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Behavior

Um modelo de fragmentação crônica do sono usando rotor orbital vibrante para induzir déficit cognitivo e comportamento semelhante à ansiedade em camundongos jovens do tipo selvagem

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61531
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000, China, 2Key Laboratory of Neurological Diseases of Chinese Ministry of Education, The School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000,China, 3Department of Pharmacology, School of Basic Medical Science; State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institutes of Brain Science and Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University, Shanghai 200032, China

Summary

Apresentado aqui é um protocolo para fragmentação crônica do sono (CSF) modelo alcançado por um rotor orbital eletricamente controlado, que poderia induzir déficit cognitivo confirmado e comportamento semelhante à ansiedade em camundongos jovens do tipo selvagem. Este modelo pode ser aplicado para explorar a patogênese da perturbação crônica do sono e distúrbios relacionados.

Abstract

A perturbação do sono é geralmente comum em populações como uma doença crônica ou um evento reclamado. A perturbação crônica do sono é proposta para estar intimamente ligada à patogênese das doenças, especialmente as doenças neurodegenerativas. Descobrimos recentemente que 2 meses de fragmentação do sono iniciaram alterações comportamentais e patológicas semelhantes à doença de Alzheimer em camundongos jovens do tipo selvagem. Aqui, apresentamos um protocolo padronizado para alcançar a fragmentação crônica do sono (CSF). Resumidamente, o CSF foi induzido por um rotor orbital vibrando a 110 rpm e operando com um ciclo repetitivo de 10 s-on, 110 s-off, durante a fase light-ON (8:00 AM-8:00 PM) continuamente por até 2 meses. Os prejuízos da aprendizagem espacial e da memória, o comportamento semelhante à ansiedade, mas não parecido com a depressão em camundongos como consequências da modelagem CSF, foram avaliados com labirinto de água morris (MWM), reconhecimento de objetos novos (NOR), teste de campo aberto (OFT) e teste de natação forçada (FST). Em comparação com outras manipulações do sono, este protocolo minimiza o manuseio de mão-de-obra e maximiza a eficiência da modelagem. Produz fenótipos estáveis em camundongos jovens do tipo selvagem e pode ser potencialmente gerado para uma variedade de propósitos de pesquisa.

Introduction

A perturbação do sono é cada vez mais comum tanto em pacientes com condições perturbadoras para o sono quanto em pessoas saudáveis com eventos perturbadores do sono. Observou-se que pacientes com doenças neurodegenerativas, dor crônica, estresse emocional, doenças do sistema respiratório, doenças do sistema urinário, etc., geralmente reclamam de experiências de sono desagradáveis1,2,3,4,5. Apneia obstrutiva do sono (OSA), movimentos periódicos de membros no sono (PLMS), insônia de manutenção do sono entre outros distúrbios do sono são as causas mais comuns, que induzem a fragmentação do sono6,7. Nos países desenvolvidos, a OSA tem mais de 5% a 9% de prevalência na população adulta e 2% na população infantil8,9,10. Enquanto isso, há uma proporção crescente da população saudável que sofre de distúrbio do sono devido ao uso excessivo de telefones inteligentes, hábitos irregulares de sono, ruídos irritantes e tarefas de trabalho, como turnos noturnos para cuidadores. O sono é reconhecido como importante para o despejo de resíduos cerebrais11,12, consolidação da memória13,14, equilíbrio metabólico15,16, entre muitos outros processos fisiológicos. No entanto, ainda não se sabe se a perturbação do sono a longo prazo dá origem a alterações irreversíveis da patogênese em seres humanos saudáveis, e se é a etiologia ou um fator contribuinte para o desenvolvimento de doenças do sistema nervoso central, como doenças neurodegenerativas em alguns anos. Nosso objetivo é relatar um modelo experimental que gere déficit cognitivo estável e evidente e comportamento semelhante à ansiedade em camundongos jovens do tipo selvagem após um tratamento de fragmentação do sono de 2 meses. Este modelo seria aplicado para responder às questões científicas listadas acima.

A perturbação do sono é listada como um fator de risco potencial para o desenvolvimento da doença de Alzheimer (DA) ou demência. Kang et al. encontraram e descreveram pela primeira vez a exacerbação da patologia da AD por 6h de privação aguda do sono17. Depois disso, muitos outros estudos relataram que a privação ou fragmentação do sono poderia agravar a patogênese nos modelos transgênicos de camundongosAD 18,19,20. No entanto, poucos pesquisadores estudaram a consequência da perturbação do sono em camundongos jovens do tipo selvagem; ou seja, se a perturbação do sono dá origem a comportamentos semelhantes a DA ou mudanças patológicas em camundongos jovens do tipo selvagem. Em nossa recente publicação, relatamos que 2 meses de fragmentação do sono induziram evidente déficit de memória espacial e comportamento semelhante à ansiedade, bem como aumento do acúmulo intracelular de β Amiloide (Aβ) tanto no córtex quanto no hipocampo em camundongos do tipo selvagem de 2 a 3meses de idade 21. Também observamos níveis de expressão alterados de marcadores de via endosome-autofagossomo e ativação de microglia, semelhantes às alterações patológicas relatadas em camundongos APP/PS121,22.

