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Behavior

Un modelo crónico de fragmentación del sueño usando rotor orbital vibratorio para inducir déficit cognitivo y comportamiento similar a la ansiedad en ratones jóvenes de tipo salvaje

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61531
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000, China, 2Key Laboratory of Neurological Diseases of Chinese Ministry of Education, The School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000,China, 3Department of Pharmacology, School of Basic Medical Science; State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institutes of Brain Science and Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University, Shanghai 200032, China

Summary

Aquí se presenta un protocolo para el modelo de fragmentación crónica del sueño (LCR) logrado por un rotor orbital controlado eléctricamente, que podría inducir déficit cognitivo confirmado y comportamiento similar a la ansiedad en ratones jóvenes de tipo salvaje. Este modelo se puede aplicar para explorar la patogénesis de la alteración crónica del sueño y trastornos relacionados.

Abstract

La alteración del sueño es generalmente común en las poblaciones como una enfermedad crónica o un evento denunciado. Se propone que la alteración crónica del sueño esté estrechamente relacionada con la patogénesis de las enfermedades, especialmente las enfermedades neurodegenerativas. Recientemente encontramos que 2 meses de fragmentación del sueño iniciaron cambios conductuales y patológicos similares a la enfermedad de Alzheimer (AD) en ratones jóvenes de tipo salvaje. En este documento, presentamos un protocolo estandarizado para lograr la fragmentación crónica del sueño (LCR). Brevemente, CSF fue inducido por un rotor orbital que vibraba a 110 rpm y operaba con un ciclo repetitivo de 10 s-on, 110 s-off, durante la fase light-ON (8:00 AM-8:00 PM) continuamente durante un período de hasta 2 meses. Las deficiencias del aprendizaje espacial y la memoria, el comportamiento similar a la ansiedad pero no similar a la depresión en ratones como consecuencias del modelado de CSF, fueron evaluados con el laberinto de agua morris (MWM), el reconocimiento de objetos novedoso (NOR), la prueba de campo abierto (OFT) y la prueba de natación forzada (FST). En comparación con otras manipulaciones del sueño, este protocolo minimiza las labores de manipulación y maximiza la eficiencia del modelado. Produce fenotipos estables en ratones jóvenes de tipo salvaje y se puede generar potencialmente para una variedad de propósitos de investigación.

Introduction

La alteración del sueño es cada vez más común tanto en pacientes con afecciones que alteran el sueño como en personas sanas con eventos que alteran el sueño. Se ha observado que los pacientes con enfermedades neurodegenerativas, dolor crónico, estrés emocional, enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades del sistema urinario, etc., suelen quejarse de experiencias desagradables de sueño1,2,3,4,5. Apnea obstructiva del sueño (AOS), movimientos periódicos de las extremidades en el sueño (PLMS), insomnio de mantenimiento del sueño entre otros trastornos del sueño son las causas más comunes, que inducen la fragmentación del sueño6,7. En los países desarrollados, la AOS tiene una prevalencia superior al 5% al 9% en la población adulta y del 2% en la población infantil8,9,10. Mientras tanto, hay una proporción cada vez mayor de la población sana que experimenta trastornos del sueño debido al uso excesivo de teléfonos inteligentes, hábitos de sueño irregulares, ruidos molestos y tareas de trabajo, como turnos de noche para cuidadores. Se reconoce que el sueño es importante para el aclaramiento de residuos cerebrales11,12,consolidación de la memoria13,14,equilibrio metabólico15,16,entre muchos otros procesos fisiológicos. Sin embargo, todavía se desconoce en gran medida si la alteración del sueño a largo plazo da lugar a alteraciones irreversibles de la patogénesis en seres humanos sanos, y si es la etiología o un factor que contribuye al desarrollo de enfermedades del sistema nervioso central, como las enfermedades neurodegenerativas en un par de años en el camino. Nuestro objetivo es informar de un modelo experimental que genera un déficit cognitivo estable y evidente y un comportamiento similar a la ansiedad en ratones jóvenes de tipo salvaje después de un tratamiento de fragmentación del sueño de 2 meses. Este modelo se aplicaría para responder a las preguntas científicas mencionadas anteriormente.

