elettrico con piattaforma allargata (67 cm x 110 cm), su cui 10 gabbie possono essere posizionate al massimo.
  2. Accendi il rotore orbitale durante la fase light-ON (8:00-20:00) controllato da un timer del programma, che è il momento in cui i topi mostrano la maggior parte del loro sonno quotidiano.
  3. Impostare il rotore orbitale con una velocità di 110 giri/min e un ciclo ripetitivo di 10 s-on, 110 s-off controllati con un timer a stato solido.
    NOTA: La capacità di carico della piattaforma è di 50 kg. L'ampiezza fissa dell'orizzonte del rotore vibrante è di 2,5 cm.
  4. Fissare le gabbie CSF sulla parte superiore della piattaforma del rotore da molle spesse per evitare la lussazione delle gabbie sulle rotazioni della piattaforma.

3. Modellazione e monitoraggio cronici della frammentazione del sonno

  1. Posizionare le gabbie del QCS e dei topi di controllo nella sala di modellazione per una settimana prima degli esperimenti, per lasciare che i topi si adattino all'ambiente circostante.
  2. All'inizio della modellazione, assicurarsi che tutti i topi abbiano libero accesso a cibo e acqua durante le rotazioni orbitali.
  3. All'inizio della modellazione, osservare almeno per 1 h per garantire che il rotore orbitale opera in marcia.
  4. Durante il periodo di modellazione, verificare che il rotore orbitale funzioni correttamente e che i topi condizionino ogni 2 giorni per garantire che i topi abbiano abbastanza cibo e acqua. Cambia le lenzuola delle gabbie ogni settimana.
  5. Durante il periodo di modellazione, pesare i topi settimanalmente alle 8:00 del mattino quando si cambia la biancheria da letto. Rimuovere i topi con una significativa perdita di peso dalla modellazione e anche dai gruppi sperimentali.
    NOTA: Una perdita di peso significativa è definita come un peso inferiore a 20 g della durata di 2 settimane.
  6. Durante le intere sessioni di modellazione, rimuovere l'aggressore, se del caso, dalla gabbia e, anche dai gruppi sperimentali.
  7. Dopo la fine della modellazione, continuare a mantenere e nutrire i topi nella stanza originale.

4. Test del labirinto d'acqua Morris (MWM)

  1. Preparazione alla prova
    1. Preparare l'apparato di un serbatoio circolare riempito con acqua tiepida (20-23 °C).
    2. Sospendere quattro segni con forme e colori diversi sulla tenda che circonda il serbatoio in quattro direzioni del quadrante come riferimento di visione distante. Rendere l'acqua opaca con l'aggiunta di latte in polvere.
    3. Individuare una piattaforma al centro del quadrante sud-ovest.
  2. Il test di allenamento
    1. Sottoponi i topi a quattro prove consecutive tra le 8:00 e le 12:00 ogni giorno in un periodo di allenamento di 5 giorni.
    2. Rilasciare ogni mouse nell'acqua di fronte alla parete laterale in uno dei quattro quadranti in quattro prove. In ogni prova, consenti al mouse di nuotare per 60 s per trovare la piattaforma. Se il mouse non è in grado di arrivare alla piattaforma entro 60 s, guidalo verso la piattaforma e resta lì per 15 s.
    3. Utilizza un sistema di tracciamento video per registrare automaticamente la latenza di fuga dei mouse per trovare la piattaforma nascosta.
  3. Il test della sonda
    1. Eseguire il test della sonda il sesto giorno dopo 5 giorni di allenamento.
    2. Rimuovere la piattaforma. Rilasciare ogni mouse dal quadrante nord-est e permettergli di nuotare per 60 s
    3. Utilizzare un sistema di tracciamento video per registrare automaticamente i dati di traccia dei mouse.