Este protocolo de fragmentação do sono (SF) foi validado por Sinton et al.23 e modificado por Li et al.24. Em resumo, um rotor orbital vibrando a 110 rpm interrompe o sono por 10 s a cada 2 minutos durante a fase light-ON (8:00 AM-8:00 PM). A alteração da estrutura do sono neste modelo foi previamente caracterizada com registros eletrofisiológicos de sono e relatada por Li et al.24, indicando um aumento significativo no tempo de vigília e diminuição do sono do movimento rápido dos olhos (REM) durante a fase light-ON, com o total de tempo de sono e vigília (em 24 horas) não afetados após mais de 4 semanas de modelagem24. Atualmente, o sono total ou a privação parcial do sono são os modelos de manipulação do sono mais usados. A privação total do sono é geralmente realizada por manuseio suave sustentado ou exposição do animal a objetos novos, alternativamente girando continuamente uma barra ou uma esteira de corrida25,26,27,28,29. Por razões éticas, a privação total do sono é geralmente menor que 24 h. O modelo de privação parcial de sono mais comumente aplicado é o método da plataforma de água, que ablação principalmente do sono REM30,31,32. Outras abordagens usando uma esteira ou uma barra que varre ao longo da parte inferior da gaiola, podem induzir a fragmentação do sono quando colocados em intervalos fixos33,34,35,36,37,38. Vale ressaltar que a SF interrompe o sono e provoca intermitentemente excitações em todas as etapas do sono24. Uma das vantagens proeminentes deste modelo CSF que aplica rotor orbital é que ele pode ser realizado continuamente por meses automaticamente controlado por máquinas, o que evita o trabalho de processamento frequente diariamente, exceto para monitoramento regular. Além disso, o aparelho permitiria modelar simultaneamente múltiplas gaiolas de camundongos sob intervenções uniformizadas. Durante as sessões de modelagem inteiras, os ratos são alojados em suas gaiolas domésticas com materiais habituais de cama e aninhamento, enquanto alguns outros métodos requerem exposição a ambientes diversificados e estresse inevitável.

A fragmentação do sono foi anteriormente caracterizada pelo método de manipulação do sono, que imita excitaçãos frequentes durante a fase de sono e recuperação substancial do sono durante a fase de vigília. Em algumas literaturas, a CSF foi considerada como modelo animal para OSA39,40. Neste estudo, a lógica da frequência escolhida de excitação a ser de 30 vezes por hora baseia-se na observação de índices de excitação em pacientes com apneia do sono moderada a grave. Observou-se que a fragmentação do sono de 4 semanas aumentou significativamente a latência hipercánica de excitação e o limiar de excitação tátil, que poderia durar pelo menos 2 semanas após arecuperação 24. Este fenótipo foi explicado pela revelação da redução da ativação c-fos em neurônios noradrenérgicos, orexinérgicos, histaminérgicos e colinérgicos em resposta à hipercapnia, bem como projeções catecoliérgicas e orexinérgicas reduzidas no córtex cingulado24. No entanto, é necessário notar que a característica mais importante na OSA é a hipóxia causada pela obstrução das vias aéreas, o que resulta em interrupção do sono41,42. Perturbação do sono e hipóxia repetitiva interagem recíprocas entre si na patogênese da OSA. Portanto, a fragmentação do sono por si só pode não ser capaz de demonstrar totalmente todas as características-chave da OSA em camundongos.

Aqui, apresentamos um protocolo padronizado para modelar a fragmentação crônica do sono em camundongos jovens selvagens. Déficit cognitivo e ansiedade, bem como comportamentos semelhantes à depressão após o tratamento de CSF foram avaliados pelo labirinto de água de Morris, reconhecimento de objetos Novos, teste de campo aberto e teste de natação forçado. É importante notar que esse modelo deve ser tomado como um todo que gera fenótipos de padrão de sono disregulado, déficit cognitivo e comportamento semelhante à ansiedade. O modelo atual poderia potencialmente ser aplicado, mas não se limitando, aos seguintes propósitos: 1) Investigar melhor os mecanismos de patogênese funcional ou molecular induzidos pela perturbação crônica do sono em camundongos jovens sem predisposição genética, 2) Identificar o caminho direto que leva à neurodegeneração iniciada pela perturbação do sono, 3) Explorar a terapêutica para melhorar os fenótipos induzidos pela perturbação crônica do sono, 4) Estudar os mecanismos protetivos/compensatórios intrínsecos em camundongos do tipo selvagem sobre perturbação crônica do sono, 5) A ser aplicado para estudar a regulação do sono e os mecanismos de transição do Estado.

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Protocol

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Tongji, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology.