La alteración del sueño se enumera como un factor de riesgo potencial para desarrollar la enfermedad de Alzheimer (AD) o demencia. Kang et al. encontró y describió por primera vez la exacerbación de la patología ad por 6 h privación aguda del sueño17. A partir de entonces, muchos otros estudios informaron que la privación o fragmentación del sueño podría agravar la patogénesis en ratones transgénicos ADmodelos 18,19,20. Sin embargo, muy pocos investigadores han estudiado la consecuencia de la alteración del sueño en ratones jóvenes de tipo salvaje; es decir, si la alteración del sueño da lugar a un comportamiento similar al AD o a cambios patológicos en ratones jóvenes de tipo salvaje. En nuestra reciente publicación, informamos que 2 meses de fragmentación del sueño indujeron un déficit evidente de memoria espacial y un comportamiento similar a la ansiedad, así como un aumento de la acumulación intracelular de Amiloide β (Aβ) tanto en corteza como en hipocampo en ratones de tipo salvaje de 2-3 meses de edad21. También observamos niveles de expresión alterados de marcadores de vías endomas-autofagosoma-glisomasas y activación de microglia, que era similar a los cambios patológicos reportados en ratones APP/PS121,22.

Este protocolo de fragmentación del sueño presentado (SF) fue validado por Sinton et al.23 y modificado por Li et al.24. En resumen, un rotor orbital que vibra a 110 rpm interrumpe el sueño durante 10 s cada 2 minutos durante la fase de encendido ligero (8:00 AM–8:00 PM). La alteración de la estructura del sueño en este modelo se caracterizó previamente con grabaciones electrofisiológicas del sueño y fue reportada por Li et al.24,lo que indica un aumento significativo en el tiempo de vigilia y disminución del sueño de movimiento ocular rápido (REM) durante la fase de encendido ligero, con el sueño total y los tiempos de vigilia (en 24 horas) no afectados después de más de 4 semanas de modelado24. Actualmente, el sueño total o la privación parcial del sueño son los modelos de manipulación del sueño más utilizados. La privación total del sueño se realiza generalmente mediante un manejo suave sostenido o la exposición del animal a objetos novedosos, alternativamente girando continuamente una barra o una cinta de correr25,26,27,28,29. Debido a razones éticas, la privación total del sueño suele ser inferior a 24 h. El modelo de privación parcial de sueño más comúnmente aplicado es el método de plataforma de agua, que principalmente ablating REM sueño30,31,32. Otros enfoques usando una cinta de correr o una barra que barre a lo largo de la parte inferior de la jaula, podrían inducir la fragmentación del sueño cuando se enciende a intervalos fijos33,34,35,36,37,38. Cabe destacar que SF interrumpe el sueño y provoca de forma intermitente excitaciones en todas las etapas del sueño24. Una de las ventajas destacadas de este modelo CSF que aplica rotor orbital es que se puede realizar continuamente durante meses controlado automáticamente por máquinas, lo que evita la mano de obra de procesamiento frecuente diariamente, excepto para el monitoreo regular. Además, el aparato permitiría modelar simultáneamente múltiples jaulas de ratones bajo intervenciones uniformadas. Durante sesiones de modelado completas, los ratones se alojan en sus jaulas domésticas con materiales habituales de ropa de cama y anidación, mientras que algunos otros métodos requieren exposición a entornos diversificados y estrés inevitable.

La fragmentación del sueño se caracterizó previamente por el método de manipulación del sueño, que imita las excitaciones frecuentes durante la fase de sueño y el rebote sustancial del sueño durante la fase de vigilia. En algunas literaturas, CSF fue considerado como el modelo animal para OSA39,40. En este estudio, la razón de la frecuencia elegida de excitación para ser 30 veces por hora se basa en la observación de índices de excitación en pacientes con apnea del sueño de moderada a grave. Se observó que la fragmentación del sueño de 4 semanas aumentó significativamente la latencia de excitación hipercácnica y el umbral de excitación táctil, que podría al menos durar 2 semanas después de la recuperación24. Este fenotipo se explica revelando la reducción de activación de c-fos en neuronas noradrenérgicas, orexinérgicas, histaminérgicas y colinérgicas activas en respuesta a la hipercapnia, así como proyecciones catecolaminérgicas y orexinérgicas reducidas en la corteza cingulada24. Sin embargo, es necesario tener en cuenta que la característica más importante en la AOS es la hipoxia causada por la obstrucción de las vías respiratorias, lo que resulta en la interrupción del sueño41,42. La alteración del sueño y la hipoxia repetitiva interactúan recíprocamente entre sí en la patogénesis de la AOS. Por lo tanto, la fragmentación del sueño por sí sola podría no ser capaz de demostrar completamente todas las características clave de la AOS en ratones.