5. Nuovo test di riconoscimento degli oggetti (NOR)

  1. La fase familiare
    1. Posizionare i topi in un serbatoio (lunghezza 30 cm, larghezza 28 cm, altezza 35 cm) in sequenza, che contiene due copie di oggetti (A1 e A2). Consenti ai topi di esplorare liberamente (10 minuti per prova).
    2. Utilizzare un sistema di tracciamento video per registrare automaticamente i dati di traccia dei mouse.
  2. La fase di test
    1. Condurre la prova di prova dopo un ritardo di 1 h della fase familiare. Sostituire uno degli oggetti originali con un nuovo oggetto ("romanzo") nel serbatoio mantenendo invariato l'altro. Riportare i topi al serbatoio e consentirgli di esplorare per 5 minuti per prova.
    2. Usa un sistema di tracciamento video per registrare automaticamente il tempo trascorso nell'esplorazione di ogni oggetto da ogni mouse.
      NOTA: L'esplorazione dell'oggetto è determinata leccando, annusando, masticando o muovendo vibrisse mentre si orienta il naso verso e a meno di 1 cm dall'oggetto. L'indice di discriminazione (DI) è calcolato con l'equazione (TN − TF)/(TN + TF), dove TN = tempo trascorso ad esplorare l'oggetto "romanzo" e TF = tempo trascorso ad esplorare l'oggetto "familiare".

6. Prova sul campo aperto (OFT)

  1. Preparare l'apparecchio di un serbatoio (30 cm x 28 cm x 35 cm).
  2. Durante il test, posizionare ogni mouse al centro del serbatoio e consentirgli di esplorare liberamente per 5 minuti. Pulire il serbatoio con il 75% di etanolo dopo ogni prova per evitare gli effetti avanzi del mouse precedente.
  3. Utilizzare un sistema di tracciamento video per registrare automaticamente i dati di traccia dei mouse.

7. Prova di nuoto forzato (FST)

  1. Preparare l'apparato di un vaso cilindrico aperto, che contiene acqua (20-23 °C) profonda 15 cm.
  2. Durante il test, posizionare ogni mouse nel cilindro e lasciare che rimanga lì per 6 minuti.
  3. Utilizzare un sistema di traccia video per registrare automaticamente il tempo di immobilità durante gli ultimi 4 minuti del test da parte di ciascun mouse.
    NOTA: Il topo è determinato ad essere immobile quando smette di lottare e galleggia nell'acqua, facendo solo movimenti necessari per mantenere la testa sopra l'acqua.

8. Analisi dei dati

  1. Analizzare i dati utilizzando un software di analisi statistica (ad esempio, GraphPad Prism 6.0).
  2. Esprimere tutti i dati come media ± SEM.
  3. Confrontare la latenza di escape nel test MWM tra due gruppi utilizzando ANOVA a due vie con misure ripetute seguite dai posttest Bonferroni. Altri confronti tra il QCS e i gruppi di controllo sono determinati da test t non accoppiati.
  4. Considerare le differenze significative se P < 0.05 in tutti i test.

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Representative Results

Tutti i risultati e le cifre rappresentativi sono stati riprodotti dalla nostra recentepubblicazione 21. Il riutilizzo delle cifre è stato consentito dalla rivista originale.

L'intero progetto sperimentale è illustrato nell'ordine di tempo, che indica la tempistica della modellazione CSF, i test comportamentali di MWM, NOR, OFT e FST (Figura 1A). Abbiamo ottenuto pesi di topi ogni settimana dal CSF e dai gruppi di controllo, per monitorarne le condizioni generali durante le sessioni di modellazione. Non è stata riscontrata alcuna differenza evidente nell'aumento di peso dei topi tra due gruppi durante la modellazione (Figura 1B).