1. Triagem e preparação de ratos para o experimento

  1. Selecione camundongos machos adultos (8 a 10 semanas) com peso de 20 a 28 g para todo o experimento.
    NOTA: Os camundongos C57BL/6 do tipo selvagem são obtidos no Centro de Pesquisa hubei para animais de laboratório, Hubei, China.
  2. Atribua aleatoriamente todos os ratos ao CSF e ao grupo de controle. Casa 3-5 ratos em cada gaiola para evitar o estresse de isolamento social. O número de ratos alojados nas gaiolas de controle é compatível com o alojado nas gaiolas CSF emparelhadas.
    NOTA: Ratos nas mesmas gaiolas de grupo são agrupados para realizar experimentos comportamentais de acompanhamento.
  3. Localize as gaiolas de controle na mesma sala com as gaiolas CSF, para manter o ambiente circundante e os efeitos trabalhistas idênticos.
  4. Número e marca os ratos em cada grupo em seus ouvidos usando uma etiqueta de ouvido para fins de monitoramento.
  5. Mantenha a temperatura ambiente e a umidade entre 21-23 °C e 35%-60 %.
  6. Mantenha o ambiente ambiente em ciclo claro-escuro de 12 horas (8:00-8:00 PM light-ON, 8:00 PM-8:00 AM light-OFF), para evitar efeito tendencioso no ritmo normal de sono em camundongos.
  7. Minimize o ruído e a interferência enquanto o pesquisador estiver presente na sala de modelagem.
  8. Forneça aos ratos comida e água suficientes. Use bocais longos com pontas de válvula de esfera em garrafas de água, para evitar o vazamento de água sobre os movimentos da plataforma. Aperte a garrafa de água em cima da gaiola com uma mola para evitar o deslocamento da garrafa durante a corrida do rotor.

2. Preparação e configuração do rotor orbital

  1. Prepare um rotor orbital eletricamente controlado com plataforma ampliada (67 cm x 110 cm), no qual 10 gaiolas podem ser colocadas no máximo.
  2. Coloque o rotor orbital ligado durante a fase light-ON (8:00 AM-8:00 PM) controlado por um temporizador de programa, que é o momento em que os ratos exibem a maior parte de seu sono diário.
  3. Defina o rotor orbital com uma velocidade de 110 rpm e um ciclo repetitivo de 10 s-on, 110 s-off controlado com um temporizador de estado sólido.
    NOTA: A capacidade de carga da plataforma é de 50 kg. A amplitude fixa do horizonte do rotor vibrando é de 2,5 cm.
  4. Aperte as gaiolas CSF no topo da plataforma do rotor por molas grossas para evitar a luxação de gaiolas em rotações de plataforma.

3. Modelagem e monitoramento de fragmentação crônica do sono

  1. Coloque gaiolas do CSF e dos ratos de controle na sala de modelagem por uma semana antes dos experimentos, para permitir que os ratos se adaptem ao ambiente ambiente.
  2. No início da modelagem, certifique-se de que todos os ratos tenham livre acesso a alimentos e água durante rotações orbitais.
  3. No início da modelagem, observe pelo menos por 1h para garantir que o rotor orbital operasse em marcha.
  4. Durante o período de modelagem, verifique se o rotor orbital está funcionando corretamente e as condições dos ratos a cada 2 dias para garantir que os ratos tenham comida e água suficientes. Troque camas de gaiolas semanalmente.
  5. Durante o período de modelagem, pese os ratos semanalmente às 8:00 am ao trocar a cama. Remova os camundongos com perda significativa de peso da modelagem, e também dos grupos experimentais.
    NOTA: A perda significativa de peso é definida como pesando menos de 20 g com duração de 2 semanas.
  6. Durante todas as sessões de modelagem, remova o agressor, se houver, da gaiola e, também, dos grupos experimentais.
  7. Após o término da modelagem, continue mantendo e alimentando os ratos na sala original.

4. Teste do labirinto de água de Morris (MWM)

  1. Preparação para o teste
    1. Prepare o aparelho de um tanque circular cheio de água morna (20-23 °C).
    2. Suspenda quatro sinais com diferentes formas e cores na cortina ao redor do tanque em quatro direções do quadrante como referência de visão distante. Faça com que a água pareça opaca pela adição de leite em pó.
    3. Localize uma plataforma no meio do quadrante sudoeste.
  2. O teste de treinamento
    1. Sujeito a quatro ensaios consecutivos entre 8:00 am e 12:00 AM todos os dias durante um período de treinamento de 5 dias.
    2. Solte cada rato na água de frente para a parede lateral em um dos quatro quadrantes em quatro ensaios. Em cada teste, permita que o rato nade por 60 s para encontrar a plataforma. Se o mouse não conseguir chegar à plataforma dentro dos anos 60, guie-o até a plataforma e permaneça lá por 15 s.
    3. Use um sistema de rastreamento de vídeo para gravar automaticamente a latência de fuga de ratos para encontrar a plataforma oculta.
  3. O teste da sonda
    1. Realize o teste da sonda no sexto dia após 5 dias de treinamento.
    2. Remova a plataforma. Solte cada rato do quadrante nordeste e deixe-o nadar por 60 s
    3. Use um sistema de rastreamento de vídeo para registrar automaticamente os dados de rastreamento de ratos.

5. Novo teste de reconhecimento de objeto (NOR)

  1. A fase familiar
    1. Coloque ratos em um tanque (comprimento de 30 cm, largura 28 cm, altura de 35 cm) em sequência, que contém duas cópias de objetos (A1 e A2). Permita que os ratos explorem livremente (10 minutos por ensaio).
    2. Use um sistema de rastreamento de vídeo para registrar automaticamente os dados de rastreamento de ratos.
  2. A fase de teste
    1. Realize o teste após um atraso de 1h da fase familiar. Substitua um dos objetos originais por um novo objeto ("romance") no tanque mantendo o outro inalterado. Devolva os ratos ao tanque e deixe-o explorar por 5 minutos por teste.
    2. Use um sistema de rastreamento de vídeo para registrar automaticamente o tempo gasto na exploração de cada objeto por cada mouse.
      NOTA: A exploração do objeto é determinada por lamber, cheirar, mastigar ou mover vibrissae enquanto orienta o nariz em direção e a menos de 1 cm do objeto. O Índice de Discriminação (DI) é calculado com a equação (TN − TF)/(TN + TF), onde TN = tempo gasto explorando o objeto "novo" e TF = tempo gasto explorando o objeto "familiar".