En este documento, presentamos un protocolo estandarizado para modelar la fragmentación crónica del sueño en ratones jóvenes de tipo salvaje. El déficit cognitivo y la ansiedad, así como los comportamientos similares a la depresión después del tratamiento con CSF fueron evaluados por morris laberinto de agua, reconocimiento de objetos novedoso, prueba de campo abierto, y prueba de natación forzada. Es importante tener en cuenta que este modelo debe tomarse en su conjunto que genera fenotipos de patrón de sueño regulado, déficit cognitivo, y comportamiento similar a la ansiedad. El modelo actual podría aplicarse potencialmente, pero no limitarse, a los siguientes propósitos: 1) Investigar más a fondo los mecanismos de patogénesis funcional o molecular inducidos por la alteración crónica del sueño en ratones jóvenes sin predisposición genética, 2) Identificación de la vía directa que conduce a la neurodegeneración iniciada por la alteración del sueño, 3) Explorando las terapias para mejorar los fenotipos inducidos por la alteración crónica del sueño, 4) Estudiar los mecanismos protectores/compensatorios intrínsecos en ratones de tipo salvaje sobre la alteración crónica del sueño, 5) Para ser aplicado para estudiar la regulación del sueño-vigilia y los mecanismos de transición estatal.

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Protocol

Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Tongji, Tongji Medical College, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong.

1. Detección de ratones y preparación para el experimento

  1. Seleccione ratones machos adultos de tipo salvaje (8-10 semanas de edad) con un peso de 20-28 g para todo el experimento.
    NOTA: Los ratones tipo salvaje C57BL/6 se obtienen del Centro de Investigación Hubei para Animales de Laboratorio, Hubei, China.
  2. Asigne aleatoriamente todos los ratones al CSF y al grupo de control. Alberga de 3 a 5 ratones en cada jaula para evitar el estrés de aislamiento social. El número de ratones alojados en las jaulas de control coincide con el alojado en las jaulas de CSF emparejadas.
    NOTA: Los ratones de las mismas jaulas de grupo están agrupados para realizar experimentos conductuales de seguimiento.
  3. Localice las jaulas de control en la misma habitación con las jaulas CSF, para mantener idéntico el entorno circundante y los efectos de mano de obra.
  4. Numere y marque los ratones de cada grupo en sus oídos usando una etiqueta de oído para fines de monitoreo.
  5. Mantener la temperatura ambiente y la humedad entre 21–23 °C y 35%–60 %.
  6. Mantenga el ambiente ambiente en ciclo de 12 horas de luz y oscuridad (8:00 AM–8:00 PM light-ON, 8:00 PM-8:00 AM light-OFF), para evitar el efecto sesgado en el ritmo de sueño normal en ratones.
  7. Minimice el ruido y la interferencia mientras el investigador está presente en la sala de modelado.
  8. Proporcionar a los ratones suficiente comida y agua. Utilice boquillas largas con puntas de válvula de bola en botellas de agua, para evitar fugas de agua en los movimientos de la plataforma. Fije la botella de agua en la parte superior de la jaula con un resorte para evitar la dislocación de la botella durante el funcionamiento del rotor.

2. Preparación y ajuste del rotor orbital

  1. Prepare un rotor orbital controlado eléctricamente con plataforma ampliada (67 cm x 110 cm), en el que se pueden colocar 10 jaulas como máximo.
  2. Encienda el rotor orbital durante la fase de encendido ligero (8:00 AM-8:00 PM) controlado por un temporizador del programa, que es el momento en que los ratones exhiben la mayor parte de su sueño diario.
  3. Ajuste el rotor orbital con una velocidad de 110 rpm y un ciclo repetitivo de 10 s-on, 110 s-off controlado con un temporizador de estado sólido.
    NOTA: La capacidad de carga de la plataforma es de 50 kg. La amplitud fija del horizonte del rotor vibrando es de 2,5 cm.
  4. Fije las jaulas CSF en la parte superior de la plataforma del rotor por muelles gruesos para evitar la dislocación de las jaulas en las rotaciones de la plataforma.