Per valutare gli effetti del QCS sull'apprendimento spaziale e sulle prestazioni della memoria, è stato condotto lo studiocomportamentale MWM 43,44. Il gruppo CSF ha mostrato capacità di fuga inferiori per trovare la piattaforma durante 5 giorni di allenamento rispetto al gruppo di controllo (Figura 2A). Nel test della sonda, i topi CSF hanno trascorso una proporzione di tempo significativamente inferiore nel quadrante mirato e hanno attraversato la posizione precedente della piattaforma di meno volte (Figura 2B,C), senza differenza di velocità di nuoto (Figura 2D). Questi risultati di cui sopra hanno indicato che le capacità di apprendimento spaziale e di recupero della memoria dei topi sono state compromesse dopo il QCS.

Abbiamo anche condotto test NOR per valutare il riconoscimento degli oggetti e la memoria di lavoro a breve termine dopo CSF45. Nella fase familiare, non vi è stata alcuna differenza significativa nel tempo totale di esplorazione tra il QCS e il gruppo di controllo(figura 3A). Di conseguenza, non sono state riscontrate differenze nel tempo di esplorazione tra gli oggetti A1 e A2, rispettivamente in due gruppi (Figura 3B). I risultati di cui sopra hanno garantito che non c'erano differenze nelle capacità di esplorazione dei topi e nelle preferenze per la posizione. Nella fase di test, l'indice di discriminazione (DI) dei topi CSF è stato significativamente ridotto rispetto ai controlli (figura 3C), che evidentemente indicavano carenze nel riconoscimento degli oggetti e nella memoria di lavoro a breve termine dopo il QCS.

Abbiamo inoltre eseguito OFT e FST, rispettivamente per esaminare comportamenti simili all'ansia e alla depressione deitopi 46,47. È interessante notare che, nell'OFT, si è scoperto che il gruppo CSF trascorreva meno tempo nella zona centrale rispetto al gruppo di controllo (Figura 4A), il che illustrava che la frammentazione del sonno poteva indurre un comportamento simile all'ansia in una certa misura. Inoltre, i topi CSF hanno mostrato una distanza totale più lunga spostata nel serbatoio (Figura 4B), suggerendo una maggiore attività spontanea dopo la modellazione. Tuttavia, questa modellazione CSF non è stata in grado di indurre comportamenti simili alla depressione, verificati da differenze non significative nel tempo di immobilità tra due gruppi sottoposti all'FST (Figura 4C).

Figure 1
Figura 1: Diagramma di flusso della procedura di progettazione sperimentale. (A) La procedura di progettazione sperimentale che indica la tempistica della modellazione csf e dei test comportamentali (ad esempio MWM, NOR, OFT e FST). (B) Curve del peso corporeo del QCS e dei topi di controllo durante il primo mese successivo all'istituzione del modello CSF. Questa cifra è stata modificata da Xie etal.

Figure 2
Figura 2: Capacità di apprendimento spaziale compromesse dal CSF e capacità di memoria valutate dal test MWM. (A) I topi CSF hanno eseguito una latenza di fuga più lunga rispetto ai topi di controllo durante il test di allenamento di 5 giorni. **p < 0,01. (B) Nel test della sonda, i topi CSF hanno mostrato meno tempo percentuale trascorso nel quadrante della piattaforma in contrasto con i topi di controllo. Il pannello superiore mostra le tracce rappresentative di due gruppi. p < 0,0001. (C) Nel test della sonda, il gruppo CSF ha eseguito meno volte l'attraversamento della posizione della piattaforma rispetto al gruppo di controllo. *p < 0,05. (D) Velocità di nuoto di due gruppi nella prova della sonda. n.s. indica che i cambiamenti tra i diversi gruppi non sono stati significativi. I dati sono stati tutti presentati come ± SEM. n = 10 per gruppo. Questa cifra è stata modificata da Xie etal.