6. Teste de campo aberto (OFT)

  1. Prepare o aparelho de um tanque (30 cm x 28 cm x 35 cm).
  2. Durante o teste, coloque cada rato no centro do tanque e deixe-o explorar livremente por 5 minutos. Limpe o tanque com 75% de etanol após cada ensaio para evitar os efeitos restantes do mouse anterior.
  3. Use um sistema de rastreamento de vídeo para registrar automaticamente os dados de rastreamento de ratos.

7. Teste de natação forçada (FST)

  1. Prepare o aparelho de um vaso cilíndrico aberto, que contém água (20-23 °C) que tem 15 cm de profundidade.
  2. Durante o teste, coloque cada rato no cilindro e deixe que ele permaneça lá por 6 minutos.
  3. Use um sistema de faixa de vídeo para registrar automaticamente o tempo de imobilidade durante os últimos 4 minutos do teste por cada mouse.
    NOTA: O mouse é determinado a ficar imóvel quando pára de lutar e flutua na água, fazendo apenas movimentos que são necessários para manter sua cabeça acima da água.

8. Análise de dados

  1. Analisar dados utilizando software de análise estatística (por exemplo, GraphPad Prism 6.0).
  2. Expressa a todos os dados como a média ± SEM.
  3. Compare a latência de fuga no teste MWM entre dois grupos usando ANOVA bidirecional com medidas repetidas seguidas de pós-testes de Bonferroni. Outras comparações entre o CSF e os grupos de controle são determinadas por testes t não pagos.
  4. Considere diferenças significativas se P < 0,05 em todos os testes.

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Representative Results

Todos os resultados e números representativos foram reproduzidos a partir de nossa recentepublicação 21. A reutilização dos números foi permitida pelo jornal original.

Todo o desenho experimental é ilustrado na ordem do tempo, o que indica o tempo de modelagem CSF, testes comportamentais de MWM, NOR, OFT e FST(Figura 1A). Obtivemos pesos de camundongos todas as semanas do CSF e dos grupos de controle, para monitorar suas condições gerais durante as sessões de modelagem. Não foi encontrada diferença evidente no aumento de peso em camundongos entre dois grupos durante a modelagem (Figura 1B).

Para avaliar os efeitos do CSF no aprendizado espacial e no desempenho da memória, realizamos o teste comportamental MWM43,44. O grupo CSF apresentou capacidades de fuga mais baixas para encontrar a plataforma ao longo de 5 dias de treinamento em comparação com o grupo controle (Figura 2A). No teste da sonda, os camundongos CSF passaram significativamente menos tempo no quadrante alvo e cruzaram o local anterior da plataforma em menos vezes(Figura 2B,C), sem diferença de velocidade de natação(Figura 2D). Esses resultados acima indicaram que as capacidades de aprendizagem espacial e recuperação de memória dos camundongos foram prejudicadas após o CSF.

Também realizamos o teste NOR para avaliar o reconhecimento de objetos e a memória de trabalho de curto prazo após o CSF45. Na fase familiar, não houve diferença significativa no tempo total de exploração entre o CSF e o grupo controle (Figura 3A). Correspondentemente, não foram encontradas diferenças no tempo de exploração entre os objetos A1 e A2, respectivamente em dois grupos (Figura 3B). Os resultados acima garantiram que não havia diferenças nas habilidades dos camundongos para exploração e preferências por localização. Na fase de teste, o Índice de Discriminação (DI) dos camundongos CSF foi significativamente reduzido em relação aos controles(Figura 3C),o que evidentemente indicou déficits no reconhecimento de objetos e memória de trabalho de curto prazo após csf.

Realizamos ainda OFT e FST, respectivamente, para examinar comportamentos semelhantes à ansiedade e depressão de camundongos46,47. Curiosamente, no OFT, verificou-se que o grupo CSF passou menos tempo na zona central do que o grupo controle (Figura 4A), que ilustrava que a fragmentação do sono poderia induzir um comportamento semelhante à ansiedade até certo ponto. Além disso, os camundongos CSF apresentaram maior distância total movida no tanque (Figura 4B),sugerindo aumento da atividade espontânea após a modelagem. No entanto, essa modelagem de CSF não poderia induzir comportamento semelhante à depressão, verificada por diferença não significativa no tempo de imobilidade entre dois grupos submetidos ao FST (Figura 4C).