3. Modelado y monitoreo crónicos de la fragmentación del sueño

  1. Coloque jaulas del CSF y los ratones de control en la sala de modelado durante una semana antes de los experimentos, para permitir que los ratones se adapten al entorno ambiente.
  2. Al comienzo del modelado, asegúrese de que todos los ratones tengan acceso gratuito a alimentos y agua durante las rotaciones orbitales.
  3. Al principio del modelado, observe al menos durante 1 h para asegurar que el rotor orbital funcione en marcha.
  4. Durante el período de modelado, compruebe que el rotor orbital funciona correctamente y las condiciones de los ratones cada 2 días para garantizar que los ratones tengan suficiente comida y agua. Cambie la ropa de cama de las jaulas semanalmente.
  5. Durante el período de modelado, pesar los ratones semanalmente a las 8:00 AM al cambiar la ropa de cama. Retire los ratones con pérdida de peso significativa del modelado, y también de los grupos experimentales.
    NOTA: La pérdida de peso significativa se define como un peso inferior a 20 g que dura 2 semanas.
  6. Durante todas las sesiones de modelado, retire el agresor, si existe, de la jaula y, también de los grupos experimentales.
  7. Después de la terminación del modelado, continúe manteniendo y alimentando a los ratones en la habitación original.

4. Prueba de laberinto de agua Morris (MWM)

  1. Preparación para la prueba
    1. Preparar el aparato de un tanque circular lleno de agua tibia (20-23 °C).
    2. Suspenda cuatro signos con diferentes formas y colores en la cortina que rodea el tanque en cuatro direcciones de cuadrante como referencia de visión distante. Haga que el agua parezca opaca por la adición de leche en polvo.
    3. Localice una plataforma en medio del cuadrante suroeste.
  2. La prueba de entrenamiento
    1. Someta a los ratones a cuatro ensayos consecutivos entre las 8:00 AM y las 12:00 AM cada día durante un período de entrenamiento de 5 días.
    2. Suelte cada ratón en el agua que da a la pared lateral en uno de los cuatro cuadrantes en cuatro pruebas. En cada prueba, permita que el ratón nade durante 60 s para encontrar la plataforma. Si el ratón no puede llegar a la plataforma en un radio de 60 s, guíela a la plataforma y permanezca allí durante 15 s.
    3. Utilice un sistema de seguimiento de vídeo para registrar automáticamente la latencia de escape de los ratones para encontrar la plataforma oculta.
  3. La prueba de la sonda
    1. Realice la prueba de sonda el sexto día después de 5 días de entrenamiento.
    2. Retire la plataforma. Libera cada ratón del cuadrante noreste y deja que nade durante 60 s
    3. Utilice un sistema de seguimiento de vídeo para grabar automáticamente los datos de seguimiento de ratones.

5. Prueba de reconocimiento de objetos novedoso (NOR)

  1. La fase familiar
    1. Coloque ratones en un tanque (longitud 30 cm, ancho 28 cm, alto 35 cm) en secuencia, que contiene dos copias de objetos (A1 y A2). Permita que los ratones exploren libremente (10 minutos por ensayo).
    2. Utilice un sistema de seguimiento de vídeo para grabar automáticamente los datos de seguimiento de ratones.
  2. La fase de prueba
    1. Realice el ensayo de prueba después de un retraso de 1 h de la fase familiar. Reemplace uno de los objetos originales por un objeto novedoso ("novela") en el tanque manteniendo el otro sin cambios. Devuelva a los ratones al tanque y déjelo explorar durante 5 minutos por ensayo.
    2. Utilice un sistema de seguimiento de vídeo para grabar automáticamente el tiempo empleado en la exploración de cada objeto por cada ratón.
      NOTA: La exploración del objeto se determina lamiendo, oliendo, masticando o moviendo vibrissae mientras orienta la nariz hacia y a menos de 1 cm del objeto. El Índice de Discriminación (DI) se calcula con la ecuación (TN − TF)/(TN + TF), donde TN = tiempo dedicado a explorar el objeto "novedoso" y TF = tiempo dedicado a explorar el objeto "familiar".