Figure 3
Figura 3: Riconoscimento degli oggetti compromesso csf e memoria di lavoro a orario breve valutata dal test NOR. (A) Il tempo totale di esplorazione tra il QCS e i topi di controllo nella fase familiare, n.s. non indica cambiamenti significativi tra gruppi diversi. (B) Tempo di esplorazione degli oggetti A1 e A2 rispettivamente tra due gruppi nella fase familiare. n.s. non indica cambiamenti significativi tra gruppi diversi. (C) Nella fase di prova, l'indice di discriminazione (DI) del gruppo CSF è stato significativamente diminuito rispetto a quello del gruppo di controllo. *p < 0,05. I dati sono stati tutti presentati come ± SEM. n = 10 per gruppo. Questa cifra è stata modificata da Xie etal.

Figure 4
Figura 4: Il CSF ha esacerbato il comportamento simile all'ansia ma non alla depressione valutato da OFT e FST. (A) I topi CSF hanno trascorso meno tempo nella zona centrale durante i 5 minuti osservati rispetto ai topi di controllo in OFT. *p < 0,05. (B) Il gruppo CSF ha mostrato una distanza totale più lunga spostata nel serbatoio rispetto al gruppo di controllo in OFT. *p < 0,05. (C) Il tempo di immobilità tra il QCS e i gruppi di controllo nell'FST. n.s. non indica cambiamenti significativi tra gruppi diversi. I dati sono stati tutti presentati come ± SEM. n = 10 per gruppo. Questa cifra è stata modificata da Xie etal.

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Discussion

I passaggi critici del protocollo attuale includono la configurazione di macchine per la frammentazione del sonno con i parametri ottimizzati in base allo scopo dello studio e il mantenimento dei topi in un ambiente di vita confortevole e silenzioso durante tutte le sessioni di modellazione. È anche fondamentale decidere i tempi adeguati per interrompere o interrompere la frammentazione del sonno e organizzare test comportamentali per quei topi. Come altri modelli di manipolazione del sonno, è importante eseguire il protocollo in una stanza dedicata con cicli di luce controllati e vuoto di tutte le possibili interferenze non necessarie. Si dovrebbero compiere sforzi per evitare di indurre rumori e ridurre al minimo il tempo di funzionamento condotto dai ricercatori per il controllo, il riempimento del cibo e l'approvvigionamento idrico, il cambio delle lenzuola, ecc. In rare occasioni, ci sono aggressori che attaccano i compagni di cucciolata, specialmente all'inizio di scomode sessioni di interruzione del sonno. L'aggressore, quando presente, dovrebbe essere rimosso dalle gabbie di casa e dai gruppi sperimentali. La maggior parte degli animali da esperimento, ad eccezione di alcuni alla nostra esperienza, si adatterebbe al trattamento e riuscirebbe ad accedere all'acqua e al cibo in base alle esigenze. Topi con problemi intrinseci, come denti deformati, sottopeso e ferite cutanee potrebbero causare perdita di peso o debolezza. Devono anche essere evitati di essere utilizzati per la modellazione. Poiché questo protocollo potrebbe potenzialmente indurre stress cronico e disregolazione metabolica, è essenziale utilizzare topi schermati con criteri uniformi, come il peso corporeo, per la modellazione e gli esperimenti.