Figure 1
Figura 1: O fluxograma do procedimento experimental de design. (A) O procedimento experimental de design indica o tempo de modelagem csf e testes comportamentais (ou seja, MWM, NOR, OFT e FST). (B) Curvas de peso corporal do CSF e dos ratos de controle durante o primeiro mês após a criação do modelo CSF. Esta figura foi modificada a partir de Xie et al.21Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: CSF prejudicou as habilidades de aprendizagem espacial e memória avaliadas pelo teste MWM. (A) Os camundongos CSF realizaram latência de fuga mais longa em comparação com os ratos de controle durante o teste de treinamento de 5 dias. **p < 0,01. (B) No teste da sonda, os camundongos CSF apresentaram menos tempo percentual gasto no quadrante da plataforma em contraste com os ratos de controle. O painel superior mostra rastreamentos representativos de dois grupos. p < 0,0001. (C) No teste da sonda, o grupo CSF realizou menos vezes de cruzar o local da plataforma quando comparado ao grupo controle. *p < 0,05. (D) A velocidade de natação de dois grupos no teste da sonda. n.s. indica que as mudanças entre diferentes grupos não foram significativas. Os dados foram todos apresentados como média ± SEM. n = 10 por grupo. Esta figura foi modificada a partir de Xie et al.21Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: CSF prejudicou o reconhecimento do objeto e a memória de trabalho de curto prazo avaliada pelo teste NOR. (A) O tempo total de exploração entre o CSF e os ratos de controle na fase familiar, n.s. não indica alterações significativas entre diferentes grupos. (B) O tempo de exploração dos objetos A1 e A2, respectivamente, entre dois grupos na fase familiar. n.s. não indica alterações significativas entre diferentes grupos. (C) Na fase de teste, o Índice de Discriminação (DI) do grupo CSF foi significativamente reduzido em relação ao do grupo controle. *p < 0,05. Os dados foram todos apresentados como média ± SEM. n = 10 por grupo. Esta figura foi modificada a partir de Xie et al.21Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: CSF exacerbou o comportamento de ansiedade, mas não semelhante à depressão, avaliado por OFT e FST. (A) Os camundongos CSF passaram menos tempo na zona central durante os 5 minutos observados em comparação com os ratos de controle em OFT. *p < 0,05. (B) O grupo CSF apresentou maior distância total movida no tanque versus o grupo de controle em OFT. *p < 0,05. (C) O tempo de imobilidade entre o CSF e os grupos de controle em FST. n.s. não indica alterações significativas entre diferentes grupos. Os dados foram todos apresentados como média ± SEM. n = 10 por grupo. Esta figura foi modificada a partir de Xie et al.21Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

As etapas críticas do protocolo atual incluem a criação de máquinas de fragmentação do sono com os parâmetros otimizados de acordo com a finalidade do estudo e a manutenção dos ratos em ambiente de vida confortável e tranquilo durante todas as sessões de modelagem. Também é crucial decidir o momento adequado para interromper ou parar a fragmentação do sono e organizar testes comportamentais para esses camundongos. Como outros modelos de manipulação do sono, é importante executar o protocolo em uma sala dedicada com ciclos de luz controlados e vazio de todas as possíveis interferências desnecessárias. Devem ser feitos esforços para evitar a indução de ruídos e minimizar o tempo de operação realizado pelos pesquisadores para verificação, recarga de alimentos e abastecimento de água, alteração das camas, etc. Em raras ocasiões, há agressores atacando os companheiros de lixo, especialmente no início de sessões desconfortáveis de interrupção do sono. O agressor, quando presente, deve ser retirado das gaiolas de casa, bem como dos grupos experimentais. A maioria dos animais experimentais, exceto alguns para nossa experiência, se adaptaria ao tratamento e conseguiria acessar a água e a comida conforme necessário. Camundongos com problemas intrínsecos, como dentes deformados, feridas abaixo do peso e pele podem causar perda de peso ou fraqueza. Eles também precisam ser evitados sendo usados para a modelagem. Como este protocolo poderia potencialmente induzir o estresse crônico e a desregulação metabólica, é essencial usar camundongos selecionados com critérios uniformizados, como peso corporal, para modelagem e experimentos.

No protocolo descrito, o rotor orbital seria ligado automaticamente durante as 8:00 AM-8:00 PM (light-ON) diariamente, que é o momento em que os ratos exibem a maior parte de sua vida diária. O rotor foi definido em um ciclo repetitivo de 10 s-on, 110 s-off durante a fase light-ON para induzir excitações frequentes. Várias durações de modelagem dariam origem a diferentes fenótipos. A fragmentação aguda do sono pode resultar em redução absoluta da duração do sono, aumento das atividades do sistema nervoso simpático, como níveis elevados de cortisona e sensibilidade à insulina prejudicada23,24. No entanto, a fragmentação crônica do sono mostrou níveis de cortisona não afetados e tempo de sono total equilibrado24. Quaisquer modificações baseadas no protocolo atual, como ciclos de luz, configurações vibratórias combinadas (velocidade, amplitude, ciclo repetitivo, etc.) e duração da modelagem, poderiam potencialmente alterar os fenótipos. É necessário realizar a gravação do sono e a análise da estrutura do sono em diferentes configurações de modelagem para identificar os fenótipos do sono. Também pode resultar em mudanças comportamentais e patológicas distintas. Como exploramos o déficit cognitivo após a fragmentação do sono a longo prazo e não uma noite e tendemos a evitar os efeitos tendenciosos da fragmentação intermitente do sono em comportamentos de camundongos em MWM e NOR, realizamos esses dois testes comportamentais após o término do protocolo CSF no dia 60. No entanto, inevitavelmente, o efeito do sono de recuperação em camundongos pode ter confundido os resultados para MWM e NOR mostrados.