6. Prueba de campo abierta (OFT)

  1. Preparar el aparato de un tanque (30 cm x 28 cm x 35 cm).
  2. Durante la prueba, coloque cada ratón en el centro del tanque y deje que explore libremente durante 5 minutos. Limpie el tanque con un 75% de etanol después de cada ensayo para evitar los efectos sobrantes del ratón anterior.
  3. Utilice un sistema de seguimiento de vídeo para grabar automáticamente los datos de seguimiento de ratones.

7. Prueba de natación forzada (FST)

  1. Preparar el aparato de un recipiente cilíndrico abierto, que contiene agua (20-23 °C) de 15 cm de profundidad.
  2. Durante la prueba, coloque cada ratón en el cilindro y deje que permanezca allí durante 6 minutos.
  3. Utilice un sistema de pista de vídeo para grabar automáticamente el tiempo de inmovilidad durante los últimos 4 minutos de la prueba por cada ratón.
    NOTA: Se determina que el ratón está inmóvil cuando deja de luchar y flota en el agua, haciendo sólo movimientos que son necesarios para mantener su cabeza sobre el agua.

8. Análisis de datos

  1. Analice los datos utilizando software de análisis estadístico (por ejemplo, GraphPad Prism 6.0).
  2. Exprese todos los datos como la media ± SEM.
  3. Compare la latencia de escape en la prueba MWM entre dos grupos que utilizan ANOVA bidireccional con medidas repetidas seguidas de postpruebas de Bonferroni. Otras comparaciones entre el CSF y los grupos de control se determinan mediante pruebas t no asoadas.
  4. Considere las diferencias significativas si P < 0.05 en todas las pruebas.

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Representative Results

Todos los resultados y cifras representativas se reprodujeron de nuestra reciente publicación21. La reutilización de las cifras fue permitida por el diario original.

Todo el diseño experimental se ilustra en el orden del tiempo, lo que indica el tiempo del modelado CSF, las pruebas de comportamiento de MWM, NOR, OFT y FST (Figura 1A). Obtuvimos pesos de ratones cada semana del CSF y los grupos de control, para monitorear sus condiciones generales durante las sesiones de modelado. No se encontró ninguna diferencia evidente en el aumento de peso en ratones entre dos grupos durante el modelado(Figura 1B).

Para evaluar los efectos de CSF en el aprendizaje espacial y el rendimiento de la memoria, realizamos la prueba conductual MWM43,44. El grupo CSF mostró capacidades de escape más pobres para encontrar la plataforma durante 5 días de entrenamiento en comparación con el grupo de control (Figura 2A). En la prueba de sonda, los ratones CSF pasaron significativamente menos tiempo en el cuadrante objetivo y cruzaron la ubicación de la plataforma anterior por menos veces(Figura 2B,C),sin diferencia de velocidad de natación (Figura 2D). Estos resultados anteriores indicaron que las capacidades de aprendizaje espacial y recuperación de memoria de los ratones se vieron afectadas después del CSF.

También realizamos pruebas NOR para evaluar el reconocimiento de objetos y la memoria de trabajo a corto plazo después de CSF45. En la fase familiar, no hubo ninguna diferencia significativa en el tiempo total de exploración entre el CSF y el grupo de control (Figura 3A). En consecuencia, no se encontraron diferencias en el tiempo de exploración entre los objetos A1 y A2, respectivamente en dos grupos (Figura 3B). Los resultados anteriores garantizaron que no había diferencias en las habilidades de los ratones para la exploración y las preferencias de ubicación. En la fase de prueba, el Índice de Discriminación (DI) de los ratones CSF se redujo significativamente en comparación con los controles(Figura 3C),que evidentemente indicaban déficits en el reconocimiento de objetos y memoria de trabajo a corto plazo después de la CSF.