Nel protocollo descritto, il rotore orbitale sarebbe stato acceso automaticamente durante le 8:00-20:00 (light-ON) ogni giorno, che è il momento in cui i topi mostrano la maggior parte della loro vita quotidiana. Il rotore è stato impostato su un ciclo ripetitivo di 10 s-on, 110 s-off durante la fase light-ON per indurre eccitazioni frequenti. Varie durate di modellazione darebbero origine a fenotipi diversi. La frammentazione acuta del sonno potrebbe comportare una riduzione assoluta della durata del sonno, un aumento delle attività del sistema nervoso simpatico, come elevati livelli di cortisone e una sensibilità all'insulinacompromessa 23,24. Tuttavia, la frammentazione cronica del sonno ha mostrato livelli di cortisone non influenzati e un tempo di sonno totalebilanciato 24. Qualsiasi modifica basata sul protocollo corrente, come cicli di luce, impostazioni vibranti abbinate (velocità, ampiezza, ciclo ripetitivo, ecc.) e durate di modellazione, potrebbe potenzialmente alterare i fenotipi. È necessario condurre la registrazione del sonno e l'analisi della struttura del sonno in diverse impostazioni di modellazione per identificare i fenotipi del sonno. Potrebbe anche comportare cambiamenti comportamentali e patologici distintivi. Mentre esploravamo il deficit cognitivo dopo la frammentazione del sonno a lungo termine piuttosto che di una notte e tendevamo ad evitare gli effetti distorti della frammentazione intermittente del sonno sui comportamenti dei topi in MWM e NOR, abbiamo eseguito questi due test comportamentali dopo aver interrotto il protocollo CSF il giorno 60. Tuttavia, inevitabilmente, l'effetto del sonno di recupero nei topi potrebbe aver confuso i risultati per MWM e NOR mostrati.

Sebbene questo modello abbia diritto a un modello di frammentazione del sonno, in realtà è composto da modelli di sonno frammentati durante la fase light-ON, disregolazione del ritmo circadiano e rimbalzo compensativo del sonno durante la fase light-OFF. Questo protocollo potrebbe indurre non solo alterazioni del modello di sonno, ma anche una sostanziale neuroinfiammazione, squilibrio metabolico, disturbo del sistema immunitario,ecc. 21,23,24. Tutti questi processi patologici possono interagire tra loro e mediare fenotipi come un'orchestra. Questo modello dovrebbe essere preso nel suo complesso per generare i topi con fenotipi di modello di sonno disregolato, deficit cognitivo e comportamento simile all'ansia nei giovani topi di tipo selvaggio. Come accennato nella sezione precedente, questo modello non rispecchia esattamente OSA a causa della mancanza di ipossia ripetitiva. Un'altra limitazione è che è difficile generare accurati cambiamenti patologici e fenotipi del sonno negli stessi topi. L'impianto di elettrodo EEG/EMG ampiamente applicato per la registrazione del sonno ha inevitabilmente indotto una grave gliosi nella corteccia48. Negli ultimi anni, le tecniche di monitoraggio video e analisi delle immagini basate sull'intelligenza artificiale sono state applicate negli studi sul sonno, che raccoglierebbero informazioni precise sul sonno senza impianto di elettrodiinvasivi 49,50,51.

I significati di questo metodo CSF rispetto ai metodi esistenti includono: 1) Diversi dai protocolli di privazione del sonno che di solito vengono eseguiti per ore o giorni, l'attuale protocollo imita meglio il disturbo del sonno a lungo termine negli esseri umani sani. Il rimbalzo compensativo del sonno nei topi frammentati del sonno rispecchia perfettamente la sonnolenza diurna e le prestazioni lavorative ritardanti nelle persone con scarsa qualità delsonno durante la notte 52,53. 2) È finora l'unico modello cronico di frammentazione del sonno nei giovani topi di tipo selvatico con deficit cognitivo confermato e fenotipi comportamentali simili all'ansia ma non depressionari, nonché evidenti cambiamenti patologici molecolari nel tessuto cerebrale. 3) Questo trattamento provoca irritazioni più lievi ai topi in modo che la modellazione possa durare mesi, anche con la possibilità di essere eseguita in periodi di tempo più lunghi. 4) Con impostazioni adeguate, questo modello può generare fenotipi stabili di disturbo del sonno, deficit cognitivo e comportamento simile all'ansia, che possono essere utilizzati sia come modelli di malattia che come interventi per diversi progetti di studio. 5) Alcuni modelli di privazione del sonno richiedono l'interferenza completa della sessione da parte dei ricercatori per applicare una manipolazione delicata o nuovi oggetti. Ad eccezione del monitoraggio regolare, questo metodo riduce al minimo le fatiche di movimentazione, il che elimina anche la distorsione artificiale.