Embora este modelo tenha direito ao modelo de fragmentação do sono, ele é composto de padrões de sono fragmentados durante a fase light-ON, desregulação do ritmo circadiano e repercussão compensatória do sono durante a fase light-OFF. Este protocolo poderia induzir não apenas alterações no padrão do sono, mas também neuroinflamação substancial, desequilíbrio metabólico, perturbação do sistema imunológico, etc21,23,24. Todos esses processos patológicos podem interagir uns com os outros e mediar fenótipos como uma orquestra. Este modelo deve ser tomado como um todo para gerar os camundongos com fenótipos de padrão de sono disregulado, déficit cognitivo e comportamento semelhante à ansiedade em camundongos jovens do tipo selvagem. Como mencionado na seção anterior, este modelo não está exatamente espelhando OSA devido à falta de hipóxia repetitiva. Outra limitação é que é difícil gerar alterações patológicas precisas e fenótipos do sono nos mesmos camundongos. A implantação de eletrodo EEG/EMG amplamente aplicada para registro de sono inevitavelmente induziu gliose grave no córtex48. Nos últimos anos, técnicas de videomonitoramento e análise de imagens baseadas em inteligência artificial foram aplicadas em estudos de sono, que coletariam informações precisas do sono sem implantação invasiva de eletrodos49,50,51.

As significâncias deste método CSF em comparação com os métodos existentes incluem: 1) Diferente dos protocolos de privação do sono que geralmente são realizados por horas ou dias, o protocolo atual imita melhor a perturbação do sono a longo prazo em seres humanos saudáveis. O recuperação compensatória do sono em ratos fragmentados do sono reflete perfeitamente a sonolência diurna e o desempenho de trabalho retardante em pessoas com má qualidade do sono durante a noite52,53. 2) É até agora o único modelo crônico de fragmentação do sono em camundongos jovens do tipo selvagem com déficit cognitivo confirmado e fenótipos de comportamento semelhantes à depressão, bem como evidentes alterações patológicas moleculares no tecido cerebral. 3) Este tratamento causa irritações mais brandas aos camundongos para que a modelagem possa durar meses, mesmo com a possibilidade de ser realizada em períodos mais longos de tempo. 4) Com configurações adequadas, este modelo pode gerar fenótipos estáveis de distúrbio do sono, déficit cognitivo e comportamento semelhante à ansiedade, que podem ser usados tanto como modelos de doenças quanto intervenções para diferentes desenhos de estudos. 5) Alguns modelos de privação de sono requerem interferência completa da sessão por parte dos pesquisadores para aplicar manuseio suave ou objetos novos. Com exceção do monitoramento regular, esse método minimiza o manuseio de mão-de-obra, o que também elimina o viés artificial.

Este protocolo CSF oferece a oportunidade de responder a uma série de questões científicas importantes, como, como, a perturbação crônica do sono é a causa ou consequência de doenças neurodegenerativas? A perturbação crônica do sono induz a patogênese durante a pouca idade é reversível? Os mecanismos compensatórios sobre a perturbação crônica do sono variam entre jovens e idosos, pessoas saudáveis e pacientes? Este protocolo também pode ser aplicado para explorar a terapêutica, avaliando a gravidade e melhoria dos fenótipos comportamentais e moleculares. Também seria aplicado ao modelo dos camundongos com craniectomia crônica, preparações de implantação de fibra óptica para gravações funcionais. Além disso, pode ser usado como estratégia intervencionista para induzir ou agravar fenótipos em cima de condições pré-existentes. Finalmente, pode ser usado para estudar mecanismos de transição do estado de vigília do sono. Curiosamente, o modelo atual de CSF poderia induzir o comportamento semelhante à ansiedade em vez de depressão em camundongos, o que está em consonância com a observação clínica de que a perturbação do sono em pacientes provavelmente estaria associada muito mais à ansiedade do que à depressão54,55. Fornece um modelo prático para estudar distúrbios emocionais em roedores.

Em resumo, apresentamos o protocolo de modelagem da fragmentação crônica do sono por meio de um rotor orbital vibrante, que poderia produzir fenótipos estáveis em camundongos jovens do tipo selvagem e minimizar os trabalhos de modelagem com alta eficiência. Pode ser potencialmente gerado para uma variedade de propósitos de pesquisa.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (61327902-6 para W. Wang e 81801318 para F.F. Ding). Reconhecemos o Dr. Sigrid Veasy por estabelecer o sistema experimental SF e gentilmente fornecer detalhes técnicos. Reconhecemos o Dr. Maiken Nedergaard por comentários instrutivos para experimentos relacionados.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Any-maze behavior tracking system Stoelting,Inc,USA - A video-tracking system which was used to record the behavior track of mice.
C57BL/6J mice Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, China. - healthy male C57BL/6J mice aged 10-12 weeks were purchased from Hubei Research Center for Laboratory Animals
Graphpad Prism 6.0 Software Graphpad Software,Inc.USA - Graphpad Prism 6.0 software was used to draw statistical graphs.
Morris water maze system Shanghai XinRuan Information Technology Co.,Ltd,China XR-XM101 The system was used to perform Morris water maze test
Orbial rotor Shanghai ShiPing Laboratory Equipment Co.,Ltd,China SPH-331 The orbital rotor was used to establish the chronic sleep fragmentation model
Solid state timer OMRON Corporation, Kyoto, Japan H3CR-F8-300 The solid state time was used to control the frequency and time of the rotor running
Wooden Lusterless Tank - - length 30 cm, width 28 cm, height 35 cm The tank was used to perform open field test and novel object recognition test