Además realizamos OFT y FST, respectivamente para examinar comportamientos similares a la ansiedad y a la depresión de ratonesde 46,47. Curiosamente, en la OFT, se encontró que el grupo CSF pasaba menos tiempo en la zona central que el grupo de control(Figura 4A),que ilustraba que la fragmentación del sueño podía inducir un comportamiento similar a la ansiedad hasta cierto punto. Además, los ratones CSF mostraron una distancia total más larga movida en el tanque(Figura 4B),lo que sugiere un aumento de la actividad espontánea después del modelado. Sin embargo, este modelado de LCR no pudo inducir un comportamiento similar a la depresión, verificado por diferencia no significativa en el tiempo de inmovilidad entre dos grupos sometidos al FST(Figura 4C).

Figure 1
Figura 1: El diagrama de flujo del procedimiento de diseño experimental. (A) El procedimiento de diseño experimental que indica la sincronización de las pruebas de modelado y comportamiento de CSF (es decir, MWM, NOR, OFT y FST). (B) Curvas de peso corporal del CSF y los ratones de control durante el primer mes después de que se estableció el modelo CSF. Esta cifra ha sido modificada de Xie et al.21Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Habilidades de aprendizaje espacial y memoria deterioradas por CSF evaluadas por la prueba MWM. (A) Los ratones CSF realizaron una latencia de escape más larga en comparación con los ratones de control durante la prueba de entrenamiento de 5 días. **p < 0.01. (B) En la prueba de sonda, los ratones CSF mostraron menos tiempo porcentual empleado en el cuadrante de la plataforma en contraste con los ratones de control. El panel superior muestra los trazados representativos de dos grupos. p < 0.0001. (C) En la prueba de sondeo, el grupo CSF realizó menos tiempos de cruzar la ubicación de la plataforma en comparación con el grupo de control. *p < 0.05. (D) La velocidad de natación de dos grupos en la prueba de sonda. n.s. indica que los cambios entre diferentes grupos no fueron significativos. Todos los datos se presentaron como media ± SEM. n = 10 por grupo. Esta cifra ha sido modificada de Xie et al.21Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Reconocimiento de objetos deteriorado por CSF y memoria de trabajo de poco tiempo evaluada por la prueba NOR. (A) El tiempo total de exploración entre el CSF y los ratones de control en la fase familiar, n.s. no indica cambios significativos entre diferentes grupos. (B) El tiempo de exploración de los objetos A1 y A2 respectivamente entre dos grupos en la fase familiar. n.s. no indica cambios significativos entre diferentes grupos. (C) En la fase de prueba, el Índice de Discriminación (DI) del grupo del CSF se redujo significativamente en comparación con el del grupo de control. *p < 0.05. Todos los datos se presentaron como media ± SEM. n = 10 por grupo. Esta cifra ha sido modificada de Xie et al.21Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: El CSF exacerbó el comportamiento similar a la ansiedad pero no similar a la depresión evaluado por oft y FST. (A) Los ratones CSF pasaron menos tiempo en la zona central durante los 5 minutos observados en comparación con los ratones de control en oft. *p < 0.05. (B) El grupo CSF mostró una distancia total más larga movida en el tanque frente al grupo de control en OFT. *p < 0.05. (C) El tiempo de inmovilidad entre el CSF y los grupos de control en FST. n.s. no indica cambios significativos entre diferentes grupos. Todos los datos se presentaron como media ± SEM. n = 10 por grupo. Esta cifra ha sido modificada de Xie et al.21Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los pasos críticos en el protocolo actual incluyen la configuración de máquinas de fragmentación del sueño con los parámetros optimizados de acuerdo con el propósito del estudio y el mantenimiento de los ratones en un ambiente de vida cómodo y tranquilo durante todas las sesiones de modelado. También es crucial decidir el momento adecuado para interrumpir o detener la fragmentación del sueño y organizar pruebas de comportamiento para esos ratones. Al igual que otros modelos de manipulación del sueño, es importante realizar el protocolo en una sala dedicada con ciclos de luz controlados y vacío de todas las posibles interferencias innecesarias. Se deben realizar esfuerzos para evitar inducir ruidos y minimizar el tiempo de funcionamiento realizado por los investigadores para comprobar, rellenar los alimentos y el suministro de agua, cambiar las camas, etc. En raras ocasiones, hay agresores atacando a los compañeros de cama, especialmente al inicio de sesiones incómodas de interrupción del sueño. El agresor cuando esté presente debe ser retirado de las jaulas domésticas, así como de los grupos experimentales. La mayoría de los animales experimentales, excepto algunos a nuestra experiencia, se adaptarían al tratamiento y lograrían acceder al agua y los alimentos según sea necesario. Los ratones con problemas intrínsecos, como dientes deformados, bajo peso y heridas en la piel, pueden causar pérdida de peso o debilidad. También hay que evitar que se utilicen para el modelado. Como este protocolo podría potencialmente inducir estrés crónico y desregulación metabólica, es esencial utilizar ratones examinados con criterios uniformados, como el peso corporal, para el modelado y experimentos.