Questo protocollo CSF offre l'opportunità di rispondere a una serie di domande scientifiche chiave, come, il disturbo cronico del sonno è la causa o la conseguenza di malattie neurodegenerative? La patogenesi indotta da disturbi cronici del sonno durante la giovane età è reversibile? I meccanismi compensatori per il disturbo cronico del sonno variano tra i giovani e gli anziani, le persone sane e i pazienti? Questo protocollo può anche essere applicato per esplorare le terapie valutando la gravità e il miglioramento dei fenotipi comportamentali e molecolari. Sarebbe anche applicato per modellare i topi con craniectomia cronica, preparati di impianto in fibra ottica per registrazioni funzionali. Inoltre, può essere utilizzato come strategia interventiva per indurre o aggravare i fenotipi oltre alle condizioni preesistenze. Infine, può essere utilizzato per studiare i meccanismi transitori dello stato di veglia del sonno. È interessante notare che l'attuale modello CSF potrebbe indurre un comportamento simile all'ansia piuttosto che alla depressione nei topi, che è in linea con l'osservazione clinica che il disturbo del sonno nei pazienti sarebbe probabilmente associato molto più all'ansia che alla depressione54,55. Fornisce un modello pratico per studiare i disturbi emotivi nei roditori.

In sintesi, presentiamo il protocollo di modellazione della frammentazione cronica del sonno mediante l'uso di un rotore orbitale vibrante, che potrebbe produrre fenotipi stabili nei giovani topi di tipo selvaggio e ridurre al minimo le fatiche di modellazione con alta efficienza. Può essere potenzialmente generato per una varietà di scopi di ricerca.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (61327902-6 a W. Wang e 81801318 a F.F. Ding). Riconosciamo la Dott.ssa Sigrid Veasy per aver stabilito il sistema sperimentale SF e aver gentilmente fornito dettagli tecnici. Riconosciamo il Dr. Maiken Nedergaard per i commenti istruttivi per esperimenti correlati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Any-maze behavior tracking system Stoelting,Inc,USA - A video-tracking system which was used to record the behavior track of mice.
C57BL/6J mice Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, China. - healthy male C57BL/6J mice aged 10-12 weeks were purchased from Hubei Research Center for Laboratory Animals
Graphpad Prism 6.0 Software Graphpad Software,Inc.USA - Graphpad Prism 6.0 software was used to draw statistical graphs.
Morris water maze system Shanghai XinRuan Information Technology Co.,Ltd,China XR-XM101 The system was used to perform Morris water maze test
Orbial rotor Shanghai ShiPing Laboratory Equipment Co.,Ltd,China SPH-331 The orbital rotor was used to establish the chronic sleep fragmentation model
Solid state timer OMRON Corporation, Kyoto, Japan H3CR-F8-300 The solid state time was used to control the frequency and time of the rotor running
Wooden Lusterless Tank - - length 30 cm, width 28 cm, height 35 cm The tank was used to perform open field test and novel object recognition test

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Comportamento Problema 163 frammentazione cronica del sonno rotore orbitale deficit cognitivo comportamento simile all'ansia apnea ostruttiva del sonno malattie neurodegenerative
Un modello di frammentazione del sonno cronico che utilizza il rotore orbitale vibrante per indurre deficit cognitivo e comportamento simile all'ansia nei giovani topi di tipo selvaggio
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Xie, Y., Deng, S. Y., Chen, S. M.,… More

Xie, Y., Deng, S. Y., Chen, S. M., Chen, X. J., Lai, W. W., Huang, L. F., Ba, L., Wang, W., Ding, F. F. A Chronic Sleep Fragmentation Model using Vibrating Orbital Rotor to Induce Cognitive Deficit and Anxiety-Like Behavior in Young Wild-Type Mice. J. Vis. Exp. (163), e61531, doi:10.3791/61531 (2020).

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