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References

  1. Peter-Derex, L., Yammine, P., Bastuji, H., Croisile, B. Sleep and Alzheimer's disease. Sleep Medicine Reviews. 19, 29-38 (2015).
  2. Mathias, J. L., Cant, M. L., Burke, A. L. J. Sleep disturbances and sleep disorders in adults living with chronic pain: a meta-analysis. Sleep Medicine. 52, 198-210 (2018).
  3. Murphy, M. J., Peterson, M. J. Sleep Disturbances in Depression. Sleep Medicine Clinics. 10 (1), 17-23 (2015).
  4. Walter, L. M., et al. Sleep disturbance in pre-school children with obstructive sleep apnoea syndrome. Sleep Medicine. 12 (9), 880-886 (2011).
  5. Helfand, B. T., et al. The relationship between lower urinary tract symptom severity and sleep disturbance in the CAMUS trial. Journal of Urology. 185 (6), 2223-2228 (2011).
  6. Kimoff, R. J. Sleep fragmentation in obstructive sleep apnea. Sleep. 19 (9), Suppl 61-66 (1996).
  7. Dhondt, K., et al. Sleep fragmentation and periodic limb movements in children with monosymptomatic nocturnal enuresis and polyuria. Pediatric Nephrology. 30 (7), Berlin, Germany. 1157-1162 (2015).
  8. Young, T., Peppard, P. E., Gottlieb, D. J. Epidemiology of obstructive sleep apnea: a population health perspective. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (9), 1217-1239 (2002).
  9. Peppard, P. E., et al. Increased prevalence of sleep-disordered breathing in adults. American Journal of Epidemiology. 177 (9), 1006-1014 (2013).
  10. Marcus, C. L., et al. Diagnosis and management of childhood obstructive sleep apnea syndrome. Pediatrics. 130 (3), 714-755 (2012).
  11. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), New York, N.Y. 373-377 (2013).
  12. Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. 65 (2), 106-119 (2019).
  13. Stickgold, R., Walker, M. P. Memory consolidation and reconsolidation: what is the role of sleep. Trends in Neurosciences. 28 (8), 408-415 (2005).
  14. Stickgold, R. Sleep-dependent memory consolidation. Nature. 437 (7063), 1272-1278 (2005).
  15. Aalling, N. N., Nedergaard, M., DiNuzzo, M. Cerebral Metabolic Changes During Sleep. Current Neurology and Neuroscience Reports. 18 (9), 57 (2018).
  16. Rempe, M. J., Wisor, J. P. Cerebral lactate dynamics across sleep/wake cycles. Frontiers in Computational Neuroscience. 8, 174 (2014).
  17. Kang, J. E., et al. Amyloid-beta dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (5955), New York, N.Y. 1005-1007 (2009).
  18. Minakawa, E. N., et al. Chronic sleep fragmentation exacerbates amyloid beta deposition in Alzheimer's disease model mice. Neuroscience Letters. 653, 362-369 (2017).
  19. Qiu, H., et al. Chronic Sleep Deprivation Exacerbates Learning-Memory Disability and Alzheimer's Disease-Like Pathologies in AβPP(swe)/PS1(ΔE9) Mice. Journal of Alzheimer's Disease : JAD. 50 (3), 669-685 (2016).
  20. Holth, J. K., et al. The sleep-wake cycle regulates brain interstitial fluid tau in mice and CSF tau in humans. Science. 363 (6429), New York, N.Y. 880-884 (2019).
  21. Xie, Y., et al. Chronic sleep fragmentation shares similar pathogenesis with neurodegenerative diseases: Endosome-autophagosome-lysosome pathway dysfunction and microglia-mediated neuroinflammation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 26 (2), 215-227 (2020).
  22. Ba, L., et al. Distinct Rab7-related Endosomal-Autophagic-Lysosomal Dysregulation Observed in Cortex and Hippocampus in APPswe/PSEN1dE9 Mouse Model of Alzheimer's Disease. Chinese Medical Journal (England). 130 (24), 2941-2950 (2017).
  23. Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
  24. Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
  25. Misrani, A., et al. Differential effects of citalopram on sleep-deprivation-induced depressive-like behavior and memory impairments in mice. Progress Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 88, 102-111 (2019).
  26. Xu, A., et al. Roles of hypothalamic subgroup histamine and orexin neurons on behavioral responses to sleep deprivation induced by the treadmill method in adolescent rats. Journal of Pharmacological Sciences. 114 (4), 444-453 (2010).
  27. Saito, L. P., et al. Acute total sleep deprivation potentiates amphetamine-induced locomotor-stimulant effects and behavioral sensitization in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 117, 7-16 (2014).
  28. Spano, G. M., et al. Sleep Deprivation by Exposure to Novel Objects Increases Synapse Density and Axon-Spine Interface in the Hippocampal CA1 Region of Adolescent Mice. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (34), 6613-6625 (2019).
  29. Morrow, J. D., Opp, M. R. Sleep-wake behavior and responses of interleukin-6-deficient mice to sleep deprivation. Brain, Behavior, and Immunity. 19 (1), 28-39 (2005).
  30. Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
  31. Aleisa, A. M., Alzoubi, K. H., Alkadhi, K. A. Post-learning REM sleep deprivation impairs long-term memory: reversal by acute nicotine treatment. Neuroscience Letters. 499 (1), 28-31 (2011).