En el protocolo descrito, el rotor orbital se encendería automáticamente durante 8:00 AM-8:00 PM (light-ON) todos los días, que es el momento en que los ratones exhiben la mayor parte de su vida diaria. El rotor se puso en marcha en un ciclo repetitivo de 10 s-on, 110 s-off durante la fase de encendido ligero para inducir excitaciones frecuentes. Varias duraciones de modelado darían lugar a diferentes fenotipos. La fragmentación aguda del sueño podría resultar en una reducción absoluta en la duración del sueño, aumento de las actividades simpáticas del sistema nervioso, tales como niveles elevados de cortisona y sensibilidad a la insulina deteriorada23,24. Sin embargo, la fragmentación crónica del sueño mostró niveles no afectados de cortisona, y un tiempo de sueño total equilibrado24. Cualquier modificación basada en el protocolo actual, como ciclos de luz, ajustes vibratorios coincidentes (velocidad, amplitud, ciclo repetitivo, etc.) y duraciones de modelado, podría alterar potencialmente los fenotipos. Es necesario llevar a cabo la grabación del sueño y el análisis de la estructura del sueño bajo diferentes ajustes de modelado para identificar los fenotipos del sueño. También podría resultar en cambios conductuales y patológicos distintivos. A medida que exploramos el déficit cognitivo después de la fragmentación del sueño a largo plazo en lugar de una noche y tendíamos a evitar los efectos sesgados de la fragmentación intermitente del sueño en los comportamientos de los ratones en MWM y NOR, realizamos estas dos pruebas de comportamiento después de terminar el protocolo CSF el día 60. Sin embargo, inevitablemente, el efecto de la recuperación del sueño en ratones podría haber confundido los resultados para MWM y NOR mostrado.

Aunque este modelo se titula con el modelo de fragmentación del sueño, en realidad se compone de patrones de sueño fragmentados durante la fase de encendido ligero, desregulación del ritmo circadiano y rebote compensatorio del sueño durante la fase de encendido ligero. Este protocolo podría inducir no sólo alteraciones del patrón de sueño, sino también neuroinflamación sustancial, desequilibrio metabólico, alteración del sistema inmune,etc. 21,23,24. Todos estos procesos patológicos pueden interactuar entre sí y mediar fenotipos como una orquesta. Este modelo debe tomarse en su conjunto para generar los ratones con fenotipos de patrón de sueño disregulado, déficit cognitivo, y comportamiento similar a la ansiedad en ratones jóvenes de tipo salvaje. Como se mencionó en la sección anterior, este modelo no está reflejando exactamente la AOS debido a la falta de hipoxia repetitiva. Otra limitación es que es difícil generar cambios patológicos precisos y fenotipos de sueño en los mismos ratones. La implantación de electrodos EEG/EMG ampliamente aplicada para la grabación del sueño indujo inevitablemente gliosis grave en la corteza48. En los últimos años, en los estudios del sueño se aplicaron técnicas de videovigilancia y análisis de imágenes basadas en inteligencia artificial, que recopilarían información precisa sobre el sueño sin implantación invasiva de electrodos49,50,51.