  32. Zagaar, M., Dao, A., Alhaider, I., Alkadhi, K. Regular treadmill exercise prevents sleep deprivation-induced disruption of synaptic plasticity and associated signaling cascade in the dentate gyrus. Molecular and Cellular Neurosciences. 56, 375-383 (2013).
  33. McKenna, J. T., et al. Sleep fragmentation elevates behavioral, electrographic and neurochemical measures of sleepiness. Neuroscience. 146 (4), 1462-1473 (2007).
  34. Tartar, J. L., et al. Hippocampal synaptic plasticity and spatial learning are impaired in a rat model of sleep fragmentation. The European Journal of Neuroscience. 23 (10), 2739-2748 (2006).
  35. Guzman-Marin, R., Bashir, T., Suntsova, N., Szymusiak, R., McGinty, D. Hippocampal neurogenesis is reduced by sleep fragmentation in the adult rat. Neuroscience. 148 (1), 325-333 (2007).
  36. Nair, D., et al. Sleep fragmentation induces cognitive deficits via nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-dependent pathways in mouse. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (11), 1305-1312 (2011).
  37. McCoy, J. G., et al. Experimental sleep fragmentation impairs attentional set-shifting in rats. Sleep. 30 (1), 52-60 (2007).
  38. Dumaine, J. E., Ashley, N. T. Acute sleep fragmentation induces tissue-specific changes in cytokine gene expression and increases serum corticosterone concentration. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (12), 1062-1069 (2015).
  39. Carreras, A., et al. Chronic sleep fragmentation induces endothelial dysfunction and structural vascular changes in mice. Sleep. 37 (11), 1817-1824 (2014).
  40. Khalyfa, A., et al. Circulating exosomes potentiate tumor malignant properties in a mouse model of chronic sleep fragmentation. Oncotarget. 7 (34), 54676-54690 (2016).
  41. Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
  42. Tripathi, A., et al. Intermittent Hypoxia and Hypercapnia, a Hallmark of Obstructive Sleep Apnea, Alters the Gut Microbiome and Metabolome. mSystems. 3 (3), (2018).
  43. D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research. Brain Research Reviews. 36 (1), 60-90 (2001).
  44. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
  45. Vogel-Ciernia, A., Wood, M. A. Examining object location and object recognition memory in mice. Current Protocols in Neuroscience. 69, 1-17 (2014).
  46. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The Open Field Test for Measuring Locomotor Activity and Anxiety-Like Behavior. Methods in Molecular Biology. 1916, Clifton, N.J. 99-103 (2019).
  47. Porsolt, R. D., Bertin, A., Blavet, N., Deniel, M., Jalfre, M. Immobility induced by forced swimming in rats: effects of agents which modify central catecholamine and serotonin activity. European Journal of Pharmacology. 57 (2-3), 201-210 (1979).
  48. Hauglund, N. L., Kusk, P., Kornum, B. R., Nedergaard, M. Meningeal Lymphangiogenesis and Enhanced Glymphatic Activity in Mice with Chronically Implanted EEG Electrodes. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
  49. Nguyen-Michel, V. H., et al. Rapid eye movement sleep behavior disorder or epileptic seizure during sleep? A video analysis of motor events. Seizure. 58, 1-5 (2018).
  50. Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31 (11), 1587-1598 (2008).
  51. Abad, J., et al. Automatic Video Analysis for Obstructive Sleep Apnea Diagnosis. Sleep. 39 (8), 1507-1515 (2016).
  52. Sandlund, C., Hetta, J., Nilsson, G. H., Ekstedt, M., Westman, J. Impact of group treatment for insomnia on daytime symptomatology: Analyses from a randomized controlled trial in primary care. International Journal of Nursing Studies. 85, 126-135 (2018).
  53. Shekleton, J. A., Rogers, N. L., Rajaratnam, S. M. Searching for the daytime impairments of primary insomnia. Sleep Medicine Reviews. 14 (1), 47-60 (2010).
  54. Dixon, L. J., Lee, A. A., Gratz, K. L., Tull, M. T. Anxiety sensitivity and sleep disturbance: Investigating associations among patients with co-occurring anxiety and substance use disorders. Journal of Anxiety Disorders. 53, 9-15 (2018).
  55. Press, Y., Punchik, B., Freud, T. The association between subjectively impaired sleep and symptoms of depression and anxiety in a frail elderly population. Aging Clinical and Experimental Research. 30 (7), 755-765 (2018).

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Comportamento Problema 163 fragmentação crônica do sono rotor orbital déficit cognitivo comportamento semelhante à ansiedade apneia obstrutiva do sono doenças neurodegenerativas
Um modelo de fragmentação crônica do sono usando rotor orbital vibrante para induzir déficit cognitivo e comportamento semelhante à ansiedade em camundongos jovens do tipo selvagem
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Xie, Y., Deng, S. Y., Chen, S. M.,… More

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