Los significados de este método de CSF en comparación con los métodos existentes incluyen: 1) Diferente de los protocolos de privación del sueño que generalmente se realizan durante horas o días, el protocolo actual imita mejor la alteración del sueño a largo plazo en seres humanos sanos. El rebote compensatorio del sueño en ratones fragmentados del sueño refleja perfectamente la somnolencia diurna y el rendimiento de trabajo retardante en personas con mala calidad del sueño durante la noche52,53. 2) Es hasta ahora el único modelo de fragmentación crónica del sueño en ratones jóvenes de tipo salvaje con déficit cognitivo confirmado y fenotipos de comportamiento similares a la ansiedad pero no a la depresión, así como cambios patológicos moleculares evidentes en el tejido cerebral. 3) Este tratamiento causa irritaciones más leves a los ratones para que el modelado pueda durar meses, incluso con la posibilidad de realizarse en períodos de tiempo más largos. 4) Con los ajustes adecuados, este modelo puede generar fenotipos estables de alteración del sueño, déficit cognitivo, y comportamiento similar a la ansiedad, que se puede utilizar ya sea como modelos de enfermedad o intervenciones para diferentes diseños de estudio. 5) Algunos modelos de privación del sueño requieren interferencias de sesión completa por parte de los investigadores para aplicar un manejo suave u objetos novedosos. A excepción de la supervisión regular, este método minimiza el manejo de las labores de trabajo, lo que también elimina el sesgo artificial.

Este protocolo de LCR ofrece la oportunidad de responder a una serie de preguntas científicas clave, tales como, ¿es la alteración crónica del sueño la causa o consecuencia de enfermedades neurodegenerativas? ¿Es reversible la patogénesis inducida por alteración crónica del sueño durante la edad temprana? ¿Los mecanismos compensatorios sobre las alteraciones crónicas del sueño varían entre las personas jóvenes y las personas mayores, las personas sanas y los pacientes? Este protocolo también se puede aplicar para explorar la terapéutica mediante la evaluación de la gravedad y mejora de los fenotipos conductuales y moleculares. También se aplicaría para modelar los ratones con craneoectomía crónica, preparaciones de implantación de fibra óptica para grabaciones funcionales. Además, posiblemente se puede utilizar como estrategia intervencionista para inducir o agravar fenotipos además de condiciones preexistentes. Por último, se puede utilizar para estudiar los mecanismos de transición del estado de sueño-vigilia. Curiosamente, el modelo actual de LCR podría inducir un comportamiento similar a la ansiedad en lugar de similar a la depresión en ratones, que está en línea con la observación clínica de que la alteración del sueño en los pacientes probablemente se asociaría mucho más con la ansiedad que con la depresión54,55. Proporciona un modelo práctico para estudiar los trastornos emocionales en roedores.

En resumen, presentamos el protocolo de modelar la fragmentación crónica del sueño mediante el uso de un rotor orbital vibratorio, que podría producir fenotipos estables en ratones jóvenes de tipo salvaje y minimizar las labores de modelado con alta eficiencia. Se puede generar potencialmente para una variedad de propósitos de investigación.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (61327902-6 a W. Wang y 81801318 a F.F. Ding). Reconocemos a la Dra. Sigrid Veasy por establecer el sistema experimental SF y proporcionar amablemente detalles técnicos. Reconocemos al Dr. Maiken Nedergaard por comentarios instructivos para experimentos relacionados.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Any-maze behavior tracking system Stoelting,Inc,USA - A video-tracking system which was used to record the behavior track of mice.
C57BL/6J mice Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, China. - healthy male C57BL/6J mice aged 10-12 weeks were purchased from Hubei Research Center for Laboratory Animals
Graphpad Prism 6.0 Software Graphpad Software,Inc.USA - Graphpad Prism 6.0 software was used to draw statistical graphs.
Morris water maze system Shanghai XinRuan Information Technology Co.,Ltd,China XR-XM101 The system was used to perform Morris water maze test
Orbial rotor Shanghai ShiPing Laboratory Equipment Co.,Ltd,China SPH-331 The orbital rotor was used to establish the chronic sleep fragmentation model
Solid state timer OMRON Corporation, Kyoto, Japan H3CR-F8-300 The solid state time was used to control the frequency and time of the rotor running
Wooden Lusterless Tank - - length 30 cm, width 28 cm, height 35 cm The tank was used to perform open field test and novel object recognition test

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Comportamiento Problema 163 fragmentación crónica del sueño rotor orbital déficit cognitivo comportamiento similar a la ansiedad apnea obstructiva del sueño enfermedades neurodegenerativas
Un modelo crónico de fragmentación del sueño usando rotor orbital vibratorio para inducir déficit cognitivo y comportamiento similar a la ansiedad en ratones jóvenes de tipo salvaje
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Xie, Y., Deng, S. Y., Chen, S. M.,… More

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